JPH03505965A

JPH03505965A - バイオリアクター装置

Info

Publication number: JPH03505965A
Application number: JP1507106A
Authority: JP
Inventors: フー，ウェイ―ショウ; ティー．ショルツ，マシュー
Original assignee: ザ　リージェンツ　オブ　ザ　ユニヴァーシティ　オブ　ミネソタ
Priority date: 1989-05-18
Filing date: 1989-05-19
Publication date: 1991-12-26
Anticipated expiration: 2013-12-14
Also published as: JP2835629B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】バイオリアクター装置本出願は１９８８年５月２３日に出願され、現在放棄されている出願番号第１９７，７００号の一部継続出願である。

本発明の分野本発明は動物細胞およびそれらの遺伝子的に改変された誘導物をインビトロで維持して種々の細胞産生物を連続的に産生させる、改良されたバイオリアクター装置に関する。

本発明の背景動物細胞およびそれらの遺伝子的に改変された誘導物はしばしばワクチン、モノクローナル抗体および組織タイプのプラスミノーゲンアクチベーターのような薬剤的タンパク質の連続的産生用バイオリアクター内で培養される。例えば、下垂体細胞はインビトロで培養して成長ホルモンを産生させることができ、腎細胞は培養してブラスミノーゲンアクチベーターを産生させることができ、そして肝細胞は培養して肝炎Ａ抗原を産生させることが知られている。これらのバイオリアクター内で細胞は本質的に触媒の１つの系であり、培地は栄養素を供給しそして成長阻止代謝物を除去する。栄養素を供給しそして代謝物を除去するために、バイオリアクター中の培地は液体流によって断続的にかまたは連続的にかのいずれかで交換される。しかし乍ら、細胞の大きさが比較的小さくまた培地とくらべたとき密度の差が小さいため、培地を交換すると細胞は必然的に回収され、バイオリアクター内の細胞濃度は相対的に低くなる。このように細胞濃度が低い結果、採取された培地中の所望の細胞産生物の濃度は低い。

理想的な動物細胞バイオリアクターは次の３つの特徴を有している＝（１）細胞が出来る限り長く、即ち殆んど無限の在留時間で、バイオリアクター装置内で高密度で生存状態が維持される：（２）高価な成長因子および所望の細胞産生物を含む高分子化合物はバイオリアクター内での在留時間が有限であるが長く、増殖する細胞は栄養素を有効に利用でき且つ細胞産生物の蓄積も高濃度になる：および（３）高価でない栄養素および阻害物質を含む低分子化合物はバイオリアクター内での在留時間が非常に短く細胞産生物形成の阻害を減少させる。

生物分子のインビトロでの細胞培養製造用の多数の方法および装置がこれらの目標を達成するために過去に試みられてきた。比較的簡単な系では、細胞は適当な栄養培地の存在下で組織フラスコおよびローラー瓶内で増殖させられた。より複雑な系では、細胞への栄養素供給手段と連携した、細胞の表面支持体として毛細管中空ファイバー膜が使用されてきた。

例えば、トルバート（Ｔｏｌｂｅｒｔ）の米国特許第４．５３７，８６０号は、細胞産生物を連続的に分泌させながら実質的に増殖が阻止された状態で動物細胞を維持するための静止細胞培養維持系を記載している。細胞は、液体栄養培地の通路間隙を有する半固形マトリックス内のりアクタ−容器室内で保持される。新鮮な栄養培地はりアクタ−室内で懸濁されており、そして実質的にマトリックスを横断している多孔度の比較的低い管を通してマトリックス内に潅流されて供給される。高多孔性管は消費された培地および細胞産生物を回収するために利用される。

膜タイプの細胞リアクターはまた細胞、培地および産生物用の種々の隔室を有する大規模膜リアクター系の構築にも示されている、Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａｒｄ、、６６巻、２２１〜２２６頁（１９８７年）。

この膜系では、細胞は、種々の膜が細胞を培地から分離させそして細胞を細胞産生物から分離させているワイヤーマ）・リックス内に固定化されている。培地と細胞間にある膜は、特定の細胞産生物が培地隔室へ移動するのを妨げる有用な分子量カットオフを有する限外濾過器である。他の膜は細胞と細胞産生物室とを分離する微小濾過膜である。この形態では、細胞を連続的に供給することおよび細胞を除去することなく集まった細胞産生物を異なった時間間隔で採取することが可能である。

これらのりアクタ−系は高い細胞濃度を維持する問題に取り組んで高いレベルの細胞産生物の採取を試みているが、改良の余地が大いにある。従って、本願発明のバイオリアクターは連続的または断続的に細胞産生物を分泌させながら多数の細胞を殆んど無限の在沼時間維持するインビ）・口での細胞培養系を提供する。

本発明の要約本願発明のバイオリアクターによって、動物細胞は持続した期間に亘ってインビトロで維持される。簡単に言えば、このバイオリアクター装置は２つの室、即ち供給および廃物室並びに細胞室からなっており、選択的透過性の限外ｉｔ！過膜によって分離されている。この膜は、栄養素と細胞老廃物は選択的に室間を通過させるが、所望の細胞産生物は通過させない。細胞室内では、生物と共存可能な三次元マトリックスが動物細胞を捕捉する。生物と共存可能なマトリックスか存在するので、細胞室は一般的（ごゲル相、即ち生物共存性マ）・リックス、および採取すべき細胞産生物の濃厚溶液を含有する液体相を有している。かくして、本願発明のバイオリアクターでは２つの室を使用するだけでバイオリアクター装置内で３つの区別された領域が得られる。消費された栄養素および細胞老廃物は供給および廃物室と流れで連絡している出口手段を通して回収される。流れで細胞室と連絡している回収手段を、産生中の細胞を邪魔することなく所望の細胞産生物を採集するために設置することもできる。

本発明の原理を使用するバイオリアクター装置からもたらされる種々の特徴および利点は請求の範囲中で特に指摘する。しかし乍ら、本発明をより一層完全に理解するためには、図面および本発明の詳細な説明も参照すべきである。

