JP2008505650A - ヒト細胞を増殖させるための装置及び方法 - Google Patents

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Abstract

反応チャンバー；ヒト細胞の導入に適合させた第１ポート（２０）；フィルターを含んだ、ガス交換に適合させた第２ポート（２１）；培地の導入に適合させた第３ポート（２２）；細胞のサンプリングに適合させた第４ポート（２６）；及びヒト細胞の培養後の収集に適合させた第５ポート（２８）を有するバイオリアクター（１５）。

Description

本発明は、ヒト細胞、特に造血細胞を増殖させるための装置及び方法に関するものである。
造血細胞は、骨髄において、自分自身を再生し、そして他の全ての造血細胞を生じさせる全能性幹細胞から産生される。この幹細胞は、前駆細胞、例えば赤血球前駆細胞及び骨髄系前駆細胞を生じさせ、これらは特定細胞種に分化することが関係づけられている。前駆細胞は、増殖能が限られているか又は全くない、分化した細胞を生じさせる。ヒトでは、幹細胞と前駆細胞はＣＤ３４抗原を発現するが、より分化した造血細胞は発現しない。
造血細胞は、患者若しくは好適なドナーの骨髄、末梢血、又は臍帯血に由来する。これらの細胞は、患者の血液凝固機能及び感染に抵抗する機能が例えば化学療法によって損なわれている場合、これらを再構築するために用いることができる。
非血縁ドナーからの臍帯血は、骨髄破壊療法後の同種移植のための造血細胞の供給源として次第に用いられるようになっている。臍帯血を使用することのいくつかの利点にもかかわらず、細胞数が限られるために、骨髄又は末梢血から利用可能な細胞と比較して、その使用は制限されている。
成人患者を治療する際に使用されるであろう臍帯血細胞の数を増加させる方法を提供することが望まれる。米国特許第５，６３５，３８７号は、造血細胞の増殖方法について記載している。第’３８７号特許は、この分野の初期の発展においては必須であると考えられていた間質細胞層も間質細胞の条件培地も使用することなく造血細胞を増殖させる方法について記載している。近年の増殖法は、完全にこの目的に専用ではない細胞増殖チャンバー又は細胞増殖バッグで実施されている。専用システムを使用しないことによりいくつかの問題が生ずる。例えば、多くのシステムは閉鎖系ではなく、このことは、ヒト幹細胞増殖は、増殖法をうまく実施するには熟練した人材と高価な設備とを必要とすることを意味する。開回路は、たとえ熟練した人材が使用し、十分に設備の整った実験室であっても、最終産物の無菌性を保証するものではなく、近年規制された推奨及び／又は指針によって規定された無菌取り扱い手順を満たすものではない。利用可能な閉回路系は、特にヒト幹細胞増殖用にデザインされてはいない非専用システムを提供している；更に、そのようなシステムが作動するには、複雑で高価な装置を必要とする。
多くの幹細胞増殖法は、近年、動物由来産物を含有する試薬を用いて実施されている。動物由来産物の使用により、増殖した細胞集団を臨床に使用できない。造血幹細胞の増殖は、近年、特に造血幹細胞増殖用にデザインされてはいないさまざまな培地を用いて実施されている。特に、試薬は、造血幹細胞増殖専用の合成培地と成長因子の混合物とから作られているわけではない。近年使用されている試薬は、成長因子の濃度、組み合わせがさまざまであり、非発熱性のような特定の要求事項を満たさないことが多く、利用しやすいものではなく、高価な設備や熟練した人材がなければ使用が困難である。
無菌性を維持しつつ、細胞生存率を損なうことなく細胞数を増加させ、細胞回収率が良好な、ヒト造血幹細胞を培養する改良された装置及び方法に対する必要性が当該技術分野に依然として存在している。
本明細書に記載の本発明は、ヒト造血幹細胞を培養するために使用できる装置を提供するものである。しかしながら、この装置は、他の種類のヒト幹細胞、ヒト筋細胞、ヒト皮膚細胞などを含めた他のヒト細胞の培養にも用いることができる。
発明の概要
本発明は：反応チャンバー；細胞の導入に適合させた第１ポート；フィルターを含んだ、ガス交換に適合させた第２ポート；培地の導入に適合させた第３ポート；細胞のサンプリングに適合させた第４ポート；及び細胞の培養後の収集に適合させた第５ポートを含む、バイオリアクターを提供する。
本発明は：上記バイオリアクターを準備し；ヒト造血細胞を第１ポートに導入し；第３ポートから培地を導入し；そして細胞数の増加に十分な条件及び時間で細胞を培養することを含む、ヒト造血細胞数をｉｎ ｖｉｔｒｏで増加させる方法を提供する。
