JP2002523039A - 非胎児血管芽細胞を含む細胞集団、およびその生産方法 - Google Patents
非胎児血管芽細胞を含む細胞集団、およびその生産方法Info
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Abstract
Description
強固な経験的証拠がある。この二つの潜在性を有する、血管芽細胞と呼ばれる、
多分化能性前駆体細胞が、W.Hisによって1900年に初めて仮定された。
推定の血管芽細胞は胚性培養物から得られ、サイトカインで操作することにより
それぞれ造血または内皮経路のいずれかに沿って分化する。細胞集団動態を用い
ることによって、胚内のプレ内皮/プレ造血細胞が表現型CD34−集団からは
っきりと発生することが示された(Choi et al., A Common Precursor for Hemat
opoietic and Endothelial Cells,Development 125,725-732(1998))。
これにより長期間の移植および複数系統の造血細胞/前駆細胞発現が可能である
ことが近年見出された。かなりの数のヒトCD34+細胞が、CD34-、Li
n-細胞が移植された動物中で検出された。正常ヒト骨髄のCD34-フラクショ
ンは、おそらく胎児の微環境中で移植可能なCD34+細胞を分化させて生産す
ることにより、子宮内での移植が可能である細胞を含むという結論が得られた(Z
anjani et al., Human Bone Marrow CD34- Cells Engraft In Vivo and Undergo
Multilineage Expression That includes Giving Rise to CD34+ Cells, Exper
imental Hematology 26:1-221(1998))。
び遺伝子治療のような細胞治療の必要がある患者のために非常に価値のあり得る
豊富に幹細胞を含む集団を提供するものである。
造血細胞および内皮細胞の共通前駆体を含む。この際、“未分化(uncommitted)
”とは、血管芽細胞が未だいずれかの系統に単分化していない、すなわち適切な
条件下でその細胞が造血細胞または内皮細胞のいずれにもなりうる、という意味
である。これらの血管芽細胞は安定で、一過性ではなく、新生児や成人のように
完全に発達した個体の組織内に存在する。事実我々は、これらの血管芽細胞は誕
生後の臍帯血から単離されうるということを見出した。類胚芽腫(embroid)以外
の組織における血管芽細胞の存在は予想外であり、新しい機会を与える。
成長因子を選択することによって、未分化血管芽細胞は刺激を受けて、造血細胞
または内皮細胞になる。以下にその詳細を示す。このように、成長因子の一つの
カクテルを供給すると、これらの血管芽細胞を増殖でき(すなわち、血管芽細胞
の数を増加できる)、および/または、これらを分化させて、例えば免疫易感染
性であるまたは血管芽細胞による遺伝子治療を必要とする患者に、造血細胞を供
給することができる。また、異なるカクテルを供給すると、血管芽細胞を増殖で
き、および/または、分化させて、例えば、遅い治癒または非治癒性の糖尿病性
潰瘍等の、創傷治癒に有効である、内皮細胞になりうる。内皮細胞はまた、例え
ば血管由来の因子を生産する遺伝子で、生体外(ex vivo)でトランスフェクショ
ンでき、これは、遺伝子治療に使用して、例えば血管または心不全の患者の血管
形成を刺激することができる。近年の研究では、サイトカイン遺伝子の移入が宿
主免疫細胞の抗腫瘍活性を増強する可能性が示された。腫瘍の血管供給を形成す
る内皮細胞は、腫瘍免疫療法を行うためのサイトカイン分子のデリバリーの有用
な媒体となりうる。Ojeifo,et al., Cytokines Mol Ther 1996 Jun;2(2):89-101
。
管芽細胞は適切な成長因子を供給することによって刺激されて造血細胞になるこ
とができるため、比較的少量のサンプルから出発しても高レベルの移植が可能で
あるであろう。
提供する方法であることを特徴とする。この方法は、(a)非胎児血管芽細胞を
