JPH07503127A - 幹細胞を選択的に増加する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 幹細胞を選択的に増加する方法 関連出願との相関 本出願は、１９９０年４月２３８に出願された米国特許出願第シリアル患０７１ ５１３．５４３の一部継続出願である。

技術分野 本発明は、一般に、骨髄を構成する細胞に関し、また特には、幹細胞の数を選択 的に増大させるのに用いられうる装置及び方法に関する。

発明の背景 癌は、合衆国における全死亡者の５分の１より多くの原因であり、死亡原因の第 ２位である。男性における癌の主なタイプは、肺、前立腺、及び結腸直腸癌であ り、女性においては乳、肺及び結腸直腸癌である。最近では、多くの癌は、外科 的治療ならびに化学療法及び／又は放射線療法の組合せで処置される。

しかし、化学療法と放射線療法における一つの困難は、これが個人の免疫系、な らびに免疫系の先祖細胞である幹細胞をも破壊することにある。免疫系を再構築 するために、患者は一般に同種の又は自己の骨髄を用いて骨髄移植される。しか し、多くの個人は、自身の骨髄が癌に侵されているか又は組織適合の提供者が見 つからないために、死亡する。

この困難を克服するために示唆された一つの方法は、移植する細胞の寿命を延長 する、長期骨髄培養の使用である。たとえば、デクスター等Ｑ、　Ｃｅ１１．　 Ｐｈｙｓ。

９１・３３５．１９７６）は、インビトロで幹細胞を増殖するための条件を記載 している（以下では、デクスター培養と云う）。簡単に云えば、この方法は、基 質細胞の粘着性一層の形成を含み、これは幹細胞及び初期先祖細胞の生育を支持 する。しかし、デクスター培養は結局のところ欠点がある。なぜなら、それは、 幹細胞及び初期先祖細胞の死亡速度を低下するのみであって、そのような細胞の 数の増大という望まれる結果を与えないからである。

本発明は、幹細胞を選択的に増加する装置及び方法を提供する。これら装置及び 方法は、従来の装置及び方法の欠点を克服し、かつ更に他の関連する利点を与え る。

発明の概要 簡単に云えば、本発明は、幹細胞を選択的に増加するため及び成熟造血細胞を得 るための装置及び方法に向けられている。本発明の一面において、（ａ）幹細胞 を他の細胞から分離する工程、及び（ｂｌ幹細胞が選択的に増加されるように選 択された培養基中で、分離した幹細胞をインキュベートする工程を含む、幹細胞 を選択的に増加させる方法が提供される。本発明の別の面において、（ａ）幹細 胞を成熟細胞から周期的に分離する工程、及び［ｂｌ幹細胞が選択的に増加され るよう選択された培養基中で、分離した幹細胞をインキュベートする工程を含む 、幹細胞を選択的に増加させる方法が提供される。種々の実施態様において、選 択される培養基は、幹細胞成長因子、インターロイキン−３、顆粒球−マクロフ ァージ　コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン−６、 または肥満細胞成長因子を含有する。

他の実施態様において、幹細胞は、アフィニティ力ラムで、又はフローサイトメ トリー（フロ一式血球計算）によって分離される。更に別の実施態様において、 分離された幹細胞は、ペトリ皿、滅菌バッグ又は中空繊維中でインキュベートさ れる。

本発明の別の実施態様において、（ａｌ幹細胞を他の細胞からアフィニティ力う ム上で分離する工程、及び（ｂ）幹細胞成長因子、インターロイキン−３、及び 顆粒球−マクロファージ　コロニー刺激因子を含む培養基を有する滅菌バッグ中 で、分離した幹細胞をインキュベートする工程を含む、幹細胞を選択的に増加さ せる方法が提供される。