本発明は：ＣＤ３４陽性ヒト造血細胞を準備し；ＣＤ３４陽性細胞を、ＣＤ３４陽性細胞の増殖に有効な栄養培地と成長因子とを含む培地を含有するバイオリアクター中に、初期濃度１×１０４〜５×１０６細胞／ｍｌで播種し、ここで、成長因子はＦｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子を含み；そしてＣＤ３４陽性細胞数の増加に十分な条件及び時間でＣＤ３４陽性細胞を培養することを含む、ヒト造血ＣＤ３４陽性細胞数をｉｎ ｖｉｔｒｏで増加させる方法を提供する。
本発明の更なる特徴及び利点を以下の説明に示すが、一部においては説明から明らかであろう。本発明の目的及び他の利点は、明細書及び特許請求の範囲に具体的に示した、ヒト細胞を増殖させるための装置及び方法によって明確に理解され、達成されるであろう。
上記の一般的説明及び下記の詳細な説明はともに典型的且つ説明的なものであり、特許請求の範囲に記載した本発明を更に説明することを意図するものであると理解すべきである。
発明の詳細な説明
本発明は：反応チャンバー；ヒト細胞の導入に適合させた第１ポート；フィルターを含んだ、ガス交換に適合させた第２ポート；培地の導入に適合させた第３ポート；細胞のサンプリングに適合させた第４ポート；及びヒト細胞の培養後の収集に適合させた第５ポートを含む、バイオリアクターを提供するものである。本発明の１つの態様では、第２ポートのフィルターはガス透過性膜フィルターである。本発明の他の態様では、第３ポートはフィルターを含む。本発明の更に他の態様では、バイオリアクターは、フィルターを含んだ、培地の導入に適合させた第６ポートを更に含む。
本発明の１つの態様では、第１ポートは穴開け可能なキャップを含む。本発明の他の態様では、第４ポートは穴開け可能なキャップを含む。本発明の１つの態様では、バイオリアクターは、第５ポートから細胞を排出させることによって細胞を培養後に収集するように適合されている。
本発明の１つの態様では、反応チャンバーは２５ｃｍ２〜６００ｃｍ２の増殖表面を有する。本発明の他の態様では、反応チャンバーは１５０ｃｍ２〜２５０ｃｍ２の増殖表面を有する。本発明の１つの態様では、反応チャンバーは透明な、組織培養用に処理されたプラスチックでできている。
本発明の１つの態様では、バイオリアクターは、第１ポートから細胞を導入できることを示すラベルを第１ポート近傍に含む。本発明の他の態様では、バイオリアクターは、第２ポートからガスを交換できることを示すラベルを第２ポート近傍に含む。本発明の更に他の態様では、バイオリアクターは、第３ポートから培地を導入できることを示すラベルを第３ポート近傍に含む。本発明の１つの態様では、バイオリアクターは、第４ポートから反応チャンバーの内容物をサンプリングできることを示すラベルを第４ポート近傍に含む。本発明の他の態様では、バイオリアクターは：（ｉ）第０日に第３ポートから培地を導入できることを示すラベルを第３ポート近傍に、そして（ｉｉ）第７日に第６ポートから培地を導入できることを示すラベルを第６ポート近傍に含む。全てのラベルはバイオリアクターに付着することもバイオリアクターにかたどることもできる。
バイオリアクターは、ヒト造血幹細胞、他の種類のヒト幹細胞、ヒト筋細胞、ヒト皮膚細胞などを含めたヒト細胞の培養に用いることができる。
本発明は、本明細書に記載のバイオリアクターと、第５ポートに接続した管とを含むキットを提供する。本発明の１つの態様では、キットは、更なる管と１以上の滅菌バッグとを更に含む。本発明の他の態様では、キットは、第１容器に栄養培地を、第２容器に成長因子 Ｆｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子を更に含む。本発明の他の態様では、成長因子は以下の濃度で存在する：Ｆｌｔ３−Ｌが１．９μｇ／ｍｌ；トロンボポエチンが１．９μｇ／ｍｌ；インターロイキン３が０．１７μｇ／ｍｌ；及び幹細胞因子が１μｇ／ｍｌ。
本発明は：本明細書に記載のバイオリアクターを準備し；ヒト造血細胞を第１ポートに導入し；第３ポートから培地を導入し；そして細胞数を増加させるのに十分な条件及び時間で細胞を培養することを含む、ヒト造血細胞数をｉｎ ｖｉｔｒｏで増加させる方法を提供する。本発明の１つの態様では、細胞を培養後に第５ポートから収集する。本発明の他の態様では、バイオリアクターは、フィルターを含んだ、培地の導入に適合させた第６ポートを更に含み、第３ポートから培地を導入後７日目に、培地を第６ポートから導入する。