含む第一の細胞集団を提供すること、および(b)非胎児血管芽細胞の増殖を促
進する条件下で、第一の細胞集団を成長すること、を含む。本発明はまた、非胎
児血管芽細胞を含む集団の拡張によって形成される細胞集第であることをも特徴
とする。
の(b)段階)において、その条件は、前記非胎児血管芽細胞の数および互いの
近接度が集団における他の非胎児血管芽細胞の集団を増加するのに十分であるよ
うな条件である。この方法は、成長段階の前に、非胎児血管芽細胞に関する第一
の細胞集団を増殖させることを含む。この方法はまた、例えばネガティブ選択プ
ロセスによって、細胞培養物中において他の細胞から非胎児血管芽細胞を分離す
ることも含む。この分離段階は、成長段階と同時に、その間に断続的に、または
その後に行われる。分離段階は、細胞増殖中に、例えば5〜10日ごとに、一回
以上行われる。成長段階は、細胞増殖中に少なくとも一つの成長因子、より好ま
しくは成長因子のカクテルを細胞集団に提供することを含む。非胎児血管芽細胞
の少なくともいくつか、好ましくは少なくとも2%、より好ましくは少なくとも
5%、より好ましくは少なくとも15%、最も好ましくは少なくとも25%は、
未分化のヒト血管芽細胞である。非胎児血管芽細胞の少なくともいくつか、好ま
しくは少なくとも2%、より好ましくは少なくとも5%、より好ましくは少なく
とも15%、最も好ましくは少なくとも25%は、CD34−、Lin−細胞で
ある。CD34−、Lin−細胞および/または未分化のヒト血管芽細胞の割合
は、初発の細胞培養物に比べて高濃度細胞培養物中において高い。未分化ヒト血
管芽細胞は、CD2-、CD3-、CD14-、CD16-、CD19-、CD24- 、CD56-、CD66b-、グリコホリンA-として特徴付けられる。未分化ヒ
ト血管芽細胞は、さらにflk−1+、CD45+、CXCR4+、MDR+(P
gp)として特徴付けられる。
とし、この高濃度細胞集団より少ない非胎児血管芽細胞を含む初発の細胞集団の
拡張によって得られる。
度細胞集団に比べて少なくとも10%少ない非胎児血管芽細胞を含む。高濃度細
胞集団における非胎児血管芽細胞である細胞の割合は、初発の細胞集団における
非胎児血管芽細胞である細胞の割合と同じまたはそれより高い。
くは少なくとも15%、最も好ましくは少なくとも25%の細胞が非胎児血管芽
細胞である細胞の組成物、および、そのような組成物の生産方法を特徴とする。
好ましくは、非胎児血管芽細胞は、Lin−細胞であるヒト未分化血管芽細胞で
あり、CD2-、CD3-、CD14-、CD16-、CD19-、CD24-、CD
56-、CD66b-、グリコホリンA-、flk−1+、CD45+、CXCR4
+、MDR+として特徴付けられる。
である。
明する概略図である。
拡大された線図である。図2aは、非標的細胞(非血管芽細胞)のネガティブ選
択に関するシステムのかなり拡大された線図である。
の概略図である。
す、概略的フローチャートである。
/CD38−/Lin−の標的細胞の成長速度論を示すグラフである。
いた次の再選択前の再選択細胞の集団プロファイルを示すドットプロット群であ
る。
団の集団プロファイルを示すドットプロット群である。
k−1を用いた培養物の3週間目の再選択細胞の集団プロファイルを示すドット
プロット群である。
いた選択培養物の3週間目の再選択細胞の集団プロファイルを示すドットプロッ
ト群である。
を含む集団の前駆細胞含有量を増加する方法を広範囲に特徴としている。好まし
くは、細胞は、CD34−、Lin−細胞またはCD2-、CD3-、CD14-
、CD16-、CD19-、CD24-、CD56-、CD66b-、グリコホリン
A-、flk−1+、CD45+、CXCR4+、MDR+として特徴付けられる
未分化血管芽細胞である。
続的に、または増殖後に、細胞集団における非標的細胞から標的細胞を選択する
ことを含む。細胞の増殖および細胞の選択は、ほとんど無限にある様々な異なる
技術およびセッティンを用いて行われるが、これらのうちいくつかを実施例とし
て以下に記載する。例えばフローサイトメトリーによる選択、不要細胞を殺す化
学薬剤を用いた選択など、多くの他の技術が当業者によって容易に予測される。