図面の簡単な説明図１は、本願発明の発明原理を使用するバイオリアクター装置の要約図であり、図２は、本願開示の発明原理を使用するバイオリアクター装置の１つの実施態様の図示であり、図３は、平板床タイプのバイオリアクター装置を使用する系の概略図であり、図４は、中空ファイバーバイオリアクタ・−装置を使用する系の概略図であり、図５は、本願発明の１つの実施態様の同寸法の分解組立図であり、図６は、図５で示された実施態様で使用される基板の平面図であり、図７は、図５で示された実施態様で使用される膜の平面図であり、図８は、図５で示された発明の実施態様で使用される培地板の平面図であり、図９は、図５で示された実施態様で使用される細胞産生物板の平面図であり、図１０は、図５で示された実施態様の線ｉｆ］−１０の断面図であり、図１１は、本願発明のもう１つの実施態様の側断面図であり、図１２は、図１１で示された実施態様の線１２−１２の断面図であり、図１３はグラフであり、図１４はグラフであり１、図１５はグラフであり、図１６はグラフであり、図１７はグラフであり、図１８はグラフであり、図１９はグラフであり、図２０はグラフであり、図２３はグラフであり、図２２は、本願発明の発明原理を使用するバイオリアクター装置の要約図であり、そして図２３は、図２２で示された実施態様の断面図である。

本発明の詳細な説明図１および図２で示された発明物に関して、本願開示の発明原理によるバイオリアクターＪＯは一般的に、近位端１８と遠位端２０を有する収容手段１６内に２つの室を有している。選択的透過膜２２は収容手段１６の内部にある。膜２２は近位端１８から遠位端２０に延びて、収容手段１６の内部を細胞室２４と供給および廃物室２６に分けている。

好ましい膜は、栄養素および細胞老廃物のような低分子化合物が細胞室２４および供給室２６間を選択的に通過し得るようにするものである。１．かし乍ら、膜２２は、採取すべき細胞産生物のような高分子化合物がこの２つの室を通過しないようにするものである。

膜は必須栄養素および毒性の老廃物に対１．では透過性であるが、一方、細胞室内の所望の細胞産生物は維持１．なければならない。

当然、膜分子量の望ましい上限は所望の細胞産生物の分子量より小さいように選択される。かくして、１４．Ｃｏｏを超える分子量を有する細胞産生物に適切な膜は、一般的には１２，０００から１４，０００までの範囲の分子量上限を有する加工セルロースから構築されよう。

このような膜は商品名スペクトラ／ボア　４　（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ　４）でカリフォルニア州ロサンゼルスのスペクトラムメディカルインダストリーズ　（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ　１ｎｄｕｓｔ、ｒｉｅｓ）インコーホレイティラドから市販で入手可能である。本願発明のバイオリアクター系と共に使用することが出来る他の限外濾過膜にはポリスルホン、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエステル／ポリカーボネート、テフロン、　イオン負荷膜、セロファン、ニトロセルロースポリエチレンおよびセラミックスがある。市販の２，３の例にはカリフォルニア州ブｌノサントンのヌクレオボーア（Ｎｕｅｌｅｏｐｏｒｅ）コーポレーションからのポリカーボネー）・およびポリエステルヌクレオボーア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ”）膜フィルター：マサチューセッツ州ベッドフォードのミリボーア（Ｍｉｌｌｊｐｏｒｅ）からのポリスルホンＰ丁ＧＣ膜；およびニューハンプシャー州キーネのンユライヒャーアンドシュネル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｅｈｎｅ１１）インコーホレイティラドからのニトロセルロースコロジオン（Ｃｏｌ　１ｏｄｉｏｎ”　）膜フィルターがある。

供給および廃物室２６は細胞に栄養培地を供給し、膜２２から室２６へ通過した消費された培地および細胞老廃物を運び去る。供給および廃物室２６と流れで連絡している入口手段２８は所望の栄養培地を供給するために設置する。出口手段３０もまた供給および廃物室２６と連絡しており消費された培地および細胞老廃物を取り除く。

増殖室２４は２つの別々の相からなっている　動物細胞を捕捉してゲル相を形成する、実質的に不溶性で生物共存性のマトリックス３４；および液体相を形成する分泌された細胞産生物の濃厚溶液。

本願明細書で使用される不溶性という用語はろ過によって細胞培地から分離しうる組成物を言う。この２分断細胞室２４は、適当なマトリックスプリカーサ−／細胞懸濁液を増殖室内に置くときに形成される。細胞含有マトリックスプリカーサ−は細胞室２４内で収縮して一般的に濃厚な、不溶性で細胞−生物共存性マトリックス３４を形成する。生物共存性マトリックス３４を使用すると、細胞を非常に長時間インビトロで維持できる。９０日までの滞留時間が達成されている。

一般に、選択した細胞を低温（例えば、０℃から３０℃まで）で、低ｐＨ値（例えば、２から５．５まで）で、低温と低ｐＨ値の両者で、または異なるイオン構成の溶液中でマトリックスプリカーサ−溶液と混合するとき、細胞−生物共存性マトリックスが形成される。選択されるマトリックスプリカーサ−はこのような懸濁液を創るために好ましくは最初は可溶性形態である。次いで、細胞−マトリックスプリカーサ−懸濁液を入口手段３１を通して細胞室２４に導入する。　ｐＨ１温度またはイオン特性が初期値から変化すると、重合化または集合が起こり、生成したポリマー鎖は不溶性の集合体を形成する（例えば、ｐｉ（値が６８から７．４までの範囲に上昇し、温度が３７℃から４５℃までの範囲に上昇した）。これらの不溶性の集合体は更に集合してファイバーを形成する。これらのファイバーは順次細胞を捕捉し、実質的に不溶性で、細胞−生物共存可能性マトリックス３４と称されるものを創製する。

選択されるマトリックスプリカーサ−は、細胞が住みつく前に、その場で実質的に不溶性で生物共存性のマトリックスを迅速に形成する能力を有することが一層望ましい。選択されるマトリックスプリカーサ−は好ましくは、細胞−マトリックスプリカーサー懸濁液の物理的または化学的変化につれて線維性マトリックスを形成する。このような変化はｐｌ値若しくは温度またはその両者、コーモノマー若しくは他の任意の重合開始剤の添加、或いはこれら方法の任意の組み合わせによってもたされよう。選択されるマトリックスプリカーサ−に依拠して、マトリックスの形成は重合化、集合化、イオン複合化等によってもたらされよう。