本発明の１つの態様では、ヒト造血細胞はＣＤ３４陽性である。本発明の他の態様では、培地は、ヒト造血細胞の増殖に有効な栄養培地と成長因子とを含み、成長因子はＦｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子を含む。本発明の態様では、ヒト造血細胞は、ヒト臍帯血、ヒト骨髄、又はヒト末梢血に由来する。
本発明は：ＣＤ３４陽性ヒト造血細胞を準備し；ＣＤ３４陽性細胞を、ＣＤ３４陽性細胞の増殖に有効な栄養培地と成長因子とを含む培地を含有するバイオリアクター中に、初期濃度１×１０４〜５×１０６細胞／ｍｌで播種し、ここで、成長因子はＦｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子を含み；そしてＣＤ３４陽性細胞数の増加に十分な条件及び時間でＣＤ３４陽性細胞を培養することを含む、ヒト造血細胞数をｉｎ ｖｉｔｒｏで増加させる方法を提供する。本発明の１つの態様では、ＣＤ３４陽性細胞はヒト臍帯血、ヒト骨髄、又はヒト末梢血に由来する。本発明の他の態様では、ＣＤ３４陽性細胞は、バイオリアクター中に初期細胞数５×１０５〜１．５×１０６細胞で播種する。本発明の更に他の態様では、バイオリアクターは２５ｃｍ２〜６００ｃｍ２の増殖表面を有する。
本発明の１つの態様では、ＣＤ３４陽性ヒト造血細胞数が少なくとも３倍に増加する。他の態様では、造血成長因子は実質的にＦｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子から成る。他の態様では、培養工程の後で、ヒト造血細胞を培地から収集する。本発明の態様では、ＣＤ３４陽性細胞を４〜２０日間培養する。更に他の態様では、ＣＤ３４陽性細胞を７日間培養し、第７日に栄養培地と成長因子とを更に加え、ＣＤ３４陽性細胞を更に５日間培養し、そして収集する。
本発明の１つの態様では、成長因子は実質的にＦｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子から成り、これらの成長因子は培養工程の初めに以下の濃度で存在する：Ｆｌｔ３−Ｌが０．０１〜０．１μｇ／ｍｌ；トロンボポエチンが０．０１〜０．１μｇ／ｍｌ；インターロイキン３が０．００１〜０．０１μｇ／ｍｌ；及び幹細胞因子が０．０１〜０．１μｇ／ｍｌ。他の態様では、成長因子は実質的にＦｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子から成り、これらの成長因子は培養工程の初めに以下の濃度で存在する：Ｆｌｔ３−Ｌが０．０５μｇ／ｍｌ；トロンボポエチンが０．０５μｇ／ｍｌ；インターロイキン３が０．００４３μｇ／ｍｌ；及び幹細胞因子が０．０２５μｇ／ｍｌ。他の態様では、培地及びバイオリアクターは間質細胞も間質細胞の条件培地も含有しない。
本発明は、実質的に成長因子 Ｆｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子から成る試薬を提供するものであり、これらの成長因子は以下の濃度で存在する：Ｆｌｔ３−Ｌが１．９μｇ／ｍｌ；トロンボポエチンが１．９μｇ／ｍｌ；インターロイキン３が０．１７μｇ／ｍｌ；及び幹細胞因子が１μｇ／ｍｌ。
本発明は、バイオリアクター、第１容器に栄養培地、並びに第２容器に成長因子 Ｆｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子を含むキットを提供する。１つの態様では、キットは１以上のシリンジを更に含む。他の態様では、キットは管と１以上の滅菌バッグとを更に含む。キットの更に他の態様では、成長因子は以下の濃度で存在する：Ｆｌｔ３−Ｌが１．９μｇ／ｍｌ；トロンボポエチンが１．９μｇ／ｍｌ；インターロイキン３が０．１７μｇ／ｍｌ；及び幹細胞因子が１μｇ／ｍｌ。
本発明の１つの態様では、ヒト細胞はバイオリアクター中の臍帯血から増殖する。栄養培地及び増殖培地中で好適な時間インキュベーションした後、細胞を回収し、洗浄して残留試薬を除去し、使用できるようにする。
造血細胞の産生に用いる培地は、栄養培地と成長因子（サイトカイン）とを含有する。各種栄養培地及び成長因子を造血細胞の増殖に使用できる。本発明に好適な栄養培地には、Ｘ−ＶＩＶＯ ２０（Ｃａｍｂｒｅｘ、イーストラザフォード、ニュージャージー州から市販されている）、又は他の無血清培地が含まれる。栄養培地には、１〜２０％の自己血漿又は異種血漿を添加することができる。
