WO2024075145A1 - 新規な歯髄幹細胞集団 - Google Patents

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WO2024075145A1
WO2024075145A1 PCT/JP2022/036892 JP2022036892W WO2024075145A1 WO 2024075145 A1 WO2024075145 A1 WO 2024075145A1 JP 2022036892 W JP2022036892 W JP 2022036892W WO 2024075145 A1 WO2024075145 A1 WO 2024075145A1
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WO
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stem cell
cell population
cells
weight ratio
dental pulp
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PCT/JP2022/036892
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English (en)
French (fr)
Inventor
泰之 三谷
宏美 有木
憲隆 福田
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キッズウェル・バイオ株式会社
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a stem cell population derived from human dental pulp and its culture supernatant, a pharmaceutical composition containing said stem cell population, and a method for producing the same.
  • Non-Patent Document 1 human dental pulp-derived stem cells
  • Non-Patent Document 2 cells were administered directly to the spinal cord immediately after spinal cord injury (Non-Patent Document 1), or directly to the brain several hours after brain injury in a cerebral palsy model (Non-Patent Document 2), which is not a realistic administration method when considering clinical application.
  • Non-Patent Document 3 cells were administered intravenously 24 hours after brain injury, but improvement in motor function was observed more than five months later (Non-Patent Document 3), and a treatment method that can achieve effects more quickly is desired.
  • Non-Patent Document 4 the results were obtained by administering cells to model animals with moderate symptoms immediately after vascular ligation (Non-Patent Document 4) or several hours after vascular ligation (Non-Patent Document 5), which is not consistent with the treatment of severe lower limb ischemia, which is the main target of stem cell therapy.
  • Non-Patent Documents 1-6 fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • Non-Patent Document 1 The cellular characteristics of dental pulp stem cells isolated by conventional methods using FBS have been analyzed, and it has been reported that they contain more than 50% or 96.2% CD117 (c-kit) positive cells (Patent Document 1, Non-Patent Document 7). Some previous studies have isolated CD117 positive cells and reported that they have pluripotency as a characteristic (Non-Patent Document 8). Other reports of dental pulp stem cells include that they are CD325 (N-cadherin) positive (Non-Patent Document 9), and that there are both positive and negative cells for CD51 (integrin ⁇ V) and CD49d (integrin ⁇ 4) (Non-Patent Documents 10, 11).
  • pluripotent stem cells can be obtained by trypsinizing human dental pulp tissue and then culturing the tissue in a serum-free medium containing human platelet lysate (hPL); however, the obtained cell population is positive for both hematopoietic stem cell markers CD34 and CD45, and is therefore considered to be a heterogeneous cell population (Non-Patent Document 12).
  • the objective of the present invention is to provide safe, highly functional stem cells suitable for clinical application, and a method for producing the same.
  • the inventors discovered that a stem cell population obtained by culturing cells isolated from dental pulp in a medium containing human platelet lysate (hPL) has structural characteristics (surface marker expression) different from previously reported dental pulp stem cells. Furthermore, they discovered that the stem cell population obtained by this method produces higher amounts of cytokines useful for tissue regeneration and can exhibit superior tissue regeneration capabilities compared to dental pulp stem cells obtained by the conventional method using FBS.
  • hPL human platelet lysate
  • stem cell population according to any one of [1] to [3], wherein the stem cell population is CD34 negative and CD45 negative.
  • stem cell population according to any one of [1] to [4], wherein the stem cell population produces SCF (stem cell factor) at a weight ratio of at least 1/20, preferably at least 1/10 of that of IL-6.
  • SCF stem cell factor
  • the stem cell population produces SCF (stem cell factor) at a weight ratio that is one-tenth to one-half, preferably one-tenth to one-third, of that of IL-6.
  • ANGPTL4 angiopoietin-like 4
  • ANGPTL4 angiopoietin-like 4
  • TGFBI transforming growth factor beta-derived
  • human dental pulp e.g., using an enzyme containing collagenase, or an enzyme containing collagenase and a neutral protease (dispase or thermolysin)
  • FBS fetal bovine serum
  • SCF stem cell factor
  • ANGPTL4 angiopoietin-like 4
  • TGFBI transforming growth factor beta-inducing
  • SCF stem cell factor
  • ANGPTL4 angiopoietin-like 4
  • TGFBI transforming growth factor beta-inducing
  • a pharmaceutical composition comprising the stem cell population according to any one of [1] to [16] or a culture supernatant of the stem cell population, and having at least one of the following characteristics 1) to 3): 1) SCF (stem cell factor) is contained in a weight ratio of 1/20 or more, preferably 1/10 or more, of IL-6; 2) Contains ANGPTL4 (angiopoietin-like 4) at a weight ratio of 3 times or more, preferably 5 times or more, of IL-6; 3) Contains TGFBI (transforming growth factor beta-inducing) in a weight ratio of 400 times or more, preferably 450 times or more, the same as IL-6.
  • SCF stem cell factor
  • ANGPTL4 angiopoietin-like 4
  • TGFBI transforming growth factor beta-inducing
  • a pharmaceutical composition comprising the stem cell population according to any one of [1] to [15] or a culture supernatant of the stem cell population, and having at least one of the following characteristics 1) to 3): 1) SCF (stem cell factor) is contained in a weight ratio of 1/10 to 1/2, preferably 1/10 to 1/3, of IL-6; 2) ANGPTL4 (angiopoietin-like 4) is contained in a weight ratio of 5 to 20 times, preferably 5 to 15 times, that of IL-6; 3) TGFBI (transforming growth factor beta-inducing) is contained in a weight ratio of 450 to 1500 times, preferably 450 to 1000 times, that of IL-6.
  • SCF stem cell factor
  • ANGPTL4 angiopoietin-like 4
  • TGFBI transforming growth factor beta-inducing
  • composition according to [18] or [19] which is for treating or preventing any disease selected from spinal cord injury, ischemic disease (cerebral infarction, lower limb ischemia, etc.), inflammatory disease, autoimmune disease, neurodegenerative disease, peripheral nerve disease, intestinal disease, and bone disease.
  • ischemic disease Cerebral infarction, lower limb ischemia, etc.
  • inflammatory disease autoimmune disease, neurodegenerative disease, peripheral nerve disease, intestinal disease, and bone disease.
  • a method for producing a stem cell population derived from human dental pulp comprising: The method includes the steps of enzymatically isolating cells from human dental pulp (e.g., using an enzyme containing collagenase or an enzyme containing collagenase and a neutral protease (dispase or thermolysin)), culturing the cells in a medium containing no FBS (fetal bovine serum) in the presence of human platelet lysate (hPL), and obtaining a colony-forming cell population as the stem cell population.
  • the cells may be subcultured (expanded) as necessary.
  • the medium is a serum-free medium.
  • the present invention provides the following [1] to [17].
  • a method for treating a disease requiring tissue regeneration comprising administering to a subject in need thereof a population of (genetically unmodified) stem cells derived from human dental pulp, said population of stem cells being characterized as CD117-negative, CD73-positive, CD90-positive, and CD105-positive (preferably a positivity rate of 90% or more).
  • TGFBI transforming growth factor beta-inducible
  • the stem cell population produces at least 500 ng of TGFBI per 1 x 10 cells per 48 hours.
  • the stem cell population is obtained by culturing cells enzymatically isolated from human dental pulp in a medium free of FBS (fetal bovine serum) in the presence of human platelet lysate (hPL).
  • FBS fetal bovine serum
  • hPL human platelet lysate
  • the present invention provides a highly functional and safe population of dental pulp stem cells. Unlike conventional methods, the stem cell population of the present invention is prepared using a serum-free medium that does not contain xenogeneic components such as FBS, and is obtained as a highly homogeneous cell population without any special separation procedures.
  • FIG. 1 shows the results of surface marker analysis of human dental pulp stem cells according to the present invention.
  • FIG. 1A CD117
  • FIG. 1B CD31
  • FIG. 1C CD34
  • FIG. 1D CD45
  • FIG. 1E CD90
  • FIG. 1F CD105
  • FIG. 1G CD73
  • FIG. 1H CD325,
  • FIG. 1I CD49d
  • FIG. 1J CD51
  • Figure 2 shows a microscopic image of fat cells (lipid droplets) stained with Oil Red, which were induced to differentiate from human dental pulp stem cells.
  • FIG. 3 shows a microscopic image of mineralization staining of osteoblasts induced to differentiate from human dental pulp stem cells.
  • Figure 4 shows a microscopic image stained with Alcian blue of cartilage tissue induced to differentiate from human dental pulp stem cells.
  • Figure 5 shows immunostained images of neurons induced to differentiate from human dental pulp stem cells (from left: isotype control, anti-Nestin, anti- ⁇ III-tubulin, and anti-neurofilament M stained images).
  • FIG. 6 shows the neurite outgrowth effect of the culture supernatant of human dental pulp stem cells.
  • FIG. 7 shows the neural progenitor cell proliferation effect of the culture supernatant of human dental pulp stem cells.
  • FIG. 8 shows the vascular endothelial cell proliferation effect of the culture supernatant of human dental pulp stem cells.
  • FIG. 9 shows the effect of constructing a blood vessel-like structure (tube formation) by the culture supernatant of human dental pulp stem cells.
  • FIG. 10 shows the vascular endothelial cell attracting effect of the culture supernatant of human dental pulp stem cells.
  • FIG. 11 shows the immunosuppressive effect of human dental pulp stem cells (the ability to suppress the proliferation of CD4 positive T cells).
  • FIG. 12 shows the motor function improving effect (A) and nerve regenerating effect (B) of human dental pulp stem cells on chronic spinal cord injury in a rat spinal cord injury model.
  • FIG. 13 shows the motor function improving effect of human dental pulp stem cells on perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy in a neonatal rat hypoxic-ischemic encephalopathy model.
  • FIG. 14 shows the improving effect on femoral blood flow (A) and the improving effect on foot necrosis (B) in an immunodeficient rat severe hind limb ischemia model.
  • Stem cell population derived from human dental pulp The present invention relates to a stem cell population derived from non-genetically modified human dental pulp, which is CD117 negative, CD73 positive, CD90 positive, and CD105 positive (hereinafter also referred to as the "stem cell population of the present invention").
  • the structural and functional characteristics of the stem cell population of the present invention are described below.
  • the stem cell population of the present invention is a genetically unmodified stem cell population derived from human dental pulp.
  • the "dental pulp” may be either the dental pulp of a baby tooth or a permanent tooth, but it is preferably the dental pulp of a baby tooth or an extracted tooth such as a wisdom tooth, because of the ease of obtaining it. It is also preferable to use a tooth within 72 hours after extraction, more preferably within 48 hours after extraction.
  • the stem cell population of the present invention may be autologous cells derived from the dental pulp of the subject to be administered, or allogeneic cells derived from the dental pulp of another person. In terms of preparation time and cost, and stability of cell quality, it is preferable that the stem cell population be allogeneic cells.
  • CD117 is a transmembrane protein that functions as a tyrosine kinase receptor, and is also called c-kit.
  • Conventionally known dental pulp stem cells are either CD117 positive or are a heterogeneous population containing CD117 positive cells and CD117 negative cells, but the stem cell population of the present invention is characterized as CD117 negative.
  • the stem cell population of the present invention is characterized as being positive for mesenchymal stem cell markers CD73, CD90, and CD105.
  • CD325", “CD49d” and “CD51” are cell surface proteins that function as adhesion factors and are also called N-cadherin, integrin ⁇ 4 and integrin ⁇ V, respectively.
  • Conventionally known dental pulp stem cells are either CD325 positive or are heterogeneous populations containing CD325 positive cells and CD325 negative cells, but the stem cell population of the present invention is preferably CD325 negative.
  • conventionally known dental pulp stem cells are heterogeneous populations containing both positive and negative cells for CD51 and CD49d, but the stem cell population of the present invention preferably exhibits a positivity rate of 90%, 95%, 97%, 98% or 99% or more for CD49d and/or CD51.
  • the stem cell population of the present invention is preferably negative for the endothelial cell marker CD31, and also negative for hematopoietic stem cell markers such as CD34 and CD45.
  • the positive marker CD150 for mesenchymal stem cells is 90% or more, preferably 95% or more positive, and the negative markers CD14 and CD19 are negative.
  • the stem cell population of the present invention is preferably negative for HLA-DR, HLA-DQ, CD40, CD80, and CD86, which are involved in immunogenicity.
  • the stem cell population of the present invention is preferably positive for the adhesion factors CD29 (ITGB1), CD44, and CD166 (ALCAM), and negative for CD106 (VCAM).