便宜上、マトリックス構成を称するために用語ポリマーまたは集合体を使用するときはいつも、マトリックスはこれらの特性を有する化合物に限定されないと理解すべきである。少なくとも最初にはその場で形成されそして細胞を捕捉する、生物共存性で実質的に不溶性のマトリックスは本願発明の範囲内であると考えられる。同様に、マトリックスプリカーサ−は、重合化し若しくは集合化する傾向を有する全ての化合物またはその場でマトリックスを形成するようなものを含むと理解すべきであるが、これらに限定されるべきではない。

細胞またはマトリックスそれ自体のいずれかで生じる収縮のために、細胞−生物共存性マトリックスは、全てではないが場合によっては、２．３時間または２．３日で元の占有容量の４分の１に収縮する。本願発明では、細胞−生物共存性マトリックスかこの程度まで収縮する必要はない。混合物で占有されていた元の容量の約９０％に収縮する細胞−マトリックスが望ましい。占有されていた元の容量の約７５１に収縮した細胞−マトリックスは更に好ましい。元の容量の約５０％に収縮した細胞−マトリックスは更に一層好ましい。しかし乍ら、最も望ましい細胞−マトリックスは混合物で占有されていた元の容量の約３分の１に収縮する。

収縮が生じた後、細胞室２４は２つの分離領域、即ち細胞−生物共存性マトリックス領域と細胞によって産生される高分子化合物が蓄積する液体領域とを有する。細胞産生物は回収手段３２から定期的にまたは連続的に採取される。

得られたマトリックスは、最適培養条件下、即ち、ｐ■＝７．０〜７．４：温度＝３７℃；および浸透度；２７５〜４００ミリオスモールで使用される細胞培地中で少なくとも部分的に不溶性でなければならない。更に、細胞−生物共存性マトリックスは非細胞毒性であり滅菌可能でなければならない。多数の７トリツクスプリ力−サー化合物は所望の細胞−生物共存性マトリックスを創製するために使用することができる。

特に好適なマトリックスを形成することが見い出されている１つの化合物はコラーゲンである。無菌の高多孔性天然アテレオベプチド（ａｔｅｌｅｏｐｅｐｔ　１ｄｅ）コラーゲンタイプＩは、カリフォルニア州パロアルトのコラーゲン（Ｃｏｌ　ｌａｇｅｎ　）コーポレーションからビトロゲンＣＶ’ｒｔｒｏｇｅｎＴ ″’）　１００の商品名で市販で入手可能である。

テレオペプチド（ｔｅｌｅｏｐｅｐｔｉｄｅ）コラーゲンタイプＩもまた有用であることが証明されており、比較的純粋な形態でニューヨーク州エルムスフォード所在のゴッテフォッセ（Ｇｏｔｔｅｆｏｓｓｅ）コーポレーションからバンコーゲンＳ　（Ｐａｎｃｏｇｅｎｅ　Ｓ　　）の商品名で入手できる。用語コラーゲンが本願明細書で使用されるときはいつでも、最適の細胞培養条件下で少なくとも部分的に不溶性である任意のタイプのコラーゲンまたは修飾コラーゲンを含むと理解すべきである。例えば、コラーゲンはカサイ（Ｋａｓａｉ　）等の米国特許第４，５５９，３０４号の技術に従って修飾することができ、その開示は参照として本願明細書に引用する。

コラーゲン−キトサン混合物もまた使用することができる。適当なキトサン、即ちＮ−アセチル結合の多くが加水分解されて遊離のアミンとなっているキチン誘導体は、ワシントン州しッドモンドのプロタンラボラトリーズ　（Ｐｒｏｔａｎ　Ｌａｂｓ）　　からウルトラピュア（Ｕｌ　ｔｒａｐｕｒｅ）キトサンの表示で乾燥状態で入手することができる。コラーゲンの場合と同じように、キトサンもまた化学的に修飾できそしてやはりマトリックス形成の有効な手段であることが認められる。更に、フィブリンを形成するためにフィブリノーゲンとトロンビンの混合物のその場での重合化が上首尾に使用されている。

この系の要件を充たす他の材料には次のものがある：（１）ポリマーを構成するサブユニットが、コラーゲンおよびキトサンのような一般的に７から１０の範囲のｐＫａ値を有するポリアミン。このようなポリアミンは、陽子化した形態のときには一般に２から５．５までの範囲のｐＨ値で細胞培地中に可溶性であり、部分的に非陽子化した形態のときには・一般に６．８から７．４までの範囲のｐｎ値で細胞培地中で部分的に不溶性である；（２）水溶性のポリアニオンポリマーとポリカチオンポリマーの混合物。この混合物はイオン結合で会合して溶液から析出する；そして（３）０℃から３０℃までの範囲の温度で細胞培地に可溶であるがより高い温度、例えば一般的に３２℃から４５℃までの範囲の温度では細胞培地に不溶性であるセルロースエーテルのようなポリマーも予期されている。

これらの原理は、図５から図９で示される本願発明の平板床タイプの実施態様１００に導入された。平板床バイオリアクター１００の外部収容器は、第１の基板１１４および第２の基板１１６の外部面１１０および１１２によって形成される。図６は基板１１４および１１Ｂを更に詳細に示す。基板１１４．１１６は、ポリカーボネートが透明で且つ蒸気滅菌可能であるので、好ましくはポリカーボネートで作られる。

しかし乍ら、基板１１４および１１６は任意の適当なプラスチックまたは金属から構成することかできる。第１の基板１１４は近位端１１ｇおよび遠位端１２０並びに外部面１１０および内部面１２２を有している。

第２の基板１１６は近位端１２４および遠位端１２６並びに外部面１１２および内部面１２８を有している。第１の基板１１４は第１の液体入り口字段１３０および第２の液体入り口字段１３２を有している。

液体入り口字段１３０．１３２は共に第１の基板１１４の近位端１１８の近くに位置していることが好ましく、第２の液体入り口手段１３２は第１の液体入り口手段１３０より僅かに後部または下部に位置する。