栄養培地に含めることができる成長因子又はサイトカインには、ヒトＦｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、及びＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、インターロイキン１、２、及び４〜７、並びにエリスロポエチンが含まれる。
図１及び図２は本発明の１つの態様を図解している。ここで、バイオリアクター１０は反応チャンバー１５を含む。チャンバーは、培地の分布を可能にし且つ細胞増殖を促進させる、簡便な形状を有する。チャンバーは、生体物質に適合した、又は適合するように処理された、透明な高分子材料で構成されている。
バイオリアクター１５は、５つのポート（２０、２１、２２、２４、２６）を備えている。ポート２０（ラベル４０「細胞」を有する）は、細胞を注入するための穴開け可能なキャップを有する。ポート２１（ラベル４２「ガス」を有する）は、外部環境とガス交換するためのフィルターを有する。ポート２２（ラベル４４「第０日」を有する）は、手順の初めに培地と成長因子を注入するためのフィルターを有する。ポート２４（ラベル４６「第７日」を有する）は、後日、例えば第７日に培地と成長因子を注入するためのフィルターを有する。ポート２６（ラベル４８「サンプリング」を有する）は、細胞をサンプリングするための穴開け可能なキャップを有する。
ポート２２及び２４を通してシリンジで培地を送達し、ポート２１を通してガスを交換する。交換されるガスには酸素及び二酸化炭素（ＣＯ２）が含まれる。ＣＯ２含量は、所望のレベル、例えば５％に制御されることが好ましい。温度は２５℃〜３７℃の範囲であり得るが、生理的温度、即ち３７℃を用いてバイオリアクターの内容物をインキュベーションすることが好ましい。湿度は約１００％に維持することが好ましい。いったんインキュベーションが完了すると、造血細胞は、バイオリアクターから出口ポート２８を介して、管線３１を通って抜け出る。これは通常の滅菌ドッキングシステムにより管３１を介して回収バッグ７に接続できる。バイオリアクター１５はポート２８に向けて傾斜しており、細胞は回収バッグ７（図３に示す）へ流れる。好ましい態様では、培養期間は１０〜１４日間である。回収バッグ７に予め接続したバッグ８には、線９を通して洗浄用食塩溶液を装填することができる。洗浄液は管１２から回収バッグ７に導入することができる。洗浄液の無菌性は滅菌フィルター１１によって保証される。
本発明の１つの態様では、造血細胞は、ポート２２を介して最初にリアクターに導入するＸ−ＶＩＶＯ ２０栄養培地及び成長因子によって産生される。成長因子には、ＩＬ−３、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びＦｌｔ３−Ｌが含まれる。選択されたＣＤ３４＋細胞はポート２０を介してチャンバーに注入され、バイオリアクターを、空気が制御された生理的温度のインキュベーターに入れる。所望のインキュベーション時間後、Ｘ−ＶＩＶＯ ２０栄養培地と成長因子（上記）とをポート２４から更に加える。
次にバイオリアクターをインキュベーターに戻す。第２のインキュベーション時間の終わりに、インキュベーターからバイオリアクターを取り出し、細胞を回収バッグに回収する。
本発明に用いる試薬は、典型的には４℃で保存する。試薬は、２つのサイトカインミックスバイアル（ＣＫ−ミックスＡとＣＫ−ミックスＢ）、及び２つの培地バイアル（ＭＥＤ ＡとＭＥＤ Ｂ）として提供することが好ましい。「Ａ」のバイアルの内容物を用いて第０日にチャンバーに播種し、第７日に「Ｂ」のバイアルの内容物をチャンバーに加える。シリンジを用いて試薬をリアクターに導入する。
バイオリアクターは、市販のポリスチレン組織培養フラスコ（例えばベクトン・ディッキンソン・ラブウェア、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国のコード番号３５−３０２８）を用いて準備し、以下のように装備する：（１）フラスコの上部に５つのポートを備える。２つのポートはポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）の０．２μｍフィルターを有する。２つのポートは穴開け可能なコネクタを有する；１つのポートはガス透過性ろ過膜を有する；（２）６つめポートは、培養期間の終わりに細胞を回収するために、組織培養フラスコを５００ｍｌの滅菌バッグに接続する。バイオリアクターは、組織培養用に処理されたポリスチレンの約１７５ｃｍ２の増殖表面を有する。
