JP2019165732A5 - - Google Patents

Description

マウス胚芽幹細胞からマウス血管芽細胞の試験管内生成が文献に報告されたことがある（Ｃｈｏｉら，１９９８ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２５：７２７−７３２）。また、造血細胞及び内皮細胞の両方に発生しうるヒト前駆細胞をヒトＥＳ細胞から誘導したが（Ｗａｎｇら、２００４ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２１）：３１−４１及びＷａｎｇら、ＪＥｘｐＭｅｄ（２０１）：１６０３−１６１４）、せいぜいして多くの細胞から少量のみ誘導される。また、血管芽細胞前駆細胞の試験管内増殖のための方法、または条件はない。

したがって、多数のヒト血管芽細胞と血管芽細胞誘導体細胞型、すなわち、造血細胞及び内皮細胞を生成して増殖させる方法と、そのような量の血管芽細胞または誘導体細胞型を含むあらゆる溶液／混合物に対する必要性は、依然として存在する。このような方法は、移植のための細胞の利用可能性を増加させ、免疫学的耐性の誘導のような各種の他の治療用途で有用である。

本発明は、ヒト血管芽細胞または血管コロニー形成細胞を試験管内で生成して増殖させる方法を提供することによって、前記開示された問題点を解消する。本願に開示された新規な方法によりヒト血管芽細胞または血管コロニー形成細胞の増殖能により各種治療用途に使用する細胞を生産しうる。また、本発明は、治療用途に使用するヒト血管芽細胞または血管コロニー形成系統細胞（すなわち、造血細胞及び内皮細胞）を生成する方法を提供する。本発明の方法は、商業的規模で使用できる多数のヒト血管芽細胞または血管コロニー形成細胞のみならず、造血細胞及び内皮細胞、そしてこれより分化された細胞を生成できるという点でも有用である。

本発明はまた、前記血管芽細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ）の増殖を支持するのに十分な量でホメオボックス蛋白質（例えば、ＨＯＸＢ４）を含む蛋白質または該機能性等価物または活性断片の存在下にほ乳動物の血管コロニー形成細胞を無血清培地中で成長させることを含む血管コロニー形成細胞を増殖する方法を提供する。増殖される前記血管コロニー形成細胞は、臍帯血液（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、末梢血液、または骨髄から濃縮されるか、精製されるか、または分離されうる。前記血管コロニー形成細胞は、ヒト血管コロニー形成細胞でありうる。この方法により１０，０００ないし４×１０⁶個、またはそれ以上の血管コロニー形成細胞を含む溶液を生成しうる。この方法で使われたＨＯＸＢ４蛋白質は、本発明のヒト血管コロニー形成細胞を生成して増殖する方法に使用するのに適した任意蛋白質でありうる。

Ｈ１−ＧＦＰ ＥＳ細胞から生成された血管芽細胞から誘導された造血ＣＦＵを例示した図面である。 無血清（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ）培養培地中に培養された赤血球系（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ）コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−Ｅ）の細胞形態を例示した図面である。 無血清（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ）培養培地中に培養された多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ／Ｍｉｘ）の細胞形態を例示した図面である。 無血清（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ）培養培地中に培養された多能性コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ／Ｍｉｘ）の細胞形態を例示した図面である。 無血清（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ）培養培地中に培養された顆粒球コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−Ｇ）及び大食細胞コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−Ｍ）の細胞形態を例示した図面である。 無血清（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ）培養培地中に培養された顆粒球／大食細胞コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−ＧＭ）及び巨核球大食細胞コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−Ｍｋ）の細胞形態を例示した図面である。 マトリゲル系（Ｍａｔｒｉｇｅｌ−ｂａｓｅｄ）培地上で（ａ）Ｈ９ ＥＳ細胞及び（ｂ）ＡＣＴ３０ ＥＳ細胞から誘導された血管芽細胞の再プレートを行った後、チューブコード（ｔｕｂｅ−ｃｏｒｄ）構造の形成を例示した図面である。 実施例２に説明されているように、ＥＧＭ−２培地中でフィブロネクチン−コーティングされたプレート上に、次いでマトリゲル上に培養されたＨ１−ＧＦＰ ＥＳ細胞から生成された血管芽細胞のチューブコード構造を例示した図面である。また図８は、実施例２に説明されているように、アレキサフルアー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）標識化されたＡｃ−ＬＤＬにより恒温処理される時、細胞によるＡｃ−ＬＤＬの吸収を例示した図面である。中間パネル上部及び右側パネル上部は、位相差写真（ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｐｉｃｔｕｒｅ）を表す。 実施例２に説明されているように、ＥＧＭ−２培地中でフィブロネクチン−コーティングされたプレート上に培養されたＨ１−ＧＦＰ ＥＳ細胞から生成された血管芽細胞でフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の発現（薄い灰色染色）を例示した図面である。 実施例４に説明されているように、ＳＣＩＤマウス内に注入されたヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色されたマトリゲルプラグの断面内血管の形成を例示した図面である。 実施例４に説明されているように、ヒト特異的核抗体に対する陽性染色（薄い灰色染色）により示されたような、マトリゲルプラグの断面から得た血管がヒト血管芽細胞から誘導された細胞である点を例示した図面である。 ヒトＨＯＸＢ４のｍＲＮＡ配列（受託番号：ＮＭ−０２４０１５．４；ＧＩ：８５３７６１８７）（配列番号：２）を例示した図面である。 ヒトＨＯＸＢ４のアミノ酸配列（受託番号：ＮＰ−０７６９２０．１；ＧＩ：１３２７３３１５）（配列番号：１）を例示した図面である。 ヒトＨＯＸＢ４のｍＲＮＡ配列（受託番号：ＢＣ０４９２０４．１；ＧＩ：２９３５１５６７）（配列番号：４）を例示した図面である。 ヒトＨＯＸＢ４のアミノ酸配列（受託番号：ＡＡＨ４９２０４．１；ＧＩ：２９３５１５６８）（配列番号：３）を例示した図面である。 実施例１及び実施例２に説明されているように、ヒトＥＳ細胞から誘導された血管芽細胞（ＢＬ−ＣＦＣ）の表現型特性化を例示した図面である：（ａ）血管芽細胞コロニーまたは芽細胞コロニー（ＢＬ−ＣＦＣまたはＢＣ、×４００）；（ｂ）二次的ＥＢ（×４００）；（ｃ）ライト・ギムザ（Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ）染色による芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ細胞）（×１０００）；（ｄ−ｆ）ＧＡＴＡ−１染色：（ｄ）ＧＡＴＡ−１で染色された芽細胞（×６００）；（ｅ）ＧＡＴＡ−１及びＤＡＰＩで染色された芽細胞（×６００）；（ｆ）ＧＡＴＡ−１及びＤＡＰＩで染色されたＢＭ細胞（×４００）；（ｇ−ｉ）ＬＭＯ２染色：（ｇ）ＬＭ０２で染色された芽細胞（×６００）；（ｈ）ＬＭＯ２及びＤＡＰＩで染色された芽細胞（×６００）；（ｉ）ＬＭＯ２及びＤＡＰＩで染色されたＫ５６２細胞（×１０００）；（ｊ−ｍ）ＣＤ７１染色（明るい灰色または薄い灰色）：（ｊ）ＣＤ７１で染色された芽細胞（×６００）；（ｋ）ＣＤ７１及びＤＡＰＩで染色された芽細胞（×６００）；（ｍ）ＣＤ７１及びＤＡＰＩで染色されたＢＭ細胞（×１０００）；（ｎ−ｐ）ＣＸＣＲ−４染色（明るい灰色または薄い灰色）：（ｎ）ＣＸＣＲ−４で染色された芽細胞（×６００）；（ｏ）ＣＸＣＲ−４及びＤＡＰＩで染色された芽細胞（×６００）；（ｐ）ＣＸＣＲ−４及びＤＡＰＩで染色されたＢＭ細胞（×６００）；（ｑ−ｓ）Ｅｐｏ−受容体染色（中間灰色）：（ｑ）Ｅｐｏ−受容体で染色された芽細胞（×６００）；（ｒ）Ｅｐｏ−受容体及びＤＡＰＩで染色された芽細胞（×６００）；（ｓ）Ｅｐｏ−受容体及びＤＡＰＩで染色されたＢＭ細胞（×６００）；（ｔ−ｖ）Ｔｐｏ−受容体染色（中間灰色）：（ｔ）Ｔｐｏ−受容体で染色された芽細胞（×６００）；（ｕ）Ｔｐｏ−受容体及びＤＡＰＩで染色された芽細胞（×６００）；（ｖ）Ｔｐｏ−受容体及びＤＡＰＩで染色されたＢＭ細胞（×１０００）。留意：パネル（ｄ）及び（ｎ）で、ｈＥＳ−ＢＣ（血管芽細胞）細胞は、ＧＡＴＡ−１及びＣＸＣＲ−４抗体で二重染色したが、個別的に表示し；パネル（ｑ）及び（ｔ）でｈＥＳ−ＢＣ（血管芽細胞）細胞は、Ｅｐｏ−受容体抗体及びＴｐｏ−受容体抗体でさらに二重染色し、個別的に表示した。 図１７ａ−ｕ。試験管内ヒトＥＳ細胞から誘導された血管芽細胞（ＢＬ−ＣＦＣまたは芽細胞）の機能性特性化を例示した図面である：（ａ−ｄ）精製された血管芽細胞から誘導された造血ＣＦＵ）：（ａ）ＣＦＵ−赤血球系（×１００）；（ｂ）ＣＦＵ−顆粒球（×１００）；（ｃ）ＣＦＵ−大食細胞（×１００）；及び（ｄ）ＣＦＵ−多系統（ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ）（混合物、×１００）；（ｅ−ｈ）ＣＦＵ−細胞のライト・ギムザ染色：（ｅ）赤血球系（×１０００）；（ｆ）顆粒球（×１０００）；（ｇ）大食細胞（×４００）；及び（ｈ）混合物（×１０００）；（ｉ−ｋ）ＣＦＵ細胞の免疫染色：（ｉ）ＣＤ２３５ａで染色されたＣＦＵ−赤血球系細胞（矢印、×１０００）；（ｊ）ＣＤ１３で染色されたＣＦＵ−顆粒球細胞（矢印、×１０００）；（ｋ）ＣＤ４５で染色されたＣＦＵ−混成物細胞（矢印、×１０００）；（ｍ−ｐ及びｖ−ｙ）プーリングされたＣＦＵ細胞のＦＡＣＳ分析：（ｍ）マウスＩｇＧイソタイプ対照群；（ｎ）ＣＤ４５；（ｏ）ＣＤ１３；及び（ｐ）ＣＤ２３５；（ｑ−ｕ）精製された血管芽細胞、または芽細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞から誘導された内皮細胞：（ｑ）血管芽細胞から誘導された付着性細胞をプレートした後、マトリゲル上に形成された毛細管類似構造（×１００）；（ｒ）血管芽細胞から誘導された内皮細胞によるＡｃ−ＬＤＬ吸収（灰色）（×２００）；（ｓ）核がＤＡＰＩで染色されている血管芽細胞−誘導された内皮細胞でｖＷＦの発現（矢印）（×６００）；（ｔ）核（図面内円形フィーチャー）がＤＡＰＩで染色されている血管芽細胞−誘導された内皮細胞でＰＥＣ ＡＭＩ（明るい染色）の偏在化（×２００）；（ｕ）核（図面内円形フィーチャー）がＤＡＰＩにより染色されている血管芽細胞−誘導された内皮細胞でＶＥ−カドヘリンの偏在化（矢印）（×２００）。実施例２を参照。 図１７ｖ−ｃｃ。試験管内ヒトＥＳ細胞から誘導された血管芽細胞（ＢＬ−ＣＦＣまたは芽細胞）の機能性特性化を例示した図面である：（ｖ）マウスＩｇＧイソタイプ対照群；（ｗ）ＣＤ４５及びＣＤ２３５ａ；（ｘ）ＣＤ１３及びＣＤ４５；及び（ｙ）ＣＤ１３及びＣＤ２３５ａ；（ｚ−ｃｃ）精製された血管芽細胞、または芽細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞から誘導された内皮細胞：（ｚ）Ａｃ−ＬＤＬアップデート（矢印ヘッド部）及びｖＷＦ発現（矢印、×６００）；（ａａ）Ａｃ−ＬＤＬのアップデート（矢印ヘッド部）及びＶＥ−カドヘリンの発現（矢印ヘッド部、×６００）；（ｂｂ）ｖＷＦの発現（矢印）及びＣＤ３１の発現（矢印ヘッド部、×６００）；（ｃｃ）ＶＥ−カドヘリンの発現（矢印）及びＣＤ３１の発現（矢印ヘッド部、×６００）。実施例２を参照。 ｈＥＳ細胞から誘導された芽細胞コロニーのクロン形成性（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を例示した図面である：（ａ−ｃ）芽細胞コロニーのクロン形成性：（ａ）及び（ｂ）芽細胞コロニーのクロン起源を立証した、ＷＡ０１−ＧＦＰとＭＡＯ１ ＥＢとの混合物で発育された２種の芽細胞コロニー：（ａ）相イメージ（×１００）；（ｂ）ＧＦＰイメージ（×１００）；（ｃ）単一細胞から発育された芽細胞コロニー（×４００）；（ｄ−ｅ）造血系統及び内皮系統の両者が観察される（×２００）、液体培養物で単一芽細胞コロニーの増殖：（ｄ）×２００；（ｅ）×４００；（ｆ−ｈ）単一ＢＣから誘導された内皮細胞：（ｆ）単一ＢＣから誘導された付着性細胞をプレートした後、マトリゲル上に形成された毛細管類似構造（×１００）；（ｇ）核がＤＡＰＩで染色されている、単一ＢＣから誘導された内皮細胞によるＡｃ−ＬＤＬ吸収（矢印）（×４００）；（ｈ）核がＤＡＰＩで染色されている、単一ＢＣ−誘導された内皮細胞でｖＷＦの発現（矢印）（×４００）；（ｉ−ｍ）単一ＢＣから誘導された造血ＣＦＵ：（ｉ）ＣＦＵ−赤血球系（×１００）；（ｊ）ＣＦＵ−顆粒球（×１００）；（ｋ）ＣＦＵ−大食細胞（×１００）；及び（ｍ）ＣＦＵ−多系統（混合物、×１００）。ゲルはＷＡ０１−ＧＦＰ＋細胞とＭＡ０１−ＧＦＰ−細胞とのプレート混合物から誘導されたＧＦＰ＋及びＧＦＰ−ｈＥＳ−ＢＣ（血管芽細胞）でＧＦＰ配列のＰＣＲ分析の結果を表す。レーン：ＷＡ０１−ＧＦＰ＋、母体ＷＡ０１／ＧＦＰ＋ｈＥＳ細胞；ＭＡ０１−ＧＦＰ−、母体ＭＡ０１ｈＥＳ細胞；Ｈ２０、水陰性対照群；ＢＣ−ＧＦＰ＋、細胞混合プレートから吸収されたＧＦＰ陽性ＢＣ；１−１０、細胞−混合プレートから吸収されたＧＦＰ陰性ＢＣ．ミオゲニン遺伝子はＰＣＲ反応対照群として使用した。実施例２を参照。 ｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４融合蛋白質の特徴を提供する。（Ａ）６ｘＨｉｓ−融合されたｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４組み換え型蛋白質をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、ニッケルプロバンド（ＰｒｏＢａｎｄ）樹脂を通じて精製した。脱塩化されたｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４蛋白質の二バッチ（（１）及び（２）で表示）に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通じてその純度及び濃度を確認した。（Ｂ）ｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４蛋白質は５％ＦＢＳを含む培地中では不安定であったが、（Ｃ）生存ＥＳ細胞を含む無血清培地中では無欠状態を保持した（Ｎ＝幹細胞ＩＩ培地単独；ｈ＝時間）。 図２０ａ−ｂ。ｈＥＳ−誘導された血管芽細胞を全身注入した後、虚血性網膜血管構造が剛健に復旧されることを示す図面である。網膜虚血症は、マウス眼球の前室に対して静水圧を２時間ほど加えて誘導した。７日後、蛍光標識された（ＧＦＰ＋）血管芽細胞をガラス体内、または静脈内に注入した。１日後、この動物を安楽死させた。眼球を摘出して切開し、網膜を扁平に固定させ、レーザー走査共焦点顕微鏡を通じて映像化するか、映像化のために切片化した。（ａ）背景に緑色蛍光発光のない典型的な網膜の血管解剖図を示す代表的な対照群（未損傷）眼球の併合図であり、個別ＧＦＰ＋（下部挿入部）及びＧＦＰ−（上部挿入部）チャンネルをさらに確認でき；（ｂ）虚血性血管構造で導入された蛍光標識された（ＧＦＰ＋）血管芽細胞−誘導された細胞（血管構造の明るい部分）を示す、同一動物の処理された眼球の併合図であり、実施例５に記述したように、個別緑色（ＧＦＰ＋血管芽細胞、下部挿入部）及び未標識細胞（上部挿入部）も見られる。実施例５を参照。 図２０ｃ−ｅ。ｈＥＳ−誘導された血管芽細胞を全身注入した後、虚血性網膜血管構造が剛健に復旧されることを示す図面である。網膜虚血症は、マウス眼球の前室に対して静水圧を２時間ほど加えて誘導した。７日後、蛍光標識された（ＧＦＰ＋）血管芽細胞をガラス体内、または静脈内に注入した。１日後、この動物を安楽死させた。眼球を摘出して切開し、網膜を扁平に固定させ、レーザー走査共焦点顕微鏡を通じて映像化するか、映像化のために切片化した。（ｃ）未損傷対照群（ＧＦＰ蛍光発光無し（明るいか、薄い灰色））の併合図である、（ｄ）及び（ｅ）は全身血管芽細胞投与以後２日（ｄ）及び７日（ｅ）の虚血性眼球の併合図である（ＧＦＰ＋細胞は明るいか、薄い灰色に見える）。実施例５を参照。 図２０ｆ。ｈＥＳ−誘導された血管芽細胞を全身注入した後、虚血性網膜血管構造が剛健に復旧されることを示す図面である。網膜虚血症は、マウス眼球の前室に対して静水圧を２時間ほど加えて誘導した。７日後、蛍光標識された（ＧＦＰ＋）血管芽細胞をガラス体内、または静脈内に注入した。１日後、この動物を安楽死させた。眼球を摘出して切開し、網膜を扁平に固定させ、レーザー走査共焦点顕微鏡を通じて映像化するか、映像化のために切片化した。（ｆ、Ｘ６００、共焦点）、蛍光免疫細胞化学でＩ／Ｒ損傷を受けたマウス眼球の横断面で存在する損傷された血管構造に対して血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）−誘導された内皮細胞を共存させた；内境界膜に隣接した神経節細胞層内血管内腔の高配率拡大図では、周辺に内皮細胞（矢印、ＣＤ３１）及び血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）から誘導された成熟した内皮細胞（矢印、ヒト核抗原）で取り囲まれた内腔が見られる。挿入上部及び中間パネルは、複合映像を作るために使われた個別ヒト核抗原及びＣＤ３１チャンネルである。下部パネルは、前記のような領域の低倍率拡大図であって、ボックスはあらゆるパネルに表した部分を示す。Ｖ＝ガラス体；ＩＰＬ＝内部網状層；ＲＰＥ＝網膜色素上皮細胞層；Ｃｈ＝脈絡膜。実施例５を参照。 糖尿病性ラットの網膜血管構造に血管芽細胞、または未分化細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞が導入されたことを示す図面である。（ａ）及び（ｂ）は、ガラス体内の血管芽細胞投与後、約２日の糖尿病性ラットの網膜血管構造の併合映像であって、ここでは、大型血管及び小型血管の両方ともに大量で血管芽細胞が導入されたことを示す（明るいか、薄い灰色部分）と、（ｃ）血管芽細胞の投与後、約２日の対照群（非糖尿病性）ラットの併合図であり、血管芽細胞（または血管芽細胞−誘導された細胞）が血管構造で導入されず、網膜の上部上に位置するシートを形成すると現れた（軟らかい灰色層）。（ｄ、Ｘ１００）、ガラス体内の未分化細胞注入後、約２日の非糖尿病性対照群ラット由来切片は、ヒト核抗原染色に対しては陰性であったが、内皮に対しては明らかに陽性であった（ＣＤ３１、矢印）。（ｅ、Ｘ１００）及び（ｆ、Ｘ６００、共焦点）はガラス体内の血管芽細胞の注入後、約２日の糖尿病性ラット由来のラット眼球切片であって、ＣＤ３１及びヒト核抗原抗体で染色したが、ガラス体と神経網膜とを分離する内境界膜に対して直ちに背面に存在する網膜の神経節細胞層内の血管内腔の内層細胞にＣＤ３１及びヒト核抗原が共存染色されたことを確かに見ることができる（明るい部分を示す矢印）。実施例６を参照。 血管芽細胞注入後、虚血性後ろ足筋肉及び梗塞された心臓での内皮分化を示す図面である。ａ、ｂ、ｈ及びｉ：梗塞された心臓で血管芽細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞の分化．（ａ（２００Ｘ））、ヒト特異的ｖＷＦ抗体で免疫染色した対照群マウス由来の梗塞心筋切片であって、ヒトｖＷＦで染色されなかったと現れ、（ｂ、２００Ｘ）及び（ｉ、Ｘ６００共焦点）、ヒト特異的ｖＷＦ抗体で免疫染色した、血管芽細胞の注入後、４週経過した梗塞心筋切片である（（ｂ）及び（ｉ）で薄い灰色または明るい部分）と、（ｈ）シャム手術、培地対照群及び血管芽細胞を処理したマウスの生存曲線である。ｃ−ｇ：虚血性後ろ足筋肉で血管芽細胞の分化。（ｃ、５０Ｘ）、ヒト特異的ｖＷＦ抗体で免疫染色した対照群マウス由来の後ろ足筋肉切片であって、ヒトｖＷＦで染色されなかったと現れ、（ｄ、５０ｘ）及び（ｅ、６００Ｘ、共焦点）、ヒト特異的ｖＷＦ抗体で免疫染色した、血管芽細胞注入後、４週ごろの虚血性後ろ足筋肉切片である（薄い灰色）；（ｆ）手術的に誘導させた虚血性脚に対する血流復元を示す図面である。後ろ足血流は、６×１０⁵ 血管芽細胞を与えられたマウス及び培地のみを受けたマウスで結紮後、ないし３０日間連続してモニターリングした。血流は、非虚血性脚に対する虚血性脚での流速として算出し、（ｇ）レーザードップラー血流映像。対照群（培地）及びＢＣ細胞を注入した虚血性動物（各群に対して、ｎ＝６）の映像である。実施例７及び８を参照。 心筋梗塞（ＭＩ）マウス由来の心臓組織切片に対するＧＦＰ（最も薄いか、明るい部分）及びｃＴｎＩ（中間灰色）の免疫染色を示す図面である。実施例８を参照。矢印は、注入された血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）から誘導された二重陽性染色細胞を示す。 平滑筋で血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）が分化したことを表す図面である。血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）で単離したＲＮＡのＰＣＲを通じて確認時、血管芽細胞は平滑筋特異的遺伝子を発現した。血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）はまた、試験管内でも平滑筋細胞に分化した。カルポニン及びα−ＳＭＡに対する免疫染色によれば、分化された細胞はこれら２つの平滑筋細胞マーカーを発現すると現れた。