本発明のこれらの面及び他の面が、以下の詳細な説明及び添付図面を参照して明 らかとなるであろう。

図面の簡単な説明 図１は、幹細胞増加における幹細胞分離の効果を、合計細胞数の増加により測定 して示すグラフである。

図２は、幹細胞増加に対する幹細胞分離の効果を、ＣＦＣの増加により測定して 示すグラフである。

図３は、合計細胞数に対する種々の成長因子の効果を示すグラフである。

図４は、ＣＦＣの数に対する種々の成長因子の効果を示すグラフである。

発明の詳細な説明 本発明は、幹細胞を選択的に増加させるための装置及び方法を提供する。本発明 の文脈において、「幹細胞」という言葉は、全能性を有する（ｔｏｐｉｐｏｔｅ ｎｔ）造血細胞ならびに初期先祖細胞たとえばコロニー形成性細胞（ＣＦＣ）を 云う。これら細胞は、ＣＤ３４レセプターの存在に基づき、他の細胞から区別さ れつる。

上記のように、本発明の一面において、（ａ）幹細胞を他の細胞から分離する工 程、及１ｂ）幹細胞を増加させることのできる選択された培養基を用いて、分離 された幹細胞をインキュベートする工程を含む、幹細胞を選択的に増加する方法 が提供される。

下記により詳しく記述される装置及び方法を用いて、たとえば末梢血及び全骨髄 を含め種々の血液プロダクトから幹細胞を分離されうる。本発明の目的のために 、分離された細胞の少くとも２０％がＣＤ３４陽性細胞であるならば、幹細胞が 分離されたと考えられる。好ましくは、ＣＤ３４陽性細胞は、９０％より大きい 純度を与えるように分離される。加えて、移植する細胞の回収及び生育を低下す る減成性酵素の放出、及び凝集を防ぐために、血小板、顆粒白血球及び赤血球の 合計数を出来るだけ小さく保つことが望ましい。より詳しくは、幹細胞が、約１ ％未満の血小板、５０％未満、好ましくは約２５％未満の顆粒白血球、及び１０ ％未満、好ましくは約１％未満の赤血球を含むことが望ましい。

幹細胞の分離は、これら細胞上の抗原を特異的に認識するリガンドの使用により 達成されうる。たとえば、ＣＤ３４抗原を特異的に認識する抗体を、下記の装置 及び方法で用いて、幹細胞を分離できる。ＣＤ３４抗原を特異的に認識する抗体 の代表例は、ＭＹ−１０及びＨＰＣＡ２（ベクトンーディッキンソン、マウンテ ンビュー　カリフォルニア）及び＋２−８（セルプロ（商標）、ポセル、ワシン トン）である。

磁気ビーズ、平皿洗い（ｐａｎｎｉｎｇ）、及びフローサイトメトリー（螢光活 性化細胞分数ｒＦＡｃｓＪ）（たとえば米国特許明細書第４．７１４．６８０号 及び４．９６５．２０４号参照：これらは引用することにより本明細書に含まれ る）の使用を含む種々の方法及び装置が、幹細胞を分離するために用いられる。

特に好ましい方法及び装置は、「免疫選択装置及び方法」という名称の米国特許 出願シリアル階０７１５１３．５４３　（引用することによりその全体が本明細 書に含められる）に記載されているようなイムノアフィニティ　カラムである。

簡単に云えば、この出願は、幹細胞のような標的粒子を、非標的粒子と標的粒子 の混合物から単離又は分離する方法及び装置を記載している。標的粒子に特異的 に結合することができるリガンドを持つ、低度非特異的結合性の多孔性物質の床 を含むカラムに粒子を通過させることにより、直接的方法で標的粒子が分離され る装置及び方法のディスカッジョンがこの出願に含められる。この出願の一面に おいて、ｔａ）流体がそこを通過してカラムに入りうる入口穴を有する基部端、 及び流体がそこれを通ってカラムから出うる出口穴を有する末梢端を有するカラ ム、ｆｂｌカラム内に低度非特異的結合性の多孔性物質の床を一般に有し、該多 孔性物質はその表面に固定化されたビオチン吸着性基を有するところの装置が提 供され、ここで多孔性物質の孔のサイズは、ビオチン吸着性基が孔に入ることを 許すのに十分であり、しかし床の崩壊を許す程に大きくなく、また床の間隙のサ イズは粒子が床を流過するのを許すのに十分である。該装置は更に、結合された 標的粒子が多孔性物質から開放されるように外部力を加えて多孔性物質を攪拌す るだの手段をカラム内に有する。