  • a marker protein or marker gene being "positive” means that the expression level of the protein or gene in a stem cell population is 30% or more, preferably 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, more preferably 90% or more, and in certain cases 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% or more, when detected by a method known in the art.
  • a marker protein or marker gene being "negative” means that the expression level of the protein or gene in a stem cell population is less than 10%, preferably less than 7%, more preferably less than 6% or less than 5%.
  • Detection of marker proteins can be performed by immunological assays using antibodies, such as ELISA, immunostaining, and flow cytometry.
  • the target protein can be detected by expressing a reporter protein together with the protein and detecting the reporter protein.
  • Detection of marker genes can be performed using nucleic acid amplification methods and/or nucleic acid detection methods, such as RT-PCR, microarrays, and biochips.
  • the stem cell population of the present invention produces higher amounts of cytokines useful for tissue regeneration than conventional dental pulp stem cells prepared using a medium containing FBS.
  • the stem cell population of the present invention is characterized by a higher ratio of the amount of cytokines useful for tissue regeneration to inflammatory cytokines produced than conventional dental pulp stem cells.
  • Cytokines useful for tissue regeneration include, for example, SCF (stem cell factor), ANGPTL4 (angiopoietin-like 4), and TGFBI (transforming growth factor beta-induced).
  • SCF stem cell factor
  • ANGPTL4 angiopoietin-like 4
  • TGFBI transforming growth factor beta-induced
  • An example of an inflammatory cytokine is IL-6 (interleukin-6).
  • SCF is a protein produced and secreted by mammalian cells, and is known to be a trophic factor that promotes the proliferation of hematopoietic stem cells in cultured cell experiments. SCF also acts on nerve cells and vascular endothelial cells that express its receptor CD117, and is involved in neuroprotection (Dhandapani et al., J Neurochem. 2005 Oct;95(1):9-19.), neurogenesis (Jin et al., J Clin Invest. 2002 Aug;110(3):311-9; Osada et al., J Neurosurg Spine. 2010 Oct;13(4):516-23), and neurite outgrowth (Hirata et al., J Neurosurg Spine.
  • ANGPTL4 is a protein produced and secreted by mammalian cells, and has been reported to have angiogenic effects (Le Jan et al., Am J Pathol. 2003 May;162(5):1521-8; Hermann et al., Clin Immunol. 2005 Apr;115(1):93-101; Ma et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Aug 10;107(32):14363-8) and anti-inflammatory effects (Cho et al., JCI Insight. 2019 Aug 22;4(16):e125437) in cultured cell and animal experiments. These effects are useful for treating ischemic diseases, inflammatory diseases, autoimmune diseases, and various other diseases that require tissue regeneration.
  • TGFBI is a protein produced and secreted by mammalian cells, and is also known as BIGH3. Cultured cell experiments and animal experiments have reported that TGFBI has angiogenic effects (Aitkenhead et al., Microvasc Res. 2002 Mar;63(2):159-71) and inhibits bone and cartilage degradation (Ruiz et al., Biomaterials. 2020 Jan;226:119544). These effects are thought to be useful in treating ischemic diseases, bone and cartilage diseases, and various other diseases that require tissue regeneration.
  • IL-6 is a protein produced and secreted by mammalian cells, and is known as an inflammatory cytokine that enhances immune responses and tissue inflammation. IL-6 is also a representative factor of a series of inflammatory cytokines called Senescence-Associated Secretion Phenomenon (SASP) produced by aging cells, and is thought to be the cause of chronic inflammation associated with aging (Rolt et al., Biogerontology. 2019 Jun;20(3):359-371, Di et al., PLoS One. 2014 Nov 24;9(11):e113572). For this reason, it is not desirable for cells administered for the purpose of disease treatment to produce a large amount of IL-6.
  • SASP Senescence-Associated Secretion Phenomenon
  • the stem cell population of the present invention can produce SCF at a weight ratio of at least 1/20, preferably at least 1/10, more preferably at a weight ratio of 1/10 to 1/2, and even more preferably at a weight ratio of 1/10 to 1/3, compared to that of IL-6. Also, the stem cell population of the present invention can produce at least 0.1 ng, 0.13 ng, 0.15 ng, preferably 0.17 ng, and more preferably 0.20 ng of SCF per 1 x 106 cells in 48 hours.
  • the produced SCF first binds to the administered cells themselves or other cells and is taken up into those cells, reducing the efficiency of its action on the endogenous cells with which it should bind.
  • the stem cell population of the present invention has a high SCF production capacity and is CD117 negative, and therefore can exert an excellent tissue regeneration effect.
  • the stem cell population of the present invention can produce ANGPTL4 at a weight ratio of 3 times or more, preferably 5 times or more, more preferably 5 to 20 times, and even more preferably 5 to 15 times, as much as IL-6. Furthermore, the stem cell population of the present invention can produce at least 4 ng, 4.5 ng, 5.0 ng, preferably 6.9 ng, and more preferably 7.0 ng of ANGPTL4 per 1 x 106 cells in 48 hours.
  • the stem cell population of the present invention can produce TGFBI at a weight ratio of 400 times or more, preferably 450 times or more, more preferably 450 to 1500 times, and even more preferably 450 to 1000 times, relative to IL-6. Furthermore, the stem cell population of the present invention can produce at least 400 ng, 450 ng, 500 ng, preferably 550 ng, and more preferably 600 ng of TGFBI per 1 x 106 cells in 48 hours.
  • the stem cell population of the present invention has high production capacity of SCF, ANGPTL4, and TGFBI, and a low production rate of IL-6, so there is little risk of inflammatory reactions and it can safely exert a tissue regeneration effect.
  • the stem cell population of the present invention is multipotent, and has the potential to differentiate into at least adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, and nerve cells, as shown in the Examples below.
  • Differentiation into target cells can be induced by culturing the stem cell population of the present invention in the presence of a differentiation-inducing factor appropriate for the target cells, according to a method known in the art.
  • the stem cell population of the present invention produces high levels of cytokines useful for tissue regeneration, and has physiological activities (functions) in vivo or in vitro, such as neural progenitor cell proliferation, neurite extension, vascular endothelial cell proliferation, vascular endothelial cell attraction, blood vessel-like structure construction, and immunosuppressive activity.
  • the stem cell population of the present invention can be produced by enzymatically isolating cells from human dental pulp, culturing the cells in a medium containing no FBS (fetal bovine serum) in the presence of human platelet lysate (hPL), and obtaining a colony-forming cell population as the stem cell population.
  • FBS fetal bovine serum
  • the "dental pulp” used in the present invention may be the dental pulp of either a baby tooth or a permanent tooth, but the dental pulp of an extracted tooth such as a baby tooth or a wisdom tooth is preferred for ease of acquisition. It is desirable to use an extracted tooth within 72 hours, more preferably within 48 hours, after extraction.
  • the collected dental pulp is treated with an enzyme, for example, an enzyme containing collagenase, preferably collagenase and a neutral protease (e.g., dispase or thermolysin), to separate the cells, which are then isolated by centrifugation.
  • an enzyme for example, an enzyme containing collagenase, preferably collagenase and a neutral protease (e.g., dispase or thermolysin), to separate the cells, which are then isolated by centrifugation.
  • the isolated cells are cultured in a medium that does not contain FBS in the presence of human platelet lysate (hPL).
  • Human platelet lysate (hPL) is obtained by dissolving platelets extracted from human blood using a freeze/thaw cycle, and is rich in various growth factors and cytokines necessary for cell culture.
  • the amount of human platelet lysate (hPL) added to the medium or the content in the medium but for primary culture, it is approximately 5-20%, preferably 5-15%, more preferably 7-15%, and most preferably approximately 10%. The same applies for subculture.
  • the term “about” refers to a value that varies by plus or minus 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, or 1%, respectively, from the reference value.
  • the term “about” refers to a range of plus or minus 10%, 5%, or 1%, respectively, from the reference value.
  • serum-free medium refers to a medium that does not contain unconditioned or unpurified serum, and also includes media containing purified blood-derived components or factors (growth factors) derived from animal tissues as long as they do not contradict the purpose of the present invention.
  • serum-free media examples include basic media without added serum, such as ⁇ MEM medium, DMEM medium, BME medium, Eagle MEM medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, F-12 medium, DMEM/F12 medium, IMDM/F12 medium, Ham's medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, or mixtures of these, and commercially available serum-free media for mammalian cells, such as MesenCult-ACF (STEMCELL Technologies), STEMPRO MSC SFM (ThermoFischer Scientific), UltraCULTURE Serum-free (Lonza), etc.
  • basic media without added serum such as ⁇ MEM medium, DMEM medium, BME medium, Eagle MEM medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, F-12 medium,
  • the "culture medium” is preferably animal-free, and more preferably xeno-free.
  • the "culture medium” may contain various nutrients necessary for the maintenance and proliferation of cells and various components necessary for differentiation induction, as appropriate, within the scope of the present invention.
  • the nutrient sources may include carbon sources such as glycerol, glucose, fructose, sucrose, lactose, honey, starch, dextrin, etc., hydrocarbons such as fatty acids, oils and fats, lecithin, alcohols, etc., nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, urea, sodium nitrate, etc., inorganic salts such as table salt, potassium salts, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, sodium molybdate, sodium tungstate, manganese sulfate, various vitamins, amino acids, etc.
  • the pH of the medium obtained by mixing the above ingredients is in the range of 6.0 to 9.0, preferably 6.5 to 8.5, and more preferably 7.0 to 8.0.
  • the container is not particularly limited as long as it is one that is used for cell culture, and examples of containers that can be used include flasks, tissue culture flasks, dishes, Petri dishes, tissue culture dishes, multi-dishes, microplates, microwell plates, multi-plates, multi-well plates, microslides, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • the seeding density of the cells is not particularly limited, but it is preferable that it is not too high.
  • cells extracted from the dental pulp of one deciduous tooth are seeded in an area of 25 to 225 cm2 , preferably 75 to 150 cm2 .
  • the culture is performed at 36°C to 38°C, preferably 36.5°C to 37.5°C, under conditions of 1% to 25% O2 and 1% to 15% CO2 , with medium replacement.
  • Primary culture is preferably carried out until colonies are formed, grow, and detached. Once detachment of the colonies is confirmed, the cells are collected using a filter or the like. The collected cells are obtained as a highly homogeneous stem cell population without the need for special separation procedures.
  • the stem cell population may be further subcultured (expansion cultured) as necessary. Subculture is performed using the same medium as the primary culture. Typically, primary culture cells are cultured for at least 7 days, preferably 9 days or more, more preferably 9 to 15 days to confirm colony formation, growth, and detachment, while cells after passage may be cultured for at least 1 day, preferably 2 days or more, more preferably 2 to 3 days.
  • the seeding density of cells after passage is not particularly limited, but it is preferable that it is not too high. For example, the cells are seeded at a density of 1000 to 2000 cells/ cm2 , preferably 1300 to 1500 cells/ cm2 .
  • the produced stem cell population may be cryopreserved (for example, stored in a deep freezer at -152°C) until use, if necessary. Cryopreservation is performed, for example, by adding an appropriate cryoprotectant to the medium used for the cell culture.
  • cryoprotectants include dextran, DMSO, and commercially available cryopreservation solutions.
  • the culture supernatant of the stem cell population of the present invention is rich in cytokines useful for tissue regeneration, and can be used itself as a pharmaceutical composition for tissue regeneration, etc.
  • the culture supernatant of the stem cell population of the present invention has at least one of the following characteristics 1) to 3): 1)
  • the weight ratio of SCF to IL-6 is 1/20 or more, preferably 1/10 or more, more preferably 1/10 to 1/2, and even more preferably 1/10 to 1/3, 2)
  • ANGPTL4 is contained at a weight ratio of 3 times or more, preferably 5 times or more, more preferably 5 to 20 times, and even more preferably 5 to 15 times that of IL-6;
  • the amount of TGFBI is 400 times or more, preferably 450 times or more, more preferably 450 to 1500 times, and even more preferably 450 to 1000 times, the weight ratio of IL-6 to that of IL-6.
  • the culture supernatant of the present invention can be frozen and stored until clinical use, and can be used to treat various diseases requiring tissue regeneration, similar to the pharmaceutical composition described below.
  • the stem cell population of the present invention produces abundant cytokines useful for tissue regeneration, such as SCF, has a low production rate of inflammatory cytokines, and is CD117 negative, and therefore has excellent tissue regeneration effects and can be used as a pharmaceutical composition.