第２の基板１１６は箪１の液体出口手段１３４および第２の液体出口手段１３６を有している。両液体出口手段は共に第２の基板１１６の遠位端１２６の近くに位置しており、好ましくは第２の液体出口手段１３６は第１の液体出口手段１３４より僅かに前部または上部に位置する。

第２の液体出口手段１３６および第２の液体入り口手段１３２は、細胞産生物の定期的採取１．か所望され、ない場合、ゴム隔壁で蓋をするかまたは末端がバルブになった小管を設置することができる。

第１の基板〕１４および第２の基板］、１６の内部面１２２．１１８の間には交互になっている細胞増殖板１３８、選択的透過性膜１４２および栄養培地板１４０がある。バイオリアクター１００は図９で更に詳細に示されるように、少なくとも１つの細胞増殖培地板１３８を有している。

各細胞増殖板］３８は少なくとも１つの縦方向窓１．４４を有している。

細胞増殖叛意］４４の長さは、組み立て１こ平板床バイオリアクター１００で測定するとき、第２の液体入り口手段１３２から第２の液体出１コ手段１３６までの間隔に実質的に等しい。

図８で更に詳細に示されるように、バイオリアクター１．００はまた少なくとも１つの栄養培地板１４０も有（−ている。各栄養培地板１．４ｒｌは少なくと乙１つの縦方向窓１４６も有している。栄養培地叛意１４６の長さは、組み立てた平板床バイオリアクター１００で測定するとき、１第１の液体入り口手段１３０から第１の液体出口手段１３４までの間隔に実質的に等１．い。かくして、栄養培地板の窓１．４６の長さは細胞板の窓１４４の長さより僅かに長い。当然ながら、縦方向の窓１４４．１４６の長さは第１および第２の液体入り口手段並びに第１および第２の液体出口手段］３４．１３６の位置によって決まる。それ故、窓１４４か栄養培地窓１４６より僅かに長いことも可能である。この場合には、栄養培地窓１４４の長さは、組み立てた平板床バイオリアクター１００で測定するとき、第１の液体入り口手段１３０から第１の液体出口手段１３４までの間隔に実質的に等しく、そして細胞叛意１４６の長さは第２の液体入り口手段１３２から第２の液体出口手段１３６までの間隔に実質的に等しい。

好ましい実施態様では、少なくとも１つの第１の培地通路１４８は第１の液体入り口手段１３０および栄養培地叛意１４６と流れでつながっている。少なくとも１つの第２の培地通路１５０は栄養培地叛意１４６および第１の液体出口手段１３６と流れでつながっている。少なくとも１つの第１の細胞通路１５２は第２の液体入り口手段１３２および細胞増殖叛意１４４と流れでつながっている。少なくとも１つの第２の細胞通路１５４は細胞増殖叛意１４４および第２の液体出口手段１３６と流れでつながっている。通路１４８．１５０．１５２および１５４はそれらのそれぞれの板１３８．１４０を越えては延びていない。第１の基板１１４上での、第１および第２の液体入り口手段１３０．１３２並びに通路１４８．１５２と流れでつながっているのは好ましくは第１および第２の液体流多岐管１５８．１６０である。同様に、第２の基板１１６上の第１および第２の液体流多岐管１６２．１６４は第１および第２の液体出口手段１３４．１３Ｇ並びに通路１５０．１５４と流れでつながっている。好ましくは、多岐管１６０．１６４の内径は産生物が回収されるとき産生物流の希薄化を避ける得る程小さい。

図７で示されそして本発明の平板床バイオリアクター１００で使用される選択的透過性膜１４２は、動物細胞および所望の細胞産生物を膜１４２の一方の側から他方の側には実質的に通過させないか、栄養素および細胞老廃物を膜１４２の一方の側から他方の側に通過させる。

基板１１４．１１６、板１３８．１４０および膜１４２は好ましくは以下のサンドイッチタイプの形態で一緒に組み立てて本願発明の平板バイオリアクター１００を形成する。第１の基板１１４および第２の基板１］６の外部面］１０．１］２を互いに外側に向かって位置させ、バイオリアクター１００の外部収容器を作る。板１３８．１４０および膜１４２は基板１．１４．１１Ｇの間に挟み、その結果栄養培地板１４０は増殖板１３８と交互になり、一方各膜１４２は各板を他の各板ココよび３基ｔｌ１４、］］６の内部面１２２．１２８から分離する。固定手段１５６、例えばポル）・、ね１：、クランプ等は組み立てたサンドイッチバイオリアクター装置を保持するために使用することができる。

バイオリアクター１００の操作では、膜１４２を基板１１４、＋１６および培地板ｊ３８．１４０の間１、二置くことは必要でない。しかし乍ら、この態様で使用するとさは、膜は有効なガスケットと１．て役立つ。サンド、インチ構造のバイオリアクター１００を形成する際には、基板１１４．１１６を除いてサンドインチの第１および最後の板は好ましくは栄養培地板】４０である。好ま１．＜は、本発明の平板床バイオリアクタ・−］００は多数の細胞増殖板１３８および栄養培地板１４０並びに多数の膜】４２で形成される、。

操作する際、選択した細胞栄養培地は、培地容器１５６から第１の液体入り口手段１３０および第１の培地通路］４８を通して栄養培地叛意］４６まで、図３で示されるよ・うに、襦動ポンプを用いて送り込む５　適当なポンプはイリノイ州ンカゴのコ・−ルバルマ−（ＣｏｌｅＰａｌｍｅｒ）の、サイズ１６マスターフＬ、／−／クス（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ）シリコ：、／管を備えたスピード変動性マスターフレックスのカタログ番号７５３３−３０である。培地は栄養培地叛意１４６から第２の培地通路１５０まで続き、そしてその後部１の液体出口手段１３４を通って平板床バイオリアクター１００から出る。細胞−マｊ・リックスプリカーサー懸濁液は第２の液体入り口手段１３２から、次いで第１の細胞通路ユ５２を通して増殖叛意１４４に導入される。第２の液体出口手段１３６は好ましくは蓋をされる。