用語“血管芽細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）”及び“血管コロニー形成細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏ−ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ）”は、本出願書の全般にわたって相互交換的に使われる。これら細胞は、これに制限されるものではないが、１つ以上のマーカーの発現（ＲＮＡまたは蛋白質）または発現欠如（ＲＮＡまたは蛋白質）をはじめとする多様な構造的及び機能的特性に基づいて説明しうる。血管コロニー形成細胞は、少なくとも造血細胞類型または内皮細胞類型を生成するように分化される。血管コロニー形成細胞は、望ましく両性能（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）で少なくとも造血細胞類型及び内皮細胞類型を生成するように分化される。このように、本発明の血管コロニー形成細胞は、少なくとも単性能であり、望ましくは、陽性能である。しかし、追加的に血管コロニー形成細胞は、相当な発生能を有することができ、一定実施形態では、他の系統の細胞類型を生成するように分化される。一実施形態で、血管コロニー形成細胞は、他の中はい葉誘導体（ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、例えば、心臓細胞（例えば、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ））及び／または平滑筋細胞（ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）を生成するように分化される。

一定実施形態で、血管芽細胞は、血小板及び赤血球細胞を含む造血細胞にさらに分化され、これに制限されるものではない。このような細胞は、輸血時に使用しうる。輸血のための大量の細胞を生成する能力は、国全体の血液銀行及び病院で体験している慢性的な血液不足を軽減させるようになる。一定実施形態で、本発明の方法は、輸血のための万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）細胞を生産可能にする。具体的に、Ｏ型及びＲｈ−型の赤血球細胞を容易に生成できて、輸血用の万能血液供給源として提供される。

本発明の方法は、多様な商業的及び臨床的応用分野で、血管芽細胞を容易に多量に試験管内で増幅させうる。試験管内の血管芽細胞の増幅は、血管芽細胞を増殖させることを意味する。本発明の方法は、ヒト造血細胞の増殖量が商業的に有用な量に到達可能にし、また本発明は、多量の血管芽細胞及び多量のヒト血管芽細胞（例えば、１０，０００、１００，０００または５００，０００細胞以上）を含む細胞調製物に関する。一定実施形態で、細胞調製物は、１×１０⁶細胞以上を含む。他の実施形態で、細胞調製物は、ヒト血管芽細胞を２×１０⁶細胞以上に含み、さらに他の実施形態では、ヒト血管芽細胞を３×１０⁶細胞以上に含む。さらに他の実施形態で、細胞調製物は、ヒト血管芽細胞を４×１０⁶細胞以上に含む。

本発明は、１０，０００ないし４百万以上の哺乳類（例えば、ヒト）血管芽細胞を含む溶液、調製物及び組成物に関する。このような溶液、調製物及び組成物のうち、血管芽細胞の数は、１０，０００ないし４百万またはそれ以上の範囲内の任意の数でありえる。この数は、例えば、２０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１百万でありうる。

同様に、本発明は、ヒト血管芽細胞の子孫細胞の調製物（例えば、ヒト造血細胞、及び内皮細胞を含むヒト造血母細胞）に関する。本発明はまた、血管芽細胞及び／または血管芽細胞系統細胞を生産、保管及び分配する方法に関するものである。

本発明の血管コロニー形成細胞は、これらの構造的または機能的特徴のうち、１つまたはその任意組合わせに基づいて同定するか、特徴を糾明しうる。これら細胞が任意の多数供給源、例えば、胚芽組織（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｔｉｓｓｕｅ）、出生期組織（ｐｒｅｎａｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ）、または周産期組織（ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ）から誘導できるが、用語“血管コロニー形成細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏ−ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）”という供給源と関係なく、少なくとも造血細胞類型及び／または内皮細胞類型を生成するように分化することができ、前述した構造的または技術的特性を有する細胞に対して使用するということを留意せねばならない。
胚様体及び血管芽細胞を得るためのヒト胚芽幹細胞の試験管内分化
本発明は、ヒト胚芽幹細胞からまたはヒト胞胚または割球で誘導されるヒト血管芽細胞を生成及び増殖させる方法を提供する。このように生成される血管芽細胞は精製及び／または分離しうる。

本発明は、血清が使われていない胚芽幹細胞からヒト血管芽細胞を生成及び増殖させる方法を提供する。無血清条件が血清を必要とする条件より良好な製造工程（ＧＭＰ）ガイドライン下での大規模製造にさらに有利である。また、無血清条件は、培地に添加される特定因子の半減期を延長させる（例えば、血清が存在しない場合、培地で成長因子、サイトカイン及びＨＯＸＢ４を含む蛋白質の半減期が増加する）。特定の実施形態では、無血清培地がヒト血管芽細胞を生成及び増殖させるための本発明方法を通じて使われる。

ヒト血管芽細胞を生成及び増殖させるための本方法の第１段階で、ヒト幹細胞は無血清培地で成長されて胚様体に分化されるように誘導される。胚様体形成を誘導するために、胚芽幹細胞をペレット化して１つ以上の形態形成因子及びサイトカインを補充した後、低付着（例えば、超低付着）培養プレートにプレートした無血清培地に（例えば、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩまたはＩＩ培地（Ｓｉｇｍａ^TM）中に）再懸濁させうる。形態形成因子及びサイトカインは、骨形態形成蛋白質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、しかしＢＭＰ−３は除き）及びＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＦＬを含むことができるが、これに限定されない。骨形態形成蛋白質及びＶＥＧＦは、単独でまたは他の因子と共に使われうる。形態形成因子及びサイトカインは、細胞培養０〜４８時間から培地に添加されうる。このような条件下に恒温処理した後、血小板形成因子（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ−３配位子及び幹細胞因子（ＳＣＦ）を含むが、これに限定されない初期造血増殖サイトカインの存在下で恒温処理すれば、プレートされたＥＳ細胞がＥＢを形成しうる。ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３配位子及びＳＣＦ以外に、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４及びＨｏｘＢ４も培地に添加されうる。一実施形態で、まずヒトＥＳ細胞をＢＭＰ−４及びＶＥＧＦ１６５（例えば、２５〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下に成長させた後、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ１６５、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＦＬＴ３配位子（ｌｉｇａｎｄ）（例えば、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）及びＨｏｘＢ４（例えば、本願に開示されたような１．５〜５μｇ／ｍｌのトリプル蛋白質伝達ドメイン−ＨｏｘＢ４融合蛋白質）の存在下に成長させる。追加因子をプレートの後、４８〜７２時間に添加しうる。

本発明の前記方法で、ヒト血管芽細胞は、初期胚様体（“ＥＢ”）から分離される。初期ＥＢから血管芽細胞の分離は、試験管内の細胞の増殖を支援する。ヒト細胞で、血管芽細胞は、１０日未満で成長したＥＢから得られる。本発明の特定の実施形態で、血管芽細胞は２〜６日間成長したヒトＥＢで発生する。一実施形態によれば、血管芽細胞を確認して４〜６日間成長したヒトＥＢから分離しうる。他の実施形態では、血管芽細胞を分離する前にヒトＥＢを２〜５日間成長させる。特定の実施形態では、血管芽細胞を分離する前にヒトＥＢを３〜４．５日間成長させる。

特定の実施形態で、初期ＥＢを洗浄し（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡまたはコラゲン分解酵素Ｂによって）分離する。選択された数の細胞（例えば、２〜５ｘ１Ｏ⁵細胞）を血管芽細胞成長のために最適化された無血清メチルセルロース培地（例えば、ＢＬ−ＣＦＵ培地、例えばＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｈ４４３６、または血管芽細胞増殖培地（ＨＧＭ）、またはＭＤＭのうち、１．０％メチルセルロース、１〜２％牛血清アルブミン、０．１ｍＭ２−メルカプロエタノール、１０μｇ／ｍｌｒｈ−インシュリン、２００μｇ／ｍｌの鉄結合ヒトトランスフェリン、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−Ｇ−ＣＳＦを含有する任意の培地）（“ｒｈ”は、“組み換えヒト”を意味する）と混合する。このような培地には、初期段階サイトカイン（ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬ、ＦＬｔ−３、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４及びＢＭＰ７を含むが、これに限定されない、しかしＢＭＰ３は除き）及びＨＯＸＢ４（または、さらなるホメオボックス蛋白質）を補充しうる。特定の実施形態では、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を培地に添加する。追加実施形態では、ＥＰＯ、ＳＣＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４及びＨｏｘＢ４を培地に添加する。追加実施形態では、細胞をＥＰＯ、ＴＰＯ及びＦＬの存在下に成長させる。Ｈ９が出発ヒトＥＳ細胞株である特定の実施形態では、ＥＰＯ、ＴＰＯ及びＦＬを培地に添加する。ＥＰＯ、ＴＰＯ及びＦＬ以外に、Ｈ９から誘導された細胞または他のＥＳ細胞のための培地はＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４及びＨｏｘＢ４をさらに含むことができる。

血管芽細胞を含む、本方法によって得られる細胞（前記細胞はＢＬ−ＣＦＵ培地内にありえる）を超低付着培養プレートにプレートし、ＣＯ₂恒温処理器で恒温処理して血管芽細胞コロニーを成長させる。一部細胞は、２次ＥＢを形成しうる。３〜６日後、一部の場合３〜４．５日後、血管芽細胞コロニーが観察される。血管芽細胞コロニーは、特徴的な葡萄状形態及び／または小型サイズによって２次ＥＢのような他の細胞と区別されうる。また、血管芽細胞は、特定マーカーの発現（例えば、初期造血細胞マーカー及び内皮細胞マーカーの発現）及び少なくとも造血細胞及び内皮細胞への分化能（以下、血管芽細胞系統細胞誘導参照）で確認されることができる。例えば、血管芽細胞は、成熟した内皮細胞または造血細胞の特徴的な一定の特徴を欠如しても、これら細胞は（例えば、ＣＤ７１＋のような）特定マーカーの存在及び他のマーカー（例えば、ＣＤ３４−）の不在で確認されることができる。血管芽細胞はまた、ＧＡＴＡ−１及びＧＡＴＡ−２蛋白質、ＣＸＣＲ−４、及びＴＰＯとＥＰＯ受容体を発現させることができる。また、血管芽細胞は他のマーカー（例えば、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＫＤＲ、または他の付着分子）の発現が低いか、ないということを特徴とすることができる。また、血管芽細胞は、特定遺伝子、例えば、血管芽細胞及び初期の未発達赤芽細胞発達と関連した遺伝子、例えば、ＳＣＬ、ＬＭＯ２、ＦＬＴ−Ｉ、胚芽胎児グロビン遺伝子、ＮＦ−Ｅ２、ＧＡＴＡ−１、ＥＫＬＦ、ＩＣＡＭ−４、グリコホリウンス（ｇｌｉｃｏｐｈｏｒｉｕｎｓ）及びＥＰＯ受容体の発現を特徴とすることができる。

したがって、血管芽細胞は大きさ（他の細胞より小さい）によって分離するか、または例えば、免疫親和性カラムクロマトグラフィーによってアンチ−ＣＤ７１＋抗体で精製しうる。

血管芽細胞は、以下の手続によって大きさ及び／または形態により分離されうる。６〜７日成長後、前記細胞混合物はＥＢ（これは丸くて多数の細胞の塊りである）及び血管芽細胞（これは葡萄状であり、ＥＢより小さく、単一細胞である）を含有する。したがって、血管芽細胞は、形態及び大きさを基準に分離しうる。血管芽細胞は、例えば、細胞混合物を顕微鏡で観察する場合、手作業で選び出すことができる。以後、細胞をコロニー（各コロニーは１００〜１５０個の細胞を有する）に成長させることができる。

前記のように誘導されるヒト血管芽細胞コロニーを選び出してメチルセルロースＣＦＵ−培地上で再プレートして造血ＣＦＵを形成しうる。特定の実施形態で、ＣＦＵ−培地は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｈ４４３６を含む。追加実施形態では、血管芽細胞をサイトカイン及び他の因子を補充したＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地でプレートする。例えば、個々のＢＬ−ＣＦＣコロニーを手で取ってＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩと組み換え型ヒトＳＣＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（例えば、２Ｏｎｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ−４（例えば、１５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−１（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、内皮細胞成長補充物（ＥＣＧＳ、例えば、１００μｇ／ｍｌ）、Ｅｐｏ（例えば、３Ｕ／ｍｌ）を含有するフィブロネクチン−コーティングプレートに移すことができる。試験管内で１週間成長させた後、用心深くピペットで採取して非付着造血細胞を除去し、造血ＣＦＵ分析に直接使用することができる。非付着細胞を除去した後、付着群集をＥＧＭ−２内皮細胞培地（Ｃａｍｂｒｅｘ^TM）で１週間成長させた後、ｖＷＦの発現を調べることができる。
試験管内血管芽細胞の増殖
本発明の特定様態は、血管芽細胞の試験管内増殖に関する。特定の実施形態で、本発明の方法で増殖される血管芽細胞は、前記のようにヒト胚芽幹細胞から誘導される初期胚様体から得られる。

ヒト胚芽幹細胞（ｈＥＳ細胞）から血管芽細胞を誘導する以外に、増殖させる血管芽細胞はまた、ほ乳動物胚芽（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０）：２１−４４、米国特許公報２００４／００５２７７１号）、臍帯組織及び胎盤からの臍帯血（Ｐｅｌｏｓｉ、ｅｔ ａｌ． ２００２ Ｂｌｏｏｄ（１００）：３２０３−３２０８；Ｃｏｇｌｅ ｅｔ ａｌ． ２００４ Ｂｌｏｏｄ（１０３）：１３３−５）、末梢血液及び骨髄（Ｐｅｌｏｓｉｅｔａｌ．２００２ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ（１００）：３２０３−３２０８）のような他のほ乳動物供給源から分離しうる。特定の実施形態では、増殖させる非ヒト血管芽細胞を（マウス及び非ヒト霊長類のような）非ヒト胚芽幹細胞から生成させることができる。特定の実施形態で、血管芽細胞は、例えば、磁気ビード陽性選別または精製技術（例えば、ＭＡＣＳカラム）のような方法によって臍帯血（ＵＣＢ）または骨髄から得られる。細胞は、そのＣＤ７１＋状態を基準に選択され、ＣＤ３４−として確認されることがある。また、分離された血管芽細胞は、造血細胞系統及び内皮細胞系統の生成可能性に対して試験しうる。特定の実施形態で、分離または精製され、任意に胚芽、臍帯血、末梢血液、骨髄または他の組織から濃厚化された血管芽細胞は純度９５％を超過する。

ヒトの骨髄は、例えば、手術中の患者の分層胸骨から採取して得られる。以後、骨髄は体積で０．１〜１ｍｍ³の組織塊りで保存した後、マウス胚芽栄養供給層（例えば、ミトマイシンＣ−処理または照射された栄養供給層）で成長させうる。骨髄細胞は、１〜２週の培養期間にわたってプレートに付着し、血管芽細胞は、形態特性及び／または細胞マーカーを基準に確認及び分離しうる（ＵＳ２００４／００５２７７１号参照）。以後、細胞を本願に開示された方法によって無血清条件で成長及び増殖させうる。

また、骨髄細胞及び血液または他の組織で由来する細胞を分別して血管芽細胞を得られる。分別方法は、業界に広く公知されており、一般的に陽性選別（すなわち、特定特性を基準にした細胞の保持）及び陰性選別（すなわち、特定特性を基準にした細胞の除去）をいずれも含む。骨髄由来細胞の濃厚化及び分別方法は、ヒト及びマウス細胞に対して最も特徴的である。

蛍光−活性細胞分類（ＦＡＣＳ）、パンニング、免疫磁気分離、免疫親和性クロマトグラフィー、抗体−媒介補体固定、免疫毒素、密度勾配分離などをはじめとする任意の適当な免疫親和性技術を骨髄由来細胞、血液細胞または他の細胞で由来する血管芽細胞の選択／濃厚化に利用しうる。免疫親和性過程で処理した後、所定細胞（陽性選別の場合、免疫親和性試薬によって結合された細胞、陰性選別の場合、免疫親和性試薬によって結合されていない細胞）を回収し、追加回収の免疫親和性選択／濃厚化を経させうる。

本発明の特定様態は、血管芽細胞の試験管内増殖に関する。特定の実施形態で、本発明の方法により増殖された血管芽細胞は、前述したようなヒト胚芽幹細胞から誘導された早期胚様体から得る。他の実施形態で、血管芽細胞は、ヒト組織（例えば、胎盤または臍帯血液、末梢血液、骨髄など）から単離または補強する。

特定の実施形態で、血管芽細胞は、ホメオドメイン蛋白質（本明細書でホメオボックス蛋白質とも称する）の存在下に増殖させる。追加実施形態で、血管芽細胞は、ＨＯＸＢ４の存在下に増殖させる。特定の実施形態で、ＨＯＸＢ４は血管芽細胞の増殖方法を通じて血管芽細胞に添加する。