  • the stem cell population of the present invention can be provided as a cell medicine together with a culture medium or culture supernatant, as necessary.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has at least one of the following characteristics 1) to 3): 1)
  • the weight ratio of SCF to IL-6 is 1/20 or more, preferably 1/10 or more, more preferably 1/10 to 1/2, and even more preferably 1/10 to 1/3, 2)
  • ANGPTL4 is contained at a weight ratio of 3 times or more, preferably 5 times or more, more preferably 5 to 20 times, and even more preferably 5 to 15 times that of IL-6;
  • the amount of TGFBI is 400 times or more, preferably 450 times or more, more preferably 450 to 1500 times, and even more preferably 450 to 1000 times, the weight ratio of IL-6 to that of IL-6.
  • the number of stem cells contained in the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately determined depending on the subject and the target disease. Taking into consideration the timing of administration to the subject and the time required for culture, it is practical to use the minimum amount that shows the effect. In general, the number of cells contained in the pharmaceutical composition is 1x106 or more, preferably 1x107 or more, more preferably 1x108 or more, and even more preferably 1x109 or more.
  • the number of administrations is not limited to one time, and may be two or more times.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably a parenteral preparation, more preferably a parenteral systemic preparation, particularly an intravenous preparation.
  • parenteral preparation preferably a parenteral systemic preparation, particularly an intravenous preparation.
  • dosage forms suitable for parenteral administration include injections such as solution injections, suspension injections, emulsion injections, and injections prepared just before use, as well as grafts.
  • Parenteral preparations are in the form of aqueous or non-aqueous isotonic sterile solutions or suspensions, and are formulated into an appropriate unit dosage form by appropriately combining, for example, pharmacologically acceptable carriers or media, specifically, sterile water, physiological saline, culture media (particularly culture media used for culturing mammalian cells such as RPMI), physiological buffer solutions such as PBS, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, excipients, vehicles, preservatives, binders, etc.
  • pharmacologically acceptable carriers or media specifically, sterile water, physiological saline, culture media (particularly culture media used for culturing mammalian cells such as RPMI), physiological buffer solutions such as PBS, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, excipients, vehicles, preservatives, binders, etc.
  • Diseases to which the pharmaceutical composition of the present invention can be applied are not particularly limited as long as they require tissue regeneration.
  • Examples include spinal cord injury (including traumatic and surgical injuries), ischemic diseases (cerebral infarction, limb ischemia including lower limb ischemia, perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy, ischemic heart disease including myocardial infarction, etc.), inflammatory diseases (sepsis, hepatitis, pancreatitis, nephritis, pneumonia, etc.), autoimmune diseases (rheumatism, SLE, type I diabetes, etc.), and intestinal diseases (irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, Hirschsprung's disease and related syndromes, etc.).
  • the present invention also provides a therapeutic method comprising administering the stem cell population of the present invention or a culture supernatant thereof to a subject in need thereof.
  • the subject to be treated is not particularly limited as long as it requires tissue regeneration, and examples of the subject to be treated include the above-mentioned spinal cord injury, ischemic disease, inflammatory disease, autoimmune disease, and intestinal disease.
  • Dental pulp stem cell bank According to the method of the present invention, a dental pulp-derived stem cell population is prepared from multiple donors and cryopreserved, thereby making it possible to create a dental pulp stem cell bank. As described above, the method for cryopreserving cells can be carried out by a method known in the art.
  • Example 1 Preparation of dental pulp stem cells Dental pulp was scraped from an extracted tooth (human deciduous tooth), cut into pieces, and then Liberase (Roche) was added at a final concentration of 0.05 mg/ml, and the mixture was treated for 15 minutes at 37°C with stirring. The reaction supernatant containing the cells was collected, and 0.05 mg/ml Liberase was added to the remaining dental pulp tissue, and the mixture was treated for 15 minutes at 37°C with stirring. Cells were collected from the treated dental pulp tissue through a 70 mm strainer, and centrifuged together with the previously collected supernatant.
  • Liberase Roche
  • the collected cells were seeded in a culture vessel using MEM ⁇ (Gibco) containing 10% hPL (AventaCell BioMedical), and isolated and cultured for 9 days or more until colonies were formed, grew, and detached. The medium was replaced 2 and 9 days after seeding. Once the colonies were confirmed to have detached, the cells were collected using TrypLE Select (Gibco), and expanded using the same medium.
  • Example 2 Surface marker analysis For the human dental pulp stem cells prepared according to Example 1 from 8 donors, 1x105 cells per donor were reacted with PE-labeled antibodies for various surface markers (CD117 (#313204), CD31 (#303105), CD34 (#343606), CD45 (#368510), CD90 (#328110), CD105 (#323206), CD73 (#344004), CD325 (#350806), CD49d (#304303), CD51 (#327909), all manufactured by Biolegend), and data were obtained using flow cytometry. For the analysis, gating was performed so that the positive rate of the isotype control antibody was around 1%, and the positive rate of various surface markers was calculated.
  • the positivity rate of CD117, CD325, and CD45 was less than 5% in all donor cells, and they were judged as negative (Fig. 1A, 1H, and 1D).
  • the positivity rate of CD73, CD90, CD105, CD49d, and CD51 was more than 96% in all donor cells, and they were judged as positive (Fig. 1G, 1E, 1F, 1I, and 1J).
  • the positivity rate of CD31 and CD34 was less than 7% in 7 out of 8 donor cells, and they were judged as negative. In one donor cell, the positivity rate of CD31 was 15.49%, and in another donor cell, the positivity rate of CD34 was 19.96% (Fig. 1B, 1C).
  • the positivity rate of CD29, CD44, and CD166 was more than 99% in all donors.
  • CD106 was less than 9% positive in 7 of 8 donor cells, and 10.75% positive in 1 donor cell.
  • Example 3 Adipocyte differentiation ability
  • the human dental pulp stem cells were seeded in a 6-well plate at 5.76x105 cells/2.5mL/well using 10% hPL/MEM ⁇ , and cultured until 100% confluency was reached, after which the medium was replaced with adipocyte differentiation medium (MEM ⁇ , 2% FBS, 500 ⁇ M IBMX, 50 ⁇ M indomethacin, 5 ⁇ g/ml insulin, 1 ⁇ M dexamethasone). After differentiation induction for 28 days, the cells were stained using a lipid assay kit (Cosmo Bio, #AK09F) and the lipid droplets were observed under a microscope.
  • adipocyte differentiation medium MEM ⁇ , 2% FBS, 500 ⁇ M IBMX, 50 ⁇ M indomethacin, 5 ⁇ g/ml insulin, 1 ⁇ M dexamethasone
  • Example 4 Osteoblast differentiation ability
  • the human dental pulp stem cells were seeded on a collagen-coated 6 -well plate at 5.76x105 cells/2.5 mL/well using 10% hPL/MEM ⁇ , and cultured until 100% confluency was reached.
  • the medium was then replaced with bone differentiation medium (MEM ⁇ , 5% FBS, 50 ⁇ g L-ascorbic acid 2 phosphate, 10 nM dexamethasone, 10 mM ⁇ -glycerophosphate).
  • the cells were stained using a calcification staining kit (Cosmo Bio, #AK21) and the calcification was observed under a microscope.
  • Example 5 Chondrocyte differentiation ability
  • the human dental pulp stem cells were seeded in a low-adhesive 96 U-bottom plate (Sumitomo Bakelite, SUMS9096U) at 2x10 ⁇ 5 cells/200 ⁇ L/well using 10% hPL/MEM ⁇ . The next day, spheroid formation was confirmed, and the medium was replaced with chondrocyte differentiation medium (PromoCell, #C-28012). After differentiation induction for 21 days, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin blocks, and sliced. The sections were stained with Alcian blue staining solution, and the cartilage tissue images were observed under a microscope.
  • Example 6 Neuronal differentiation ability The human dental pulp stem cells were seeded onto poly-D-lysin/laminin cell ware 8-well culture slids (Corning) at 2.8x103 cells/400 ⁇ l/well using 10% hPL/MEM ⁇ , and after 24 hours, the medium was replaced with N2 medium (Neuobasal-A + N2 supplement serum free, 10 ng/ml human EGF, 10 ng/ml human FGF-basic).
  • the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with anti-BIII-tubulin (clone:TU-20) (Millipore, #MAB1637), anti-Nestin (clone:10C2) (Novus Bio, #NB300-266), and anti-neurofilament M (clone: NN18) (Sigma, #5264) antibodies as primary antibodies for neural differentiation markers, and Alexa Fluor (registered trademark) 488 anti-mouse IgG (H+L) (Jackson immunoresearch) as a secondary antibody, and observed under a fluorescent microscope.
  • anti-BIII-tubulin clone:TU-20
  • anti-Nestin clone:10C2
  • Novus Bio Novus Bio, #NB300-266
  • anti-neurofilament M clone: NN18
  • Alexa Fluor registered trademark
  • 488 anti-mouse IgG H+L
  • Example 7 Cytokine production ability After subculture of the human dental pulp stem cells in 10% hPL/MEM ⁇ or 10% FBS/MEM ⁇ for 7 days, they were seeded in a 6-well plate at 5.76x105 cells/2.5 ml/well using the same medium, and the next day, the medium was replaced with 2.5 ml/well of MEM ⁇ without hPL, FBS, or phenol red. After 48 hours, the culture supernatant was collected, dispensed, and stored at -80°C.
  • the frozen samples were thawed, and the concentrations of SCF, ANGPTL4, TGFBI, and IL-6 in the samples were measured using a Multiplex HGF panel (Biolegend, #740180), a Human ANGPTL4 assay kit (IBL, #27749), a Human beta IG-H3 ELISA (abcam, #ab220651), and a Multiplex Neuroinflammatory panel (Biolegend, #740796), respectively, and the concentration ratios to IL-6 were calculated (Tables 1 and 2). In addition, the production amounts of each factor were calculated per 1x106 cells from the volume of culture supernatant and the number of cells seeded (Tables 3 and 4).
  • the culture supernatant of dental pulp stem cells after subculture in 10% hPL/MEM ⁇ had higher concentration ratios to IL-6 and higher production amounts per 1x106 cells for SCF, ANGPTL4, and TGFBI compared to the culture supernatant of dental pulp stem cells after subculture in 10% FBS/MEM ⁇ .
  • Example 8 Neurite extension effect The human dental pulp stem cells were seeded at a density of 1000 cells/ cm2 using 10% hPL/MEM ⁇ , cultured for 6 days, and then the medium was replaced with MEM ⁇ . After further culturing for 7 days, the culture supernatant was collected. This culture supernatant was added to a Poly-D lysin (PDL)-coated culture plate (Corning) to coat the plate with the components contained in the culture supernatant. IMR-32 cells were seeded on this plate, and differentiation into neurons was induced by adding all trans retinal on days 1 to 4 and days 7 to 8.
  • PDL Poly-D lysin
  • Example 9 Proliferation of neural progenitor cells
  • Human neural progenitor cells (ENStemA, Millipore) were suspended in ENstem expansion medium containing L-glutamine and FGF, and seeded on Corning BioCoat poly-L-ornithine/laminin coated multi-well plates. The next day, the medium was replaced with ENstem expansion medium containing L-glutamine and 20% or 40% of the dental pulp stem cell culture supernatant collected in Example 8 or MEM ⁇ (control), and cultured for another 3 days.
  • CCK-8 was added to the neural progenitor cells, and the number of neural progenitor cells was evaluated by measuring the absorbance at 450 nm after 1 hour.
  • Example 10 Vascular endothelial cell proliferation effect HUVEC (human vascular endothelial cell line) was suspended in Humedia/2% FBS and then seeded in a 96-well plate. The next day, the dental pulp stem cell culture supernatant collected in Example 8 was mixed with MEM ⁇ at various ratios, and FBS was added to a final concentration of 2%. An equal amount of the mixture was added on top of the Humedia/2% FBS in the well and cultured for 3 days. CCK-8 was added to HUVEC, and the mixture was reacted at 37°C for 4 hours, and the number of HUVEC cells was evaluated by measuring OD450.
  • HUVEC human vascular endothelial cell line
  • Example 11 Vascular-like structure construction effect Dental pulp stem cell culture supernatant recovered in Example 8 or HUVEC suspended in MEM ⁇ were seeded at a density of 1x105 cells/ cm2 into extracellular matrix gel prepared in a 96-well plate and cultured for 20 hours. The wells were photographed in bright field, and the branching interval (distance between branches) was measured by image analysis using Angiogenesis Analyzer for ImageJ to investigate the tube formation (vascular-like structure construction) effect.
  • Example 12 Vascular endothelial cell attraction effect After seeding HUVECs in the upper layer of a transwell, the lower layer was filled with dental pulp stem cell culture supernatant or MEM ⁇ recovered in Example 8 and cultured for 24 hours. HUVECs that had migrated to the back side of the upper layer (lower layer side) were detached with trypsin, and the cell number was measured as luminescence intensity using CellTiterGlo (Promega) to evaluate the attraction of HUVECs to the lower layer.