細胞−マトリソクスプリカーサー懸濁液が細胞増殖叛意１４４に導入された後、細胞を捕捉している実質的に不溶性のマトリックス３４がその場で形成される。

細胞は、膜１４２を通過する栄養培地の連続流で維持される。毒性の細胞老廃物は膜１４２を通過して栄養培地叛意１４６に拡散し、そこで老廃物はバイオリアクターから運び出される。採取すべき細胞産生物は、これらの分子上が高いため、膜１４２を通過１．ない。

細胞産生物を定期的に採取するために、ンリンジまたは他の回収手段を第２の液体出口手段１３６中に挿入する。連続的に採取するためには、ポンプかまたは試料流制御バルブかのいずれかを使用することができる。或いは、液体を細胞室に導入１．て採取すべき細胞産生物と置換することができる。

或いは１、本願発明の原理は図１１および１２で示される中空ファイバーバイオリアクター２００で使用することができる。適当な中空ファイバー組立品はマザチューセッツ州ダンバースのＬ　Ｒ，グｌノースアンドカンパニー（Ｇｒａｃｅ　＆　　Ｃｏ、　）の一部門であるアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）からでているアミコンＰＮ　５４０７モデル囲４であり、圧力制御バルブおよびフィルターフリッ）・が除かれている。′アミコンＨＩＰ３０−４３中空ファイバー膜組立品は上限分子量約３０，０００を有し、該バイオリアクター２００の実施例用に使用１．た。上記した任意の適当な膜組成物も上首尾に使用できるが、上記組立品の中空ファイバーは、ポリスルホンから作られた。

適当な中空ファイバー組立品２００は、間隔の離れた末端部分２１３ａ、　２１．３１）を有する収容器２０］を有しており、末端部分はそれらの間で室２１４を区画している。収容器２０１は第１の液体入り口手段２０２および第２の液体入り口手段２０４を有しており、第２の液体入り口手段２０４は一般に第１の液体入り口手段２０２の内側方向に位置している。収容器２０１はまた第１の液体出口手段２０６および第２の液体出口手段２０８も有しており、第２の液体出口手段２０８は一般に第１の液体出口手段２０６の内側方向位置している。収容器２０１は図１１および図１２で円筒形であるように描かれているが、その形状はそのように限定されるものではない。中空ファイバーを収容する任意の収容器を首尾良く使用することができる。

収容器２０１の内部には少なくとも１つの選択的透過性の中空ファイバー２１０があり、これは細胞および所望の細胞産生物は実質的に通過させないが栄養素および毒性の細胞老廃物は通過させ、収容器２０１の長さに及んでいる。中空ファイバー２１０は室２１４を中空ファイバー２１０内の毛細管内空間２１５と中空ファイバーの外側の毛細管外空間２１６に分けている。毛細管内空間２１５と毛細管外空間２１６は中空ファイバー２１０の壁を通してのみつながっている。好ましくは、毛細管外空間２１６は栄養培地または供給および廃物室を提供するが、毛細管内空間２１５は選択されたマトリックス内に捕捉された細胞の細胞室を提供する。これらの役割は、所望の場合、逆にすることができる。好ましくは、多数のファイバーを使用する。中空ファイバー２１０の内部間隙は第１の液体入り口字段２０２および第１の液体出口手段２０６と流れでつながっている。毛細管外空間２１６は第２の液体入り口字段２０４および第２の液体出口手段２０８と流れでつながっている。

操作する際、図４で示されるように、毛細管外空間２１６が栄養培地または供給および廃物室として使用される場合、栄養培地は容器２１２から第２の液体入り口字段２０４を通して送り込まれる。培地は毛細管外空間２］６を移動し、第２の液体出口手段２０８を通って収容器２０１を出る。マトリックスプリカーサ− 細胞！ｉ！に濁液は、毛細管内空間２１５が細胞室として使用される場合、第１の液体入り口字段２０２を通して中空ファイバー２１０中に導入される。第１の液体出口手段２０６はゴム隔壁または末端がバルブ状の小管で蓋をする。その後、実質的に不溶性の細胞−マトリックスが中空ファイバー２１０内のその場で形成される。

栄養培地は中空ファイバー２１０の線維膜壁を移動して、捕捉された細胞に供給される。細胞老廃物および消費された培地は中空ファイバー２１０を通って毛細管外空間に流れ、そこでこれらは培地流と共に運び出される。所望の細胞産生物は第１の液体出口手段２０６を通して連続的にまたは定期的に採取される。

多領域バイオリアクターの設計に本願発明の原理を使用することもできる。このバイオリアクターの形態は１つ以上の細胞産生物を採取したい場合に特に有用であろう。この形態では、採取されるべき細胞産生物、Ｐｌ、Ｐ、は分子量がかなり異なっていよう。

例えば、細胞産生物Ｐ、は細胞産生物Ｐ、の分子量よりかなり大きい分子量を有する。図２２および図２３で示されるように、一般に３００と称される、本願の原理に従う多領域のバイオリアクターは、間隔の離れた末端部分を有し、それらの間で室が区画されている収容器内に密封された種々の孔サイズの、多数の同心円の、選択的透過性中空ファイバーＭ５、Ｍ、およびＭ３からなっている。

図２２で示されるように、多領域のバイオリアクター３００の収容室内には第１の選択的透過性の中空ファイバーＭ１があり、これは細胞を実質的に通過させないが、好ましくは栄養素、毒性の細胞老廃物並びに細胞産生物Ｐ、およびＰｔを通過させる。第１の中空ファイバー１の毛細管内空間内には第１の領域２．がある。第２の選択的透過性中空ファイバー島は上記の第１の中空ファイバー１と同心である。第２の中空ファイバー鯖、は、少なくとも１つの細胞産生物、例えばＰ、に対しては不透過性であるが、好ましくは栄養素および細胞老廃物の通過に対しては透過性であろう。第２の中空ファイバーＭｆは第１の中空ファイバー島と第２の中空ファイバーＭ、との中間の毛細管内空間内に第２の領域Ｚ、を創る。

第３の選択的透過性中空ファイバーらは第２の中空ファイバーＭ、と同心である。第３の中空ファイバーＭ３は、全ての所望の細胞産生物、ここではＰ、およびＰ、は通過に対しては不透過性であるが、好ましくは栄養素および細胞老廃物の通過に対しては実質的に透過性であろう。第３の中空ファイバーＭ、は２つの領域を更に創る：　第４の領域ｚ４は第３の中空ファイバーらと収容器３０１の中間の毛細管外空間内に創設されるが、第３の領域２．は第２の中空ファイバーもと第３の中空ファイバーＭ、の中間の毛細管内空間内に創設される。