第０日に、栄養培地と成長因子との混合物を、０．２μｍ滅菌フィルターを有するポートから滅菌シリンジで導入する。栄養培地と成長因子との混合物は、１５６０μｌの栄養培地に懸濁させた、０．２７０μｇのＩＬ−３、３．０μｇのＴＰＯ、１．５μｇのＳＣＦ、及び３．０μｇのＦｌｔ３−Ｌを含有するサイトカイン組成物（ＣＫ−ミックスＡ）と、６０ｍｌのＸ−ＶＩＶＯ ２０培地（ＭＥＤ Ａ）とを混合することによって調製する。第０日であって栄養培地と成長因子を入れた後に、ＣＤ３４＋の選択された細胞を他の専用ポートを用いてバイオリアクター中に播種する。例えば１．２×１０６の選択された細胞を６１．５ｍｌの栄養培地（初期細胞濃度はおよそ２０，０００細胞／ｍｌ）とともに播種する。ＣＤ３４＋細胞の最低生存率は８０％であり、最低純度は７０％である。
バイオリアクターの内容物を、約５％ＣＯ２を含有する空気雰囲気中にて、３７℃、約１００％湿度でインキュベーションする。培養又はインキュベーションの１週間後（即ち第７日）、栄養培地と成長因子との混合物を、０．２μｍ滅菌フィルターを有する他の専用ポートから滅菌シリンジで導入する。栄養培地と成長因子との混合物は、７７６μｌの栄養培地に懸濁させた、０．１３５μｇのＩＬ−３、１．５μｇのＴＰＯ、０．７５μｇのＳＣＦ、及び１．５μｇのＦｌｔ３−Ｌを含有するサイトカイン組成物（ＣＫ−ミックスＢ）と、３０ｍｌのＸ−ＶＩＶＯ ２０培地（ＭＥＤ Ｂ）とを混合することによって調製する。
培養期間の終わりに、バイオリアクターの内容物を、専用ポートを通してバイオリアクターから排出させ、滅菌バッグに流す。標準的手段によって細胞を洗浄することにより、残留サイトカインを除去する。
この方法は、典型的には、ＣＤ３４＋の増殖を３〜４０倍にし、全細胞増殖数を３０〜３００倍、平均約２００倍にする。細胞生存率は８０％を越える。
上記の説明及び添付の図面は、本発明の態様を説明するために提供するものであり、いかなる場合も本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当該技術分野に熟練した者には、本発明の精神又は範囲を逸脱することなく、細胞を増殖させる装置及び方法にさまざまな改変や変形をなし得ることが明らかであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内にある限り、本発明の改変や変形に及ぶことを意図するものである。
図１は、本発明のバイオリアクターの斜視図を示す。 図２は、図１のバイオリアクターの上面図を示す。 図３は、本発明のバイオリアクターとともに使用できる管及び滅菌バッグの上面図を示す。

Claims (47)

  1. 反応チャンバー；
    ヒト細胞の導入に適合させた第１ポート；
    フィルターを含んだ、ガス交換に適合させた第２ポート；
    培地の導入に適合させた第３ポート；
    細胞のサンプリングに適合させた第４ポート；及び
    ヒト細胞の培養後の収集に適合させた第５ポート
    を含む、バイオリアクター。
  2. 第２ポートのフィルターがガス透過性膜フィルターである、請求項１に記載のバイオリアクター。
  3. 第３ポートがフィルターを含む、請求項１又は２に記載のバイオリアクター。
  4. フィルターを含んだ、培地の導入に適合させた第６ポートを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
  5. 第１ポートが穴開け可能なキャップを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
  6. 第４ポートが穴開け可能なキャップを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
  7. 第５ポートから細胞を排出させることによってヒト細胞を培養後に収集するよう適合させた、請求項１〜６のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
  8. 反応チャンバーが、２５ｃｍ２〜６００ｃｍ２の増殖表面を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
  9. 反応チャンバーが、１５０ｃｍ２〜２５０ｃｍ２の増殖表面を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
  10. 反応チャンバーが、透明な、組織培養用に処理されたプラスチックでできている、請求項１〜９のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