本発明の方法で血管芽細胞の生成及び増殖に使われるＨＯＸＢ４は全長ＨＯＸＢ４（例えば、公開受託番号ＧＩ：１３２７３３１５、ＧＩ：２９３５１５６８と特定されたＨＯＸＢ４ポリペプチド）だけでなく、その任意の機能性変移体及び活性断片を含むが、これに限定されない。野生型ＨＯＸＢ４蛋白質は、配列番号１、配列番号３のアミノ酸配列またはその蛋白質の任意の他の代案的な対立遺伝子形態でコーディングされうる。このような配列は、Ｇｅｎｂａｎｋのように公開的に入手可能なデータベースを通じて接近しうる。また、ＨＯＸＢ４は、細胞内でエクトピカル（ｅｃｔｏｐｉｃａｌ）に発現されるか、培地に提供されうる。エクトピカルに発現されたＨＯＸＢ４は、誘発促進者に実施可能に連結されうる。培地に提供されたＨＯＸＢ４は、他の細胞形態（例えば、フィーダ層）により分泌されるか、または培地に直接添加されうる。

ＨＯＸＢ４の機能性変移体は、ＨＯＸＢ４の突然変異及び対立遺伝子変移体及びその活性断片を含む。ＨＯＸＢ４の機能性変移体は、本発明の方法によって血管芽細胞を増殖させうる任意のＨＯＸＢ４ポリペプチド及びその活性断片を含む。ＨＯＸＢ４機能性変移体はまた、本来のＨＯＸＢ４蛋白紙に比べて転写活性がさらに大きいＨＯＸＢ４ポリペプチドを含む。ＨＯＸＢ４変移体は、野生型ＨＯＸＢ４と関連して１以上のアミノ酸が置換、付加及び／または欠失された蛋白質を含む。ＨＯＸＢ４変移体はまた、配列番号１または配列番号３に提供された配列と７５％以上類似したポリペプチドを含むが、これに限定されない。したがって、ＨＯＸＢ４変移体は、配列番号１または配列番号３に提供されたアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％及び９９％類似したポリペプチドを含む。

ＨＯＸＢ４の活性断片は、本発明の方法によって血管芽細胞を保持しうる全長ＨＯＸＢ４ポリペプチドの任意の断片を含むが、これに限定されない。したがって、一実施形態で、本発明のＨＯＸＢ４蛋白質は、Ｎ末端の一部、例えば、全長ＨＯＸＢ４のＮ末端３１、３２、または３３アミノ酸が欠失されたＨＯＸＢ４蛋白質である。ＨＯＸＢ４蛋白質のうち、任意のものは追加蛋白質または蛋白質ドメインで融合されうる。例えば、ＨＯＸＢ４は蛋白質伝達ドメイン（ＰＴＤ）に連結されうる。

特定の実施形態で、ＨＯＸＢ４は、血管芽細胞内でエクトピカルに発現されるか、または培地に提供される。エクトピカルに発現されたＨＯＸＢ４は、調節配列に実施可能に連結される。調節配列は、当業系に認知されており、ＨＯＸＢ４ポリペプチドの発現を誘導するために選択される。

培地に提供されたＨＯＸＢ４は、他の細胞類型により分泌されうる。他の細胞類型は、分泌可能なＨＯＸＢ４を発現するために伝えられたマウス間質細胞層のようなフィーダ層でありうる。例えば、ＨＯＸＢ４は、蛋白質の流出及び分泌を促進する疎水性配列または単一ペプチドを含むように融合または操作されうる。代案として、ＰＴＤに共有または非共有結合された融合蛋白質のようなＨＯＸＢ４は培地に直接添加されうる。追加的に、ＨＯＸＢ４は、レトロウイルスベクターまたはアデノウィルスベクターのようなウイルスベクター上に媒介されうる。このようなベクターは、その培養物で血管芽細胞または他の細胞を伝達しうる。

特定の実施形態で、使われるＨＯＸＢ４蛋白質によって、血管芽細胞の増殖の間に選択された時間でＨＯＸＢ４を培地に添加する。血管芽細胞は、無血清培地で増殖されるために、ＨＯＸＢ４は比較的安定的である。したがって、特定の実施形態で、ＨＯＸＢ４蛋白質または融合蛋白質を毎日ヒト血管芽細胞に添加する。他の実施形態で、ＨＯＸＢ４蛋白質または融合蛋白質を隔日で添加し、また他の実施形態でＨＯＸＢ４蛋白質または融合蛋白質を二日ごとに添加する。一実施形態で、ＨＯＸＢ４融合蛋白質、ＨＯＸＢ４−ＰＴＤは二日ごとに培地に添加する。

特定の実施形態で、血管芽細胞は、このような細胞の増殖に十分に存在する任意の他の成長因子または蛋白質の存在下に増殖させることができる。

ヒトまたは非ヒトＥＳ細胞、骨髄、胎盤またはヘソ臍帯血液、末梢血液または他の組織をはじめとする任意の供給源から得た血管芽細胞を前記方法によって増殖させることができる。したがって、特定の実施形態で、選択された数の精製された血管芽細胞または補強された細胞を血管芽細胞成長に対して最適化された無血清メチルセルロース培地（例えば、ＢＬ−ＣＦＵ培地、実施例１及び２参照）と混合する。この培地を初期段階サイトカイン（ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬ、ＶＧＦ、ＢＭＰ類似ＢＭＰ２、ＢＭＰ４及びＢＭＰ７を含むが、これに限定されない。ＢＭＰ３は除外）及びＨＯＸＢ４で補完されうる。特定の実施形態で、エリトロ蛋白質（ＥＰＯ）を培地に添加する。特定の実施形態で、ＥＰＯ、ＴＰＯ及びＦＬを培地に添加する。次いで、細胞を超低付着培養プレートに置いてＣＯ₂インキュベータで成長させる。前記のように、血管芽細胞コロニは、特有の葡萄類似外形を表し、他の細胞より比較的小さく、よって、他の細胞類型と区別されうる。血管芽細胞に対してマーカーのみならず、造血細胞または内皮細胞血統でさらに分化されうるその能力を試験しうる。次いで、血管芽細胞を単離し、試験管内で増殖させる。増殖に使われる培地は、初期段階サイトカイン及びＨＯＸＢ４で補完された血管芽細胞成長に対して最適化された無血清メチルセルロース培地（例えば、ＢＬ−ＣＦＵ）を含む。初期段階サイトカインは、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ類似ＢＭＰ２、ＢＭＰ４及びＢＭＰ７を含むが、これに限定されず、ＢＭＰ３は除外する。特定の実施形態で、エリトロ蛋白質（ＥＰＯ）を培地に添加する。追加実施形態で、ＥＰＯ、ＴＰＯ及びＦＬを培地に添加する。

したがって、血管芽細胞増殖用培地は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＢＭＰ−４及びＨｏｘＢ４を含み、特定の実施形態で培地は、ＴＰＯ及びＦＬをさらに含むことができる。約３．５日間培養されたＥＢから製造された単一細胞を収集し、２ないし５分間０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に解離し、２２Ｇ針を３ないし５回通過させて単一細胞懸濁液を製造した。５分間１，０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を収集した。細胞ペレットを５０ないし２００μｌのＳｔｅｍｌｉｎｅ Ｉ培地に再懸濁させた。血管芽細胞を増殖させるために、２〜５×１０⁵ｈＥＳ細胞の分化で誘導された単一細胞懸濁液を、５０ｎｇ／μｌのＴｐｏ及びＦＬを含有するか、含有せず、ＩｓｏｃｖｅのＭＤＭのうち、１．０％のメチルセルロース、１ないし２％の牛血清アルブミン、０．１ｍＭの２−メルカプロエタノール、１０μｇ／ｍｌのｒｈ−インシュリン、２００μｇ／ｍｌの鉄で飽和されたヒトトランスフェリン、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ、３−６単位／ｍｌのｒｈ−Ｅｐｏ、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＢＭＰ−４及び１．５μｇ／ｍｌのｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４を含有する２ｍｌの血管芽細胞増殖培地（ＨＧＭ）と混合した。細胞混合物を超低プレートに置き、４ないし６日間５％ＣＯ２内で３７℃で培養した。

特定状況では、患者または患者親戚から血管芽細胞を得て前記血管芽細胞を試験管内で増殖させることが望ましい。このような状況は、例えば、化学療法または放射線治療を計画している患者、または（患者自身の幹細胞を利用する）自家ＨＳＣ移植を利用しうる他の状況を含む。したがって、本発明は、本発明の増殖された血管芽細胞または血管芽細胞血統細胞を利用して、細胞に基づいた治療を必要とする患者（例えば、造血再構成または治療、または虚血をはじめとする血管損傷の治療または血管成長を必要とする患者、下記参照）を治療する方法であって、血管芽細胞を患者または患者親戚の骨髄、血液または他の組織から得る治療方法を提供する。したがって、特定の実施形態で、血管芽細胞（または血管芽細胞血統細胞）を必要とする患者の治療方法は、患者または患者親戚から血管芽細胞を単離する段階を含むことができる。患者または患者親戚から単離した血管芽細胞は、本発明の方法によって試験管内で増殖させ、次いで患者に投与しうる。代案として、増殖された血管芽細胞は、さらに成長させて患者治療前に造血細胞または内皮細胞を生成させることができる。

体細胞核移植のような当業系に公知された任意の方法により、このような患者からヒトＥＳ細胞をも得られる。次いで、本発明の方法を利用して、この患者の血管芽細胞を生成させ、該固有なＥＳ細胞から増殖させる。これら血管芽細胞またはその血統誘導体を、その患者に、または該親戚に投与しうる。

本発明の方法を使用して、ヒト血管芽細胞を増殖させ、次いで多様な治療及び臨床分野で使われうる商業的量産に到達することができる。また、本願に開示された方法で得た血管芽細胞をさらに分化させて臨床分野で使用するための造血細胞または内皮細胞系統を発生させうる。

ヒトＥＳ細胞からヒト血管芽細胞を生成及び増殖させる本発明の方法から得た血管芽細胞は、少なくとも内皮細胞または造血細胞に分化する潜在性を有する（すなわち、それらは少なくとも両側潜在性である）。他の血管芽細胞また両側潜在性であり得る。しかし、他の血管芽細胞は、造血細胞及び内皮細胞以外の他の細胞に分化されることもある（すなわち、それらは複合または多数潜在性である）。
複雑性が低下した血管芽細胞を得るためのヒト胚芽幹細胞中のＭＨＣ遺伝子の処理
本発明によるヒト血管芽細胞を生成及び増殖させる方法において出発地点として使われるヒト胚芽幹細胞はまた、ヒト胚芽幹細胞のライブラリから由来し、それらそれぞれは、ヒト個体群に存在する１以上のＭＨＣ対立遺伝子に半接合または同型接合である。所定の実施例において、前記幹細胞ライブラリの各構成員は、前記ライブラリの残りの構成員に比べて異なるセットのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合または同型接合である。所定の実施例において、前記幹細胞のライブラリは、ヒト個体群に存在するあらゆるＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合または同型接合である。本発明において、１以上の組織適合抗原遺伝子に同型接合である幹細胞は、１以上の（及び一抹の実施例で、全ての）かかる遺伝子に対して無接合である細胞を含む。遺伝子座に対する無接合は、前記遺伝子がその遺伝子座で０、すなわちその遺伝子の対立遺伝子二つとも消失されるか、または非活性化されたことを意味する。あらゆるＭＨＣ遺伝子に無接合である幹細胞は、当業界に公知の標準方法、例えば、遺伝子ターゲッティング及び／または二重接合性の欠損（ＬＯＨ）によって生成されうる。例えば、米国特許出願ＵＳ ２００４００９１９３６、ＵＳ ２００３０２１７３７４及びＵＳ ２００３０２３２４３０、及びＵＳ仮出願番号第６０／７２９，１７３号を参考にする（これらいずれの開示内容も本願に参考として含まれる）。

従って本発明は、ＭＨＣ複雑性が低下した血管芽細胞のライブラリを含む血管芽細胞を得る方法に係るものである。ＭＨＣ複雑性が低下した血管芽細胞及び血管芽細胞系統細胞は、それが患者一致と関連した困難さを除去するとき、治療分野で利用可能な細胞の供給が増加するであろう。かかる細胞は、ＭＨＣ複合体の遺伝子に対して半接合または同型接合になるように処理された幹細胞から由来しうる。

一様態において、ライブラリの各構成員が１以上のＨＬＡ遺伝子に対して同型接合であるＥＳ細胞株のライブラリは、本発明の方法によって、血管芽細胞を誘導するのに使われる。他の一様態において、本発明は、血管芽細胞（及び／または血管芽細胞系統細胞）のライブラリを提供するが、このとき、いくつかのＥＳ細胞株価選択されて血管芽細胞に分化される。かような血管芽細胞及び／または血管芽細胞系統細胞は、細胞系治療が必要な患者に使われうる。

従って、本発明の所定の実施例は、複雑性が低下した胚芽幹細胞から由来したヒト血管芽細胞、造血母細胞、またはヒト内皮細胞を、これを必要とする患者に投与する方法に係るものである。所定の実施例で、該方法は、（ａ）ヒト血管芽細胞、造血母細胞またはヒト内皮細胞を、投与することを含む治療が必要な患者を確認する段階と、（ｂ）患者の細胞表面で発現されたＭＨＣ蛋白質を確認する段階と、（ｃ）本発明の試験管内ヒト血管芽細胞を生成及び増殖させる方法によって製造された、ＭＨＣ複雑性が低下したヒト血管芽細胞のライブラリを提供する段階と、（ｄ）該患者のＭＨＣ蛋白質を、その細胞に一致させるライブラリからヒト血管芽細胞細胞を選択する段階と、（ｅ）選択的に、段階（ｄ）で確認されたヒト血管芽細胞細胞をヒト造血母細胞、内皮細胞または二つとも、または必要によってこれら二系統のうち一つまたは二つともで追加分化される細胞に分化させる段階と、（ｆ）段階（ｄ）及び／または（ｅ）からの任意の細胞を前記患者に投与する段階とを含む。該方法は、地域センター、例えば、病院、クリニック、診療室及び他の健康管理施設で遂行されうる。また、患者に一致すると選択された血管芽細胞は、少ない細胞数で保存される場合、患者治療に先立ち増殖されうる。
ヒト血管コロニー形成細胞／血管芽細胞
所定の様態において、本発明はヒト血管コロニー形成細胞を提供する。これら細胞は、多様な治療及び他の用途を有した唯一の初生細胞類型である。また、この細胞類型は、少なくとも造血及び／または内皮系統の進化を研究するのに重要なツールを提供する。このように本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む組成物及び多様な調製物（薬学調製物を含む）だけではなく、血管コロニー形成細胞から部分的または定期的に分化された１以上の細胞類型を含む組成物及び調製物（薬学調製物を含む）に係るものである。

「血管芽細胞」及び「血管コロニー形成細胞」という用語は、本出願全体で入れ替えて使われるであろう。これらの細胞は、以下に限定されるものではないが、１以上のマーカの発現（ＲＮＡまたは蛋白質）または発現不足（ＲＮＡまたは蛋白質）を含む多数の構造的及び機能的特性を基に記述されうる。血管コロニー形成細胞は分化し、少なくとも造血細胞類型または内皮細胞類型を発生させることができる。血管コロニー形成細胞は両性潜在性でであり、分化して少なくとも造血細胞類型及び内皮細胞類型を発生させることができることが望ましい。このように、本発明の血管コロニー形成細胞は、少なくとも単一潜在性であり、望ましくは両性潜在性である。追加的ではあるが、血管コロニー形成細胞は、さらに大きいレベルの進化潜在性を有することができ、所定の実施例において、分化して他系統の細胞類型を発生させることができる。所定の実施例において、前記血管コロニー形成細胞は分化し、心臓細胞（例えば、心筋細胞）及び／または平滑筋細胞のような他の中胚葉誘導体を生成できる。

本発明のヒト血管コロニー形成細胞は、本願に記載された任意の疾患または状態の治療時を含み（これに制限されるものではない）、本願に記載された任意の方法または利用分野で使用できる。
実験室内で増殖された血管芽細胞を含む細胞製剤
本発明の特定実施例で、哺乳動物（ヒトを含む）の血管芽細胞は、商業用数量に達するほどに増殖され、多様な治療学的及び臨床的利用分野で使用する。特定実施例で、血管芽細胞は、１０，０００ないし４百万（またはそれ以上）の次数の細胞数に達するように増殖される。かような細胞数は、出発初期の製剤の３ないし４日内に到達しうる。従って本発明は、多量の血管芽細胞を含む製剤であって、前記製剤が少なくとも１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、百万、２百万、３百万または４百万の細胞を含む製剤に係るものである。

また本発明は、多量の血管芽細胞を含む溶液、組成物、及び製剤であって、前記溶液、前記組成物、及び前記製剤が少なくとも１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、百万、２百万、３百万または４百万の細胞を含む溶液、組成物、及び製剤に係るものである。血管芽細胞はヒトのものでありうる。

本発明の他の様態は、本願に開示された方法によって収得された血管芽細胞を、臨床的利用分野で後続的に使われる、造血または内皮の細胞系譜、または系譜二つともに分化させるものに係るものである。従って本発明はまた、多量の造血または内皮細胞を含む細胞製剤に係るものである。本発明はまた、本願に開示された方法によって収得された血管芽細胞を造血及び内皮細胞以外の他の細胞系譜に分化させることに係るものである。従って本発明はまた、多量の他の血管芽細胞分化細胞を含む細胞製剤に係るものである。

多量（例、千万または百万）の血管芽細胞を含む組成物及び製剤は、本願に記載された通りに収得した血管芽細胞を増殖させることによって収得できる。従って本発明は、ＥＳ細胞（例えば、ヒトＥＳ細胞）または臍帯血、末梢血または骨髄血から収得された血管芽細胞を増殖させることによってなされた多量の血管芽細胞を含む組成物及び製剤に係るものである。さらに増殖方法として、例えば、マウス、ラット、牛、または非ヒト霊長類の血管芽細胞に利用される。また本発明は、ヒト以外の他種の多量の血管芽細胞を含む組成物及び製剤に係るものである。本発明の方法によって増殖された血管芽細胞は、二分化性（ｂｉ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）でありうる。すなわち、その細胞は、内皮細胞または造血幹細胞に分化されうる。特定実施例で、ヒトＥＳ細胞から生成されて増殖されたヒト血管芽細胞は、二分化性である。血管コロニー形成細胞は、少なくとも造血細胞類型または内皮細胞類型を提供するために分化されうる。血管コロニー形成細胞は望ましくは二分化性であり、少なくとも造血細胞類型及び内皮細胞類型を提供するために分化されうる。かかる機能において、本発明の血管コロニー形成細胞は少なくとも単一分化性（ｕｎｉ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、望ましくは二分化性である。さらにしかし、血管コロニー形成細胞は高い程度の発生潜在力を有することができ、特定実施例で、他の系譜の細胞類型を提供するために分化されうる。特定実施例で、血管コロニー形成細胞は、他の中胚葉性分化体、例えば、心臓細胞（例えば、心筋細胞）及び／または平滑筋細胞を提供するために分化されうる。
哺乳動物血管芽細胞細胞マーカ
前述の通り、血管コロニー形成細胞は、成体内皮または造血細胞の特徴的な特定の特性が不足している。しかし、かような血管コロニー形成細胞または血管芽細胞は、例えば、ＣＤ７１＋、ＧＡＴＡ−１及びＧＡＴＡ−２蛋白質、ＣＸＣＲ−４、及びＴＰＯ及びＥＰＯの受容体のような多様なマーカによって確認しうる。追加実施例で、血管芽細胞はＬＭＯ−２を発現する。さらに血管芽細胞は、他のマーカの不在または低い発現によって特徴づけられる。従って血管芽細胞は、ＣＤ３４−ＣＤ３１−、及びＫＤＲ−でありうる。追加実施例で、血管芽細胞ＣＤ３４−、ＣＤ３１−、ＫＤＲ−、及びＣＤ１３３−でありうる。