この出願の他の面において、標的粒子は、アビジン及びビオチンを用いる一段階 又は二段階法により分離される。しかし、本発明の目的のためには、イムノアフ ィニティ　カラム内でたとえば非多孔性物質のような他の物質を用いうろことを 注意しておく。

特に好ましいイムノアフィニティ　カラムは、「細胞分離のための改善された装 置及び方法」という名称の米国特許出願（代理人のドケットＰＪＱ２０００７２ ．４０７）（引用することにより、他の全体を本明細書に含める）に記載されて いる。簡単に云えば、この出願の一面において、試料流体から標的細胞を分離す るためのカラム組立体を含む「細胞セパレーター」が提供され、カラム組立体は 、カラム、試料流体供給バッグ、及び流体収集バッグを含み、ここでカラムは試 料流体供給バッグから試料流体を受け取り、試料流体から標的細胞を分離し、そ して標的細胞を保持するために備えられ、また流体収集バッグはカラムから放出 された後の標的細胞を受け取るために備えられている。該細胞セパレーターは、 カラム内に保持された試料細胞の放出を助けるためにカラム内容物を攪拌するた めの攪拌手段（該撹拌手段は、試料細胞が放出される速度を変えるためにカラム 内容物の攪拌の量を変えるための駆動シグナルに応答する）、カラムから流出し て流体収集バッグに流入する流体の光学密度を示すカラムシグナルを与えるため のカラムセンサー手段、カラムから流出する流体が選択的に流体収集バッグへ流 入できるようにするカラムバルブ制御シグナルに応答するカラムバルブ手段、及 び細胞セパレーターの運転を制御するためのデータ処理手段（該データ処理手段 は、駆動シグナルを与えるためのカラムシグナル、及び不十分な濃度の標的細胞 が集められることを防ぐためのカラムバルブ制御シグナルに応答する）を含む。

この発明の一実施態様は、セルプロ（ボセル、ワシントン）から入手できるＣＥ ＰＲＡ置Ｃ（商標）細胞分離システムである。

分離された細胞は次に、幹細胞が選択的に増加されるように選択された培養基中 でインキュベートされる。本発明の文脈において、幹細胞の数が、他の細胞タイ プ全体よりもより増大するなら、幹細胞は「選択的に増加」される。簡単に云え ば、該培養基は、細胞生育を維持する栄養基、ならびに幹細胞の数を増加する因 子を含まねばならない。栄養基の代表例は、ＲＰＭＩ、ＴＣＩ９９又は夏ｓｃｏ ｖｅＤＭＥＭであり、これらは蛋白質たとえば胎児ウシ血清を補われている。あ るいは、栄養基は、Ｅｘ　Ｖｉｖｏのような規定された培養基でありうる。種々 の成分が、幹細胞を選択的に増加させるために用いられつる。代表的な因子は、 インターロイキン−１、インターロイキン−３、インターロイキン−４，インタ ーロイキン６、インターロイキン−７、ＳＣＦ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ３Ｆ、Ｍ −Ｃ３Ｆ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、α−ＩＮＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ− １、及びＩＧＦ−２を含む。特に好ましい因子は、幹細胞成長因子（アムゲン、 サウザンド、オークス、カリフォルニア）、インターロイキン−１顆粒球−マク ロファージ　コロニー刺激因子（イムネックス、シアトル、ワシントン）、顆粒 球コロニー刺激因子、イタローロイキン−６（アムゲン、サウザンド　オークス 、カリフォルニア）及び肥満細胞成長因子（イムネックス、シアトル、ワシント ン）を含む。