  • Example 13 Immunosuppressive effect
  • the human dental pulp stem cells were mixed with CFSE-labeled human PBMCs (peripheral blood mononuclear cells), and then anti-CD3 and anti-CD28 antibodies (final concentrations of 0.1 ⁇ g/ml each) were added to stimulate the PBMCs for 6 days.
  • Example 14 Effect on spinal cord injury A spinal cord injury model was created by dropping a weight (2.5 mm in diameter, 10 g) from a height of 50 mm onto the spinal cord between the 9th and 10th thoracic vertebrae of anesthetized rats using a MASCIS Impactor (Rutgers University, USA). 7, 9, 11, and 13 weeks after model creation, the vehicle or the human dental pulp stem cells of the present invention were administered intravenously at 1x10 6 cells and intraspinal cavity at 5x10 5 cells, and the motor function recovery and nerve regeneration effects on chronic spinal cord injury were examined. Specifically, the motor function of the hind limbs was evaluated over time using the BBB (Basso-Beattie-Bresnahan) test.
  • BBB Basso-Beattie-Bresnahan
  • the rats were perfusion-fixed using 4% paraformaldehyde, and the spinal cord including the injured area was collected and coronal frozen sections were prepared using OCT compound.
  • the sections were stained with H&E or Luxol Fast Blue (LFB), and the stained areas were quantified by image analysis using Image J to evaluate nerve regeneration.
  • Cyclosporine was administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg every other day starting one day before the first administration.
  • Example 15 Effect on perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy
  • a neonatal rat hypoxic-ischemic encephalopathy model was prepared by ligating the left carotid artery of 7-day-old rats under anesthesia, leaving them for 1-2 hours, and then placing them in a hypoxic (8% O 2 ) environment for 1 hour.
  • the vehicle or the human dental pulp stem cells of the present invention were administered intravenously at 1x10 5 cells to examine the effect of improving motor function against perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy.
  • a rotarod test was performed 41 days after administration, and the motor coordination and endurance of the limbs were evaluated by measuring the latency to fall from the rod.
  • Example 16 Effect on severe limb ischemia
  • a severe limb ischemia model was prepared by ligating and cutting the right common iliac artery and femoral artery and vein of immunodeficient rats. The following day, the animals were divided into groups based on the degree of reduction in blood flow compared to the normal limb, and the human dental pulp stem cells ( 2x106 cells/head) were administered into the ischemic limb muscle to examine the effect on severe limb ischemia.
  • the blood flow improvement effect due to angiogenesis was evaluated by the blood flow compared to the normal limb.
  • the improvement effect on foot necrosis was evaluated by visually observing the presence or absence of necrosis up to the heel for each individual on Day 7 (4 cases per group) and Day 14 (6 cases per group) after model preparation.
  • the vehicle-administered group showed a sustained decrease in blood flow over the 14 days after ischemia, whereas the cell-administered group showed a remarkable recovery in blood flow day by day ( Figure 14A). Furthermore, the cell-administered group showed a high rate of avoidance of foot necrosis over the 14 days, with a statistically significant difference from the vehicle-administered group ( Figure 14B). Based on the above, it is believed that this human dental pulp stem cell can restore blood flow through angiogenesis when administered via a clinically feasible route and at a time suitable for severe limb ischemia, thereby preventing foot amputation due to foot necrosis.
  • the dental pulp stem cells of the present invention have multi-differentiation potential, neural progenitor cell proliferation, neurite extension, vascular endothelial cell proliferation, vascular endothelial cell attraction, blood vessel-like structure construction, and immunosuppressive properties, and are useful for treating spinal cord injury, ischemic disease, inflammatory disease, neurodegenerative disease, etc.

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Abstract

本発明は、ヒト歯髄由来の幹細胞集団及びその培養上清、前記幹細胞集団を含む医薬組成物、ならびにその製造方法に関する。より詳細には、ヒト歯髄由来の幹細胞集団であって、CD117陰性、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105陽性で特徴づけられる幹細胞集団、及び、ヒト歯髄から単離した細胞をヒト血小板溶解物(hPL)の存在下で、FBS（ウシ胎児血清）を含まない培地で培養する工程を含む、ヒト歯髄由来の幹細胞集団の製造方法に関する。

Description

新規な歯髄幹細胞集団
　本発明は、ヒト歯髄由来の幹細胞集団及びその培養上清、前記幹細胞集団を含む医薬組成物、ならびにその製造方法に関する。
　ヒト歯髄由来の幹細胞（歯髄幹細胞）は、動物モデルを用いた実験で、脊髄損傷、脳性麻痺（周産期低酸素性虚血性脳症）、下肢虚血などに対する治療効果が報告されている。しかし、これまでの報告では、細胞は脊髄損傷の直後に脊髄に直接投与したり（非特許文献1）、脳性麻痺モデルにおいて脳損傷の数時間後に脳に直接投与されており（非特許文献2）、臨床応用を考えた場合、現実的な投与方法ではない。別の脳性麻痺モデルでは、脳損傷24時間後に細胞を静脈内投与しているが、5カ月以上後で運動機能の改善を認めており（非特許文献3）、より早期に効果が得られる治療方法が望まれる。下肢虚血についても、中等度の症状のモデル動物に対して、血管結紮の直後（非特許文献4）又は数時間後（非特許文献5）に投与した結果であり、幹細胞療法の主たる対象である重症下肢虚血の治療とは乖離がある。
　歯髄組織から歯髄幹細胞を単離する方法としては、従来、ウシ胎児血清（FBS）が用いられている（非特許文献1～6）。しかし、投与製剤に異種血清成分が残留する可能性を完全には否定できないため、臨床応用を考えた場合、FBSの使用は好ましくない。患者自身の歯髄組織から単離した細胞を使用する場合には、当該患者の自己血清を用いて細胞を調製することも考えられるが、患者の負担に加えて、オーダーメードによる時間と費用の増大が問題になる。歯髄幹細胞による治療をより多くの患者に利用可能なものにするためには、同種細胞を大量製造し、オフザシェルフで治療に供することが求められる。
　FBSを用いた従来法で単離された歯髄幹細胞については、その細胞特性が解析されており、例えばCD117（c-kit）陽性細胞を50%以上、もしくは96.2%含むといった特性が報告されている（特許文献1、非特許文献7）。なかにはCD117陽性細胞を分離し、その特性として多分化能を報告している先行研究もある（非特許文献8）。歯髄幹細胞に関しては、他にも、CD325（N-カドヘリン）陽性であること（非特許文献9）、CD51（インテグリンαV）とCD49d（インテグリンα4）については陽性細胞と陰性細胞の両方が存在することが報告されている（非特許文献10、11）。
　ヒト歯髄組織をトリプシン処理した後、その組織ごと、ヒト血小板溶解物（human Platelet Lysate: hPL）を含む無血清培地で培養することにより多能性幹細胞を取得する報告もあるが、取得された細胞集団は造血幹細胞マーカーであるCD34及びCD45が共に陽性であることから、ヘテロジニアスな細胞集団と考えられる（非特許文献12）。
WO2014/141210A2（JP6491606B）
Sakai et al., J Clin Invest. 2012 Jan;122(1):80-90. doi: 10.1172/JCI59251. Yamagata et al., Stroke. 2013 Feb;44(2):551-4. doi: 10.1161/STROKEAHA.112.676759. Kitase et al., Stem Cells Dev. 2020 Jan 15;29(2):63-74. doi: 10.1089/scd.2019.0221. PMID: 31801412. Yong et al., Tissue Eng Regen Med. 2022 Aug;19(4):861-870. doi: 10.1007/s13770-022-00452-6. Li et al., Stem Cells Int. 2021 Aug 31;2021:5585255. doi: 10.1155/2021/5585255. Miura et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 May 13;100(10):5807-12. doi: 10.1073/pnas.0937635100. Suchanek et al,. Acta Medica (Hradec Kralove). 2010;53(2):93-9. doi: 10.14712/18059694.2016.66. Carnevale et al., J Tissue Eng Regen Med. 2018 Feb;12(2):e774-e785. doi: 10.1002/term.2378. Takahashi et al., Arch Oral Biol. 2012 Jan;57(1):44-51. doi: 10.1016/j.archoralbio.2011.07.013. Lee et al., Stem Cell Res Ther. 2020 Jun 3;11(1):210. doi: 10.1186/s13287-020-01714-7. Hata et al., Stem Cell Res Ther. 2015 Sep 7;6(1):162. doi: 10.1186/s13287-015-0156-4. Pilbauerova et al., Biomolecules. 2022 Aug 8;12(8):1091. Doi: 10.3390/biom12081091.
　本発明の課題は、臨床応用に適した、安全で高機能な幹細胞、及びその製造方法を提供することにある。
　発明者らは、歯髄から単離した細胞を、ヒト血小板溶解物（hPL）を含む培地で培養して得られる幹細胞集団は、従来報告されている歯髄幹細胞とは異なる構造的特徴（表面マーカー発現）を有することを見出した。さらに、この方法で得られる幹細胞集団は、FBSを使用した従来の方法で得られる歯髄幹細胞に比べて、組織再生に有用なサイトカインの産生量が高く、優れた組織再生能を発揮しうることを見出した。