とする”標的細胞に対する親和性を有する選択分子を提供する)およびネガティ
ブ選択(すなわち“目的とする”非標的細胞に対する親和性を有する選択分子を
提供する)として広く分類される。これら二つの選択技術は、単独でまたは組み
合わせて使用され、不要細胞をシステムから除去し、標的細胞をいつでも必要な
時に集めることができる。
の標的集団に対して特異的である一以上の抗デキストラン結合抗体を、培養物中
に導入する。特定のインキュベーション時間後、磁気性デキストラン鉄粒子コロ
イド(magnetic dextran iron particle colloid)をその細胞懸濁液中に導入す
る。細胞/抗原/抗体/抗デキストラン/デキストラン/鉄複合体が形成される
。次に、この複合体を磁場に通過させる。ポジティブ選択された細胞は磁場に残
るが、鉄結合複合体を有さない細胞は除去される。捕獲してリンスした後、磁場
を除去し、ポジティブ選択された所定の標的集団を栄養培地に戻す。
標的集団に属さない所定の集団に対して特異的である一以上の抗デキストラン結
合抗体を、培養物中に導入する。特定のインキュベーション時間後、磁気性デキ
ストラン鉄粒子コロイドをその細胞懸濁液中に導入する。細胞/抗原/抗体/抗
デキストラン/デキストラン/鉄複合体が形成される。次に、この複合体を磁場
に通し、栄養培地から所定の標的集団に属さない細胞を除去する。所定の集団を
下流で集め、栄養培地に戻す。
他の技術をポジティブ選択およびネガティブ選択の両方に用いることができる。
、他の成分も含んでもよく、例えば選択分子を結合する固体支持体がある。この
固形支持体は、選択を行ったりまたは選択分子を所望の位置に維持したりまたは
これらを導入しかつシステムから除去することを補助する物質から形成される。
例えば、図2の説明で上記で述べたように、選択分子は鉄または他の磁気粒子に
結合できるため、選択細胞を磁場をかけることによって簡単にシステムから除去
した後、磁場をはずすことによって回収することが可能である。
るチャンバーの壁に結合させてもよい。ガラスのまたは他の不活性の不浸透性ビ
ーズもまた固体支持体として用いられ得る。ビーズまたは他の粒子を使用する場
合には、栄養培地がそこを通過して流れる充填形状で提供されても、またはルー
ズな形態、懸濁液または任意の望ましいタイプの配置でシステム中に導入されて
もよい。容易に理解できるように、広範で多様な他の固体支持体を使用してもよ
い。
に供給し、システムから除去する多様な操作形態で用いることがでる。これらの
操作形態は、栄養培地を細胞増殖の始めに供給し、加えたり除去したりしない、
選択的バッチ培養(図3)から、新鮮またはリサイクルされた栄養培地のいずれ
かを実質的に連続的にシステムを通して流す連続フローまたはリサイクルフロー
培養(それぞれ、図3Cおよび図3D)までの範囲である。これらの代わりの形
態については、以下に詳細に説明される。
ンプルもその容器に導入する。細胞増殖の間、栄養培地は交換してもしなくても
よい。しかしながら、選択された細胞は、物理的に選択される、即ち、連続的に
、断続的にもしくは細胞増殖後のいずれかで選択分子に結合することによって、
栄養培地中で他の細胞から分離される。これらの選択細胞は、ポジティブ選択を
使用する場合には、標的集団の細胞であり、またはネガティブ選択を使用する場
合には、不要細胞である。容器、ビーズ、バッフル(baffle)、インペラー(imp
eller)等の表面にポジティブ選択分子を形成しつつ、一方でネガティブ選択で不
要細胞を除去することによって、二重選択(ポジティブ選択およびネガティブ選
択)を行なってもよい。あるいは、細胞を培養容器の外でポジティブまたはネガ
ティブに選択して、戻してもよい。
ティブおよびネガティブ選択に関する選択バッチ形態と同様である。これらの三
種の形態間の重要な差は、栄養培地の処理にある。バッチ形態では培地の体積は
一定であり、培地は新しくされず(補給はされ得る)、セミ−バッチ形態は使用
済みの培地を新しい培地で部分的に交換し、供給バッチ形態は経時的に培地の体
積が徐々に増加する。
操作形態で行なわれてもよい。これら二つ形態において、そのシステムは、入口