上記のように幹細胞を精製し、それを選択された培養基と共に後記のようにイン キニーベートすることによって、培養基が選択的に幹細胞を増加させるか否か容 易に決定できる。幹細胞及び他の細胞の数は、インキュベーションの前に及び後 にカウントされる。上記のように、もし幹細胞の数が増大し、他の細胞がそうで ないなら、幹細胞は選択的に増加された。細胞の合計数は、標準的な手法（たと えば血球計数器）によりカウントでき、幹細胞の数は、フローサイトメトリー（ すなわち、螢光的に結合された抗ＣＤ３４抗体でラベルされた細胞がＦＡＣ３に よりカウントされうる）、又は実施例３で後述のようにカウントされる。

分離された細胞は、種々の容器中でインキュベートされうる。特に好ましい容器 は、ペトリ皿（コーニンググラス　ワークス、コーニング、ニューヨーク）、６ 穴プレート（コスタ−）、ガス透過性滅菌バックたとえば５ｔｅｒｉｃｅｌｌ　 （テルモ、エルクトン、メリーランド）及びＬｉｆｅｃｌｌ　（バクスター、デ アフィールド、イリノイ）、及び中空繊維たとえばＣｅ１ｌｐｈａｒ　２（ユニ シン　ファイバチック、サンジエゴ、カリフォルニア）、Ａｃｃｕｓｙｓ（エン ドトロニクス、ミネアポリス、ミネソタ）、又はＶｉｔａｆｉｂｅｒ　（アミコ ン、ダンバース、マサチューセッツ）を含む。好ましくは、細胞は５％〜１０％ ＣＯ１の雰囲気かつ約３７℃の温度でインキュベートされる。

本発明の他の面において、（ａｌ幹細胞を成熟細胞から周期的に分離する工程、 及び（ｂｌ幹細胞を選択的に増加させるよう選択された培養基中で、分離された 幹細胞をインキュベートする工程を含む、幹細胞を選択的に増加させる方法が提 供される。簡単に云えば、成熟細胞（これは、最終的に分化された血細胞のみで な（、中間的な系統をも含む）は、幹細胞の増加及び分化をフィードバック制御 メカニズムを介して禁止すると考えられる。すなわち、培養物からの成熟細胞の 除去は、幹細胞の元の数の何倍もの幹細胞の増加を許す。本発明の文脈において 、周期的分離は、少くとも１０日毎に成熟細胞の除去を意味する。

周期的に幹細胞を分離するために、種々の方法が用いられている。たとえば一実 施態様において、細胞が上記のようにアフイニテイ力うム上で分離され、上記の 容器のいずれかを用いて、選択された培養基中でインキュベートされ、そして次 に、新たに分化された成熟細胞から幹細胞を分離するために再分離される。

本発明の別の面において、幹細胞が選択的に増加されるように選択された培養基 を潅流しながら、幹細胞を連続的に分離する。簡単に云えば、一実施態様におい て、これは分離装置（たとえば上記のアフィニティ力ラム）に選択された培養基 を連続的に潅流することにより行われうる。幹細胞は分離装置中に保持され、一 方、成熟細胞にれはＣＤ３４抗原を持たない）は装置を通過する。幹細胞が成長 し、数が増大すると、新しい幹細胞は同様の分離装置に粘着し、一方、新たに分 化した、ＣＤ３４抗原を有さない細胞は装置を通過する。

本発明の別の実施態様において、成熟細胞上に見られる表面抗原に対する固定化 されたリガンドを予めコーティングされたビーズを潅流室に通過させることによ り、幹細胞は潅流装置中で連続的に分離される。従って、成熟細胞が結合され、 ビーズにより潅流室から運び去られる。