　本発明は、上記の知見に基づくものであり、第１の形態において、以下の［１］～［２９］を提供する。
［１］　ヒト歯髄由来の（遺伝子改変されていない）幹細胞集団であって、CD117陰性、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105陽性（好ましくは90％以上の陽性率）で特徴づけられる、幹細胞集団。
［２］　前記幹細胞集団が、CD325陰性であるか、あるいはCD49d及び／又はCD51が90％、95%、97%、98%又は99%以上の陽性率の陽性率である、請求項１に記載の幹細胞集団。
［３］　前記幹細胞集団がCD31陰性である、［１］又は［２］に記載の幹細胞集団。
［４］　前記幹細胞集団がCD34陰性、かつCD45陰性である、［１］～［３］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［５］　前記幹細胞集団が、SCF（幹細胞因子）をIL-6の20分の1以上、好ましくは10分の1以上の重量比で産生する、［１］～［４］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［６］　前記幹細胞集団が、SCF（幹細胞因子）をIL-6の10分の1～2分の1、好ましくは10分の1～3分の1の重量比で産生する、［１］～［５］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［７］　前記幹細胞集団が、1×106細胞あたり48時間で少なくとも、0.1ng、0.13ng、0.15ng、好ましくは0.17ng、より好ましくは0.20ngのSCFを産生する、［１］～［７］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［８］　前記幹細胞集団が、ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の3倍以上、好ましくは5倍以上の重量比で産生する、［１］～［７］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［９］　前記幹細胞集団が、ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の5倍～20倍、好ましくは5倍～15倍の重量比で産生する、［１］～［８］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［１０］　前記幹細胞集団が、1×106細胞あたり48時間で少なくとも、4.0ng、4.5ng、5.0ng、好ましくは6.9ng、より好ましくは7.0ngのANGPTL4を産生する、［１］～［９］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［１１］　前記幹細胞集団が、TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の400倍以上、好ましくは450倍以上の重量比で産生する、［１］～［１０］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［１２］　前記幹細胞集団が、TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の450倍～1500倍、好ましくは450倍～1000倍の重量比で産生する、［１］～［１１］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［１３］　前記幹細胞集団が、1×106細胞あたり48時間で少なくとも、400ng、450ng、500ng、好ましくは550ng、より好ましくは600ngのTGFBIを産生する、［１］～［１２］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［１４］　前記幹細胞集団が、ヒト歯髄から酵素的に（例えば、コラゲナーゼを含む酵素、コラゲナーゼと中性プロテアーゼ（ディスパーゼ又はサーモリシン）とを含む酵素を用いて）単離した細胞を、ヒト血小板溶解物(hPL)の存在下で、FBS（ウシ胎児血清）を含まない培地で培養することにより取得されたものである、［１］～［１３］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［１５］　前記培地が無血清培地である、［１４］に記載の幹細胞集団。
［１６］　［１］～［１５］のいずれかに記載の幹細胞集団の培養上清であって、下記1)～3)の少なくとも1つの特性を有する培養上清：
1)SCF（幹細胞因子）をIL-6の20分の1以上、好ましくは10分の1以上の重量比で含む、
2)ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の3倍以上、好ましくは5倍以上の重量比で含む、
3)TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の400倍以上、好ましくは450倍以上の重量比で含む。
［１７］　［１］～［１５］のいずれかに記載の幹細胞集団の培養上清であって、下記1)～3)の少なくとも1つの特性を有する培養上清：
1)SCF（幹細胞因子）をIL-6の10分の1～2分の1、好ましくは10分の1～3分の1の重量比で含む、
2)ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の5倍～20倍、好ましくは5倍～15倍の重量比で含む、
3)TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の450倍～1500倍、好ましくは450倍～1000倍の重量比で含む。
［１８］　［１］～［１６］のいずれかに記載の幹細胞集団又は前記幹細胞集団の培養上清を含み、下記1)～3)の少なくとも1つの特性を有する医薬組成物：
1)SCF（幹細胞因子）をIL-6の20分の1以上、好ましくは10分の1以上の重量比で含む、
2)ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の3倍以上、好ましくは5倍以上の重量比で含む、
3)TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の400倍以上、好ましくは450倍以上の重量比で含む。
［１９］　［１］～［１５］のいずれかに記載の幹細胞集団又は前記幹細胞集団の培養上清を含み、下記1)～3)の少なくとも1つの特性を有する医薬組成物：
1)SCF（幹細胞因子）をIL-6の10分の1～2分の1、好ましくは10分の1～3分の1の重量比で含む、
2)ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の5倍～20倍、好ましくは5倍～15倍の重量比で含む、
3)TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の450倍～1500倍、好ましくは450倍～1000倍の重量比で含む。
［２０］　脊髄損傷、虚血性疾患（脳梗塞、下肢虚血等）、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、末梢神経疾患、腸管疾患、及び骨疾患から選ばれるいずれかの疾患を治療又は予防するためのものである、［１８］又は［１９］に記載の医薬組成物。
［２１］　ヒト歯髄由来の幹細胞集団の製造方法であって、
　ヒト歯髄から酵素的に（例えば、コラゲナーゼを含む酵素、コラゲナーゼと中性プロテアーゼ（ディスパーゼ又はサーモリシン）とを含む酵素を用いて）細胞を単離する工程、前記細胞をヒト血小板溶解物(hPL)の存在下で、FBS（ウシ胎児血清）を含まない培地で培養する工程、コロニー形成する細胞集団を前記幹細胞集団として取得する工程、とを含む、前記方法。前記方法において、細胞は必要に応じて継代培養（拡大培養）を行ってもよい。
［２２］　前記培地が無血清培地である、［２１］に記載の方法。
［２３］　培地がanimal-free、好ましくはxeno-freeである、［２１］又は［２２］に記載の方法。
［２４］　得られる歯髄幹細胞集団がCD117陰性である、［２１］～［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］　得られる歯髄幹細胞集団が、さらに、［１］～［１３］のいずれかに記載の幹細胞集団の特性を有する、［２１］～［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］　前記ヒト歯髄が、乳歯又は永久歯の歯髄、好ましくは乳歯の歯髄、より好ましくは抜歯後48時間以内の乳歯の歯髄である、［２０］～［２４］に記載の方法。
［２７］　前記ヒト歯髄が、乳歯又は永久歯の歯髄、好ましくは乳歯の歯髄、より好ましくは抜歯後48時間以内の乳歯の歯髄である、［１］～［１５］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［２８］　前記幹細胞集団が、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、及び神経細胞に分化する能力を有する、［１］～［１５］のいずれかに記載の幹細胞集団。
［２９］　神経前駆細胞増殖作用、神経突起伸展作用、血管内皮細胞増殖作用、血管内皮細胞誘引作用、血管様構造体構築作用、及び免疫抑制作用から選ばれる少なくとも１つの作用を有する、［１］～［１５］のいずれかに記載の幹細胞集団、［１６］又は［１７］に記載の培養上清、又は［１８］～［２０］のいずれかに記載の医薬組成物。
　本発明は、第２の形態において、以下の［１］～［１７］を提供する。
［１］　組織再生を必要とする疾患の治療方法であって、必要とする対象に、ヒト歯髄由来の（遺伝子改変されていない）幹細胞集団を投与することを含み、前記幹細胞集団が、CD117陰性、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105陽性（好ましくは90％以上の陽性率）で特徴づけられる、前記方法。
［２］　前記幹細胞集団が、CD325陰性であるか、あるいはCD49d及び／又はCD51が90％以上の陽性率である、請求項１に記載の幹細胞集団。
［３］　前記幹細胞集団がCD31陰性である、［１］に記載の方法。
［４］　前記幹細胞集団がCD34陰性、かつCD45陰性である、［１］に記載の方法。
［５］　前記幹細胞集団が、SCF（幹細胞因子）をIL-6の10分の1以上の重量比で産生する、［１］に記載の方法。
［６］　前記幹細胞集団が、SCF（幹細胞因子）をIL-6の10分の1～3分の1の重量比で産生する、［１］に記載の方法。
［７］　前記幹細胞集団が、1×106細胞あたり48時間で少なくとも、0.1ngのSCFを産生する、［１］に記載の方法。
［８］　前記幹細胞集団が、ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の5倍以上の重量比で産生する、［１］に記載の方法。
［９］　前記幹細胞集団が、ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の5倍～15倍の重量比で産生する、［１］に記載の方法。
［１０］　前記幹細胞集団が、1×106細胞あたり48時間で少なくとも5ngのANGPTL4を産生する、［１］に記載の方法。
［１１］　前記幹細胞集団が、TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の450倍以上の重量比で産生する、［１］に記載の方法。
［１２］　前記幹細胞集団が、TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の450倍～1000倍の重量比で産生する、［１］に記載の方法。
［１３］　前記幹細胞集団が、1×106細胞あたり48時間で少なくとも、500ngのTGFBIを産生する、［１］に記載の方法。
［１４］　前記幹細胞集団が、ヒト歯髄から酵素的に単離した細胞を、ヒト血小板溶解物(hPL)の存在下で、FBS（ウシ胎児血清）を含まない培地で培養することにより取得されたものである、［１］に記載の方法。
［１５］　前記培地が無血清培地である、［１４］に記載の方法。
［１６］　前記培地がanimal-free、好ましくはxeno-freeである、［１４］に記載の方法。
［１７］　組織再生を必要とする疾患が、脊髄損傷、虚血性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、腸管疾患から選ばれるいずれかである、［１］に記載の方法。
　本発明によれば、高機能で安全な歯髄幹細胞集団が提供される。本発明の幹細胞集団は、従来法とは異なり、FBSなどの異種成分を含まない無血清培地を用いて調製され、特別な分離手段なしに、均一性の高い細胞集団として取得される。
図1は、本発明にかかるヒト歯髄幹細胞の表面マーカー解析結果を示す。図1A:CD117、図1B:CD31、図1C:CD34、図1D:CD45、図1E:CD90、図1F:CD105、図1G:CD73、図1H:CD325、図1I:CD49d、図1J:CD51 図2は、ヒト歯髄幹細胞から分化誘導した脂肪細胞（脂肪滴）のオイルレッド染色による顕微鏡画像を示す。 図3は、ヒト歯髄幹細胞から分化誘導した骨芽細胞の石灰化染色による顕微鏡画像を示す。 図4は、ヒト歯髄幹細胞から分化誘導した軟骨組織のAlcian blue染色による顕微鏡画像を示す。 図5は、ヒト歯髄幹細胞から分化誘導した神経細胞の免疫染色像を示す（左より、isotype control、anti-Nestin、anti-βIII-tubulin、anti-neurofilament Mの染色像）。 図6は、ヒト歯髄幹細胞の培養上清による神経突起伸展作用を示す。 図7は、ヒト歯髄幹細胞の培養上清による神経前駆細胞増殖作用を示す。 図8は、ヒト歯髄幹細胞の培養上清による血管内皮細胞増殖作用を示す。 図9は、ヒト歯髄幹細胞の培養上清による血管様構造体構築作用（チューブフォーメーション）を示す。 図10は、ヒト歯髄幹細胞の培養上清による血管内皮細胞誘引作用を示す。 図11は、ヒト歯髄幹細胞による免疫抑制効果（CD4陽性T細胞の増殖抑制能）を示す。 図12は、ラット脊髄損傷モデルにおける、ヒト歯髄幹細胞による慢性期脊髄損傷に対する運動機能改善効果（A）、及び神経再生効果（B）を示す。 図13は、新生仔ラット低酸素性虚血性脳症モデルにおける、ヒト歯髄幹細胞による周産期低酸素性虚血性脳症に対する運動機能改善効果を示す。 図14は、免疫不全ラット重症下肢虚血モデルにおける、大腿部血流量の改善効果（A）、及び足部壊死に対する改善効果（B）を示す。
１．ヒト歯髄由来の幹細胞集団
　本発明は、CD117陰性、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105陽性である、遺伝子改変されていないヒト歯髄由来の幹細胞集団（以下「本発明の幹細胞集団」とも記載する）に関する。以下、本発明の幹細胞集団の構造的又は機能的特性について記載する。
１．１　由来
　本発明の幹細胞集団は、ヒト歯髄に由来する遺伝子改変されていない幹細胞集団である。「歯髄」は、乳歯又は永久歯のいずれの歯髄であってもよいが、取得の容易性等から、乳歯や親知らずなどの抜去歯が好ましい。また、抜歯後72時間以内、より好ましくは抜歯後48時間以内の歯を使用することが望ましい。
　本発明の幹細胞集団は、投与される対象の歯髄に由来する自家細胞であっても、他者の歯髄に由来する同種他家細胞でもよい。好ましくは、準備の時間や費用、細胞の品質の安定性という点では、幹細胞集団は他家細胞であることが望ましい。
１．２　マーカー
　「CD117」は、チロシンキナーゼ受容体として機能する膜貫通型タンパク質であり、c-kitとも呼ばれる。従来公知の歯髄幹細胞はCD117陽性であるか、あるいはCD117陽性細胞とCD117陰性細胞を含むヘテロな集団であるが、本発明の幹細胞集団はCD117陰性で特徴付けられる。また、本発明の幹細胞集団は、間葉系幹細胞マーカーであるCD73、CD90、及びCD105について陽性であることで特徴付けられる。