および出口を有するチャンバーを備えており、栄養培地を入口から出口へチャン
バーを通過して流させる。連続形態では、新しい栄養培地を源またはリザーバか
らチャンバーを通過して流し、一方でリサイクル形態では、同じ栄養培地をチャ
ンバーを通過して繰り返し循環させる。もし必要であれば、連続またはリサイク
ル形態を交互に実施するタイプのシステムが可能である。任意の望ましい選択分
子がこれらの操作形態において用いられ得る。
の速度および純度に影響を与えてもよい。
に変化させ得る。細胞増殖を促進するための適切な成長因子としては、幹細胞因
子(Stem Cell Factor)(SCF;R&D Systems、カタログ番号:25
5−SC−010)、トロンボポイエチン(Tpo;R&D Systems、
カタログ番号:288−TP−005)、および、FLT3(R&D Syst
ems、カタログ番号:308−FK−005および308−FK−025)が
挙げられ、これら全てはR&D Systems,Inc., 614 McKinley Place NE, Minneapol
is,MN 55413から市販されている。好ましくは少なくとも10ng/ml、より
好ましくは10〜500ng/mlの上記各成長因子を添加する。細胞集団が未
分化血管芽細胞を含む場合には、供給される成長因子は、その血管芽細胞が造血
細胞になるかまたは内皮細胞になるかによって決定される。造血細胞を得るため
には、血管芽細胞にSCF、TPoおよびFLT3を含むカクテルを供給し;内
皮細胞を得るためには、血管芽細胞にVEGFを含むカクテルを供給する。SC
F、TPoおよびFLT3の適切な濃度は上述されている。VEGFの適切な濃
度は5〜100ng/mlである。
を受けることを見出した。我々は、標的細胞の増殖が増殖中の培養物中における
標的細胞の相対濃度を周期的に上げることによって促進されることを見出した。
例えば非標的細胞を分離し、例えば培養槽の断面直径を小さくすることにより、
残りの標的細胞を互いにより近接させて配置することによって、その濃度を上げ
ることができる。
影響を及ぼす。非標的細胞を培養物から除去することよって、副産物および阻害
剤の蓄積を減少させることにより細胞増殖を促進し、ゆえに頻繁な選択により標
的集団の増殖が促進できるであろう。ほとんどの場合、阻害を最小限にするよう
に、選択は実質的に全ての非標的細胞を除去することが好ましい。しかしながら
、場合によっては、他の集団を標的集団と共に増殖させることが望ましい。さら
に、混合集団を用いるまたは例えば移植片対白血病(Graft vs. Leukemia)(G
VL)型の効果が所望される骨髄修復などの、意図された用途において望ましい
場合には、選択を完全に排除してもよい。
る栄養培地、インキュベーター内のガス圧力、播種密度(非胎児血管芽細胞の初
期濃度)、および培養物の攪拌などが挙げられる。これらの因子は当業者であれ
ば容易に調節して、所望の結果を得ることができる。
。次に、この血液を上述したように用いて、自己由来または同種の非胎児血管芽
細胞のプールを作製し、これを患者の免疫系および/もしくは造血系にダメージ
を与える治療(例えば化学療法)の前に免疫系の追加刺激(booster)として、な
らびに/または、治療後に患者の易感染性免疫(compromised immune)系もしくは
造血系に対する刺激剤として、患者に標準的な方法を用いて投与する。例えば、
米国特許第5,130,144号、米国特許第5,635,386号、米国特許
第5,670,147号、米国特許第5,646,043号、米国特許第5,6
35,387号および米国特許第5,061,620号等の文献に記載される方
法を用いて、骨髄等の、免疫系の部分を再構成するために細胞が投与される。な
お、上記文献の開示は、ここに引用することによって参照される。
後、この非胎児血管芽細胞を前駆体として用いて細胞の望ましい集団の増殖を促
進するように選択された条件下で培養液中に細胞を置くことによって、細胞の選
択集団のプールを作製してもよい。
治療に使用できる。例えば、そのような細胞は創傷治癒に用いられ、例えば、注