下記の実施例は、例示のためのものであり、限定するためのものではない。

実施例 実施例１ アビジン化されたバイオゲルの調製 Ａ、ポリアクリルアミドゲルのカルボキシル化１７ｇ（７）乾燥バイオゲルＰ　 −６０（５０−１００メツシユ（湿）、粗ビーズ）（バイオラド、カタログＴｈ １５０．１６３０、リッチセント、カリフォルニア）を、１．５リツトル（Ｄｏ 、５Ｍ　ＮａＨＣＯｓ　１０．５Ｍ　Ｎａｔ　Ｃｏｗ　ｌ：加える。

ＮａＯＨを用いてｐＨを１Ｏ０５に調節し、ビーズを損っけないように注意深く 約２０〜３０分間、ミキサー（ＲＺＲＩ、カルファモ、ウィアトン、オンタリオ 、カナダ）で混合する。ミキサーを次に、６０℃水浴中に置く。混合物が６０℃ に達した後、それをたまに攪拌しながら更に２時間（６０℃で）インキュベート する。混合物を次に水浴から取出し、水浴中に入れて混合物温度を室温へ下げる 。

蒸留水又は脱イオン水を用いてビーズを数度洗い、次に真空源に接続された粗ガ ラスフィルターを用いてＰＢＳで数度洗う。該カルボキシル化されたゲルはＰＢ Ｓ中で４℃で貯蔵でき、もし滅菌されるが否は保存剤と共に貯蔵されるなら１年 間まで安定である。

Ｂ、カルボキシル化されたバイオゲルのアビジン結合まず、真空源に接続された 粗ガラスフィルターで濾過することにり、測定された量のカルボキシル化バイオ ゲルからＰＢＳを除去する。ゲルを次に、蒸留水又は脱イオン水中で１５〜３０ 分間平衡化する。水中での平衡化は、予め測定した体積の約４倍へのゲルの膨張 を起す。ゲルの１−当り（ＰＢＳ中で当初測定）、蒸留水又は脱イオン水のｌ〇 −中にゲルを再懸濁する。

当初測定したゲルのｌ−当り３０■の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ ロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ−ＨＣＩｌ）（シグマケミカル社、カタログ胆 Ｅ７７５０、セントルイス、ミズリー）を加える。ＨＣｌを滴下することにより ｐＨを迅速に５．５に調節する。ｐＨを５．５に維持するよう注意する；５．０ 未満又は６．０より大きいｐＨは、バイオゲルの著しく小さい活性化を結果する 。混合物を５分間攪拌する。

アビジン（インターナショナル　エンザイムズ社、フォールブロック、カリフォ ルニア）を、脱イオン水にｌＯ〜１００■／−の濃度で溶解する。次に、ゲルの １ｍ／（ＰＢＳ中で当初測定）当り１■のアビジンを迅速に加える。混合物を１ ．５時間攪拌する。次に２Ｍのグリシンを加えて、混合物において０．２Ｍグリ シンの最終濃度にし、更に１時間攪拌する。

粗ガラスフィルター及び真空を用いて、ゲルを数体積置のＰＢＳで洗い、４℃で ＰＢＳ中に貯蔵する。ゲルは、約１年間安定である。

実施例２ 移植する細胞の単離 Ａ、豚皮脂細胞（ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ　ｃｅｌｌ）の調製骨髄の試料を２４０ 重ｇで１５分間遠心分離する。血漿を除き（後の使用のために保持しておく）、 そして残った豚皮脂細胞を再び２４０重ｇで１５分間遠心分離して、赤血球細胞 を除く。豚皮脂細胞を、ＲＰＭＩを用い１８０重ｇ、１０分間の遠心分離により 二度洗う。次に細胞を再懸濁して、ＲＰＭＩ＋１％ＢＳＡの１Ｆｎｌ中ｌＸｌ０ ”内直細胞の最終濃度とする。

Ｂ、豚皮脂細胞と抗体とのインキュベーション豚皮脂細胞の懸濁物を、ビオチン 化した（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗ＣＤ３４抗体（Ｃｅｌｌｐｒｏ　、ボセ ル、ワシントン）の２０重ｇ／−の最終濃度で、室温で２５分間インキュベート する。次に抗体−細胞混合物を、ＰＢＳを用いて１８０重ｇで１０分間遠心分離 して洗う。細胞を次に再懸濁して、ＰＢＳｌ−中ｌＸｌ０”内直細胞の濃度とす る。