この形態では、第１の中空ファイバーＭ１％第２の中空ファイバー　Ｍ　ｔおよび第３の中空ファイバーｙ、は栄養素および細胞老廃物を領域ｚｌから領域ｚ４にそして領域Ｚ４から領域ＺＩに移動させることができるであろう。しかし乍ら、細胞産生物Ｐ、は領域２．内に含まれるであろう。他方、細胞産生物Ｐ、は第２の中空ファイバーＭ、を通過して自由に領域ｚ３に拡散することができよう。

しかし乍ら、第３の中空ファイバーもの孔サイズは細胞産生物Ｐ、が領域ｚ４に拡散するのを妨げるであろう。しかし乍ら、採取すべき細胞産生物数および所望の濃度に依拠して、４つより多いかまたは少ない領域が可能であることを理解すべきである。図２２および２３で示される実施態様は多領域バイオリアクターの限定的な描写であるようには意図されていない。

本願発明で使用するのに適当な市販で入手可能な同心円ファイバーバイオリアクターはカリフォルニア州リバーモアのセテツク（Ｓｅｔｅｃ）インコーホレイティラドから商品名　トリセントリンク（ＴＲＩＣＥＮＴＲＩＣ８））で入手できる。この組立品の中空ファイバーは、上記した任意の適当な膜組成物も上首尾に使用できるけれども、ポリプロピレンからできている。

操作に際しては、適当なマトリックスプリカーサ−／細胞溶液は領域Ｚ、と流れで連絡されているバルブ手段ｖ、゛を通して領域２、に導入され、そこでその後、懸濁液は収縮して一般に濃厚な不溶性の、細胞−生物共存可能性マトリックス３０２を形成する。マトリックス３０２および細胞産生物は、やはり領域Ｚ１と流れで連絡されているバルブ手段ｖ１から取り出すことができる。マトリックス３０２では、細胞は非常に長時間インビトロで維持することができる。

栄養培地はバルブ手段Ｖ、およびｖ、゛によって領域ｚ４を通過する。

バルブ手段ｖ３およびｖ、゛は領域Ｚ４と流れでつながっている。低分子量の栄養素は中空ファイバー殖７、Ｍ、およびＭ３から自由に拡散して領域２．に存在する細胞を維持する。同様に、低分子量の細胞老廃物および阻害代謝物は一連の同心円中空ファイバーから領域Ｚ４に拡散させることができる。領域ｚ４中の培地流は消費された栄養培地および細胞老廃物を組立品から運び去る。

細胞産生物Ｐ、およびＰ、の在留時間はオペレーターによって制御される。これらの産生物は、所望の領域と流れで連絡されているバルブ手段から連続的にかまたは断続的に採取することができる。

図２２で示されるように、領域Ｚ、からの細胞産生物流は細胞産生物Ｐ、およびＰ、の両方を含有しているが、一方領域Ｚ、の細胞産生物流は細胞産生物ＰｔＬか含有していない。細胞産生物Ｐ、はバルブ手段ｖｔおよびｖ、゛を使用して領域２．から容易に取り出すことができる。

他方、比較的純粋なＰ、流が望ましい場合、バルブ手段ｖ、’　、ｖ。

およびＶ、“が開けられ、そしてバルブ手段Ｖ、、Ｖ、およびｖ３′は栄養培地がバルブ手段Ｖ、から領域ｚＩに送り込まれる間閉じられる。

この方法で、栄養培地は存在する細胞産生物Ｐｔを運びながら第２の中空ファイバーＭ、を通過して拡散し、バルブ手段Ｖ、を通して組立品から出る。この形態では細胞産生物Ｐ、が中空ファイバーＭ、を通過できないので、細胞産生物Ｐ、は領域２．に残りその後採取することができる。　この方法は細胞産生物Ｐｔを幾らか薄めるであろうが、それでもやはり細胞産生物Ｐ、流は、細胞が慣用のバイオリアクター系中で増殖された場合より数倍濃縮されであろう。

他のデザインも使用することかできる。本願発明のバイオリアクター装置デザインの本質的な特徴は、２・っの室を使用し、その場で形成されるマトリックスを導入することによってバイオリアクター内に少なくとも３つの分離領域を達成することである。

本願発明の原理を使用するバイオリアクター装置は捕捉された細胞に高酸素輸送を提供して低剪断流のバイオリアクター内で細胞生存性を維持する。更に、回収される細胞産生物が濃縮されているので、細胞産生物回収コストが低減される。

実際、多くの場合に実質的に細胞を有さない細胞産生物が達成される。本願発明の原理に従うバイオリアクター装置は＾ＦＰ−２７のような非表面依存細胞を採取するために使用することもできる。これらの細胞は最終的には細胞増殖によってマトリックスから離れ、所望の細胞産生物と一緒に採取する、二とができる。

本発明者の結果によって、実施例６で示されるようにこのバイオリアクター装置の急速な運転開始は、血を斤含有培地から血清不含培地、そして更には多くの場合、タンパク質不含培地への工程変更と同様に可能であることが証明される。「工程変更」は徐々にではなくて即座に変更することを意味する。本願明細書では、工程変更とは専ら血清を含有する培地の除去およびそれに続く血清不含培地による代替を言う。図２０の三角印で示されるように、血清不含培地が徐々にまたは長期の遷移期間ではなくて工程変更の態様でバイオリアクター中に導入された後、細胞は生存１．続ける。三角印２は、血清不含培地が系に導入された時間を示す。血清不含培地への急速な変更はグルコース消費度の減少または他の装置で通常生起する細胞死を生］」させない。血清不含培地の急速な導入が可能になるので、本願発明のバイオリアクター装置は迅速に且つ効率的に調節し操作することかできる。

以下の実施例は、動物細胞およびそれらの遺伝子的に改変された誘導物から如何にして実質的に不溶性の生物共存性マトリックスを作ることができるかを更に十分に示すものである。これらの系で生じた細胞応答も記載する。