従って特定実施例で、本発明の方法によって生成されて増殖された血管芽細胞は、表２に記載された任意の一つ以上のマーカの存在または不在によって特徴づけられる。例えば、血管芽細胞は、「ＢＬ−ＣＦＣ」の下に「−」で表示された表２に記載された任意の一つ以上のマーカの発現に対する検査に陰性でありうる。従って、一部実施例で血管芽細胞は、ＣＤ３４発現に対して陰性でありうる。該細胞は、追加でまたは代案的にＣＤ３１、ＣＤ１３３、及び／またはＫＤＲ発現に対して陰性でありうる。追加実施例で血管芽細胞は、「＋」で表２に表示された任意のマーカを発現できる。例えば該細胞は、マーカのうち一つ以上を発現できる。ＬＭＯ−２及びＧＡＴＡ−２。マーカの発現は、例えば、蛋白質発現を検査するための免疫組織化学または免疫吸取紙（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）、またはＲＮＡレベルで発現を検査するためのｍＲＮＡ分析のような任意の方法によって検定できる。
血管芽細胞系譜細胞の分化
また本発明の方法及び細胞製剤は、血管芽細胞分化細胞に係るものである。本発明によって生成されて増殖されたヒト血管芽細胞、及び本発明の方法によって増殖された哺乳動物血管芽細胞は、実験室内で分化して造血細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む）または内皮細胞だけではなく、かような２種系譜でさらに分化された細胞を収得できる。かような細胞は、後述の治療学的及び商業的利用分野で後続的に使用できる。

特定実施例で造血細胞は、血管芽細胞を無血清ＢＬ−ＣＦＵで３〜１０日間成長させて誘導する。他の実施例で、ｈＥＳ−誘導されたＢＬ−ＣＦＣ細胞の単一細胞懸濁液を１０〜１４日間成長させる。無血清条件が拡大生産及び調節の指針との適合性だけではなく、コスト減少を促進する限り、無血清条件を維持することが最も望ましい。本発明の血管芽細胞はまた、無血清Ｈｅｍ−培養で成長させることができ（Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（１８６）：６１９−６２４）、これはヒト造血母細胞を維持させ、ＢＳＡ（例えば、１％ＢＳＡ）、インシュリン（例えば、５μｇ／ｍｌヒトインシュリン）、トランスフェリン培地またはトランスフェリン（例えば、１００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン）、Ｌ−グルタミン、ベータ−メルカプトエタノール（例えば、１０^-4Ｍ）及び成長因子を含む。成長因子は、ＳＣＦ（例えば、３００ｎｇ／ｍｌ）、顆粒球−コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３（例えば、３００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−６（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）を含むことができる。血管芽細胞から造血細胞を得るのに有用な他の因子としては、血小板形成因子（ＴＰＯ）及びＶＥＧＦ（例えば、文献［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００５ Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｅｘ（１０４４）：２９−４０］参照）及びＢＭＰ−４を挙げることができる。前記血管芽細胞はまた、多血統造血成長因子カクテルを補充した無血清メチルセルロース培地で成長できる。従って血管芽細胞は、早期活性成長因子（例えば、ｃ−ｋｉｔ配位子、ｆｌｔ３配位子）、多血統成長因子（例えば、ＩＬ−３、顆粒球大食細胞−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ））及び単一血統成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ））、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを補充し、ＢＳＡ、飽和ヒトトランスフェリン、ヒトＬＤＬを含むイスコーブ改質されたＤｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ：Ｉｓｃｏｖｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｍｅｄｉｕｍ）中のメチルセルロースで成長できる。代案として血管芽細胞は、造血細胞（例えば、赤血球、大食細胞または顆粒球）の一類型の成長を支援する単一血統成長因子を含む培地で成長できる。

一実施例で血管芽細胞コロニーは、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ Ｉ培地で再懸濁される。次に、細胞を無血清造血ＣＦＵ培地（Ｈ４４３６、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^TM）１ｍｌ＋ｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４及び０．５％ＥＸ−ＣＹＴＥ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｎｃ．^TM）１．５μｇ／ｍｌと混合する。次に、細胞混合物を細胞培養未処理プレート上でプレーティングし、３７℃で１０〜１４日間恒温処理した。初期プレーティング１０〜１４日後に発生する造血ＣＦＵは、形態学的に、例えばＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染料によって染色されることを特徴とすることができる。

造血細胞はまた、当業界に公知のその他条件を利用して血管芽細胞から誘導できる（例えば、ＩＭＤＭ、３０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０^-4Ｍベータ−メルカプトエタノール及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含む培地で）。また他の実施例で、基本繊維芽細胞成長因子を使用してＥＢ内でＢＬ−ＣＦＣいずれの頻度も向上させ、造血分化を促進できる（Ｆａｌｏｏｎ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１２７）：１９３１−１９４１）。他の実施例で、成長因子造血（ＨＡＰＯ）を利用して血管芽細胞の成長及び造血分化を促進する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｂｌｏｏｄ（１０３）：４４４９−４４５６）。造血細胞への分化は、例えばＣＤ４５状態（ＣＤ４５＋）及びＣＦＵ分析によって評価できる。

造血細胞を形成するために、ヒト血管芽細胞は、ＣＦＵ−培地で３〜１０日間、または任意にさらに長時間（例えば、１０〜２４日）の間成長できる。本発明のヒト血管芽細胞は、顆粒球、赤血球、大食細胞及び巨核細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ／混合）を含むＣＦＵだけではなく、以下の細胞類型（例えば、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｍ及びＣＦＵ−ＧＭ）のうちただ一つを含有するユニットを形成するコロニーを形成できる。特定実施例で、ｈＥＳ−誘導されたＢＬ−ＣＦＣ細胞の単一細胞懸濁液は１０〜１４日間成長し、例えば赤血球、骨髄、大食細胞及び多血統造血細胞のような造血細胞を誘導する。

本発明のさらに他の様態は、本願で記述された方法によって収得されて増殖されたヒト血管芽細胞、またはこれによって増殖された哺乳動物血管芽細胞から誘導された内皮細胞に係るものである。血管芽細胞は、上皮成熟に望ましい条件で成長できる。

本発明の特定実施例で、内皮細胞を得るために、血管芽細胞をまずファイブロネクチン・コーティングされた表面にプレーティングし、３〜５日（または、他の実施例で３〜７日後）後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌの厚い層で再プレーティングして内皮細胞への分化を支援する。前記条件は、血管芽細胞発達中に形成される無血清条件を維持させる。代案として血管芽細胞は、公知の培地で成長して内皮細胞への分化を支援する。かような条件は、例えば２０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、５０ｎｇ／ｍｌ内皮細胞成長補充物（すなわち、脳下垂体抽出物）、１０ ＩＵ／ｍｌヘパリン及び５ｎｇ／ｍｌヒトＶＥＧＦ−Ａ₁₆₅を含むＥｎｄｏ−培養を含む（Ｔｅｒｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ（３６）：１２５−１３２）。当業界に公知の他の条件としては、２５％ＦＣＳ／ウマ血清を補充した培地があり、一部実施例では、ヘパリン（例えば、１０Ｕ／ｍｌ）、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦｌ）（例えば、２ｎｇ）及びＥＣ成長補充物（ＥＣＧＳ、例えば１００μｇ）を補充した培地がある。成長因子ＶＥＧＦ及びＥＧＦをまたＨＡＰＯと共に使用し、内皮分化を支援できる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２００４）。血管芽細胞はまた、コラーゲン及びファイブロネクチンでコーティングされたプレート上にシーディングし、例えば内皮細胞への分化を促進できる。該細胞は、フォンビレブラント因子（ｖＷＦ：ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）及び内皮酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）及び試験管内内皮ネットワーク形成能に対して分析することができる。

従って、内皮細胞を形成するために、前述の方法によって誘導された血管芽細胞コロニーをピッキングし、内皮分化への第１段階に最適化されたファイブロネクチン・コーティングされた培養プレート上に再プレーティングする。前記細胞は、ＥＧＭ−２またはＥＧＭ−２ＭＶ完全培地（Ｃａｍｂｒｅｘ^TM）でプレーティングできる。３〜５日、代案的な実施例では３〜７日後に、前記細胞を内皮分化を支援するＭａｔｒｉｇｅｌ層のような表面上に再プレーティングする。恒温処理１６〜２４時間後、分枝型チューブコード（ｂｒａｎｃｈｅｄ ｔｕｂｅ−ｃｏｒｄ）の形成（例えば、図８参照）で典型的な内皮細胞の挙動が確認される。内皮特定分析、例えばＬＤＬ−吸収はまた、前記細胞が内皮特徴を有するということを確認するのに利用できる。

本発明の他の様態で、本発明によって生成されて増殖されたヒト血管芽細胞及び本発明の方法によって増殖された哺乳動物血管芽細胞は、試験管内で分化されて他の細胞だけではなく、前記細胞血統からさらに分化された細胞を得ることができる。かようなさらなる細胞血統は、本発明によって生成されて増殖された血管芽細胞及び本発明の方法によって増殖された哺乳動物血管芽細胞から誘導されうるが、これは、前記血管芽細胞が造血及び内皮細胞への分化後の潜在的な発達程度がさらに大きくありうるためである。

ヒト血管芽細胞及び血管芽細胞血統細胞の臨床的及び商業的実施例
細胞療法
ヒト血管芽細胞は、生体内で他の造血または内皮細胞に分化する可能性がある一方、これらは、前記２個の細胞類型が必要であるか、または治療を向上させることができる細胞治療で使われうる。また、血管芽細胞血統細胞（すなわち、造血細胞及び／または内皮細胞）を含む任意の療法または治療によって処置されうる。下記部分は、本発明の方法によって生成されて増殖されたり、または本発明の方法によって増殖された本発明のヒト血管芽細胞を使用する方法を記述する。

本発明の特定実施例で、造血細胞を増加させたり治療する処置及び血管成長増加及び／または血管回復促進のための処置が考慮される。従って、特定様態で本発明は、造血細胞または血管成長または回復が必要な患者を治療するための方法及び組成物に係るものである。血管芽細胞は、被験体の血管に注射したり、または手術を介して被験体の血管に投与できる。前記患者及び被験体はヒトでありうる。

本発明の特定実施例で、ヒト血管芽細胞は移植に使われ、これと異なる場合には、ＨＳＣ移植が使われうる。かような移植は、例えば急性または慢性白血病、再生不良性貧血及び多様な免疫欠乏症だけではなく、多様な非血液学的悪性腫瘍及び自家免疫障害を病む患者の治療のための造血再構成に利用し、高い投与量の化学療法及び／または放射線療法後の治療誘発性形成不全から患者を救済するのに利用できる。かような移植は、生体内または生体外で実施できる（例えば、骨髄移植）。

本発明の他の実施例でヒト血管芽細胞は、造血再構成または造血治療が必要な患者を治療するのに使われる。かような患者としては、例えばサラセミア（地中海貧血）、鎌状赤血球貧血症、再生不良性貧血症（低形成貧血症ともいう）、血球減少症、骨髄低形成症、血小板欠乏症、造血悪性腫瘍、例えば白血病、夜間発作性血尿症（ＰＮＨ）及びＡＤＡ（例えば、脱アミノ酵素（ＡＤＡ）−欠乏重症複合免疫欠乏症（ＳＣＩＤ））を病む患者を挙げることができる。

従って、本発明の具体的な実施例は、本発明の血管芽細胞を利用した造血再構成または造血治療を必要とする患者の治療方法に係るものである。従って本発明は、造血再構成または治療を必要とする患者の治療方法であって、これを必要とする患者の選別、本発明の方法によるヒト血管芽細胞の生成と増殖または増殖、前記ヒト血管芽細胞の患者への投与を含む方法に係るものである。従って前記方法は、生成及び増殖されたり、または増殖されたヒト血管芽細胞をヒト造血細胞に分化させた後、造血細胞を患者に投与することを含むことができる。

代案的な実施例は、ヒト血管芽細胞を大規模に生成し、これを必要とする患者の先立って保管する方法を含む。従って本発明のさらに他の実施例は、造血再構成または治療を必要とする患者の治療方法であって、これを必要とする患者の選択、前述の方法によってすでに分離されて増殖されたヒト血管芽細胞に対する処方、及び前記ヒト血管芽細胞の前記患者への投与を含む方法に係るものである。同様に前記方法は、前記ヒト血管芽細胞をヒト造血細胞に分化させることと、前記造血細胞を患者に投与することとを含むことができる。追加実施例で、１以上のＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合であるか、または同型接合である血管芽細胞を成長させ、任意に商業的な量に成長させ、任意に企業体が保管する。患者がかような細胞または血管芽細胞血統細胞を必要とする場合、臨床医または病院は、事業体にかような細胞を注文する。

本発明のヒト血管芽細胞は、血管形成微小棲息環境下で内皮細胞に増殖及び分化するために、ヒト血管芽細胞は、治療的方式に使われて患者の傷部位で新しい血管を提供したり、または損傷血管の回復を誘導できる。従って、特定様態で本発明は、新しい血管の成長または損傷血管系の回復を促進させる方法に係るものである。本発明のヒト血管芽細胞は、内皮損傷、例えば心筋梗塞、脳卒中及び虚血性脳、虚血性四肢及び虚血性四肢を含む皮膚傷及び糖尿病動物または患者から発生する傷、及び網膜での虚血性再貫流損傷を治療するのに使用できる。本発明の血管芽細胞で治療できるその他虚血性病態としては、腎臓虚血、肺虚血及び虚血性心筋病症を挙げることができる。血管芽細胞はまた、気球血管形成または脳血管ステントの発達後に損傷された血管の回復を助けるのに使用できる。血管芽細胞はまた、組織移植、手術、及び放射線損傷後に使用できる。また血管芽細胞は、アテローム性動脈硬化症の治療及び／または進展の防止だけではなく、全身硬化症及びレイロード現象（ＲＰ）で発生する内皮細胞損傷を回復させるのに使用できる（Ｂｌａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．（２０）：１３２５−３０）。

従って本発明は、血管成長の提供や、これを必要とする患者の回復と関連した多様な方法を提供する。一実施例で本発明は、虚血性組織での新しい血管形成をこれを必要とする患者で誘導する方法であって、前記患者に前述のヒト血管芽細胞の精製された製剤を有効量で投与し、前記虚血性組織に新しい血管を形成させることを含む方法を提供する。従って本発明の特定様態は、血管形成をこれを必要とする患者で増大させる方法であり、これを必要とする患者の選別、前述のようなヒト血管芽細胞の分離、及び前記血管芽細胞の前記患者への投与を含む方法を提供する。他の様態で本発明は、損傷された血管の治療を必要とする患者で損傷された血管を治療する方法であって、これを必要とする患者の選別、前述のようなヒト血管芽細胞の増殖または生成と増殖、及び前記血管芽細胞の前記患者への投与を含む方法を提供する。前述の実施例以外に、血管芽細胞は大規模に生成し、血管芽細胞を必要とする患者の選別以前に保管できる。追加実施例で、１以上のＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合であるか、または同型接合である血管芽細胞を成長させ、任意に商業的な量に成長させ、血管芽細胞治療の対象として患者を選別する前に任意に保管する。前述の血管芽細胞または血管芽細胞製剤のうち任意のものを循環系に直接（静脈内に）投与できる。特定実施例（例えば、目での血管回復が必要な場合、例えば網膜の虚血／再貫流損傷の治療の場合）、血管芽細胞または血管芽細胞製剤は、ガラス体内の注射によって投与できる。

血管芽細胞またはその誘導体細胞の溶液または製剤は、任意の経路で投与でき、かような投与は個別的に決定できる。また、血管芽細胞またはその誘導体細胞の溶液または製剤の投与される有効量は、治療的に有効であって個別的に決定されうる量である。

追加様態で血管芽細胞血統細胞は、治療的用途、例えば前述の徴候の治療で使われる。従って、本願で記述される方法で生成及び増殖されたり、または増殖される血管芽細胞は、まず試験管内で分化されて造血及び／または内皮細胞を産出した後、前記２個の血統でさらに分化される細胞を産出する。かような細胞は、以後、例えば造血病態の治療、または造血再構成、または虚血または血管損傷の治療のために被験体または患者に投与できる。

本願で開示される方法によって収得されるヒト血管芽細胞から誘導されるＨＳＣは、成長してさらにＨＳＣを増殖させ、かつ／または他の造血血統細胞類型を誘導する。本発明の特定様態は、移植中の血管芽細胞から誘導されたＨＳＣの用途に係るものである。追加実施例で、分化された造血細胞（例えば、顆粒球、赤血球、骨髄細胞、巨核細胞、血小板、大食細胞、肥満細胞及び好中性白血球（Ｗｉｌｅｓ ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ １９９１ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１１１）：２５９）が多様な治療、例えば輸血療法または感染治療に使われる。従って本発明の他の実施例は、本発明の血管芽細胞から誘導されたＨＳＣまたは造血血統細胞を利用した造血再構成または治療を必要とする患者の治療方法に係るものである。

一部様態で本発明は、造血細胞を必要とする患者の治療方法または治療を必要とする患者を選択する段階、本発明の方法によってヒト血管芽細胞を増殖したりまたは分離及び増殖する段階、前記血管芽細胞を造血母細胞及び／または成熟造血細胞に分化させる段階、及び前記造血細胞を前記患者に投与する段階を含む治療に係るものである。

本発明の他の様態で血管芽細胞は、ここに開示された方法によって成長して内皮細胞を発生させる。前記内皮は、その後患者の損傷部位で損傷された血管の復旧を誘導したり、または新しい血管を提供するのに使われうる。従って、一部様態で本発明は、新しい血管成長を促進したり、または損傷された脈管構造を復旧する方法に係り、ここで血管芽細胞から誘導された内皮細胞が治療剤として使われる。前記内皮細胞は、内皮損傷、例えば心筋梗塞及び肺虚血、発作及び虚血性脳損傷、四肢虚血及び四肢虚血を含む皮膚損傷及び糖尿病動物でも患者に発生する損傷、網膜内虚血性再貫流損傷、腎臓虚血を治療するのに使われうる。前記内皮細胞はまた、気球血管形成術または血管内ステントだけではなく、グラフティングでの配置、手術及び以後の放射線損傷後に損傷された血管の復旧を助けるのに使われうる。また前記内皮細胞は、アテローム性動脈硬化症進行の治療及び／または予防だけではなく、全身硬化症及びレイノー現象で発生する内皮細胞損傷を復旧するのに使われうる。

従って本発明の一部様態は、治療を必要とする患者を選択する段階、本発明の方法によってヒト血管芽細胞を増殖したりまたは分離及び増殖する段階、前記血管芽細胞を内皮細胞に分化させる段階、及び前記内皮細胞を前記患者に投与する段階を含む、内皮または血管損傷を有する患者、または血管成長や復旧を必要とする患者の治療方法に係るものである。
血液銀行
本発明の他の様態は、移植に適した造血細胞を生成する方法を提供する。かような細胞及び方法は数多くの用途を有するが、特に重要な用途は、移植用血液の適合性を向上させるところにあるのである。望ましい一部実施例で本発明は、血管芽細胞／血管コロニー形成単位から分化された赤血球を提供する。かような分化された赤血球は移植に使われうる。

本発明のさらに他の様態は、血管芽細胞／血管コロニー形成単位から分化された、これを必要とする者のための輸血に使われる造血細胞を生成する方法に係るものである。一部実施例で分化された造血細胞は、外傷、手術中の血液損失、血液疾患、例えば貧血、鎌状赤血球貧血、または溶血性疾患、または悪性疾患を治療するために移植される。一部実施例で赤血球は、外傷、手術中の血液損失、または血液疾患、例えば貧血、鎌状赤血球貧血、または溶血性疾患を治療するために移植される。一部実施例で血小板は、先天性血小板疾患または悪性疾患を治療するために移植される。一部実施例で、赤血球及び血小板の混合群が移植される。

特定実施例において細胞の該調製物は、一つ以上の感染疾病に対して選別される。選別は、発生または保管前後に起こりうる。例えば細胞の該調製物は、前記製品の受容者に伝達されうる肝炎、ＨＩＶ、またはその他血因性感染疾病を確認するために選別されうる。
移植体受容者内での耐性誘導
本発明の方法によって生成されて増殖されたり、または本発明の方法によって増殖されたヒト血管芽細胞を使用して免疫耐性を誘導できる。免疫耐性とは、例えば受容者に非自我（ｎｏｎｓｅｌｆ）ＭＨＣ抗原（例、移植体及び耐性化された血管芽細胞と共有された抗原）の導入に対して、そうでなけば発生する移植体受容者の免疫反応の抑制をいう。従って耐性とは、免疫抑制剤を使用して引き出しうる広範囲なスペクトルの免疫抑制と反対して特異的な供与者抗原によって誘導される免疫反応の抑制をいう。耐性は、体液性反応、細胞性反応、または体液性及び細胞性いずれもの反応を伴うことができる。耐性は、先在する成熟した供与者反応性Ｔ細胞の除去及び／または不活性化、及び新規に発生した供与者反応性Ｔ細胞の長期間（例、一生）の除去及び／または不活性化を含むことができる。