  11. 第１ポートから細胞を導入できることを示すラベルを第１ポート近傍に含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
  12. 第２ポートからガスを交換できることを示すラベルを第２ポート近傍に含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
  13. 第３ポートから培地を導入できることを示すラベルを第３ポート近傍に含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
  14. 第４ポートから反応チャンバーの内容物をサンプリングできることを示すラベルを第４ポート近傍に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
  15. （ｉ）第０日に第３ポートから培地を導入できることを示すラベルを第３ポート近傍に、そして（ｉｉ）第７日に第６ポートから培地を導入できることを示すラベルを第６ポート近傍に含む、請求項４に記載のバイオリアクター。
  16. ラベルが、バイオリアクターに付着しているか、又はバイオリアクターにかたどられている、請求項１１に記載のバイオリアクター。
  17. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバイオリアクターと、第５ポートに接続した管とを含むキット。
  18. 更なる管と１以上の滅菌バッグとを更に含む、請求項１７に記載のキット。
  19. 第１容器に栄養培地を、第２容器に成長因子 Ｆｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子を更に含む、請求項１７又は１８に記載のキット。
  20. 成長因子が、以下の濃度:
    Ｆｌｔ３−Ｌ １．９μｇ／ｍｌ；
    トロンボポエチン １．９μｇ／ｍｌ；
    インターロイキン３ ０．１７μｇ／ｍｌ；及び
    幹細胞因子 １μｇ／ｍｌ、
    で存在する、請求項１９に記載のキット。
  21. ヒト造血細胞数をｉｎ ｖｉｔｒｏで増加させる方法であって：
    請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバイオリアクターを準備し；
    ヒト造血細胞を第１ポートに導入し；
    第３ポートから培地を導入し；そして
    細胞数を増加させるのに十分な条件及び時間で細胞を培養する、
    ことを含む、前記方法。
  22. 細胞を培養後に第５ポートから収集する、請求項２１に記載の方法。
  23. バイオリアクターが、フィルターを含んだ、培地の導入に適合させた第６ポートを更に含み、第３ポートから培地導入後７日目に、培地を第６ポートから導入する、請求項２１又は２２に記載の方法。
  24. ヒト造血細胞がＣＤ３４陽性である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 培地が、ヒト造血細胞の増殖に有効な栄養培地と成長因子とを含み、成長因子はＦｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子を含む、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. ヒト造血細胞がヒト臍帯血に由来する、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. ヒト造血細胞がヒト骨髄に由来する、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  28. ヒト造血細胞がヒト末梢血に由来する、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  29. ヒト造血細胞数をｉｎ ｖｉｔｒｏで増加させる方法であって：
    ＣＤ３４陽性ヒト造血細胞を準備し；
    ＣＤ３４陽性細胞を、ＣＤ３４陽性細胞の増殖に有効な栄養培地と成長因子とを含む培地を含有するバイオリアクター中に、初期濃度１×１０４〜５×１０６細胞／ｍｌで播種し、ここで、成長因子はＦｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子を含み；そして
    ＣＤ３４陽性細胞数の増加に十分な条件及び時間でＣＤ３４陽性細胞を培養する、
    ことを含む、前記方法。