　「CD325」、「CD49d」及び「CD51」は接着因子として機能する細胞表面タンパク質であり、それぞれN-カドヘリン、インテグリンα4、およびインテグリンαVとも呼ばれる。従来公知の歯髄幹細胞はCD325陽性であるか、CD325陽性細胞とCD325陰性細胞を含むヘテロな集団であるが、本発明の幹細胞集団はCD325陰性であることが好ましい。また、従来公知の歯髄幹細胞は、CD51及びCD49dについては、陽性細胞と陰性細胞の両方を含むヘテロな集団であるが、本発明の幹細胞集団は、CD49d及び／又はCD51が、90％、95%、97%、98%又は99%以上の陽性率を示すことが好ましい。
　本発明の幹細胞集団は、内皮細胞マーカーであるCD31について陰性であり、CD34、CD45陰性などの造血幹細胞マーカーについても陰性であることが好ましい。また、間葉系幹細胞の陽性マーカーであるCD150は90％以上、好ましくは95%以上の陽性率であり、陰性マーカーであるCD14、CD19は陰性であることが好ましい。
　本発明の幹細胞集団は、免疫原性に関わるHLA-DR、HLA-DQ、CD40、CD80、CD86が陰性であることが好ましい。
　本発明の幹細胞集団は、接着因子であるCD29（ITGB1）、CD44、CD166（ALCAM）が陽性であり、CD106（VCAM）が陰性であることが好ましい。
　なお、本明細書中において、マーカータンパク質又はマーカー遺伝子が「陽性」であるとは、当該分野で公知の手法で検出したとき、幹細胞集団における当該タンパク質又は遺伝子の発現量が30％以上、好ましくは40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、より好ましくは90％以上、特定の場合には91％、92％、93％、94％、95％、96以上であることを意味する。マーカータンパク質又はマーカー遺伝子が「陰性」であるとは、幹細胞集団における当該タンパク質又は遺伝子の発現量が10％未満、好ましくは7％未満、より好ましくは6％未満、5％未満であることを意味する。
　マーカータンパク質の検出は、ELISA、免疫染色、フローサイトメトリーなどの抗体を用いた免疫学的アッセイにより実施できる。細胞内に発現し、細胞表面には現れないタンパク質の場合は、当該タンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするタンパク質を検出できる。マーカー遺伝子の検出は、RT-PCR、マイクロアレイ、バイオチップなどの核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法を用いて実施できる。
１．３　サイトカイン産生
　本発明の幹細胞集団は、FBSを含む培地を用いて調製される従来の歯髄幹細胞に比較して、組織再生に有用なサイトカインの産生量が高い。とくに、本発明の幹細胞集団は、従来の歯髄幹細胞に比較して、炎症性サイトカインに対する、組織再生に有用なサイトカインの産生量の比率が高いという特徴を有する。
　組織再生に有用なサイトカインとしては、例えば、SCF（幹細胞因子）、ANGPTL4（アンジオポエチン様4）、TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）を挙げることができる。炎症性サイトカインとしては、例えば、IL-6（インターロイキン-6）を挙げることができる。
　「SCF」は、哺乳動物の細胞で生成、分泌されるタンパク質で、培養細胞実験において、造血幹細胞を増殖させる栄養因子として知られている。またSCFは、その受容体であるCD117を発現する神経細胞や血管内皮細胞に作用することで、神経保護（Dhandapani et al., J Neurochem. 2005 Oct;95(1):9-19.）、神経新生（Jin et al., J Clin Invest. 2002 Aug;110(3):311-9、Osada et al., J Neurosurg Spine. 2010 Oct;13(4):516-23）、神経突起伸長（Hirata et al., Development. 1993 Sep;119(1):49-56）、血管新生（Matsui et al., J Biol Chem. 2004 Apr 30;279(18):18600-7、Sun L., Cancer Cell. 2006 Apr;9(4):287-300、Kim et al., Cardiovasc Res. 2011 Oct 1;92(1):132-40）を促進することが、培養細胞実験や動物実験で報告されている。これらの作用は、神経疾患や虚血性疾患のみならず、腸管疾患や骨疾患など、組織再生を必要とする各種疾患治療に有用である。
　「ANGPTL4」は、哺乳動物の細胞で生成、分泌されるタンパク質で、血管新生作用（Le Jan et al., Am J Pathol. 2003 May;162(5):1521-8、Hermann et al., Clin Immunol. 2005 Apr;115(1):93-101、Ma et al.,  Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Aug 10;107(32):14363-8）、抗炎症作用（Cho et al., JCI Insight. 2019 Aug 22;4(16):e125437）を有することが、培養細胞実験や動物実験で報告されている。これらの作用は、虚血性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患の他、組織再生を必要とする各種疾患治療に有用である。
　「TGFBI」は、哺乳動物の細胞で生成、分泌されるタンパク質で、BIGH3とも呼ばれる。TGFBIは血管新生作用（Aitkenhead et al.,  Microvasc Res. 2002 Mar;63(2):159-71）、骨・軟骨分解抑制作用（Ruiz et al.,  Biomaterials. 2020 Jan;226:119544）を有することが、培養細胞実験や動物実験で報告されている。これらの作用は、虚血性疾患、骨・軟骨疾患の他、組織再生を必要とする各種疾患治療に有用と考えられる。
　「IL-6」は、哺乳動物の細胞で生成、分泌されるタンパク質で、免疫反応及び組織炎症を増大させる炎症性サイトカインとして知られている。またIL-6は、老化した細胞が産生するSASP（細胞老化随伴分泌現象）と呼ばれる一連の炎症性サイトカイン群の代表因子であり、老化に伴う慢性炎症の原因と考えられている（Rolt et al., Biogerontology. 2019 Jun;20(3):359-371、Di et al., PLoS One. 2014 Nov 24;9(11):e113572）。このことから、疾患治療を目的として投与される細胞がIL-6を多く産生することは好ましくない。
　具体的には、本発明の幹細胞集団は、SCFをIL-6の20分の1以上、好ましくは10分の1以上の重量比、より好ましくは10分の1～2分の1の重量比、さらに好ましくは10分の1～3分の1の重量比で産生しうる。また、本発明の幹細胞集団は、1×106細胞あたり48時間で少なくとも、0.1ng、0.13ng、0.15ng、好ましくは0.17ng、より好ましくは0.20ngのSCFを産生しうる。
　従来公知の歯髄幹細胞のように、投与細胞自体がCD117陽性である場合、産生されたSCFはまず初めに自己もしくは他の投与細胞に結合し、その細胞内に取り込まれてしまうため、本来結合すべき内在性の細胞に対する作用効率が低下してしまう。本発明の幹細胞集団は、SCFの産生能が高く、かつCD117陰性であるため、優れた組織再生効果を発揮しうる。
　本発明の幹細胞集団は、ANGPTL4をIL-6の3倍以上、好ましくは5倍以上の重量比、より好ましくは5倍～20倍の重量比、さらに好ましくは5倍～15倍の重量比で産生しうる。また、本発明の幹細胞集団は、1×106細胞あたり48時間で少なくとも4ng、4.5ng、5.0ng、好ましくは6.9ng、より好ましくは7.0ngのANGPTL4を産生しうる。
　本発明の幹細胞集団は、TGFBIをIL-6の400倍以上、好ましくは450倍以上の重量比、より好ましくは450倍～1500倍の重量比、さらに好ましくは450倍～1000倍の重量比で産生しうる。また、本発明の幹細胞集団は、1×106細胞あたり48時間で少なくとも、400ng、450ng、500ng、好ましくは550ng、より好ましくは600ngのTGFBIを産生しうる。
　本発明の幹細胞集団は、SCF、ANGPTL4、TGFBIの産生能が高く、IL-6の産生比率が低いため、炎症反応のリスクが少なく、安全に組織再生効果を発揮しうる。
１．４　分化能
　本発明の幹細胞集団は分化多能性（multipotent）であり、後述する実施例に示すとおり、少なくとも、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、及び神経細胞に分化する能力を有する。目的細胞への分化誘導は、当該分野で公知の方法にしたがい、本発明の幹細胞集団を目的細胞に応じた分化誘導因子の存在下で培養すればよい。
１．５　生理活性
　本発明の幹細胞集団は、組織再生に有用なサイトカインを高レベルで産生し、生体内又は生体外において、神経前駆細胞増殖作用、神経突起伸展作用、血管内皮細胞増殖作用、血管内皮細胞誘引作用、血管様構造体構築作用、免疫抑制作用などの生理活性（機能）を有する。
２．本発明の幹細胞集団の製造方法
　本発明の幹細胞集団は、ヒト歯髄から酵素的に細胞を単離し、前記細胞をヒト血小板溶解物(hPL)の存在下で、FBS（ウシ胎児血清）を含まない培地で培養し、コロニー形成する細胞集団を前記幹細胞集団として取得することにより、製造することができる。
　本発明で使用する「歯髄」は、乳歯又は永久歯のいずれの歯髄であってもよいが、取得の容易性からは、乳歯や親知らずなどの抜去歯の歯髄が好ましい。抜去歯は、抜歯後72時間以内、より好ましくは48時間以内の歯を使用することが望ましい。採取された歯髄は、酵素、例えば、コラゲナーゼを含む酵素、好ましくは、コラゲナーゼと中性プロテアーゼ（例えば、ディスパーゼ又はサーモリシン）で処理して細胞を分離し、遠心分離して単離する。
　単離された細胞は、ヒト血小板溶解物(hPL)の存在下で、FBSを含まない培地で培養する。「ヒト血小板溶解物(hPL)」とは、ヒト血液から抽出した血小板を、freeze/thawサイクルにより溶解させて得られるもので、細胞培養に必要な各種の増殖因子やサイトカインが豊富に含まれている。ヒト血小板溶解物(hPL)の培地への添加量または培地中の含有量は特に限定されないが、初代培養の際は、約5～20％、好ましくは5～15％、より好ましくは7～15％、最も好ましくは約10％である。継代培養の際も同じである。
　なお、本明細書において、「約」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%まで変動する値を示す。好ましくは、「約」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ10%、5%、又は1%の範囲を示す。
　本発明で使用される「培地」は、FBSを含まなければ特に限定されないが、無血清培地を使用することが好ましい。本明細書において「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地であり、精製された血液由来成分や動物組織由来の因子（増殖因子）が混入している培地も、本発明の目的に反しない限り無血清培地に含まれる。無血清培地としては、例えば、血清を添加していない基本培地：例えば、αMEM培地、DMEM培地、BME培地、Eagle MEM培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、又はこれらの混合培地、市販の哺乳動物細胞用の無血清培地：例えば、MesenCult-ACF (STEMCELL Technologies)、STEMPRO MSC SFM (ThermoFischer Scientific)、UltraCULTURE Serum-free (Lonza)等を挙げることができる。
　「培地」は、臨床使用のためには、animal-freeであることが好ましく、xeno-freeであることがより好ましい。
　「培地」は、本発明の目的を損なわない範囲で、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を適宜添加してもよい。例えば、栄養源としては、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等の無機塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム及び硫酸マンガン、各種ビタミン類、アミノ酸類等を含むことができる。
　上記の成分を配合して得られる培地のpHは6.0～9.0、好ましくは6.5～8.5、より好ましくは7.0～8.0の範囲である。
　歯髄から単離した細胞、及び本発明の幹細胞集団は付着培養される。容器は、細胞培養に使用されるものであれば特に限定されず、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルを使用することができる。
　細胞の播種密度は特に限定されないが、あまり高くなりすぎないほうが好ましい。例えば、乳歯1個の歯髄から抽出してきた細胞は、25～225 cm2、好ましくは75～150 cm2の面積に播種される。培養は、36℃～38℃、好ましくは36.5℃～37.5℃で、1％～25％ O2、1％～15％　CO2の条件下で、培地交換をしながら実施する。
　初代培養は、コロニーが形成され、成長し、剥離が確認されるまで行うことが好ましい。コロニーの剥離が確認されたら、フィルター等を用いて細胞を回収する。回収された細胞は、特別な分離手段なしに、均一性の高い幹細胞集団として取得される。
　幹細胞集団は、必要に応じてさらに継代培養（拡大培養）を行ってもよい。継代培養は初代培養と同じ培地を用いて実施する。典型的には、初代培養細胞はコロニーの形成、成長、剥離を確認するため、少なくとも7日以上、好ましくは9日以上、より好ましくは9～15日間培養を行うが、継代後の細胞は、少なくとも1日以上、好ましくは2日以上、より好ましくは2～3日間培養すればよい。継代後の細胞の播種密度は特に限定されないが、あまり高くなりすぎないほうが好ましい。例えば、1000～2000 cells/cm2、好ましくは1300～1500 cells/cm2の密度で播種される。
　回収した幹細胞集団やその培養上清液は、安全のために、再度エンドトキシン試験、マイコプラズマ試験、無菌試験等を実施することが望ましい。
　製造された幹細胞集団は、必要に応じて、使用されるまで凍結保存（例えば、-152℃のディープフリーザーにて保存）してもよい。凍結保存は、例えば、上記細胞培養に用いた培地に適当な凍結保護剤を添加して行う。凍結保護剤としては、デキストラン、DMSO、市販の凍結保存液等を使用できる。
３．本発明の幹細胞集団の培養上清
　本発明の幹細胞集団の培養上清は、組織再生に有用なサイトカインを豊富に含み、それ自体組織再生用の医薬組成物等として利用することができる。
　具体的に言えば、本発明の幹細胞集団の培養上清は、下記1)～3)の少なくとも1つの特性を有する：
1)SCFをIL-6の20分の1以上、好ましくは10分の1以上、より好ましくは10分の1～2分の1、さらに好ましくは10分の1～3分の1の重量比で含む、
2)ANGPTL4をIL-6の3倍以上、好ましくは5倍以上、より好ましくは5倍～20倍、さらに好ましくは5倍～15倍の重量比で含む、