本発明に記載されたヒト血管芽細胞の生成及び増殖方法は、耐性を誘導するのにいくつかの利得を提供する。本発明の方法は莫大であり、従来には得難い数のヒト血管芽細胞を生成させる。莫大な量のヒト血管芽細胞は、あまり有害ではないあらかじめ調整されたプロトコルを利用して移植体受容者で耐性を誘導できる。また本発明の方法は、ヒト血管芽細胞のライブラリを生成するために提供され、ここでそのそれぞれは、ヒト集団に存在する一つ以上のＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合性であるか同型接合性であり、前記血管芽細胞のライブラリのうち各構成員は、ライブラリ内の他の構成員に対して異なるセットのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合性であるか同型接合性である。かかるヒト血管芽細胞のライブラリは細胞を選択し、任意の使用可能な供与者移植体と一致できるように耐性のなされたヒト血管芽細胞の選択に使われうる。

従って、本願に記載された新規方法が莫大な数のヒト血管芽細胞を生産できるために、本発明は、調節プロトコルがあまり苛酷ではないか、あまり有害ではない免疫耐性が誘導される利点を提供する。例えば、造血細胞空間の形成段階は、十分な数の耐性がある供与者細胞が使われる場合に省略されうる。

従って、本発明の特定実施例において、本願に記載された方法によって生成されて増殖されたり、または増殖されたヒト血管芽細胞を使用して免疫耐性を誘導できる。前記メカニズムを基に任意の理論によって拘束されることを希望しない一方、ヒト血管芽細胞は、受容者の骨髄に受容され、受容者の骨髄に移植されて混合されたキメラ現象を生産することによって免疫耐性を誘導できる。

特定実施例において、供与者ヒト血管芽細胞は、受容者患者に供与者からの移植体を移植したり器官、組織、または細胞を移植する前に（例えば、静脈注射によって）、受容者患者に投与される。特定実施例において、ヒト血管芽細胞は、耐性の誘導の必要がある患者（例、移植組織または移植体受容者）に耐性を誘導するために投与される。従って、特定実施例において、ヒト受容者患者で耐性を誘導する方法は、（ａ）移植または細胞治療の必要がある患者を選択する段階、（ｂ）供与者から由来したり供与者に一致（符合）するヒト血管芽細胞を前記患者に投与する段階であって、ここで前記血管芽細胞は、本発明によって生成されて増殖されたり増殖される段階、及び（ｃ）受容者患者に供与者の器官、組織、または細胞移植体を移植する段階であって、ここで前記血管芽細胞は、供与者抗原に対する耐性を誘導する段階を含む。特定実施例において患者は、器官、組織、または細胞治療を受容し、ここで前記器官、組織、または細胞は、供与者または供与者細胞源から得られる。例えば、供与者からの血管芽細胞は、（１）前記記載された方法によって増殖されて多数の供与者耐性細胞を生成し、（２）生体内増殖されて分化されて造血細胞または内皮細胞または組織を得るが、これは、後続して受容者患者に移植されうる。他の実施例において、器官、組織、または細胞治療は、供与者血管芽細胞から由来しないが、供与者血管芽細胞と一致する。

本願に使われた用語である「一致した（符合した）」というのは、供与者及び受容者（例、移植体）間のＨＬＡ類型がどれほど類似しているかに係るものである。一実施例において、供与者血管芽細胞及び移植体について、用語「一致した」というのは、拒否反応が起きないようにというＭＨＣ Ｉ型及び／またはＭＨＣ ＩＩ型対立遺伝子との一致度をいう。他の実施例において、供与者血管芽細胞及び移植体について用語「一致した」というのは、供与者移植体がその一致する供与者血管芽細胞によって耐性化されるようにというＭＨＣ Ｉ型及び／またはＭＨＣ ＩＩ型対立遺伝子との一致度をいう。さらに他の実施例において、供与者血管芽細胞及び移植体について用語「一致した」というのは、免疫抑制が要求されないようにというＭＨＣ Ｉ型及び／またはＭＨＣ ＩＩ型対立遺伝子との一致度をいう。

同種異系抗原または同種異系グラフト（ｇｒａｆｔ）に対して耐性を誘導するための前述の方法は、供与体と受容体との間に、ＭＨＣ遺伝子座またはその他遺伝子座でグラフト拒否反応を招くほどの不一致が存在する場合に使われうる。従って、例えば特定実施例で、１個以上のＭＨＣ遺伝子座で、または認識及び拒否反応を媒介する他の１個以上の遺伝子座で、例えば、極小抗原遺伝子座で不一致が起こりうる。一部実施例で例えば、受容体と供与体とのＨＬＡ対立遺伝子が不一致であって、一つ以上の不一致の抗原を招く。Ｉ型及びＩＩ型ＭＨＣ遺伝子座の場合、供与体と受容体は、例えば、Ｉ型で一致し、ＩＩ型で不一致であり、Ｉ型で不一致であり、ＩＩ型で一致し、Ｉ型で不一致であり、ＩＩ型で不一致であり、Ｉ型で一致し、ＩＩ型で一致しうる。認識及び拒否反応を統制する他の遺伝子座の任意の組合わせで、例えば、極小抗原遺伝子座が一致または不一致でありうる。ＭＨＣ Ｉ型で不一致であるというのは、一つ以上のＭＨＣ Ｉ型遺伝子座が不一致であるということを意味し、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃのうち一つ以上で不一致であるということを意味する。ＭＨＣ ＩＩ型で不一致であるというのは、一つ以上のＭＨＣ ＩＩ型遺伝子座が不一致であるということを意味し、例えば、ＤＰＡ、ＤＰＢ、ＤＱＡ、ＤＱＢ、ＤＲＡ、またはＤＲＢのうち一つ以上で不一致であるということを意味する。例えば、血管芽細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）とグラフトは、ＩＩ型ＨＬＡ−ＤＲＢ１及びＤＱＢ１対立遺伝子で一致しうる。血管芽細胞とグラフトは（一致したＤＲＢ１及びＤＱＢ１対立遺伝子に追加して）、２個以上のＩ型ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、またはＣ、対立遺伝子で一致しうる。

他の実施例で、耐性化された（ｔｏｌｅｒｉｚｉｎｇ）供与体細胞は、前述の方法によって生成及び増殖または増殖された血管芽細胞から由来した細胞である。この実施例によれば、供与体ヒト血管芽細胞は、試験管内分化されて供与体造血母細胞を生成し、この供与体造血母細胞を受容体患者に投与して耐性を誘導する。前記方法のうち一部の場合、供与体血管芽細胞またはそれから由来した造血母細胞を前記受容体に投与し、前記受容体で耐性を誘導することによって（供与体耐性化細胞に対して）、一致した移植またはグラフトを準備する。

他の実施例で耐性を誘導する方法は、造血スペースを生成する段階（これによって血管芽細胞またはそれから由来した造血母細胞のグラフト化を促進する）をさらに含む。他の実施例で耐性を誘導する方法は、例えば、先在する供与体−反応性Ｔ細胞を除去及び／または不活性化することによって、供与体血管芽細胞またはそれから由来した造血母細胞の拒否反応を一時的に阻害する段階をさらに含む。造血スペースを生成するために、該方法は、照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）（例、全身、リンパ球、または選択的胸腺照射）を含むことができる。供与体細胞の拒否反応を予防するために、該方法は、薬物または抗体（例、細胞増殖阻害剤、抗代謝剤、または抗−Ｔ細胞または抗−ＣＤ８または抗−ＣＤ４抗体）の投与、及び／または供与体細胞のグラフト化及び生存、及び混合キメラ現象の形成を促進するその他処理（例、ストローマ細胞または成長因子、サイトカインなどを前記受容体に投与、または受容体の天然抗体を枯渇または不活性化させる他の製剤の投与）をさらに含むことができる。特定実施例で、受容体内で供与体の生存を促進し、かつ／または造血スペースを生成するために、投与される照射、抗体、薬物及び／またはその他製剤は、受容体で胸腺細胞及び／またはＴ細胞を不活性化するのに十分である。かような造血スペースを生成し、かつ／または供与体細胞の拒否反応を一時的に阻害する段階は、例えば、供与体血管芽細胞を前記受容体に導入させる前に遂行できる。代案として、患者に製剤を摂取させたり、または供与体耐性化細胞の投与と同時に、Ｔ−細胞を遮断、除去または不活性化する方法を施行することもできる。

特定実施例で、造血スペース生成と免疫抑制法とを組合わせて使用する。例えば、受容体に抗−Ｔ細胞抗体摂取を低容量全身照射及び／または胸腺照射と共に遂行する。一実施例で、受容体に抗−ＣＤ４及び抗−ＣＤ８抗体を摂取させ、その後温和な、非骨髄破壊性（ｎｏｎｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）容量の全身照射（例、骨髄が回復不可能にならないように受容体の骨髄分画を除去する容量）と選択的な胸腺照射とを遂行するか、代案的に追加的な容量のＴ細胞不活性化抗体または共同刺激遮断試薬（例、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ及び／または抗−ＣＤ４０Ｌ抗体）を摂取させる。照射後、供与体血管芽細胞またはそれから由来した造血母細胞を受容体に（例、静脈注射によって）投与できる。この実施例で、供与体細胞のグラフト化を促進するための全身照射は、さまざまな供与体ヒト血管芽細胞またはそれから由来した造血母細胞を投与することに代替されうる。かようなさまざまな供与体ヒト細胞を得ることは、前述の方法によって行われうる。

他の実施例で、受容体Ｔ細胞を枯渇または不活性化するための処理は、投与された供与体耐性化ヒト血管芽細胞の生存を促進してグラフト化阻害を予防するのに助けになりうる。他の実施例でこの方法は、受容体患者で供与体反応細胞のクローン枯渇を含むことができる。例えば、患者に温和な投与量の全身照射を遂行した後、Ｔ細胞共同刺激遮断及び供与体ヒト血管芽細胞の投与を遂行しうる。代案として、患者に照射なしにＴ細胞共同刺激遮断及びさまざまな供与体ヒト血管芽細胞への投与を遂行することもできる。

他の実施例で、受容体の骨髄破壊調節なしに耐性を得ることも可能である。一実施例で、受容体に供与体ヒト血管芽細胞を供与体血管芽細胞のグラフト化を容易にするために、抗−ＣＤ４０Ｌと共に摂取させることができる。例えば、受容体にさまざまな供与体血管芽細胞を抗−ＣＤ４０Ｌ単一クローン抗体と共に摂取させた後、何日か以内にＣＴＬＡ４−Ｉｇ投与量を摂取させる。かようなプロトコルは供与体反応性Ｔ細胞を除去し、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を遮断させる。ヒト血管芽細胞を試験管内生成及び増大させるための前述の新規方法は、かような温和な耐性プロトコルを実行可能にする。

受容体調節及び／または供与体反応性Ｔ細胞の枯渇または遮断後、本発明の方法で生成した供与体耐性化ヒト血管芽細胞を受容体に投与する。供与体ヒト血管芽細胞は、供与体からの組織または細胞源から収得した血管芽細胞に由来しうる。代案として、供与体ヒト血管芽細胞は、供与体と一致する異なる非供与体源から収得できる。

特定実施例で、供与体ヒト血管芽細胞を多重投与で（例えば、２、３、４またはその以上の供与体細胞の投与）投与することによって、耐性が誘導される。従って耐性は、供与体耐性化細胞の多重投与を含む方法へ誘導でき、ここで多重投与は、週またはそれ未満の期間内に受容体に行われる。

特定実施例で、本発明ヒト血管芽細胞が免疫耐性を誘導する能力は、異なる実験モデルシステムを使用して評価できる。例えば、ＳＣＩＤマウスにヒト免疫システムを樹立する能力は、実験モデル内でヒト免疫反応を研究するのに使われてきた。ヒト胎児肝及び胸腺組織を使用し、免疫不全マウス受容体で機能的なヒト免疫システムを再構成できるということはすでに明らかにされている。同様に、本発明ヒト血管芽細胞の機能的力量を類似の実験モデルシステムを使用して評価できる。例えば、マウス内の機能的なヒト免疫システムを設立するのに、ヒト胎児肝を代替するヒト血管芽細胞の能力は、前述の実験モデルを使用して評価できる。また、機能的なヒト免疫システムを有するマウスで（例えば、ヒト胎児肝及び胸腺組織をＳＣＩＤマウス内のヒト免疫システムを設立するのに使用してｈｕ−ＳＣＩＤマウスを生産した場合）、混合キメラ現象を得るために、ヒト「供与体」血管芽細胞（ｈｕ−ＳＣＩＤマウスを設立するのに使われた胎児肝及び胸腺組織に対して不一致）を前述の方法のうちいずれか一つによってｈｕ−ＳＣＩＤマウスに投与できる。その後、供与体血管芽細胞に対して一致する同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）をこれらの動物に移植する場合、供与体抗原に対する耐性を評価できる。

特定実施例で本発明は、細胞配合物に係るものである。効果的な細胞配合物は、次の２成分を含む：免疫耐性を誘導する第１細胞類型及び必要な機能を再生する第２細胞類型。二種の細胞類型は、本発明の方法で製造でき、同じ供与体から収得できる。例えば、供与体由来ヒト血管芽細胞が耐性化供与体細胞として使われうる。供与体由来細胞（例、胚芽幹細胞、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または初期先祖細胞、または血管芽細胞）も使われ、例えば、造血細胞または内皮細胞（ここに叙述される）、神経細胞、例えば、希突起膠細胞、肝細胞、心筋芽細胞または心筋芽細胞先祖細胞、または造骨細胞及びこれらの先祖細胞を生成できる。従って、前記供与体血管芽細胞または前記供与体胚芽または多能性幹細胞から由来した細胞または組織に受容体が耐性を有するように、供与体ヒト血管芽細胞を受容体で耐性を誘導するのに使用できる。

他の実施例で、本発明の細胞配合物の二細胞成分を異なる供給源または供与体から得ることができ、このとき２個の供給源または供与体は一致する。例えば、血管芽細胞を胚芽幹細胞供給源から生成でき、グラフト細胞または組織は、ヒト血管芽細胞を生成するのに使われた胚芽幹細胞供給源と異なる供給源から収得できる。かような実施例で、２つの供給源は一致する。

本明細書に叙述された治療目的のうちいずれかのために、免疫耐性のためのヒト血管芽細胞またはそれから由来した造血細胞が、ヒト投与のための十分な滅菌条件下で製造された等張添加剤を含む薬学組成物の形態で提供できる。
遺伝子治療法での血管芽細胞
本発明の他の様態は、血管芽細胞細胞、またはそれから分化された造血または内皮細胞、または順にこれらの細胞から追加分化された細胞を遺伝子治療法に利用することに係るものである。本発明の哺乳類血管芽細胞の製剤は、治療遺伝子の遺伝子産物によって治療されうる疾病を有する患者に治療遺伝子を伝達するのに使われうる。血管芽細胞は、新生血管形成（例、虚血性組織で側副（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）の形成を誘導するＶＥＧＦ）、造血作用（例、赤血球生成を誘導するエリスロポイエチン）、血管機能（例、動脈瘤を治療するために血管平滑筋の増殖を誘導する成長因子）または血液細胞機能（例、出血を減少させる凝固因子）または分泌ホルモン（例、成長ホルモン）に係るコードに関与したり、または影響を与える治療遺伝子を伝達するのに特に有用である。遺伝子治療法に係る方法は、先行技術に示されている。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）を参考にしうる。遺伝物質を伝達するための生体適合性カプセルについては、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０５４５２（Ｂａｅｔｇｅ ｅｔ ａｌ．）に記述されている。骨髄由来細胞に遺伝子を伝達する方法についてもすでに報告されている（米国特許第６，４１０，０１５号（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．）参考）。治療遺伝子は、疾病予防または治療に関与する遺伝子産物または蛋白質を暗号化する遺伝子、または疾病予防または治療に関与する細胞調節効果を有する遺伝子と共に、臨床的有用性を有する任意の遺伝子でありうる。かような遺伝子産物は、患者で欠陥があったり消失された遺伝子産物、蛋白質を代替したり細胞調節の効果を有し、患者の疾病または疾患の予防または治療を可能にできる。

従って本発明は、遺伝子治療法を受けなければならない疾病を有する患者に治療遺伝子を伝達する方法をさらに提供し、該方法は、これを必要とする患者を選別する段階、細胞が治療遺伝子を保有するように血管芽細胞製剤を変形させる段階、及び患者に変形された製剤を投与する段階を含む。かような製剤は、本技術分野に一般的に公知の技法によって変形されうる。変形には血管芽細胞の治療効果を増強させる遺伝子産物を暗号化するＤＮＡまたはＲＮＡ断片を哺乳類血管芽細胞に挿入することが含まれうる。変形された血管芽細胞が患者身体で治療遺伝子産物を生産したり、または所定の治療効果を有するようにする方式で遺伝子を挿入する。一実施例で血管芽細胞は、骨髄と共に患者から収得した細胞供給源から製造される。任意の遺伝子伝達手続き、例えば、ネイキドＤＮＡ統合、ＤＮＡの直接注入、受容体媒介されたＤＮＡ摂取、レトロウイルス媒介された形質感染、ウイルス媒介された形質感染、非ウイルス形質感染、脂質媒介された形質感染、電子伝達、電気泳動、リン酸カルシウム媒介された形質感染、マイクロ注入またはプロテオリポゾーム（これら全ての方法には、遺伝子治療法ベクターを含むことができること）を使用し、遺伝子を血管芽細胞に挿入できる。その他ベクターとしては、レトロウイルスベクター以外にも、ＤＮＡウイルス及びその他ＲＮＡウイルスから由来したベクターを使用できる。ＲＮＡウイルスを使用する場合に明白なように、かようなウイルスは、かようなＲＮＡウイルスに形質感染された血管芽細胞が治療遺伝子産物を暗号化するＤＮＡを提供するように、所定の薬剤を暗号化するＲＮＡを含む。遺伝子を細胞に導入する方法は、本技術分野に公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｉｄ．参考）。

本発明の他の様態によれば、治療遺伝子を保有するように変形されたヒト血管芽細胞の精製された製剤が、容器または商業的パッケージで提供され、かような容器または商業的パッケージは、治療遺伝子伝達によって疾病を予防及び／または治療するための遺伝子治療法で、製剤の使用のための説明書をさらに含む。従って本発明は、本発明の哺乳類血管芽細胞の製剤（かような製剤は、製剤の細胞が治療遺伝子を保有するように変形される）、及び遺伝子治療法で治療可能な疾病を有する患者を治療するための説明書を含む商業的パッケージ（すなわち、キット）をさらに提供する。
その他商業的応用及び方法
本発明の特定様態は、ヒト血管芽細胞を商業的量に増大させるものである。特定実施例で、ヒト血管芽細胞を大規模に生産し、必要な場合に保存し、病院、臨床医またはその他ヘルスケア機関に供給する。患者が、例えば、虚血または血管損傷のような処方を受けた場合、または造血再構成が要求される場合、ヒト血管芽細胞を注文して相応の時に供給できる。従って本発明は、商業的規模で細胞を得るために、ヒト血管芽細胞を生成及び増大させる方法と、前記方法から由来したヒト血管芽細胞を含む細胞製剤、及びヒト血管芽細胞を病院及び臨床に提供（すなわち、生産、必要な場合に保存、及び販売）する方法とに係るものである。さらに、血管芽細胞系統細胞を試験管内で生産し、必要な場合に保存し、病院及び臨床医に販売できる。

従って本発明の特定様態は、本明細書に記述された方法によって増大した血管芽細胞を生産、保存及び分配する方法に係るものである。ヒト血管芽細胞を試験管内で生産及び増大させた後、患者治療に先立ってヒト血管芽細胞を回収、精製、及び必要な場合に保存しうる。代案として、血管芽細胞系統細胞が望まれた場合、患者治療に先立って、ヒト血管芽細胞を試験管内でさらに分化させることもできる。従って、特定実施例では本発明は、血管芽細胞を病院、ヘルスケアセンター、及び臨床医に供給する方法を提供し、本明細書に公開された方法によって生産された血管芽細胞または血管芽細胞系統細胞は保存され、病院、ヘルスケアセンターまたは臨床医の要求によって注文され、血管芽細胞または血管芽細胞系統治療法が要求される患者に投与される。代案的な実施例で、病院、ヘルスケアセンター、または臨床医は、患者の特定データに基づいてヒト血管芽細胞を注文し、ヒト血管芽細胞を患者の状態によって生産し、注文した病院または臨床医に供給される。