実施例　１・　コラーゲンマトリックス中の２９３細胞薄層流がＨＥＰＡフィルターでろ過されたフード中で、２個の】５ｍｌ無菌ねじり蓋管、管Ａおよび管Ｂを準備して使用した。管Ａには修正したダルベツコの修正イーグル培地（Ｄ￥Ｅ）　１．７５　ｍｌを加えた。

この培地は前辺て通常のＩｆｆの２倍になるように調製されており、そしてこれは１０％のウソ胎児血清（ＦＢＳ）　；　　３００μｇ／ｍｌのゼネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、２００　μｇ／ｍｌのヒグロマインンＢ、および２μｇ／ｍ）のビタミンＫを含有していた。得られた培地混合物はろ過滅菌１．た。蒸気滅菌した［１．１ＮのＮａＯＨＯ，１０１ｆを管Ａに加えた。無菌のビトローゲノ１００　（ＶＩＴＲＯＧＥＮ　１００　　）　１．＋ｌ　ｍｌを管Ｂに加えた。両管共密封し氷水浴中に入れて溶液を一般的には４℃以下に冷却１．た。

遺伝子的に操作１−たヒト腎上皮細胞（「２９３細胞」）をこの実施例に使用した。この基本細胞は、メリーランド州ロックビルのＡＴＣＣでの寄託番号ＣＲｆ、　１．５７３で公げに入手可能である５、標準的で良く知られた技術を使用して、これら細胞は天然の抗凝集タンパク質であるタンパク質Ｃを産生ずるように遺伝子的に操作することができる。例えば、　ローレンス　１１　　クロツグ　（Ｌａｗｒｅｎｃｅ　１４（：１ｏｕｓｅ）およびフィー／リプＣコンブ（Ｐｈｉｌｉｐ　Ｃ，Ｃｏｎ＋ｐ）　、止血制御　タンパク質Ｃ系、３］４　（２０）、Ｔｈｅ　Ｎｅｔｙ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＭｅｄｉｃｉｎｅ　１２９８　（１９８６年５月１５日）；Ｐ、Ｃ，コンブおよびり、１（、クロツグ、血漿タンパク質ＣおよびＳ・　２つの天然抗凝集素の機能およびアッセイ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎａｇｅｍｅｒ＋ｔ　２２−３２頁（１９８５年１２月）参照。

２９３細胞は、標準的な組織培養技術に従って５％のＦＢＳ＋　　３００μｇ／ｍｌのゼネチシン；２００μｇ／ｍｌのヒグロマイノンＢ；　および２μｇ／巾１のビタミンに、　ＣｒＤＭＥ十Ａｂ溶液」）を含有するＤＭＥ溶液中７５ｃｍ ”の組織培養フラスコ内で集密するまで増殖させた。

伝えば、Ｒ，イアンフレッシュ：−４（Ｒ，ｆａｎ　Ｆｒｅｓｈｎｅｙ：）　、アランＲ，リス（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ）、動物細胞の培養、Ａ　　Ｍａｎｕａｌ　ｏｒＢａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、（１９８３年）参照。無菌技術を使用１５て、培地をフラスコから取り比し、細胞はりん酸緩衝塩類（ＰＢＳ　）溶液５．０　ｍｌを用いて静かに洗浄して残存する血清を除去した。ＰＢＳ溶液は８　ｇ／ｉ！の塩化ナトリウム、０．２　ｇ／１２の塩化カリウム、２．０ｇ／Ｒのりん酸水素ナトリウムおよび０．４０　ｇ／（！のりん酸二水素カリウムを含有していた。次いで、ＰＢＳ溶液を除去した。

続いて、ＰＢＳ中０．２５％のトリプシン溶液１．Ｏｃｌを加えた。細胞および溶液は３７℃で５分間インキュベージジン（５た。インキュベーション期間後、ＤＭＥ＋Ａｂ溶液はトリプシンを不活性化するために加えた。細胞は表面をはかｊ７、培地を加えて懸濁した。

再び無菌技術を使用して、管Ａの内容物を管Ｂの内容物に加えた。この添加工程の直後に、細胞懸濁液０．９　ｍｌ、　（６，↑５ＸＩＯ’個の細胞総数）を管Ｂに加えた。次いで、管Ｂの内容物を管を数回逆さにして良く混合した。得られた混合物を３４　ｍｍの組織培養皿に注ぎ、３７℃でインキュベーションして実質的に不溶性の細胞−生物共存性マ）・リックスを形成させた。マトリックス収縮量は、ベル（Ｂｅｌｌ）等の、［インビトロでの異なる増殖能のヒト線維芽細胞によるコラーゲン格子収縮による組織様構造の製造」、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓ、：　　Ｌｌ、Ｓ、＾１．７６巻、第３号、１２７４ −１２７８頁（１９７９年３月）に記載された方法を使用して毎日測定した。

細胞を負荷したマトリックスを妨害することなく液体培地３．Ｏｍｌを毎日取り除きそして取り替えノ、；。グルコース濃度は、ミズーリー州セントルイスのシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ＾Ｉｄｒｉｃｈ）コーポレーシヨンから入手可能な診断用シグマグルコースＨＫヘキソキナーゼ酵素アッセイを使用して取り出した培地中で測定した。標準的なエリザ（ＥＬＩＺ＾）アブセイ技術を使用して、タンパク質Ｃの濃度も測定した。

図１３は時間に対するゲル直径を比較することによるマトリックスの縮少速度を示している。　最初に速い速度で収縮した後で、細胞マトリックスの直径は一般に安定している。図１４は、消費された培地に含まれているタンパク質Ｃの濃度を表わしている。図１５のグルコース摂取曲線は、細胞かポリマーマトリックス中に導入された後に細胞が生存し続けたことを証明している。

実施例２：コラ−ゲニン−キトサンマトリックス中の２９３細胞この実験では、実施例１の方法を使用したが、管Ｂにはウルトラピュアキトサン（Ｐｒｏｔｏｎ　Ｌａｂｓ、　　ロット番号ＰＴＬ−１７３）を蒸留水に溶解して調製した２ｚのキトサン水溶液０．５　ｍｌを入れ、１２１℃で３０分間蒸気滅菌し、その後ｐＨ４に調整した。得られた溶液中ではコラーゲン製炭は０．１．　ｍｇ／ｎｌに減少していた。管Ｂ中のこの混合物を使用して、キトサン−コラーゲン−細胞のマトリックスを創った０図１４は、細胞を生物共存性マトリックスに導入したとき、長時間に亘ってタンパク質Ｃが成功裡に産生されたことを示している。図１５で示されるように、細胞はこのマトリックスに捕捉されている間グルコースを消費し続けた。