3)TGFBIをIL-6の400倍以上、好ましくは450倍以上、より好ましくは、450倍～1500倍、さらに好ましくは450倍～1000倍の重量比で含む。
　本発明の培養上清液は、臨床使用まで凍結保存することができ、後述する医薬組成物と同様に組織再生を必要とする各種疾患の治療に使用することができる。
４．本発明の幹細胞集団を含む医薬組成物
　本発明の幹細胞集団は、SCFなどの組織再生に有用なサイトカインを豊富に産生し、炎症性サイトカインの産生比率が低く、かつCD117陰性であるため、優れた組織再生効果を有し、医薬組成物として利用することができる。本発明の幹細胞集団は、必要に応じて、培養液又は培養上清とともに、細胞医薬として提供される。
　本発明の医薬組成物は、下記1)～3)の少なくとも1つの特性を有する：
1)SCFをIL-6の20分の1以上、好ましくは10分の1以上、より好ましくは10分の1～2分の1、さらに好ましくは10分の1～3分の1の重量比で含む、
2)ANGPTL4をIL-6の3倍以上、好ましくは5倍以上、より好ましくは5倍～20倍、さらに好ましくは5倍～15倍の重量比で含む、
3)TGFBIをIL-6の400倍以上、好ましくは450倍以上、より好ましくは、450倍～1500倍、さらに好ましくは450倍～1000倍の重量比で含む。
　本発明の医薬組成物に含まれる幹細胞の細胞数は、対象や対象疾患に応じて適宜決定される。対象への投与時期や、培養に要する時間を勘案すると、効果を示す最小量であることが実用的である。一般的には、医薬組成物に含まれる細胞数は、1x106個以上、好ましくは1x107個以上、より好ましくは1x108個以上、さらに好ましくは1x109個以上である。投与回数は1回に限られず、2回以上投与されてもよい。
　本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与製剤、より好ましくは非経口全身投与製剤、特に静脈内投与製剤である。非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤等の注射剤や移植片などが挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であり、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、培地（とくに、RPMI等の哺乳動物細胞の培養に用いられる培地）、PBSなどの生理緩衝液、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤等を適宜組み合わせて、適切な単位投与形態に製剤化される。
　本発明の医薬組成物が適用可能な疾患は、組織再生を必要とするものであれば特に限定されない。例えば、脊髄損傷（外傷性及び手術操作による損傷を含む）、虚血性疾患（脳梗塞、下肢虚血を含む四肢虚血、周産期低酸素性虚血性脳症、心筋梗塞を含む虚血性心疾患等）、炎症性疾患（敗血症、肝炎、膵炎、腎炎、肺炎等）、自己免疫疾患（リウマチ、SLE、I型糖尿病等）、および腸管疾患（過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、ヒルシュスプリング病および関連症候群等）などを挙げることができる。
５．本発明の幹細胞集団又はその培養上清を用いた治療方法
　本発明は、本発明の幹細胞集団又はその培養上清を、必要とする対象に投与することを含む治療方法も提供する。治療対象は、組織再生を必要とするものであれば特に限定されず、上記した脊髄損傷、虚血性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び腸管疾患などを挙げることができる。
６．歯髄幹細胞バンク
　本発明の方法にしたがい、複数のドナーからの歯髄由来幹細胞集団を調製し、凍結保存することで、歯髄幹細胞バンクを作製することができる。細胞の凍結保存方法は、上述したように、当該分野で公知の方法により実施することができる。
　以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：歯髄幹細胞の調製
　抜去歯（ヒト乳歯）から歯髄を掻き出し、細断後、最終濃度0.05 mg/mlのリベラーゼ(Roche)を添加し、37℃で撹拌しながら15分間処理した。細胞を含む反応上清を回収し、残りの歯髄組織にさらに0.05 mg/mlのリベラーゼを加え、37℃で撹拌しながら15分間処理した。処理した歯髄組織から細胞を70 mmストレイナーを通して回収し、先に回収した上清と合わせて遠心分離した。回収した細胞を10％hPL (AventaCell BioMedical)を含むMEMα (Gibco)を用いて培養容器に播種し、コロニーが形成、成長、剥離するまで9日間以上、単離培養を行った。培地交換は播種2日後と9日後に行った。コロニーの剥離が確認されたら、TrypLE Select(Gibco)を用いて細胞を回収し、同培地を用いて拡大培養を行った。
実施例２：表面マーカー解析
　実施例１にしたがって調製した8ドナー分のヒト歯髄幹細胞について、ドナー毎にそれぞれ1x105個を、PEで標識した各種表面マーカーの抗体（CD117(#313204)、CD31(#303105)、CD34(#343606)、CD45（#368510）、CD90(#328110)、CD105(#323206)、CD73(#344004)、CD325 (#350806)、CD49d (#304303)、CD51 (#327909)、いずれもBiolegend社製）と反応させ、フローサイトメトリーを用いてデータを取得した。解析は、isotype control抗体の陽性率が1%前後となるようゲーティングした上で、各種表面マーカーの陽性率を算出した。
　その結果、CD117、CD325およびCD45については、いずれのドナー細胞も陽性率は5％未満であり、陰性と判定された（図1A、1Hおよび1D）。CD73、CD90、CD105、CD49dおよびCD51については、いずれのドナー細胞も陽性率は96%以上であり、陽性と判定された（図1G、1E、1F、1Iおよび1J）。CD31およびCD34については、8ドナー細胞中7ドナー細胞で陽性率7%未満であり、陰性と判定された。1ドナー細胞においてはCD31が15.49%の陽性率、別の1ドナー細胞においてはCD34が19.96%の陽性率を示した（図1B、1C）。また、CD29、CD44およびCD166は、いずれのドナーも陽性率99%以上であった。CD106は8ドナー細胞中7ドナー細胞で陽性率9%未満、1ドナー細胞で陽性率10.75%であった。
実施例３：脂肪細胞分化能
　本ヒト歯髄幹細胞を6-well plateに5.76x105 cells/2.5 mL/well となるよう10%hPL/MEMαを用いて播種し、100%コンフルエンシーに達するまで培養した後、脂肪分化培地（MEMα、2% FBS, 500 μM IBMX、50 μM インドメタシン、5 μg/ml インシュリン、1 μM デキサメタゾン）に置換した。28日間分化誘導を行った後、リピッドアッセイキット（コスモバイオ、#AK09F）を用いて染色し、顕微鏡で脂肪滴像を観察した。
　その結果、細胞内に赤色に染まった脂肪滴を認めたことから、本ヒト歯髄幹細胞は脂肪細胞への分化能を有することが示された（図2）。
実施例４：骨芽細胞分化能
　本ヒト歯髄幹細胞をCollagenコート6-well plateに5.76x105 cells/2.5 mL/well となるよう10%hPL/MEMαを用いて播種し、100%コンフルエンシーに達するまで培養した後、骨分化培地（MEMα、5 % FBS、50 μg L-アスコルビン酸2ホスフェイト、10 nM デキサメタゾン、10 mM β-グリセロホスフェイト）に置換した。28日間分化誘導を行った後、石灰化染色キット(コスモバイオ, #AK21)を用いて染色し、顕微鏡で石灰化像を観察した。
　その結果、赤色に染まった石灰化像を認めたことから、本ヒト歯髄幹細胞は骨芽細胞への分化能を有することが示された。（図3）。
実施例５：軟骨細胞分化能
　本ヒト歯髄幹細胞を低吸着96 U-bottom plate(住友ベークライト, SUMS9096U)に2x10^5 cells/200 μL/well となるよう10%hPL/MEMαを用いて播種し、翌日、スフェロイド形成を確認した後、軟骨分化培地（PromoCell、#C-28012）に置換した。21日間分化誘導を行った後、4%パラフォルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロックに包埋後、薄切した。切片をAlcian blue染色液を用いて染色し、顕微鏡で軟骨組織像を観察した。
　その結果、青色に染まった軟骨組織像を認めたことから、本ヒト歯髄幹細胞は軟骨細胞への分化能を有することが示された（図4）。
実施例６：神経細胞分化能
　本ヒト歯髄幹細胞をpoly-D-lysin/laminin cell ware 8-well culture slid（Corning）に2.8x103 cells/400 μl/wellとなるよう10%hPL/MEMαを用いて播種し、24時間後、N2培地(Neuobasal-A＋N2 supplement serum free、10 ng/ml human EGF、10 ng/ml human FGF-basic)に置換した。21日間分化誘導を行った後、4%パラフォルムアルデヒドで固定し、神経分化マーカーの一次抗体としてanti-BIII-tubulin(clone:TU-20) (Millipore, #MAB1637)、anti-Nestin (clone:10C2)(Novus Bio, #NB300-266)、anti-neurofilament M(clone: NN18)(Sigma, #5264)抗体を、二次抗体としてAlexa Fluor(登録商標) 488 anti-mouse IgG(H+L)( Jackson immuno research)を用いて染色し、蛍光顕微鏡にて観察した。
　その結果、いずれの神経分化マーカーも、その抗体で免疫染色される細胞を認めたことから、本ヒト歯髄幹細胞は神経細胞への分化能を有することが示された。（図5）。
実施例７：サイトカイン産生能
　本ヒト歯髄幹細胞を10%hPL/MEMαまたは10%FBS/MEMαで7日間継代培養した後、6-well plateに5.76x105 cells/2.5 ml/wellとなるよう、同培地を用いて播種し、翌日、hPL不含FBS不含フェノールレッド不含MEMα 2.5 ml/wellに置換した。48時間後に培養上清を回収し、分注して-80℃で保管した。凍結サンプルを融解し、サンプル中のSCF、ANGPTL4、TGFBI及びIL-6濃度をそれぞれ、Multiplex HGF panel(Biolegend, #740180)、Human ANGPTL4 assay kit (IBL, #27749)、Human beta IG-H3 ELISA (abcam, #ab220651)及びMultiplex Neuroinflammatory panel(Biolegend, #740796)を用いて測定し、IL-6に対する濃度比をそれぞれ算出した（表1及び表2）。また、培養上清量及び播種細胞数から、各種因子の産生量を1x106細胞当たりの産生量として算出した（表3及び表4）。
　その結果、10%hPL/MEMαで継代培養後の歯髄幹細胞の培養上清では、10%FBS/MEMαで継代培養後の歯髄幹細胞の培養上清と比べ、SCF、ANGPTL4、TGFBIのいずれにおいても、IL-6に対する濃度比、および1x106細胞当たりの産生量が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例８：神経突起伸展作用
　本ヒト歯髄幹細胞を1000 cells/cm2の密度で10%hPL/MEMαを用いて播種し、6日間培養した後、培地をMEMαに交換した。さらに7日間培養した後、その培養上清を回収した。この培養上清をPoly-D lysin (PDL)コートの培養プレート(Corning)に添加することで、培養上清中に含まれる成分でプレートをコーティングした。このプレートにIMR-32細胞を播種し、Day1～4とDay7～8にall trans retinalを添加することで神経細胞に分化誘導した。Day9にTubulin TrackerTM Green (ThermoFisher Scientific)で神経突起を、Hoechst 33342 (Dojindo)で核を染色して撮像した後、Autoneurite Jを用いた画像解析により神経突起長を測定した。
　その結果、培養上清でコートしたプレートでは、PDLコートのみのプレートと比較し、神経分化誘導したIMR-32細胞から伸びる神経突起長が有意に長かった。すなわち、本ヒト歯髄幹細胞が分泌する細胞外マトリックス等により、神経突起進展が促進されたと考えられた（図6）。本作用は神経再生に重要である。
実施例９：神経前駆細胞増殖作用
　ヒト神経前駆細胞（ENStemA, Millipore）をL-glutamineおよびFGFを含むENstem expansion mediumに懸濁し、Corning BioCoat ポリ-L-オルニチン/ラミニンコートマルチウェルプレートに播種した。翌日、実施例８で回収した歯髄幹細胞培養上清またはMEMα（コントロール）をL-glutamineを含むENstem expansion mediumに20%または40%の割合で添加した培地に置換して、さらに3日間培養した。神経前駆細胞にCCK-8を添加し、1時間後の450 nm吸光度を測定することで、神経前駆細胞の細胞数を評価した。
　その結果、MEMαを添加した神経前駆細胞ではMEMαの添加量依存的に吸光度が低下したのに対し、培養上清を添加した神経前駆細胞では逆に吸光度が上昇した。すなわち、本ヒト歯髄幹細胞が分泌する栄養因子等により、神経前駆細胞が増殖したと考えられた（図7）。本作用は神経再生に重要である。
実施例１０：血管内皮細胞増殖作用
　HUVEC（ヒト血管内皮細胞株）をHumedia/2%FBSに懸濁した後、96well plateに播種した。翌日、実施例８で回収した歯髄幹細胞培養上清を各種割合でMEMαと混合し、さらに終濃度2%のFBSを添加したものを、ウェル中のHumedia/2%FBSの上から等量加え、3日間培養した。HUVECにCCK-8を添加し、37℃で4時間反応させた後、OD450を測定することで、HUVECの細胞数を評価した。
　その結果、培養上清の割合依存的に吸光度が上昇した。すなわち、本ヒト歯髄幹細胞が分泌する栄養因子等により、血管内皮細胞が増殖したと考えられた（図8）。本作用は血管新生に重要である。
実施例１１：血管様構造体構築作用
　96well plateに作製したExtracellular matrix gelに、実施例８で回収した歯髄幹細胞培養上清またはMEMαに懸濁させたHUVECを1x105 cells/cm2の密度で播種し、20時間培養した。ウェルを明視野で撮像し、Angiogenesis Analyzer for ImageJを用いた画像解析によりBranching interval（枝分かれ間の距離）を測定することで、チューブフォーメーション（血管様構造体構築）作用を検討した。
　その結果、培養上清の添加により、Branching intervalは著しく増大した（図9）。すなわち、本ヒト歯髄幹細胞が分泌する栄養因子等により、チューブフォーメーションが促進されたと考えられた。本作用は血管新生に重要である。
実施例１２：血管内皮細胞誘引作用
　トランスウェルの上層にHUVECを播種した後、下層を実施例８で回収した歯髄幹細胞培養上清またはMEMαで満たし、24時間培養した。上層の裏側（下層側）に移動したHUVECをトリプシンで剥離した後、その細胞数をCellTiterGlo (Promega)による発光強度として測定することで、HUVECが下層に誘引される作用を評価した。
　その結果、下層を培養上清で満たすことで、発光強度は著しく増大した（図10）。すなわち、本ヒト歯髄幹細胞が分泌するケモカイン等により、血管内皮細胞が強く誘引されたと考えられた。本作用は血管新生に重要である。