本発明の追加的な様態は、潜在的な患者受容体に一致する細胞を提供できる血管芽細胞及び／または血管芽細胞系統細胞のライブラリに係るものである。従って、一実施例で本発明は、１個以上の組織接合性抗原に対して同質の（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）血管芽細胞製剤を提供する段階を含む薬学ビジネスを遂行する方法を提供し、このとき細胞は、本明細書に公開された方法によって増大しうるヒト血管芽細胞ライブラリを含むかような細胞銀行から選択され、それぞれの血管芽細胞製剤は、ヒト群集に存在する１個以上のＭＨＣ対立遺伝子に対して半同質（ｈｅｍｉｚｙｇｏｕｓ）であるか同質であり、前記血管芽細胞銀行は、細胞銀行の他のメンバーと比較するとき、ＭＨＣ対立遺伝子の異なるセットに対してそれぞれ半同質であるか同質である。前述のように、遺伝子標的化または異質性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）の消失は、血管芽細胞を誘導するのに使われる半同質または同質のＭＨＣ対立遺伝子幹細胞を生成するのに使われうる。一実施例で、患者に適するように特定血管芽細胞製剤を選択した後、患者治療に適切な量に増大させられる。かような方法は、受容体に細胞を投与するに先立って、血管芽細胞を分化させて造血及び／または内皮細胞を収得する段階をさらに含むことができる。薬学ビジネスを遂行する方法はまた、販売用製剤を分配する分配システムを遂行することを含むことができ、薬学製剤のマーケッティングのための販売グループを設立することを含むこともできる。

本発明の他の様態は、薬学的、化学的、またはバイオ技術会社、病院、または学術または研究機関の設備内の調査機器として、本発明のヒト血液母細胞を利用することに係るものである。例えば、ヒト血液母細胞及び血液母細胞誘導細胞（例えば、内皮細胞）は、新生血管及び抗−新生血管因子をスクリーン及び評価するのに使われ、または組織エンジニアリンに使われうる。また、ここに公知の方法によって得られて拡張された血管芽細胞は、造血及び内皮細胞に分化されうる二重の可能性有するために、これらは、造血及び血管形成の細胞及び分子生物学用として使われうる。さらにヒト血管芽細胞は、これらの細胞、遺伝子、成長因子、及び造血と血管生成とに役割を担当する分化因子の新しいマーカの発見、または潜在的な毒性または保護剤のためのスクリーニング・アッセイの発展及び薬物発見のために使われうる。

本発明の他の実施例で、（血液細胞のような）血管芽細胞系統細胞はまた、商業的に使われうる。造血細胞は、臨床及びリサーチ適用のために使われうる、ヘモグロビン及び成長因子のような血液生成物を生成するのに使われうる。

本発明はまた、患者から得たヒトＥＳ細胞収得方法及びＥＳ細胞から由来したヒト血管芽細胞膨脹方法を含む。この血管芽細胞は保存されうる。またこの血管芽細胞は、ＥＳを得た患者、またはこの患者の親戚を治療するのに使われうる。

前述の方法及び適用は、血管芽細胞の治療、薬学的製剤及び保存に係り、本発明はまた、かような適用に適した血管芽細胞溶液に係るものである。従って本発明は、患者に注射用に適した血管芽細胞の溶液に係るものである。かような溶液は、生理学的に許容される液体（例えば、生理食塩水、緩衝食塩水または均衡食塩水溶液）内で製剤化された細胞を含みうる。溶液は、選択的に生体内細胞分化を促進する因子を含みうる。溶液は、骨髄移植用に使われる方法を許容する技術によって、患者に血管投与（例えば、静脈内注入）することによって投与できる。一部実施例で細胞溶液は、末梢血管、表面末梢血管、または代案として中心静脈投与（例えば、中心静脈カテーテルを介する）内に投与される。溶液内細胞の数はおよそ１０²以上であって、およそ１０⁹細胞未満でありうる。他の実施例で溶液内細胞の数は、およそ１０¹、１０²、５Ｘ１０²、１０³、５Ｘ１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶，１０⁷、または１０⁸ないしおよそ５Ｘ１０²、１０³、５Ｘ１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶，１０⁷、１０⁸、または１０¹⁰の範囲であって、下限線が常に上限性未満であることを除き、上限線及び下限線は、非独立的に選択される。さらに細胞は、単一または複合投与で投与されうる。

実施例１：造血及び内皮可能性をいずれも示すヒトＥＳ細胞から由来した血管芽細胞
ヒト胚芽幹細胞系Ｈ１とＨ９とをマウス胚芽線維芽細胞（ＭＥＦｓ）のＥＳ細胞培地で培養する。培養されたヒトＥＳ細胞を２００ｇで遠心分離して分離、ペレット化し、胚状体（ＥＢ）形成培地で再懸濁する。ＥＢ形成培地は、ＢＭＰ−４及びＶＥＧＦが補充された無血清Ｓｔｅｍｌｉｎｅ培地（Ｓｉｇｍａ（登録商標））を含む。この後、細胞を超低付着（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）培養プレート上にプレーティングし、ＣＯ₂インキュベータで培養する。２４−４８時間後、初期造血サイトカイン（ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３ＫＹＥ、及びＳＣＦ）を加え、ＥＢを形成するためにさらに２４−４８時間培養する。

胚状体（ＥＢ）は２−６日間または選択的に２−５日間培養され、この後ＰＢＳで収集、洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡを使用した単一細胞懸濁液で脱凝集する。ＥＢの数を測定し、ほぼ５−１０Ｘ１０⁶細胞／ｍＬを、ＢＬ−ＣＦＵ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ^TM）を含み、サイトカイン及びＰＴＤ−ＨＯＸＢ４融合蛋白質で補充された血管芽細胞成長に最適化された無血清メチルセルロース培地で培養する。この後細胞は、血管芽細胞コロニーを成長させるために、新たな超低付着培養プレート上に再プレーティングする。

ＥＢは、血管芽細胞コロニーの形成のために、毎日モニタリングする。ほぼ３日目に、血管芽細胞コロニーの形成が観察される。血管芽細胞は、非常に特徴的なブドウ型細胞形態によって特定される。

細胞の一部からさらにＥＢを形成できるであろう（第２ ＥＢｓ）。第２ ＥＢｓは、図１６ｂから分かるように、ブドウ型形態を有さない。血管芽細胞はまた、第２ ＥＢｓより小さい。

その後、これら血管芽細胞コロニーは選択、識別されて及び造血コロニー形成ユニット（ＣＦＵｓ）を形成し、さらに分化する能力を検査するために、メチルセルロースＣＦＵ−培地内に再プレーティングされる。同様に、これら血管芽細胞コロニーは選択され、識別され、内皮分化への最初の段階のために最適化されたフィブロネクチン−コーティング培養プレート上に再プレーティングされる。

該選択された血管芽細胞コロニーから造血前駆細胞の発生を検査するために、顆粒球、赤血球、大食細胞及び巨大核細胞のためのコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の成長は、成長した後の３−１０日間に測定される。

該分離された血管芽細胞コロニーから内皮細胞の発生を検査するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌの厚い層内に再プレーティングされるとき、分枝された管−腱（ｔｕｂｅ−ｃｏｒｄ）を形成する血管芽細胞の能力を測定する。

内皮細胞に分化する分離された血管芽細胞コロニーの能力はまた、内皮細胞表面マーカの存在またはＬＤＬ ｕｐｔａｋｅのような他の内皮特異アッセイを利用して確認しうる。
実施例２：血管芽細胞またはｈＥＳＣ由来ＢＣ細胞の副次的な特徴ヒトＥＳ細胞培養。

本研究に使われるｈＥＳ細胞系は、以前に記述された（ＷＡＯｌ、ＷＡ０７、及びＷＡ０９としてＮＩＨ登録されている）Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９細胞系及びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから由来した４個の系（ＭＡＯｌ、ＭＡ０３、ＭＡ４０、及びＭＡ０９）である。未分化のヒトＥＳ細胞は、８０％合流されるまで、完全なｈＥＳ培地Ｅで非活性（ミトマイシンＣ−処理の）マウス胚芽線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞で培養される（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ ＆ ＭｃＭａｈｏｎ，Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｏｆ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ：Ｄｅｔａｉｌｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ，ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｖｏｌｕｍｅ １：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，ｅｄ．Ｌａｎｚａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，２００４）。その後、未分化のｈＥＳ細胞を２−５分間０．０５％トリプシン−０．５３ｍ ＭＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^TM）で分離し、５分間１，０００ｒｐｍで遠心分離して収集する。
ＥＢ形成
血管芽細胞前駆体（中胚葉）形成を誘導するために、ｈＥＳ細胞（２ないし５Ｘ１０⁵細胞／ｍｌ）をＢＭＰ−４及びＶＥＧＦ₁₆₅（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ^TM）の添加された無血清Ｓｔｅｍｌｉｎｅ培地（例えば、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩまたはＩＩ、Ｓｉｇｍａ^TM）内の超低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ^TM）上にプレーティングし、５％ＣＯ₂で培養する。４８時間後、ＥＢ培地は、初期造血／内皮成長因子の混合物（ｃｏｃｋａｔｉｌ）で補充及び充填する。例えば、培地の半分を４８時間後に除去し、新たな培地にＢＭＰ−４及びＶＥＧＦさらにＳＣＦ、ＴＰＯ及びＦＬＴ３配位子（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を同じ最終濃度で加えた。トリプル蛋白質形質の導入、ドメイン（ｔＰＴＤ）−ＨｏｘＢ４融合蛋白質（１．５μｇ／ｍｌ）を血管芽細胞及びその前駆体を増殖させるために４８−７２時間培養培地に加えた。
血管芽細胞または芽細胞（ｂｌａｓｔ）増殖
３．５−５日後、ＥＢｓを２−５分間０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^TM）で分離、収集し、単一細胞懸濁液を２２Ｇニードルを介して３−５回及び４０μＭ ストレイナを通過させて製造する。細胞は、５分間１，０００ｒｐｍで遠心分離して収集されてカウントされる。細胞ペレットは、無血清Ｓｔｅｍｌｉｎｅ培地の５０−２００ｍｌで再懸濁される。血管芽細胞を増殖するために、２ないし５Ｘ１０⁵ ｈＥＳ細胞の分化から由来したＥＢｓから得た単一細胞懸濁液は、ＩｓｃｏｖｅのＭＤＭ、１−２％牛血清アルブミン、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び成長因子の混合物内の１．０％メチルセルロースＬを含む２ｍｌのＢＬ−ＣＦＣ／血管芽細胞増殖培地（ＢＧＭ）で混合される。例えば、１０μｇ／ｍｌ ｒｈ−インシュリン、２００ μｇ／ｍｌ鉄飽和ヒトトランスフェリン、２０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ−ＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ−ＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ、３ないし６ユニット／ｍｌ ｒｈ−ＥＰＯ、５０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ−ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ−ＦＬｔ３配位子、５０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ−ＶＥＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ−ＢＭＰ−４）（「ｒｈ」は「ヒト組換え」を示す）、及びＴＰＯ及びＦＬの１．５μｇ／ｍｌ包含／非包含ＰＴＤ−ＨｏｘＢ４融合蛋白質の１．５μｇ／ｍｌを加えた。細胞混合物は、超低付着プレート（例えば、６−ウェルプレートの１ウェル内２−５Ｘ１０⁵細胞／２ｍｌ）にプレーティングし、４−７日間３７℃、５％ＣＯ₂で培養した。４−６日後、ブドウ型血管芽細胞芽細胞コロニー（ＢＬ−ＣＦＣｓまたはＢＣｓと示す）は、図１６ａから分かるように、顕微鏡によって観察された。

時間過程（２日ないし６日）は、ＥＢ内のヒトＢＬ−ＣＦＣ形成を検査し、狭い時間周期は、ヒトＥＳＣ由来ＥＢｓが多数のＢＬ−ＣＦＣｓ（またはｈＥＳ−ＢＣｓ）を生成する間に発見された。２日目にＥＢｓは、低頻度でｈＥＳ−ＢＣｓを生成し（ＷＡＯ１ ｈＥＳ ｃｅｌｌｓの場合、５７．３±７．４ ＢＣｓ／１ｘ１０⁵ ＥＢ ｃｅｌｌｓ、平均±ＳＥ、ｎ＝３；ＭＡＯ１ ｈＥＳ ｃｅｌｌｓの場合、３９５±１０．４ ＢＣｓ／ｌｘ１０⁵ ＥＢ ｃｅｌｌｓ、ｎ＝３）、そして６日目に造血（赤血球）前駆体が発生した。しかし、３．５日目にＥＢｓは、両胞胚（ＷＡＯ１及びＷＡ０９）及び単一分割細胞（ＭＡＯ１及びＭＡ０９）から由来したｈＥＳＣ系を含む、あらゆる検査ｈＥＳＣ系内で多数の血管芽細胞またはｈＥＳ−ＢＣｓ（ＷＡＯ１ ｈＥＳ細胞の場合、３４７．４±１１．１ ＢＣｓ／ｌＸ１０⁵ ＥＢ細胞、ｎ＝３；ＭＡＯ１ ｈＥＳ細胞の場合，５２３．３±６０．１ ＢＣｓ／ｌｘ１０⁵ ＥＢ細胞、ｎ＝３）を生成した。効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、ｈＥＳＣ系と成長条件とによって変わるにもかかわらず（表１参照）、ＷＡＯ１−ＧＦＰ及びＭＡＯ１ ｈＥＳ細胞（１２−１３Ｘ１０⁶細胞）の１つの６−ウェルプレートは、それぞれ２２．１８±３．５１Ｘ１０⁵（６−８日間増殖、平均±ＳＥ、ｎ＝１７）、そして４９．７３±７．２３Ｘ１０⁶（６−８日間増殖、ｎ＝９）そして３９６．４±９１．６３ｘ１０⁶（１０−１３日間増殖、ｎ＝６）の血管芽細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞を生成した。従って細胞は、前述の良好に定義されて再生可能な条件下で容易に増殖できる。

血管芽細胞の冷凍保存
血管芽細胞（または芽細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞）は、無血清培地で冷凍保存されうる。血管芽細胞の冷凍保存のために、精製された細胞を同じ二部分に分けた：この細胞の半分を２つの造血ＣＦＵアッセイ及び内皮細胞発達のために直接プレーティングし、他の半分は、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ培地の８％ＤＭＳＯに再懸濁して液体窒素内保存した。その後細胞は、造血及び内皮発達可能性のために解凍して検査した。解凍してから、血管芽細胞をここに記述されているように造血及び内皮系発達のためにプレーティングし、新鮮な、精製された細胞と比較した。内皮細胞系統の場合、冷凍過程後に細胞の７８±２％（平均＋ＳＥ、ｎ＝３）が回収された一方、総造血ＣＦＵｓの６１±７％（ｎ＝３）とＣＦＵ−赤血球の４６±４％（ｎ＝３）とが新鮮なｈＥＳ−ＢＣ細胞と比較するときに残った。ＣＦＵ−混合のためのさらに原始的な多潜在性前駆体の損失は、液体窒素保存でｈＥＳ−ＢＣ細胞回収後にはないと観察された。
血管芽細胞の特徴
ＢＬ−ＣＦＣ免疫細胞の化学分析において、精製されたＢＬ−ＣＦＣｓは、ポリリジン処理したグラススライド上にサイトスピンし、４％パラホルムアルデヒドで固定した。最大遺伝子の発現を検査するために、第１抗体を４℃で一晩培養し、次に蛍光染料で第２抗体を標識し、最後に蛍光顕微鏡で検査した。正常ヒトＢＭ細胞、Ｋ５６２細胞及びＨＵＶＥＣを対照群として使用した。

免疫細胞化学分析は、ｈＥＳ細胞由来ＢＬ−ＣＦＣｓまたはＢＣｓがＣＤ３１、ＣＤ３４及びＫＤＲがない蛋白質、または他の付着分子と関連したさまざまな血管芽細胞を発現することを明らかにした。ｈＥＳ−ＢＣｓは、ＧＡＴＡ−１（図１６ｄ及び１６ｅ）及びＧＡＴＡ−２蛋白質を示す。ＧＡＴＡ−１は、２つの原始（胚芽）及び最終（成体）造血いずれにも必須な亜鉛フィンガ転写因子であり、マウスの血管芽細胞内で発現される（Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．２００５ ＭｏＩ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５：１２１５−１２２７ ａｎｄ Ｙｏｋｏｍｉｚｏ ｅｔ ａｌ．２００７ ＥＭＢＯ Ｊ ２６：１８４−１９６）。ＧＡＴＡ−２は、血管芽細胞発達及び分化内多様な段階で作用する亜鉛フィンガ転写因子である（Ｌｕｇｕｓ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３４：３９３−４０５））。ｈＥＳ細胞由来ＢＬ−ＣＦＣｓまたはＢＣｓはまた、ＬＭＯ２（血管芽細胞発達に重要なＬＩＭ−ドメイン蛋白質（Ｇｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３０：６１８７−６１９９）（図１６ｇ及び１６ｈ）とＣＸＣＲ−４（図１６ｎ及び１６ｏ）とを示す。ＣＸＣＲ−４はケモカインＳＤＦ−Ｉ用受容体であって、ｈＥＳＣｓ、造血母細胞及びマウス血管芽細胞から由来した内皮細胞の表面で発現される。ＣＸＣＲ−４は、骨髄内造血前駆体の移動、貯留及び発達に重要な役割を果たす。細胞はさらにＴＰＯ及びＥＰＯ受容体（図１６ｔ及び１６ｕ、及び１６ｑ及び１６ｒ、及び表１）を示し、ＣＤ７１、トランスフェリン受容体用特異抗体に容易に反応する（図１６ｊ及び１６ｋ）（表２及び図１６ｄ−ｖ参考）。細胞は、他の付着分子またはＣＤ３１、ＣＤ３４及びＫＤＲをほとんどまたは発現させない（表２）。ＣＤ３４、ＣＤ３１、及びＫＤＲ発現の不在、及びＣＤ １３３発現の不在は、表面マーカ発現の独特なプロファイルである。

遺伝子プロファイル分析において、総ＲＮＡは、精製されたＢＬ−ＣＦＣｓ／ｈＥＳ−ＢＣ細胞、３．５日になったＥＢｓ及び未分化のＥＳ細胞からＲＮＡｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して分離される。切断されたアンチセンスｃＲＮＡは、マサチューセッツ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）大学のコアゲノムファシリティでヒトＵ１３３．２アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標），Ｉｎｃ）への混成化のために使われた。β−クラスタグロービン遺伝子の発現プロファイルのために、個別ＣＦＵコロニーが選択され、ＲＮＡは分離及び増幅され、β−，γ−及びε−グロービン遺伝子発現は、前述の（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｂｌｏｏｄ（１０３）：４１３４−４１４１）で分析された。

Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ^TMアレイによる分子プロファイルは、血管芽細胞と関連した遺伝子内の相当な増加及び初期段階ＥＢｓと比較し、初期原始赤血球母細胞の発達を示す（表２）。ＳＣＬ及びＬＭＯ２、血管芽細胞発生に重要な２つの遺伝子（Ｄ’Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｂｌｏｏｄ（１０５）：３８６２−３８７０；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１３１）：２７４９−２７６２；Ｇｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１３０）：６１８７−６１９９））だけではなく、ＦＬＴ−Ｉ（ＶＥＧＦ用受容体）は、ＢＬ−ＣＦＣｓ／母細胞コロニー内で容易に検出された。胚芽（ε−グロービン、５４９倍）及びｆａｔａｌ（γ−グロービン、８１７倍）グロービン遺伝子発現は、ＢＬ−ＣＦＣｓ／ｈＥＳ−ＢＣｓ内で劇的に増加し、ＮＦ−Ｅ２（１２倍）、ＧＡＴＡ−１（６倍）、ＥＫＬＦ（７倍）、ＩＣＡＭ−４（４倍）、グリコフォリン（１４倍）及びＥｐｏ受容体（４倍）メッセージ（ｍｅｓｓａｇｅ）数値もまた適度に増加した。