Ｃ，カラム操作及び結果 ＣＥＰＲＡＴＥ　ＬＣ（商標、ボセル、ワシントン）分離系を、製造者の指示に 本質的に従って用いた。簡単に云うと、装置をセットアツプし、チューブを接続 し、試薬を装填し、抗体処理された細胞を用いて実験を始めた。細胞は、ポンプ によってカラムに通され、カラムはＰＢＳで洗われ、そして、吸着された細胞は 磁気駆動インペラーによって放出された。吸着された細胞は、収集バッグ中に蓄 積された。

Ｄ、結果 １００億個の骨髄細胞がカラムを通された：２２億の細胞がカラムに結合され、 収集バッグ中に回収された。収集された細胞の生育性は、トリバンブルー排除に より測定して、９１％であった。収集された細胞は、ＦＡＣ３分析によると、７ ５％ＣＤ３４＋であった。

実施例３ ＣＦＣ生育性の測定及び回収 ２ｍＭのし一グルタミン及び５０重ｇ／−のゲンタマイシンを補われたｌ５ｃｏ ｖｅのメチルセルロール（テリーフォックスラボラトリーズ、バンク−バー、ブ リティッシュ　コロンビア、カナダ）の、３５ｍｍプレート当りｌ−を３７℃に 温めた。

アッセイの精度を改善するために、細胞を３倍希釈で３重にプレートした。プレ ートされた細胞の最大数は、１０５／プレートであった。但し、カラム精製され た細胞は、３ＸＩＯ３及び未満でプレートされた。細胞を各プレートの表面に均 一にスプレーし、３７℃で５％ＣＯｚの空気中で１０−１４日間、加湿インキュ ベーター中でインキュベートした。コロニーか５０より多い細胞を含んでし、ま たら、コロニーをカウントし、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ又は他（たとえばＣＦ Ｕ−ＧＥＭＭ）として記録された。種々のタイプのコロニーの数は合計されて、 コロニー形成性細胞（ＣＦＣ）の合計数を与える。

実施例４ 幹細胞増加 Ａ０分離された幹細胞と全骨髄中の幹細胞との増加の比較実施例２記載のように 精製された幹細胞を、ＲＰＭＩ　１６４０，１０％胎児ウシ血清（ＨＹＣＬＯＮ Ｅ、ロガン、ユタＬ５０ｎｇ／−幹細胞成長因子、ｓｏｎｇ／−インターロイキ ン−３，２０重ｇ／−顆粒球−マクロファージコロニー刺激性因子、及び２０重 ｇ／−顆粒球コロニー刺激性因子を含む溶液中で成長させた。細胞は、培養基ｌ −中、プレート当り１０’でプレートされた。第７．１４及び２１日に細胞を取 除き、実施例３記載のようにＣＦＣアッセイのための再プレートした。生育性細 胞を、トリパンブルーを用いる血球計数器によりカウントした。

図１で合計細胞カウントにより示されるように、及び図２でＣＦＣの数により示 されるように、細胞を培養する前の幹細胞分離は、幹細胞成長及び増加を劇的に 改善した。

Ｂ、幹細胞増加を起こす因子 幹細胞を増加させるためにどの成長因子が有用であるかを決めるために、下記の アッセイを行った。簡単に云えば、上記のように精製された幹細胞を、コーニン グ３５ｎ＋ｍプレート中のプレート当り１０’細胞の密度でプレートした。該細 胞に、１０％胎児ウシ血清及び下記の成長因子の種々の組合せを補われたＲＰＭ Ｉ１６４０を含む溶液を加えた。