実施例１３：免疫抑制作用
　本ヒト歯髄幹細胞をCFSEで標識したヒトPBMC（末梢血単核細胞）と混合した後、抗CD3抗体と抗CD28抗体（それぞれ終濃度0.1 μg/ml）を添加することで、PBMCを6日間刺激した。PBMC中のCD4陽性T細胞のうち、増殖によってシグナルが希釈されたCFSElowの割合を、CD4陽性T細胞の増殖率として、フローサイトメトリーにより定量することにより、歯髄由来細胞の免疫抑制作用を評価した。
　その結果、抗CD3抗体と抗CD28抗体刺激によって惹起されたCD4陽性T細胞の増殖は、本ヒト歯髄幹細胞により著しく抑制された（図11）。すなわち、本細胞は強い免疫抑制作用を有する。
実施例１４：脊髄損傷に対する効果
　麻酔下のラットに対し、重錘（直径2.5mm，10g）を50 mmの高さからMASCIS Impactor（Rutgers university, USA）を用いて第9～10胸椎間の脊髄に落下させることで、脊髄損傷モデルを作製した。モデル作製の7、9、11、13週後に、溶媒または本発明ヒト歯髄幹細胞を静脈内に1x106個、及び脊髄腔内に5x105個投与することで、慢性期脊髄損傷に対する運動機能回復及び神経再生作用を検討した。具体的には、後肢の運動機能をBBB (Basso-Beattie-Bresnahan) テストにより経時的に評価した。モデル作製15週後に4%パラフォルムアルデヒドを用いてラットを還流固定後、損傷部位を含む脊髄を採取し、OCT compoundを用いて冠状凍結切片を作製した。切片にH&E染色またはLuxol Fast Blue（LFB）染色を施し、Image Jを用いた画像解析により染色領域をそれぞれ定量することで、神経再生を評価した。尚、初回投与の1日前から1日おきに、シクロスポリンを10 mg/kgの投与量で腹腔内投与した。
　その結果、細胞の初回投与4週後からBBBスコアの上昇傾向を認め、最終投与2週後には統計学的に有意な上昇を認めた（図12A）。脊髄切片のH&E染色およびLFB染色では、いずれも損傷中心（Epicenter）において、細胞投与による有意な染色面積の増大を認めた（図12B）。以上のことから、本ヒト歯髄幹細胞は脊髄損傷慢性期において、臨床で実施可能な経路およびタイミングでの投与により、神経実質及び髄鞘を再生させ、運動機能を回復させ得ると考えられた。
実施例１５：周産期低酸素性虚血性脳症に対する効果
　7日齢のラットに対し、麻酔下、左頸動脈を結紮し、1～2時間置いた後、低酸素（8%O2）環境に1時間置くことで、新生仔ラット低酸素性虚血性脳症モデルを作製した。翌日、溶媒または本発明ヒト歯髄幹細胞を静脈内に1x105個投与することで、周産期低酸素性虚血性脳症に対する運動機能改善作用を検討した。具体的には、投与から41日後にロタロッド試験を実施し、ロッドから落下するまでの潜時を測定することで、四肢の運動協調性と持久力を評価した。
　その結果、偽処置群（正常群）と比べ、溶媒投与群では落下潜時が大きく短縮、すなわち運動機能の明らかな障害を認めたが、細胞投与群では落下潜時はほとんど短縮せず、運動機能の回復が認められた（図13）。このことから、本ヒト歯髄幹細胞は、周産期低酸素性虚血性脳症に対し、臨床で実施可能な経路およびタイミングでの投与により、比較的早い期間で、脳性麻痺の症状を回復させ得ると考えられた。
実施例１６：重症下肢虚血に対する効果
　免疫不全ラットの右総腸骨動脈並びに大腿動静脈を結紮し切離して、重症下肢虚血モデルを作製した。翌日、正常肢と比較した血流量の低下度を指標に群分けを行った後、本ヒト歯髄幹細胞(2x106cells/head)を虚血下肢筋肉内に投与することで、重症下肢虚血に対する効果を検討した。血管新生作用による血流改善作用は、正常肢と比較した血流量で評価した。足部壊死に対する改善効果は、モデル作製後Day7（各群4例）とDay14（各群6例）で、目視で個体ごとの踵までの壊死の有無で評価した。
　その結果、溶媒投与群では虚血後14日間に渡って、持続的な血流量の低下を認めたのに対し、細胞投与群では日を追うごとに血流量の著しい回復を認めた（図14A）。また、細胞投与群では14日間に渡り、高い足部壊死回避率を示し、溶媒投与群との間に統計学的有意差を認めた（図14B）。以上のことから、本ヒト歯髄幹細胞は、重症下肢虚血に対し、臨床で実施可能な経路およびタイミングでの投与により、血管新生を通して血流を回復させ、その結果、足部壊死による足切断処置を回避させ得ると考えられた。
　本発明の歯髄幹細胞は、多分化能、神経前駆細胞増殖作用、神経突起伸展作用、血管内皮細胞増殖作用、血管内皮細胞誘引作用、血管様構造体構築作用、及び免疫抑制作用を有し、脊髄損傷、虚血性疾患、炎症性疾患、神経変性疾患などの治療に有用である。
　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

 

Claims (24)

  1. 　ヒト歯髄由来の幹細胞集団であって、CD117陰性、CD73陽性、CD90陽性、及びCD105陽性で特徴づけられる、幹細胞集団。
  2. 　前記幹細胞集団が、CD325陰性であるか、あるいはCD49d及び／又はCD51が90％以上の陽性率である、請求項１に記載の幹細胞集団。
  3. 　前記幹細胞集団がCD31陰性である、請求項１又は２に記載の幹細胞集団。
  4. 　前記幹細胞集団がCD34陰性、かつCD45陰性である、請求項１～３のいずれか１項に記載の幹細胞集団。
  5. 　前記幹細胞集団が、SCF（幹細胞因子）をIL-6の10分の1以上の重量比で産生する、請求項１～４のいずれか１項に記載の幹細胞集団。
  6. 　前記幹細胞集団が、SCF（幹細胞因子）をIL-6の10分の1～3分の1の重量比で産生する、請求項１～５のいずれか１項に記載の幹細胞集団。
  7. 　前記幹細胞集団が、1×106細胞あたり48時間で少なくとも0.1ngのSCFを産生する、請求項１～６のいずれか１項に記載の幹細胞集団。
  8. 　前記幹細胞集団が、ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の5倍以上の重量比で産生する、請求項１～７のいずれか１項に記載の幹細胞集団。
  9. 　前記幹細胞集団が、ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の5倍～15倍の重量比で産生する、請求項１～８のいずれか１項に記載の幹細胞集団。
  10. 　前記幹細胞集団が、1×106細胞あたり48時間で少なくとも5ngのANGPTL4を産生する、請求項１～９のいずれか１項に記載の幹細胞集団。
  11. 　前記幹細胞集団が、TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の450倍以上の重量比で産生する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の幹細胞集団。
  12. 　前記幹細胞集団が、TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の450倍～1000倍の重量比で産生する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の幹細胞集団。
  13. 　前記幹細胞集団が、1×106細胞あたり48時間で少なくとも500ngのTGFBIを産生する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の幹細胞集団。
  14. 　前記幹細胞集団が、ヒト歯髄から酵素的に単離した細胞を、ヒト血小板溶解物の存在下で、FBS（ウシ胎児血清）を含まない培地で培養することにより取得されたものである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の幹細胞集団。
  15. 　前記培地が無血清培地である、請求項１４に記載の幹細胞集団。
  16. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の幹細胞集団の培養上清であって、下記1)～3)の少なくとも1つの特性を有する培養上清：
    1)SCF（幹細胞因子）をIL-6の10分の1以上の重量比で含む、
    2)ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の5倍以上の重量比で含む、
    3)TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の450倍以上の重量比で含む。
  17. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の幹細胞集団の培養上清であって、下記1)～3)の少なくとも1つの特性を有する培養上清：
    1)SCF（幹細胞因子）をIL-6の10分の1～3分の1の重量比で含む、
    2)ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の5倍～15倍の重量比で含む、
    3)TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の450倍～1000倍の重量比で含む。
  18. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の幹細胞集団又は前記幹細胞集団の培養上清を含み、下記1)～3)の少なくとも1つの特性を有する医薬組成物：
    1)SCF（幹細胞因子）をIL-6の10分の1以上の重量比で含む、
    2)ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の5倍以上の重量比で含む、
    3)TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の450倍以上の重量比で含む。
  19. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の幹細胞集団又は前記幹細胞集団の培養上清を含み、下記1)～3)の少なくとも1つの特性を有する医薬組成物：
    1)SCF（幹細胞因子）をIL-6の10分の1～3分の1の重量比で含む、
    2)ANGPTL4（アンジオポエチン様4）をIL-6の5倍～15倍の重量比で含む、
    3)TGFBI（ベータ誘導トランスフォーミング成長因子）をIL-6の450倍～1000倍の重量比で含む。
  20. 　脊髄損傷、虚血性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、腸管疾患から選ばれるいずれかの疾患を治療又は予防するためのものである、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物。
  21. 　ヒト歯髄由来の幹細胞集団の製造方法であって、
    　ヒト歯髄から酵素的に細胞を単離する工程、前記細胞をヒト血小板溶解物の存在下で、FBS（ウシ胎児血清）を含まない培地で培養する工程、コロニー形成する細胞集団を前記幹細胞集団として取得する工程、とを含む、前記方法。
  22. 　前記培地が無血清培地である、請求項２１に記載の方法。
  23. 　培地がxeno-freeである、請求項２１に記載の方法。
  24. 　得られる歯髄幹細胞集団がCD117陰性である、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010021412A1 (ja) * 2008-08-22 2010-02-25 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 脳梗塞治療材及び脳組織再生方法
JP2011525798A (ja) * 2008-06-26 2011-09-29 ウニベルシタ デグリ ストゥディ ディ ウディネ 歯髄類似細胞（ｄｐｍｓｃ）ならびにその単離および使用の方法
WO2012117333A1 (en) * 2011-02-28 2012-09-07 Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
WO2019132025A1 (ja) * 2017-12-28 2019-07-04 株式会社カネカ 接着性幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物
WO2019132026A1 (ja) * 2017-12-28 2019-07-04 株式会社カネカ 接着性幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物
WO2020027163A1 (ja) * 2018-07-31 2020-02-06 Ｊｃｒファーマ株式会社 歯髄由来細胞の製造方法
JP2021520790A (ja) * 2018-04-10 2021-08-26 ブレインストーム セル セラペウティクス リミテッド 細胞型特異的エキソソームおよびそれらの使用
JP2021522805A (ja) * 2018-05-08 2021-09-02 ウニヴェルズィテート チューリヒ ｈＭＰＣの集団をゼノフリー生成するための方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011525798A (ja) * 2008-06-26 2011-09-29 ウニベルシタ デグリ ストゥディ ディ ウディネ 歯髄類似細胞（ｄｐｍｓｃ）ならびにその単離および使用の方法
WO2010021412A1 (ja) * 2008-08-22 2010-02-25 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 脳梗塞治療材及び脳組織再生方法
WO2012117333A1 (en) * 2011-02-28 2012-09-07 Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
WO2019132025A1 (ja) * 2017-12-28 2019-07-04 株式会社カネカ 接着性幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物
WO2019132026A1 (ja) * 2017-12-28 2019-07-04 株式会社カネカ 接着性幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物
JP2021520790A (ja) * 2018-04-10 2021-08-26 ブレインストーム セル セラペウティクス リミテッド 細胞型特異的エキソソームおよびそれらの使用
JP2021522805A (ja) * 2018-05-08 2021-09-02 ウニヴェルズィテート チューリヒ ｈＭＰＣの集団をゼノフリー生成するための方法
WO2020027163A1 (ja) * 2018-07-31 2020-02-06 Ｊｃｒファーマ株式会社 歯髄由来細胞の製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GANG DING: "Dental pulp stem cells suppress the proliferation of lymphocytes via transforming growth factor-β1", HUMAN CELL, vol. 28, no. 2, 21 January 2015 (2015-01-21), pages 81 - 90, XP093154177, ISSN: 1749-0774, DOI: 10.1007/s13577-014-0106-y *

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