血管芽細胞の機能的特性化
ブドウ状の血管芽細胞コロニーをピッキングし、解剖顕微鏡下で手動に単離して無血清Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ Ｉ）培地に再懸濁した。その後、この細胞を後述する方法で系統潜在性（ｌｉｎｅａｇｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）についてテストした。
ｈＥＳ−母細胞のクローン形成能（Ｃｌｏｎａｌｉｔｙ）
ｈＥＳ−母細胞コロニーが複製的であって一般的な二分化能（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）前駆細胞から由来しているか否かを決定するために、マウス研究（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１２５）：７２５−７３２；Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｎａｔｕｒｅ（３８６）：４８８−４９３）にすでに記載されたような細胞混合実験を遂行した。ＷＡＯ１ −ＧＦＰのＥＢからの細胞及びＭＡＯ１ ｈＥＳ細胞を混合してＢＧＭにプレーティングした。ｈＥＳ−母細胞コロニーを４−６時間後に位相及び蛍光顕微鏡で調べた。一連の３ｒｏ、母細胞コロニーの１００％（７７個のうち７７個）がＧＦＰ陽性またはＧＦＰ陰性ということが明らかにされている（混合ＢＣは観察されていない、図１８ａ及び１８ｂ） ＧＦＰ陰性コロニーが非活性ＧＦＰ遺伝子を有した細胞を含有する可能性を排除するために、ＧＦＰ陽性及びＧＦＰ陰性コロニーをＧＦＰ配列の存在について調べた。混合実験から１２個の個別ＧＦＰ陽性及び１２個の個別ＧＦＰ陰性コロニーを位相及び蛍光顕微鏡下でハンドピッキングした。遺伝子のＤＮＡをＭｉｃｒｏＤＮＡ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ^TM）で単離させ、ＧＦＰ特異ｗｊｒＲ反応を遂行した。ＰＣＲ反応に対する内部対照群として、ミオゲニンプライマーをあらゆるＰＣＲ反応に含めたが、これは、２４５ｂｐの断片を生成させる。ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲルで分離させ、臭化エチジウム染色によって視覚化させた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析は、あらゆる陰性コロニーでＧＦＰ遺伝子配列の不在を確認させた（図１８、ＰＣＲ分析）。

第二の方法で、一次及び二次母細胞コロニーからの個別ＢＣをピッキングして２つの群に分け、１つの群は造血ＣＦＵについてテストし、他の１つの群は内皮前駆細胞形成についてテストした。一次ＢＣに対して、９０％以上（２４のうち２２）が造血及び内皮系統を発生させ、１００％及び９２％がそれぞれ造血及び内皮細胞を発生させた（表３）。同様に、限界希釈実験からの７個の個別ＢＣも造血及び内皮系統に分化するこれらの潜在性について調べた。５個のＢＣは、造血及び内皮子孫細胞いずれもを生成し（表３）、通常の実験からのＢＣと比較して低い効率を示したが（７１％ｖｓ．９２％）、これは、発生条件が最適ではないためでありうる。２９個の二次ＢＣに対して、半分以上（２９のうち１５）が造血及び内皮系統を発生させた一方、６（２１％）及び３（１０％）は、それぞれ造血または内皮細胞満を生成させた（表３）。たとえ一次ＢＣが造血及び内皮細胞の前駆体を含んで異種集団を含むとしても、二次限界希釈実験は、一次ＢＣで血管芽細胞の存在を明白に示す。

図１から分かるように、血管芽細胞の造血潜在性の例示として造血ＣＦＵは、Ｈ１−ＧＦＰ ＥＳ細胞から生成された血管芽細胞から観察された。

血管芽細胞の造血潜在能の他の例示として、単一細胞懸濁液を１０−１４日間前述の多様なサイトカインを含有する無血清メチルセルロース培地にプレーティングしたとき、赤血球コロニー（図１７ａ）、顆粒白血球（図１７ｂ）、大食細胞（図１７ｃ）及び多系統（図１７ｄ）造血細胞がさらに観察された。ＣＤ２３５ａ（赤血球）、ＣＤ１３（骨髄）及びＣＤ４５（白血球）に対する抗体を利用したＰＡＣＳ分析（図１７ｖ−ｙ）、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色（図１７ｅ−ｇ）及び免疫染色（図１７ｉ−ｋ）で、これらの造血系統の同一性を確認した。ほとんどのＣＦＵ（＞５０％）は、赤血球コアを有した系統であり、プレーティング後の数日内に形成された（例えば、図１参照）。

図１７ｖ−ｙに与えられたＦＡＣＳ分析のために、ＬＳＲＩＩの流れ細胞測定器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ^TM）で標準手続を利用して３色細胞測定分析を行った。細胞を多様な類型の造血ＣＦＵを有するウェルから収集し、ＩＭＤＭ培地５体積でメチルセルロースを希釈することによって、単離させた。単一細胞懸濁液を部分に分けてイソタイプ対照群または抗原特異的抗体で染色させた。使われた抗体組合わせは、フルオロセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に接合されたＣＤ２３５ａ、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）に接合されたＣＤ４５及びアロピコシアニン（ＡＰＣ）に接合されたＣＤ１３であった。また細胞の一定部分はまた、イソタイプ対照群としてＡＰＣ、ＰＥ、及びＦＩＴＣに接合されたマウスＩｇＧで染色させた（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ^TM）。サンプルをＬＳＲＩＩ流れ細胞測定器で）操作し、ＦｌｏｗＪｏ^TMバージョン６．３．２ソフトウェアで分析した。
内皮前駆細胞分析
内皮前駆細胞分析のために、細胞の残りの伴分を３−７日間ＥＧＭ−２またはＥＧＭ−２ＭＶ完全培地（Ｃａｍｂｒｅｘ^TM）でフィブロネクチン被覆されたプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ^TM）上にプレートした。単離された血管芽細胞コロニーの内皮細胞への分化能は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上の管形成、ＬＤＬ吸収及び内皮細胞表面マーカーの存在を検出する免疫組織化学を利用して確認された。
Ｍａｔｒｉｇｅｌ上の官形成
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ^TM）を４−ウェル組織培養プレート（０．２ｍｌ）または９６−ウェルプレート（０．０５ｍｌ）のそれぞれのウェルに添加し、３７℃で４５−９０分間固形化した。ゲル形成後、前記培養物から由来した０．５−１．５Ｘ１０５細胞を含有するＥＧＭ−２またはＥＧＭ−２ＭＶ培地に細胞懸濁液０．２−０．３ｍｌ（例えば、９６−ウェルプレートに対して０．１ｍｌ）をＭａｔｒｉｇｅｌの上部に位置させ、３７℃、５％ＣＯ₂で培養させた。毛細管類似（管）構造の形成を１６−２４時間培養後にチェックした。図７は、Ｈ９（ａ）及びＡＣＴ３０（ｂ）細胞から由来した血管芽細胞の管−コード（ｃｏｒｄ）形成の代表的な写真を表す；Ｍａｔｒｉｇｅｌ基材培地上に再プレートした後、血管芽細胞は、毛細血管類似構造を形成し、またＡｃ−ＬＤＬを吸収する付着細胞を発生させた。図８（ａ）は、またＨｌ−ＧＦＰ細胞から由来した内皮潜在性を有する血管芽細胞の管−コード構造の代表的な写真を示す。また、図１７ｑは、血管芽細胞から由来した付着細胞の再プレート後Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に形成された毛細管類似構造を示す。このような細胞は、ＡＣ−ＬＤＬを吸収しうる（データは示さない）。
ＡＣ−ＬＤＬ吸収
フィブロネクチン被覆されたウェルで３−７日間成長された血管芽細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７−標識ＡＣ−ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^TM）１０μｇ／ｍｌと添加し、４−６時間培養した。次いで、細胞を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、３０分間４％パラホルムアルデヒドで固定させた。ＡＣ−ＬＤＬの吸収は、蛍光顕微鏡下で視覚化された。
例えば、図８ｂは、Ｈｌ−ＧＦＰ細胞から由来した血管芽細胞のＡＣ−ＬＤＬ吸収を表す。図１７ｚ及び１７ａａはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４標識ＡＣ−ＬＤＬとの培養が内皮細胞の中断（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ）染色パターン特性を表すということを示す。
免疫細胞化学
フィブロネクチン被覆ウェル上で３−７日間成長した血管芽細胞を１ＸＰＢＳで３回洗浄させ、４％パラホルムアルデヒドでＯ３０分間固定させた。Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）、ＶＥ−カドヘリン、ＫＤＲ及びＣＤ３４の発現のために、細胞を透過させた後、１次抗−ヒトｖＷＦ（Ｄａｋｏ^TMまたはＣｈｅｍｉｃｏｎ^TM）、ＰＥＣＡＭ−１及びＫＤＲ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^TM）、ＶＥ−カドヘリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ^TM）、及びＣＤ３４（Ｄａｋｏ）抗体と共に各々４℃で一晩中培養させた後、ロダミンまたはＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ^TM）で標識された相応する２次抗体で３０−６０分間培養させた。ｖＷＦ蛋白質の発現は、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７ ２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ^TM）と共に３０−６０分間培養することによって検出された。最終洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡下でチェックした。図９は、Ｈｌ−ＧＦＰ ＥＳ細胞から由来した血管芽細胞でのｖＷＦ発現を表す。図１７ｓは、血管芽細胞由来の内皮細胞でのｖＷＦの発現（矢）を表す。血管類似構造での付着細胞は、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）、ＫＤＲ及びＶＥ−カドヘリンに対して陽性であった（図１７ｔ、１７ｕ、及び１７ｚ−１７ｃｃ）。

文献［Ｋｒｏｓｌ ｅｔ ａｌ．（２００３ Ｎａｔ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：１４２８−１４３２）］には、ＴＡＴ−ＨｏｘＢ４蛋白質はＦＢＳを含有する環境で非常に不安定であり、生物学的機能を保持するためには、２時間ごとに改めなければならない説明した。本明細書で存在する結果は、ｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４が５％ＦＢＳを含有する培地で不安定であり、１時間未満の半減期を有することを確認させた（図１９Ｂ）。７０℃で３０分間のＦＢＳ前処理は大部分の酵素活動を除去した。その安定性をさらに調べるために、ｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４蛋白質を無血清ステムライン培地に添加し、３７℃でｈＥＳＣで培養した。図１９Ｃで示したように、ｈＥＳＣへの４８時間培養後にも、ｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４蛋白質の実質的な断片が検出された。
実施例４：ＳＣＩＤマウスに移植されたマトリゲルプラグが内皮細胞を発生させる
血管芽細胞由来内皮細胞またはＨｌ−ＧＦＰヒトＥＳ細胞から由来の純粋な血管芽細胞（１×１０⁶細胞）を精製し、７００μｌのマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ^TM）で再懸濁した。この細胞を４週齢ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ^TM）の脊椎領域に皮下注射した。注射後５週目、動物からマトリゲルプラグを除去し、このプラグから凍結標本を製造した。マトリゲルプラグの横断面を固定し、標準ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色だけでなく、抗−ヒト特異的核抗体（ＭＡＢ１２８１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ^TM）及びヒト特異的抗−ｖＷＦ抗体後、蛍光染料標識化された該当２次抗体（ＭＡＢ１２８１のためのヤギ抗−マウスＩｇＧ−テキサスレッド２次抗体）を利用する免疫組織化学法で染色した。図１０は、Ｈ＆Ｅ染色されたマトリゲルプラグの横断面内の血管を立証し、図１１はマトリゲルプラグの横断面内の血管がヒト特異的核抗体に対して陽性であるヒト血管芽細胞由来の細胞であることを立証する。
実施例５：眼球の生体内の虚血／再潅流研究
２種の技術、ガラス体内注射及び養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用して、生体内の復旧過程に対するｈＥＳ由来血管芽細胞の寄与度を直接的に調べた。虚血／再潅流（Ｉ／Ｒ）損傷は、眼内圧の上昇を誘発した。Ｉ／Ｒが損傷されたモデルは、血管閉塞（ｖａｓｏ−ｏｂｌｉｔｅｒａｔｉｏｎ）及び無細胞毛細管の生成を含む網膜内皮に対する損傷を起こす。網膜Ｉ／Ｒ損傷後７日目、マウスに６日目、血管芽細胞（“ｈＥＳ−ＢＣ”とも称される）から収集された蛍光標識化された血管芽細胞をｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌｓｉｎｕｓを通じて全身注射したか（ｎ＝１３）、またはガラス体内注射した（ｎ＝４）。

注射後１日目、マウスを安楽死させ、網膜を除去し、ロダミン−接合されたリシヌスコミュニスアグルチニンＩで標識化した。このようなアグルチニンは、内皮細胞により特異的に発現された糖蛋白質に結合するので、血管外部表面を蛍光標識化するのに利用される。共焦点顕微鏡は、血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）由来内皮細胞に対する緑色蛍光標識を立証し、これは３３．５±１０％の損傷された眼球の網膜脈管構造を表した。対照群眼球（図２０ａ及び２０ｂ、各々）では、緑色蛍光が観察されず、これは血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）細胞が単に損傷された領域にのみ同化される無細胞領域に帰り、損傷された網膜内に非潅流性（ｎｏｎ−ｐｅｒｆｕｓｅｄ）無細胞毛細管の再内皮化を起こすという事実を立証する（図２１ａ及び２１ｂ）。このような復旧過程は、同じ方式であらゆる動物（ｎ＝ｌ７）で観察された。

Ｉ／Ｒ損傷された動物の２番目群（ｎ＝６）を前述したように取扱った後、犠牲させる前に、血管の血管ルメン（ｖａｓｃｕｌａｒ ｌｕｍｅｎ）を視覚化し、決定的にこのような細胞により回復された血管を開き、したがって、機能性であるを立証するために３−５ｍｌのＴＲＩＴＣ−接合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）デキストリンを使用して潅流固定した。赤色染色は開いた血管を表し、緑色染色は血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）由来の内皮細胞を立証し、黄色染色は血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）細胞が開いた脈管構造を発生させた位置を示した。図２１ｄは、ｈＥＳ−ＢＣ細胞注射後２日目、黄色（赤色及び緑色、薄い灰色で現れる）蛍光を有する大血管を図示し、これは細胞が血管壁で統合され、血管が潅流されたことを表す。この動物で、特に顕著なのは緑色だけ観察された多数の微細血管であり、これは開いたルメンを発生させるのに充分に成熟されていない新たな横補償新生脈管構造（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）を表すものと見られ、よって悲観類されたままで残っていた。図２０ｃは、同じ動物の非損傷された対照群眼球を図示し、明白にＢＣ細胞がいかなる方式でも非損傷された脈管構造と関連されなかったことを立証する。ｈＥＳ−ＢＣ細胞注射後７日目に犠牲されたマウスからの網膜扁平標本（ｍｏｕｎｔ）で、緑色管（非ルメン化、非潅流性血管）の数は、２日目犠牲されたマウスに比べて少なかった。ＴＲＩＴＣ−デキストリン（赤色）で潅流されたｈＥＳ−ＢＣ細胞由来の血管（緑色）を表す黄色血管（薄い灰色または白色で現れる）がさらに多く存在した。これは完全に機能性の血管を表し、血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）細胞が損傷された眼球の血管内に統合され、潅流された微細血管を有する面積をさらに広げたしたを立証した（図２Ｏｅ）。

蛍光免疫組織化学法は、血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）細胞由来の内皮細胞を同時位置させて（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ）、Ｉ／Ｒ損傷されたマウス眼球の横断面内の損傷された脈管構造を示し、損傷された眼球からの網膜内の神経節細胞層の血管の代表的な横断面を示す（図２Ｏｆ）。血管の抗−ＣＤ３１染色とヒト核抗原染色の同時位置は、脈管構造内の内皮細胞のうち、一部が血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）細胞から由来したことを提示する。図２０ｆは、内境界膜に隣接する神経節細胞層内の血管ルメンの高配率写真を示す。ルメンは、内皮細胞により囲まれており（図２Ｏｆ、矢印、ＣＤ３１）、血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）細胞由来の成熟した内皮細胞により囲まれている（図２Ｏｆ、矢印、ヒト核抗原）。
方法
生体内の虚血／再潅流研究のために、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）は研究の序盤に７ないし１０週齢であった。虚血／再潅流損傷は、眼内圧（ＩＯＰ）の上昇を誘発した。虚血の誘発間マウスを吸入麻酔（イソフルラン蒸気）下に置いた。眼球の前方（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ）を食塩水注入ラインに付着された３０−ゲージ針でキャニュラーをさし、眼球前方に２時間の静水圧（８０−９０ｍｍＨｇ、ＴｏｎｏＰｅｎにより測定し、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｓｏｌａｎ、Ｊａｃｋｓｏｎｖｉｌｌｅ、Ｆｌａ）処理した。これは紅彩の白色症及び赤色反射の損失により確認されるような網膜虚血を引き起こす。１２０分後、針を除去し、ＩＯＰを正常化し、これは再潅流損傷を引き起こす。反対側眼球は対照群として作用した。

網膜虚血再潅流損傷後７日目、マウスに６日目ｈＥＳ−ＢＣｓから収集された蛍光標識化された血管芽細胞をｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓを通じて全身注射したか（ｎ＝１３）、またはガラス体内注射した（ｎ＝４）。血管芽細胞の蛍光バイタル標識化は製造社の説明書によって染料ＰＫＨ−６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ^TM）を使用して行った。全身注射の場合、各マウスは４×１０⁵標識化された血管芽細胞を１００μｌ投与した一方、ガラス体内注射の場合、各マウスは５×１０⁴ 血管芽細胞を２μｌ投与した。ガラス体内注射群の反対側対照群の眼球には、無菌性等張食塩水の当量体積を注射した。１日後、マウスを安楽死させ、眼球を除去し、４％パラホルムアルデヒドで１時間固定した。洗浄後、周辺切開術（ｃｉｒｃｕｍｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｌｉｍｂｉｃｉｎｃｉｓｉｏｎ）で眼球を切開して角膜及び水晶体を除去した後、ガラス体液を除去した。次いで、非損傷された神経網膜を、下の脈絡膜から柔らかに取って除去した。非損傷された網膜を均質化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）緩衝液に位置させた。網膜を単離し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．５）のうち、１：１０００ロダミン−接合されたＲ．コミュニスアグルチニンＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内で４℃で一夜間培養した。２４時間後、網膜を４０℃で２４時間１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭＮａＣｌで洗浄した後、フロリダ大学（Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ）の光学顕微鏡施設でのＭＲＣ−１０２４共焦点レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（ＢｉｏＲａｄ）を使用するイメージ化のためにカバースリップ上に標本化した。代案として、Ｚｅｉｓｓレーザースキャニング共焦点顕微鏡を利用して網膜をイメージ化した。

右側眼球がＩ／Ｒ損傷処理されたマウスの２番目群（ｎ＝６）は約２×１０⁵ ＰＫＨ−６７標識化されたｈＥＳ−ＢＣまたは血管芽細胞を左側ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌｓｉｎｕｓ注射で１００μｌ投与された。マウスは、損傷後２日目及び７日目（各ｎ＝３）安楽死させ、左心室穴を通じて４％緩衝されたパラホルムアルデヒドで３−５ｍｌ ＴＲＩＴＣ−接合されたデキストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，５ｍｇ／ｍｌ）で潅流した。次いで、眼球を除去し、切開し、前述したような共焦点顕微鏡によるデジタルイメージキャップチャーのために網膜を扁平に標本化した。反対側（非損傷）眼球は、対照群として作用した。このような潅流固定方法は、機能性血管のみを潅流できるために、開いた血管の視覚化を許容する。
実施例６：糖尿病モデルの生体内の復旧
生体内の復旧は、３ヵ月超過の第２類型糖尿病がある自発的に糖尿病性肥満であるＢＢＺＤＲ／Ｗｏｒラットで研究した。このラットは、無細胞毛細管及び内皮機能異常、外膜細胞損失及び血液網膜障害破壊を含む予備増殖性糖尿病網膜病症の多数の特徴を発生させる（文献［Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｂｌｏｏｄ（９２）：３６２−３６７；Ａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２７５）：９６４−９６７；Ｋａｌｋａ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．（８６）：１１９８−１２０２；Ｍｕｒｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１０５）：１５２７−１５３６；Ｕｒｂｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．（１４）：３１８−３２２］参照）。