（１１５０ｎ　ｇ／ｍｌ幹細胞成長因子（アムゲン、サウザンドオークス、カリ フォルニア）　、（２１５０重ｇ／−インターロイキン−３、（３）２０　ｎ　 ｇ／ｍ！顆粒球−マクロファージコロニー刺激性因子（イムネックス、シアトル 、ワシントン）、及び（４）顆粒球コロニー刺激性因子（ゲンザイム、ケンブリ ッヂ、マサチューセッツ）。

図３及び４に示されるように、ＳＣＦを含む二つの培養基は幹細胞を増加させた （ＣＦＣ数の増加で測定して）。

上記から、本発明の特定の実施態様が、例示のためにここに記述されたが、種々 の変更が本発明の精神及び範囲からそれることなくなされうることが理解されよ う。従って、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定される。

培養時間（日） 培養時間（日） 、　Ｆｂ　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０９０１９フロントページの続き （７２）発明者　ベレンソン　ロナルド　ジェイアメリカ合衆国　ワシントン州 　９８０４０マーサー　アイランド　エイティフォースアベニュー　サウスイー スト　６１２７（７２）発明者　フェイ　ルイガオ アメリカ合衆国　ワシントン州　９８１１５シアトル　１　トウニンティサード 　アベニュー　ノースイースト　８５１９ （７２）発明者　ボッ　ランダル　エイアメリカ合衆国　ワシントン州　９８０ ２１ボセル　トゥーハンドレッドアンドトウエンティフィフス　ブレイス　サウ スイースト　５０８ （７２）発明者　ピーターラン　ディル　アールアメリカ合衆国　ワシントン州 　９８０２１ボセル　トウエンティエイス　アベニユーサウスイースト　１８６ ３０ （７２）発明者　ポーター　クリストファー　エイアメリカ合衆国　ワシントン 州　９８０７２ウツデインヴイル　ノースイースト　ワンハントレッドアンドト ウエンティセヴンスプレイス　１９７５６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）幹細胞を他の細胞から分離すること、及び（ｂ）幹細胞を選択的に増 加させるよう選択された培養基中で、分離された幹細胞をインキュベートするこ と を含む、幹細胞を選択的に増加させる方法。 ２．（ａ）幹細胞を成熟細胞から周期的に分離すること、及び（ｂ）幹細胞を選 択的に増加させるよう選択された培養基中で、分離された幹細胞をインキュベー トすること を含む、幹細胞を選択的に増加させる方法。 ３．選択された培養基で幹細胞成長因子を含む請求の範囲第１項又は第２項の方 法。 ４．選択された培養基かインターロイキン−３を含む請求の範囲第１項又は第２ 項の方法。 ５．選択された培養基が顆粒球ーマクロフォージコロニー刺激性因子を含む請求 の範囲第１項又は第２項の方法。 ６．選択された培養基が顆粒球コロニ−刺激性因子を含む請求の範囲第１項又は 第２項の方法。 ７．選択された培養基がインターロイキン−６を含む請求の範囲第１項又は第２ 項の方法。 ８．選択された培養基が肥満細胞成長因子を含む請求の範囲第１項又は第２項の 方法。 ９．幹細胞かアフィニティカラムで分離される請求の範囲第１項又は第２項の方 法。 １０．幹細胞がフローサイトメトリーにより分離される請求の範囲第１項又は第 ２項の方法。 １１．分離された幹細胞がペトリ血中でインキュベートされる請求の範囲第１項 又は第２項の方法。 １２．分離された幹細胞が滅菌バック中でインキュベートされる請求の範囲第１ 項又は第２項の方法。 １３分離された幹細胞が中空繊維中でインキュベートされる請求の範囲第１項又 は第２項の方法。 １４．（ａ）幹細胞を他の細胞からアフィニティカラム上で分離すること、及び （ｂ）分離された幹細胞を、幹細胞成長因子、インクーロイキン−３及び顆粒球 −マクロフォージコロこ−刺激性因子を含む培養基を含む滅菌バック中でインキ ューベートすること を含む、幹細胞を選択的に増加させる方法。