射によってデリバーされるドナー内皮細胞はレシピエントマウスの血管新生領域
にのみ局在化していることが見出されている(T. Asahara et al., Isolation of
Putative Progenitor Endothelial Cells for Angiogenesis,Science, Vol.275
, p.964, Feb.14,1997)。内皮細胞はまた遺伝子治療にも使用でき、例えば、内
皮細胞は、例えば、その開示はここに引用されることによって参照される、米国
特許第5,733,876号、米国特許第5,712,291号および米国特許
第5,698,586号に開示されるような血管形成阻害タンパク質をコードし
た切り替え可能な遺伝子を用いて、腫瘍の血管新生を阻害するようにデリバーさ
れうる。インビトロの生産システムは、癌検出や癌治療に用いられる抗血管新生
剤のスクリーニングに用いる血管形成活性分析に、ならびに例えば、冠状動脈、
末梢動脈および脳血管等の、虚血性循環器疾患の治療における血管新生を目的と
する移植などの、移植組織操作用途に特に有用である。
cco's Medium)(IMDM)(100ml)、ペニシリン/ストレプトマイシン
(50μl)、BSA(50mg/ml)、インスリン(50μg/ml)、ト
ランスフェリン(1mg/ml)、低比重リポタンパク質(100μl)、2−
メルカプト−エタノール(1/100溶液を7μl)、FTL3(100ng/
ml)、SCF(100ng/ml)、Tpo(100mng/ml)。
。
た。
に、5,000Lin−細胞/mlを接種した。
て、ネガティブ(−)選択で精製した。
長培地に接種し、37℃および5%CO2でインキュベーター内にその培養皿を
設置した。
日、21日目に実施した。
含むカクテルと共に、培地中で細胞をインキュベートした。インキュベーション
後、磁気性デキストラン鉄粒子コロイドを細胞懸濁液に加えた。細胞/抗原/抗
体/抗デキストラン/デキストラン/鉄複合体が形成された。次に、この複合体
を磁場に通し、所定の標的集団に属さない細胞を栄養培地から除去した。標的集
団を下流で回収し、栄養培地に戻した。我々が次に行なった詳細な方法を以下に
説明する。
cia Biotech)製)比重遠心法を用いた単核細胞組成物(バフィーコート)を調製
し、PBS(Ca++またはMg++を含まない)で二回リンスした。
、CD56、CD24、CD19、CD66b、CD14、CD16及びグリコ
ホランA(glycophoran A)(ステムセップ(StemSep)製)を含む抗体カクテル10
μlを、上記段階2で得られた2×107個の単核細胞を含む1mlに加えた。
μlを加えた。
ムセップ(StemSep)製)、ポンプ(コール−パーマー(Cole-Parmer)製)および磁
石(ステムセップ(StemSep)製)を組み立てて、流速をカラムの製造社の説明書
に従って調整した。
すぐに、サンプルをカラムの頂上にのせた。
ス中を通過させた。
ックスに入らないよう、PBSにFBSを加えたものを断続的にカラムの頂上に
加えた。
した。
ドルフチューブに移した。
1mlのHBSに再懸濁した。
濃度で栄養培地にまいた。
34-/CD38-/Lin-の標的細胞の成長速度論を示すグラフである。図5
に示されるように、CD34-、Lin-の細胞の集団は、30日の期間中拡張し
続けた。
いた次の再選択前の再選択細胞の集団プロファイルを示すドットプロット群であ
る。我々は、(a)それぞれの選択段階の前にLineageのポジティブな後
代(lineage positive progeny)の継続的な生産高;(b)CD34+、Lin-細
胞の継続的な増殖、および(c)CD34-、Lin-細胞の継続的な増殖を観察
した。
の集団プロファイルを示すドットプロット群である。CD34対抗VEGF受容
体(VEGFR)を用いて、我々は、CD34−/VEGFR+細胞の存在を接種
材料中に観察した(図7の囲み部分を参照)。
−1を用いた培養物の3週間目の再選択細胞の集団プロファイルを示すドットプ
ロット群である。この培養物中の実質的に全ての細胞はCD45+であり、かな