  30. ＣＤ３４陽性細胞がヒト臍帯血に由来する、請求項２９に記載の方法。
  31. ＣＤ３４陽性細胞がヒト骨髄に由来する、請求項２９に記載の方法。
  32. ＣＤ３４陽性細胞がヒト末梢血に由来する、請求項２９に記載の方法。
  33. ＣＤ３４陽性細胞をバイオリアクター中に初期濃度１×ｌ０４〜５×１０６細胞／ｍｌで播種する、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. バイオリアクターが、２５ｃｍ２〜６００ｃｍ２の増殖表面を有する、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. ＣＤ３４陽性ヒト造血細胞数が少なくとも３倍に増加する、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. ＣＤ３４陽性ヒト造血細胞数が少なくとも５倍に増加する、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 成長因子が、実質的にＦｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子から成る、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 培養工程の後で、ヒト造血細胞を培地から収集することを更に含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. ＣＤ３４陽性細胞を４〜２０日間培養する、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. ＣＤ３４陽性細胞を７日間培養し、第７日に栄養培地と成長因子とを更に加え、ＣＤ３４陽性細胞を更に５日間培養し、そして収集する、請求項２９〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 成長因子が実質的にＦｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子から成り、これらの成長因子は、培養工程の初めに以下の濃度：
    Ｆｌｔ３−Ｌ ０．０１〜０．１μｇ／ｍｌ；
    トロンボポエチン ０．０１〜０．１μｇ／ｍｌ；
    インターロイキン３ ０．００１〜０．０１μｇ／ｍｌ；及び
    幹細胞因子 ０．０１〜０．１μｇ／ｍｌ、
    で存在する、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 成長因子が実質的にＦｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子から成り、これらの成長因子は、培養工程の初めに以下の濃度：
    Ｆｌｔ３−Ｌ ０．０５μｇ／ｍｌ；
    トロンボポエチン ０．０５μｇ／ｍｌ；
    インターロイキン３ ０．００４３μｇ／ｍｌ；及び
    幹細胞因子 ０．０２５μｇ／ｍｌ、
    で存在する、請求項２９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 培地及びバイオリアクターが間質細胞も間質細胞の条件培地も含有しない、請求項２９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 実質的に成長因子 Ｆｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子から成る試薬であって、これらの成長因子は以下の濃度：
    Ｆｌｔ３−Ｌ １．９μｇ／ｍｌ；
    トロンボポエチン １．９μｇ／ｍｌ；
    インターロイキン３ ０．１７μｇ／ｍｌ；及び
    幹細胞因子 １μｇ／ｍｌ、
    で存在する、前記試薬。
  45. バイオリアクター、第１容器に栄養培地、並びに第２容器に成長因子 Ｆｌｔ３−Ｌ、トロンボポエチン、インターロイキン３、及び幹細胞因子を含む、キット。
  46. 管と１以上の滅菌バッグとを更に含む、請求項４５に記載のキット。
  47. 成長因子が以下の濃度：
    Ｆｌｔ３−Ｌ １．９μｇ／ｍｌ；
    トロンボポエチン １．９μｇ／ｍｌ；
    インターロイキン３ ０．１７μｇ／ｍｌ；及び
    幹細胞因子 １μｇ／ｍｌ、
    で存在する、請求項４５又は４６に記載のキット。
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