Ｉ／Ｒマウスモデルと同じように、ガラス体内投与されたｈＥＳ−ＢＣ細胞（血管芽細胞）が広い脈管構造及び狭い脈管構造（図２１ａ及び２１ｂ）いずれも有する領域内に広範囲に統合された。図２０ｂはまた、ほぼいずれも緑色であり、非常に急激に狭くなる大血管（図２１ｂの右側上の薄灰色血管）を示す。かような「ピンチオフ」血管は予備増殖性糖尿病網膜病症の特徴であり、このとき、微小血栓症（ｍｉｃｒｏｔｈｒｏｍｂｉ）は、血管変性及び下流虚血を起こす。かようなピンチされた広い血管からの広範囲に分枝化され、連続される牛血管は、緑色ＢＣ細胞の高度の統合を示す（図２１で薄灰色で図示する）。対照的に、緑色ｈＥＳ−ＢＣ細胞は、非糖尿病性対照群動物からの眼球内の残留血管と同時位置していない。非糖尿病性対照群動物からの眼球は、ＢＣ細胞が非損傷の脈管構造内に統合されるのではなく、ｈＥＳ−ＢＣ細胞のガラス体内投与後に、網膜の端にシートとして残っているということを確認させた（図２１ｃ、薄灰色領域）。

免疫組織化学的分析によって、ガラス体と神経網膜とを分離する内部境界膜直後部の、糖尿病性ラット網膜の神経節細胞層内細胞ライニング血管ルーメン内のヒト核抗原及びＣＤ３１を利用する同時局所化染色（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を確認した（図２１ｅ及び２１ｆ）。この解剖学的位置は、外見上の網膜血管叢の位置であり、糖尿病で血管病理学の典型的な位置である。かような正確な局所化及び強力な統合によって、血管芽細胞が糖尿病性網膜症に関連した血管の修復に参与することを明白に確認した。ほとんどの切片は、周辺が内皮（ＣＤ３１）及びヒト核抗原マーカいずれに対しても染色される細胞でライニングされた明確に可視的なルーメンを有した血管を示した一方（図２１ｅ及び２１ｆの矢印）、ＢＣ細胞も注入した非糖尿病性対照群ラット眼球内血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）の細胞統合の証拠は確認されなかった（図２１ｄ、矢印）。
実施例７：ミューリン後肢虚血モデルでの生体内修復
また、ミューリン後肢虚血モデルを介して血管内皮細胞を生成できるＢＣ細胞の能力を調べた。実験は８週齢ないし１２週齢（２０〜３０ｇ）ＮＯＤ−ＳＣＩＤ β２マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を利用して遂行した。右側後肢の虚血は大腿動脈連結術を利用して誘導し、血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）（６ｘ１０⁵ ｈＥＳ−ＢＣ細胞）または無細胞培地を、前記連結術手術直後に虚血性筋肉周辺部位に注入した。

注入した血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）の生理的な機能を立証するために、右側虚血性後肢血行を４週間モニタリングし、左側の正常後肢の血行と比較した。免疫蛍光技法を利用してヒト特異的ｖＷＦ（Ｒ ａｎｄ Ｄ ｓｙｓｔｍｅ^TM、ＭＮ）を検出し、移植された血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）由来の血管内皮細胞を確認した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４と接合された第２抗体を使用した。血行分析のために、レーザドップラ血液イメージング技法を使用し、大腿動脈連結以前（０日）及び以後（３日から３０日）でのマウスの血行を分析し、血行速度は、非虚血性足での血行に対する虚血性足での血行の割合で計算した。

図２２ｆ及び図２２ｇで確認しうるように、血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）は、培地対照群に比べて虚血性足での血行速度の回復に有意的に増強させた（ｐ＜０．０００１）。かような改善は、正常血行速度が得られるまで４週間持続された。

虚血性筋肉内にｈＥＳ−母細胞コロニー細胞を注入してから４週目に動物を犠牲にし、ヒト特異的ｖＷＦに対して免疫染色した。筋肉内部位は、ヒト特異的ｖＷＦ細胞の陽性染色を保有すると確認されたが、これは、血管組織化を示すものである（図２２ｄ−ｅ）。無細胞培地が注入された梗塞された筋肉から取った対照群組織は、ヒトｖＷＦ染色を表さなかった（図２２ｃ）。
実施例８：ミューリン心筋梗塞モデルでの生体内修復
ミューリン心筋梗塞（ＭＩ）モデルを利用した一連の実験で、前述のように［参照：Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００２ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ（９３）：１１４０−１１５１］、左側冠状動脈の連結によって、８週齢ないし１２週齢（〜２０〜３０ｇ）ＮＯＤ−ＳＣＩＤ β２マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ^TM）で心筋梗塞を誘導した。心筋梗塞を誘導して１５分後に、Ｈ１−ＧＦＰ ｈＥＳ細胞由来の３ｘ１０⁵ ＧＦＰ−血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）または無細胞培地を虚血性心筋及び虚血性心筋の周辺に移植した。実験プロトコルは、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｍ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇガンセンターの動物保護委員会から承認された。血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）注入後３０日目に、注入された血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）の７１％（１２／１７）は生存した一方、培地対照群を注入した動物の場合、４２％（８／１９）が生存した（図２２ｈ、ｐ＜０．００２）。

虚血性心筋及び虚血性心筋の周辺に血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）を注入し、４週目に動物を犠牲にし、迅速に心臓を摘出した後でＰＢＳ中て洗浄した。心臓は、組織冷凍培地（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ^TM、ＮＪ）内に包埋した。冷凍組織は、１０−μｍスライドに切片化した。

また、移植された血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）は、心筋細胞を生成させた。移植された血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）から再生された心筋細胞を確認するために、二重免疫蛍光染色技法を使用し、Ｈ１−ＧＦＰ ｈＥＳ細胞（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．^TM、ＣＡ）由来のヒト細胞でのみ発現されるＧＦＰ及びｃＴｎＩ、心筋細胞マーカ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．^TM、ＣＡ）を検出した。ＧＦＰのためにはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、またはＴｎＩのためにはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４と接合された第２抗体を使用した。イメージは、蛍光顕微鏡で撮影した。Ｎ＝３．図２３は、ＭＩマウスでＧＦＰ（最も明るく染色された部位）及びｃＴｎＩ（中間ほどに曇った部位）の免疫染色を表し、ＧＦＰ及びｃＴｎＩに対して陽性に染色された細胞は、注入されたｈＥＳ−ＢＣ細胞から由来した心筋細胞であった（図２３、倍率２００ｘ）。矢印は、注入されたｈＥＳ−ＢＣ細胞から由来した二重陽性染色細胞を示す。

実施例７及び実施例８の結果から確認しうるように、血管芽細胞は、心筋梗塞後の死亡率を低下させ、虚血性後肢でほぼ正常レベルに血行を回復させた。
実施例９：血管芽細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞は、試験管内で平滑筋細胞を生成させることが可能
本発明の血管芽細胞またはｈＥＳ−ＢＣ細胞はまた、平滑筋細胞に分化され、従って特定実施例で全能細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）でありうる。

血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）内での遺伝子発現を調べるために、６日目に細胞を解剖顕微鏡下で注意深く取り、全体ＲＮＡを分離した。ＲＮＡｅａｓｙマイクロｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ^TM）を利用し、前記ＲＮＡから単一鎖ｃＤＮＡを合成し、このとき、ＳＭＡＲＴ ＩＩ及びＣＤＳプライマー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ^TM）とスーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^TM）を使用し、ｃＤＮＡプールは、ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ合成ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ^TM）を利用して構成した。平滑筋遺伝子発現パターンは、ＳＭ２２、平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、ＧＡＰＤＨ（特質対照群）及び平滑筋カルポニン（ＣＮＮ１）に対して特異的なプライマーを利用し、ＰＣＲで分析した。ヒト大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭ）由来の全体ＲＮＡは、陽性対照群として使用し、マウス線維芽細胞３Ｔ３全体ＲＮＡは、陰性対照群として使用した。ＰＣＲ生成物は、１％アガロースゲル上で分離し、ＥｔＢｒ蛍光によって露出させた。

図２４は、血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）が平滑筋特異性遺伝子ＣＮＮ１、α−ＳＭＡ及びＳＭ２２を発現するところを示す。

本発明の血管芽細胞から平滑筋細胞を誘導するために、平滑筋培地（Ｌｏｎｚａ^TM）内のフィブロネクチンコーティングされた培養スライド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ^TM）上に精製した血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）をプレーティングし、２−９日間分化を誘導した。次に、細胞を１５分間４％パラホルムアルデヒドで固定し、１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）した。平滑筋蛋白質の発現の検出のために、透過化した細胞を４℃で一晩カルポニン（ＣＮＮ１）及びα−ＳＭＡ（Ｄａｋｏ）に対して一次抗体と共に培養した後、ロダミン標識された二次抗体を利用して蛍光顕微鏡で検査した。

図２４に提示した結果は、前記条件下での試験管内分化後に、ある血管芽細胞（ｈＥＳ−ＢＣ）はＣＮＮ１及びα−ＳＭＡ陽性平滑筋細胞を発生させるということを明確に立証する。
実施例１０：マウスモデル系の移植受容者での免疫寛容の誘導
本発明の方法によって生成及び増殖されたヒト血管芽細胞は、移植受容者で供与者特異的免疫寛容を誘導するのに利用できる。血管芽細胞または誘導された造血母細胞は、細胞が多数で提供されるとき、無条件受容者（ｕｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）に移植されうる。移植されてキメラ現象を発生させる血管芽細胞の能力は、マウスをヒト免疫細胞で再構成した免疫低下ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−Ｔｇマウスモデル系でテストできる。免疫欠乏ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−Ｔｇマウスは、全身照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）で処理し、同じ日にヒト供与者血管芽細胞を注射できる。ヒト胎児胸腺及び胎児肝断片をマウスの腎臓被膜（ｃａｐｓｕｌｅ）下部に移植し、ヒトリンパ球生成及びヒト免疫系の再構成を達成する。移植されたヒト胸腺及び肝断片は、ヒト供与者血管芽細胞に対して不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）である。次に、第三の非一致（ｎｏｎ−ｍａｔｃｈ）移植片に係る耐性と比較し、ヒト血管芽細胞に対して一致した（ｍａｔｃｈ）移植片に対して耐性をマウスに対して検査できる。

移植を最適化するために、胸腺照射の投与によって胸腺スペース（ｔｈｙｍｉｃ ｓｐａｃｅ）を誘導できる。マウスモデルで、受容者マウスは、抗−ＣＤ４及び抗−ＣＤ８ｍＡｂのような抗−Ｔ細胞ｍＡｂを受容することができ、０日目に７ Ｇｙ胸腺照射、そして０ないし４日目にヒト血管芽細胞を受容することができる。

耐性を評価するために、混合リンパ球反応及び細胞媒介リンパ球溶解研究を遂行しうる。

また、ｈｕ−ＳＣＩＤマウスまたは類似のモデル系でキメラ現象を誘導する血管芽細胞の能力を検査するために、前述の方法でヒト胎児肝断片をヒト血管芽細胞に代用できる。
実施例１１：移植受容者での免疫寛容の誘導
ヒトで、耐性は、本発明の方法によって生成及び増殖または増殖された多数のヒト血管芽細胞を利用して達成できる。

末梢キメラ現象は、全身照射の必要なしに多数の血管芽細胞を介して達成できる。しかし、中枢欠損性（ｃｅｎｔｒａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎａｌ）耐性を達成するためには、高いレベルの胸腺内のキメラ現象を発達させるために、胸腺にスペース（ｓｐａｃｅ）を生成することが最適でありうる。胸腺内のスペースは、特異的照射によってまたは抗−Ｔ細胞抗体の多数の投与の利用によって、または胸腺を枯渇させる薬物によって達成できる。

本方法は、次の段階のうち一つ以上を含みうる：共通刺激遮断（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｂｌｏｃｋａｄｅ）または受容者Ｔ細胞の不活性化、耐性誘導細胞、例えばヒト血管芽細胞の移植、選択的に、供与者基質組織の移植またはヒトサイトカイン投与、胸腺照射の投与。十分に多くの個数の供与者ヒト血管芽細胞と胸腺照射及び／またはＴ細胞共通刺激遮断の組合わせは、全身照射の必要性を顕著に減少または除去する。本方法は、これら段階のうち任意のもの、または全部を含むことができ、段階は、次の順序で遂行しうる。

まず、ウマの抗ヒト胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）またはその他枯渇性抗Ｔ細胞枯渇剤の調製物を受容者に静脈注射する。この抗体調製物は、成熟したＴ細胞を除去する。もし除去されなければ、成熟したＴ細胞は、ヒト血管芽細胞またはこれから誘導される造血母細胞、そして敏感化後には移植片自体の双方いずれの拒否も促進できる。ＡＴＧ調製物は、自然殺傷（ＮＫ）細胞をさらに除去する。ＮＫ細胞は、移植された臓器には恐らく効果を示さないが、新しく導入されたヒト血管芽細胞を拒否するように即刻作用できる。

受容者Ｔ細胞が移植後に再生する時間の間、受容者胸腺内の供与者抗原の存在は、受容者Ｔ細胞を耐性化するのに重要である。もし受容者Ｔ細胞が再生する前に供与者ヒト血管芽細胞が受容者胸腺で確立されて耐性を誘導できなければ、非骨髄除去性（ｎｏｎ−ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）治療法全体を介して、抗受容者Ｔ細胞抗体の反復された投与量が必要でありうる。受容者Ｔ細胞の連続的枯渇が数週間要求できる。

非骨髄形成過程での第二段階は、特定成長因子またはサイトカインを提供し、ヒト供与者の血管芽細胞または幹細胞の接種（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）を促進するためのものでありうる。

その後、供与者のヒト血管芽細胞（または供与者と一致するもの）は受容者に注射できる。供与細胞は、受容者の適切なところに位置を占め、受容者の残りの細胞と隣接して成長して増殖し、キメラリンパ造血器系母集団を形成する。かような過程によって、新しく形成されたＢ細胞（及びこれらが生成する抗体）が供与者抗原に露出され、前記移植が自家移植として認識されるのである。

ヒト血管芽細胞または由来した造血母細胞接種が達成される受容者のＴ細胞レベルで供与者に対する耐性も観察される。一致した臓器移植が造血器系または骨髄キメラ現象が起きた後で何ヵ月が過ぎた受容者で起こる場合に、移植が免疫システムの体液性及び細胞性アーム（ａｒｍ）双方いずれでも受容されねばならない。かような接近は、受容者の患者の正常健康及び免疫力が臓器移植時点には回復されうるように、ヒト供与者血管芽細胞の移植後に十分に長い間の後にも、臓器移植の遂行を可能にするというさらなる利点を有する。

造血空間を生成する多くの方法が全身照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）を使用して接種を促進させる。照射の必要性は、多数の供与者血管芽細胞を投与することによって実質的に減少されたり除去できる。供与者ヒト血管芽細胞の投与は、例えば、胸腺空間を誘導する胸腺照射またはＴ細胞共同刺激遮断と同じ処置と共になされうる。

本明細書は、良好に定義され、かつ再現可能な条件下で血管芽細胞、またはヒトＥＳ−ＢＣ細胞が確実に由来して増殖されることを証明し、本来の機能を発揮できない血管構造を有する患者のための限りない細胞源を示す。かような細胞の濃度は利用率で限定されず、むしろ個別的な正確な臨床要求に合わせることができる。医師が必要であるとと判断する場合、患者の全生涯にわたって同じ細胞集団が反復的に注入されることも可能なことである。また、一致するまたは減少された複雑性のＨＬＡ ｈＥＳラインの銀行を作りだす能力は、免疫抑制薬物及び／または免疫調節プロトコルいずれの必要性をも潜在的に減少させたり除去できる。

本明細書はまた、胚芽幹細胞から由来した血管芽細胞が四種の互いに異なる動物モデルで血管復旧を達成するのに使われうることを初めて証明する。新たな血管の形成は早くて活発であり、ｈＥＳ由来血管芽細胞が生体内で活発な復旧潜在力を有するということを示す。かような結果はまた、血管性疾病を有する患者で、血管化及び機能を回復するのに血管芽細胞が使われうることを示す。従って、血管芽細胞のような内皮前駆体細胞の入養転移（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、血管フローを回復させて毛細管密度を向上させ、四肢損失を減少させ、心筋損傷からの回復を促進するのに有用でありうる。

Claims (18)

1. ヒト胚芽幹細胞由来の血管芽細胞をインビトロで生成する方法であって、
   （ａ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）を含む無血清培地でヒト胚芽幹細胞を培養する工程；
   （ｂ）工程（ａ）で作製した細胞を、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＬＴ３（ＦＬ）、及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）からなる群から選択される少なくとも２つの成長因子を含む無血清培地で培養して、胚様体を形成する工程；
   （ｃ）前記胚様体を単一細胞に解離する工程；及び
   （ｄ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びＦＬＴ３（ＦＬ）を含む無血清メチルセルロース培地で前記単一細胞を培養し、それにより血管芽細胞を生成する工程、
   を含み、ヒト胚芽幹細胞由来の血管芽細胞が、造血細胞及び内皮細胞に分化することができる、方法。
2. 工程（ｄ）の無血清培地が、さらに、インスリン、トランスフェリン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の成長因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. ヒト胚芽幹細胞が、工程（ａ）において、細胞培養の少なくとも最初の４８時間、ＢＭＰ−４及びＶＥＧＦを含む無血清培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
4. 工程（ａ）及び（ｂ）が、細胞培養４８〜７２時間以内にて実施される、請求項１に記載の方法。
5. 工程（ｄ）が、細胞培養７２時間後に実施される、請求項１に記載の方法。
6. 工程（ｂ）の無血清培地が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 工程（ｂ）または工程（ｄ）の無血清培地が、ＨＯＸＢ４タンパク質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 工程（ａ）、工程（ｂ）、及び工程（ｄ）における培養が、低付着条件下で実施される、請求項１に記載の方法。
9. 工程（ａ）において、ＶＥＧＦの濃度が２５〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＢＭＰ−４の濃度が２５〜１００ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
10. 工程（ｂ）において、ＶＥＧＦの濃度が、２５〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＢＭＰ−４の濃度が、２５〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦの濃度が１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬの濃度が１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＰＯの濃度が１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＥＰＯの濃度が３〜６ユニット／ｍｌである、請求項６に記載の方法。
11. 工程（ｄ）において、インスリンの濃度が１０μｇ／ｍｌであり、トランスフェリンの濃度が２００μｇ／ｍｌであり、ＧＭ−ＣＳＦの濃度が２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ−３の濃度が２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ−６の濃度が１０ｎｇ／ｍｌまたは２０ｎｇ／ｍｌであり、Ｇ−ＣＳＦの濃度が２０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦの濃度が２０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＰＯの濃度が２０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬの濃度が２０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌであり、ＶＥＧＦの濃度が２５〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＢＭＰ−４の濃度が２５〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度である、請求項２に記載の方法。
12. 胚芽幹細胞が、ヒト集団に存在する少なくとも１つの主組織的合成複合体（ＭＨＣ）対立遺伝子について半接合性または同種接合性である胚芽幹細胞のライブラリーから由来し、ライブラリーの各メンバーは、前記胚芽幹細胞のライブラリーの他のメンバーと比較して特有のセットのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合体または同種接合体であり、それによりヒト集団に存在する少なくとも１つの主組織的合成複合体（ＭＨＣ）対立遺伝子に対して半接合体または同種接合体であるヒト血管芽細胞のライブラリーを生成し、前記ヒト血管芽細胞のライブラリーの各メンバーは、前記ヒト血管芽細胞のライブラリーの他のメンバーと比較して特有のセットのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合体または同種接合体である、請求項１に記載の方法。
13. ヒト血管芽細胞を精製する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
14. 血管芽細胞の精製工程が、抗ＣＤ７１抗体を用いた免疫親和性カラムクロマトグラフィーの使用を含む、請求項１３に記載の方法。
15. ヒト血管芽細胞を分離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
16. 血管芽細胞の分離工程が、サイズ及び／または形態によって前記血管芽細胞を分離することを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 血管芽細胞をヒト造血細胞に分化させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
18. 血管芽細胞をヒト内皮細胞に分化させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。

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