りの勾配がMHCの発現中で存在する。重要なことに、細胞がCD45+である
という事実から、CD34+/−、Flk−1+細胞が、CD45−である、ヒ
トの臍帯血管内皮細胞(HUVECS)を汚染していないことが示される。MH
Cの発現における勾配から、天然のおよび成熟した双方の白血球の存在が示され
る。
いた選択培養物の3週間目の再選択細胞の集団プロファイルを示すドットプロッ
ト群である。丸で囲まれた細胞はCD34+(バックゲイト分析(backgated an
alysis))であり、四角で囲まれた細胞はCD34−/CXCR4+/Flk+
およびCD34−/Pgp+/Flk+集団である。特に、CXCR4は、骨髄
中に移植細胞を扱う(trafficking)のに応答性のあるるケモカイン(chemokine)受
容体である。また、Pgpは、ヘキストLo(Hoechst Lo)に相当する多剤耐性(
MDR)遺伝子産物に対する受容体であり、これは高移植力(engraftment poten
tial)を持つマウスおよび赤毛猿においてCD34−と相関する。
D34−/CD45+/CD38−/Lin−/Flk+/MDR+/CXCR
4+標的細胞の生体外生産が示される。この開発は、当該分野に重要な貢献を果
たすものであり、これにより細胞療法の分野における特別な有用性を持つ希少な
細胞を生体外で生産することができる。
明する概略図である。
拡大された線図である。図2aは、非標的細胞(非血管芽細胞)のネガティブ選
択に関するシステムのかなり拡大された線図である。
の概略図である。
す、概略的フローチャートである。
D34−/CD38−/Lin−の標的細胞の成長速度論を示すグラフである。
いた次の再選択前の再選択細胞の集団プロファイルを示すドットプロット群であ
る。
団の集団プロファイルを示すドットプロット群である。
−1を用いた培養物の3週間目の再選択細胞の集団プロファイルを示すドットプ
ロット群である。
いた選択培養物の3週間目の再選択細胞の集団プロファイルを示すドットプロッ
ト群である。
Claims (37)
- 【請求項1】 (a)非胎児血管芽細胞を含む細胞集団を提供すること、お
よび (b)前記非胎児血管芽細胞の増殖を促進する条件下で前記細胞集団を成長す
ること を含む、非胎児血管芽細胞を含む細胞集団を提供する方法。 - 【請求項2】 段階(b)において、前記条件は、前記非胎児血管芽細胞の
数および相互の近接度が、他の細胞に比べて、集団における非胎児血管芽細胞の
割合を増加して、高濃度細胞培養物を提供するのに十分なものである、請求項1
に記載の方法。 - 【請求項3】 (c)前記細胞培養物中の他の細胞から前記非胎児血管芽細
胞の少なくとも一部分を分離することをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 前記分離段階(c)は、ネガティブ選択プロセスを含む、請
求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 前記分離段階(c)は、成長段階(b)と同時に、その間に
断続的に、またはその後に行われる、請求項3に記載の方法。 - 【請求項6】 前記分離段階は成育段階(b)の間に一回より多く行われる
、請求項3に記載の方法。 - 【請求項7】 前記分離段階は5〜10日ごとに行われる、請求項6に記載
の方法。 - 【請求項8】 前記成長段階は細胞増殖中に少なくとも一つの成長因子を前
記細胞集団に提供することを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項9】 複数の成長因子を前記細胞集団に提供する、請求項8に記載
の方法。 - 【請求項10】 前記成長因子はSCF、TPoおよびFLT−3を含む、
請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 前記成長因子はVEGFである、請求項8に記載の方法。
- 【請求項12】 前記非胎児血管芽細胞はヒトの血管芽細胞である、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項13】 提供段階(a)で提供される非胎児血管芽細胞はヒトの臍
帯血から得られる、請求項1に記載の方法。 - 【請求項14】 非胎児血管芽細胞の少なくとも5%は前記ヒト血管芽細胞
である、請求項12に記載の方法。 - 【請求項15】 非胎児血管芽細胞の少なくとも15%は前記ヒト血管芽細
胞である、請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】 非胎児血管芽細胞の少なくとも25%は前記ヒト血管芽細
胞である、請求項15に記載の方法。 - 【請求項17】 前記ヒト血管芽細胞は、CD2-、CD3-、CD14-、
CD16-、CD19-、CD24-、CD56-、CD66b-、グリコホリンA- として特徴付けられる、請求項12に記載の方法。 - 【請求項18】 前記ヒト血管芽細胞は、さらにflk−1+、CD45+と
して特徴付けられる、請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 前記ヒト血管芽細胞は、さらにCXCR4+、MDR+と
して特徴付けられる、請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】 非胎児血管芽細胞の少なくともいくつかは、CD34−、
Lin−細胞である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項21】 CD34−、Lin−である細胞の割合が初発の細胞培養
物中に比べて成長段階(b)後の方が高いものである、請求項20に記載の方法
。 - 【請求項22】 非胎児血管芽細胞の少なくとも5%は前記CD34−、L
in−細胞である、請求項20に記載の方法。 - 【請求項23】 非胎児血管芽細胞の少なくとも15%は前記CD34−、
Lin−細胞である、請求項22に記載の方法。 - 【請求項24】 非胎児血管芽細胞の少なくとも25%は前記CD34−、
Lin−細胞である、請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】 非胎児血管芽細胞を含む細胞集団であって、前記細胞集団
より少ない非胎児血管芽細胞を含む初発の細胞サンプルの拡張から得られる細胞
集団。 - 【請求項26】 前記初発の細胞サンプルは、細胞集団より少なくとも10
%少ない割合の非胎児血管芽細胞を含む、請求項25に記載の細胞集団。 - 【請求項27】 高濃度細胞培養物中の非胎児血管芽細胞である細胞の割合
が初発の細胞サンプル中の非胎児血管芽細胞である細胞の割合より高いものであ
る、請求項25に記載の細胞集団。 - 【請求項28】 細胞の少なくとも2%は非胎児血管芽細胞である細胞の組
成物。 - 【請求項29】 細胞の少なくとも5%は非胎児血管芽細胞である、請求項
28に記載の組成物。 - 【請求項30】 細胞の少なくとも15%は非胎児血管芽細胞である、請求
項29に記載の組成物。 - 【請求項31】 細胞の少なくとも25%は非胎児血管芽細胞である、請求
項30に記載の組成物。 - 【請求項32】 前記非胎児血管芽細胞はヒトの血管芽細胞を含む、請求項
28に記載の組成物。 - 【請求項33】 前記非胎児血管芽細胞はCD34−、Lin−細胞を含む
、請求項28に記載の組成物。 - 【請求項34】 前記ヒト血管芽細胞は、CD2-、CD3-、CD14-、
CD16-、CD19-、CD24-、CD56-、CD66b-、グリコホリンA- として特徴付けられる、請求項32に記載の組成物。 - 【請求項35】 前記ヒト血管芽細胞は、さらにflk−1+、CD45+と
して特徴付けられる、請求項32に記載の組成物。 - 【請求項36】 前記ヒト血管芽細胞は、さらにCXCR4+、MDR+と
して特徴付けられる、請求項35に記載の組成物。 - 【請求項37】 (a)非胎児未分化ヒト血管芽細胞を含む第一の細胞集団
を提供すること、および (b)前記非胎児未分化血管芽細胞の増殖を促進する条件下で前記第一の細胞
集団を成長すること を含む、非胎児未分化ヒト血管芽細胞を含む細胞集団を提供する方法。
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