実施例３；　コラーゲンマトリックス中のチャイニーズハムスター卵巣細胞コラーゲンマトリックス中のチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の細胞増殖および収縮を試験するために実施例】のプロトコールを修正した。この実施例では管Ａは、１０容量％のＦＢＳ、２００単位／ｍｌのペニシリンＧ　；　　２００　μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；　および０．Ｉ　Ｎの水酸化ナトリウム０．０６　ｍｌを含有する、２倍濃度のＤＭＥ　１．０５　ｍｌを有していた。

ＣＨＯ細胞は標準的で周知の技術、例えば、Ｖ、　Ｂ、ヒムズ（ｌｉｍｅｓ）およびＬＳ、ツー（ｎｕ）、種々のイオン交換容量を有する微小担体での哨乳類動物細胞の付着および増殖、上掲、に従って使用するために調製した。次いで、この細胞を５容量％のＦＢＳを有するＤＭＥ溶液に懸濁した。ハムスター細胞懸濁液　（７Ｘ１０’細胞／ｍｌ）　３７．５　ｍ１１を遠心分離した。培地が僅か３　ｗｌになるまで培地を除去し、ハムスター細胞濃度を８．７５Ｘ１０’細胞／ｍｌまで上昇させた。

Ｃ）１０細胞懸濁液（、１，３１Ｘ　１０’個の総細胞）　１．５　ｍｌを、管Ａおよび管Ｂの内容物を混合したものに加えた。次いで、この混合物は実施例１で説明したようにしてベトリ皿に注いだ。しかし乍ら、ベトリ皿はインキユベーシヨンするのではなくて、３７℃の水浴上に浮かべた。この様にして、内容物を急速に温め、細胞が住みつく前にコラーゲンの原線維形成を起こさせた。実質的に不溶性の細胞マトリックスか形成された後、５＄のＦＢＳおよび１００単位／＋ｎｌのペニシリンＧ並びに１００μｇ／１Ｔｈｌのストレプトマイシンを有するＤＭＥ　５．Ｏｍｌを、細胞マトリックスゲルの表面に静かに加えた。１日当たり約７０ｍ１の培地を交換した。

図１３および図１６は、一般に濃厚な細胞−コラーゲンマトリックスが形成されるときの細胞−コラーゲン混合物の急速な収縮を表わしている。図１７のグルコース摂取曲線によって示されるように、ハムスター細胞もまた成功裡に維持された。

実施例４：　コラーゲンマトリックス中のＡＦＰ−２７ハイブリドーマ実施例１の一般的なプロトコールに従って、　コラーゲンマトリックス中のＡＦＰ−２７ハイブリドーマ細胞（ｒＡＦＰ−２７細胞Ｊ）を試験するために以下の修正を行った。ＡＦＰ−２７細胞はアルファ胎児タンパク質に対するＩｇＧ抗体を産生ずる。これらの細胞はミネソタ州ミネアポリスのｖＡ、メディカルセンターのロバートＬ、ベセラ（Ｒｏｂｅｒｔ　ＬＪｅｓｓｅｌｌａ）博士から入手した。

管Ａの溶液には、２０容量％のウマ血清：２００単位／ｌｌ１１のペニシリンｃ；　　２００ｇｇ／ｍｌのストレプトマイシン：　および０．１２　ｍｌの０．１　ＮＮａＯＨを有する２倍濃度のＤＭＥ溶液溶液１デｌっていた。実施例３に記載した細胞濃縮技術を使用して、３０．８　ｒＡｌのＡＦＰ細胞懸濁液（１，００Ｘ１０’細胞／ｍ１）を１．０３Ｘ１０’細胞／ｍｌにまで濃縮した。

管Ａと管Ｂを混合した後、１．５　ｍｌのＡＦＰ細胞懸濁液（１，５４Ｘ］０’ 個の総細胞）を混合物に加えた。全混合物をペトリ皿に注ぎ、実施例３で行ったようにして３７℃の水浴上に浮かべた。　コラーゲンマトリックスが形成された後、１０％のウマ血清、１００単位／ｅｅ１のペニシリンＧおよび１００μｇ／１１のストレプトマイシンを含有するＤＭＥ４ｍｌを皿に加えｆニ。約８．０　ｍｌの培地を毎日交換した。

図１３および図１８は、時間に対する実質的に不溶性の細胞−コラーゲンマトリックスの形成を表わす。　図１３は更に、実施例１．３および４で形成されたマ）・リックスの相対密度を比較している。

実施例３のマトリックスは直径が最も小さいことが見いだされた。

実施例４のマトリックスは直径か最も大きいことが見いだされた。

図】９はこの細胞タイプが、捕捉された細胞による連続的グルコース摂取で証明される細胞生存性を損なうことなく、持続した期間に亘ってこのマトリックス環境で維持され得ることを示している。

実施例　５・　フィブリンマトリックス中の２９３細胞血清不含培地中のフィブリノーゲン溶液は、修正ＤＭＥ／Ｆ１２溶液１５．０＋ｎｌにウソフィブリノーゲン（ミズーリー州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）コーポレーションのカタログ番号Ｆ−４７５３）　０．０７５ｇを加えて調製した。この修正ＤＭＥ／Ｆ１２溶液はＤＭＥ３部とハム（Ｈａｍ）のＦ１２栄養栄養物（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）Ｐ、　Ｎ、　　４３０−１７００）　１部とを混合１．た後、３００ｇｇ／ｍｌのゼネチシン、２００ｇｇ／＋ｎｌのヒグロマイシンＢおよび１部ｇ／ｍｌのビタミンＫ（１部ｇ／＋ｅｌ）を添加して作成した。フィブリノーゲン溶液を１時間混合した後、溶液を傾瀉して不溶のフィブリノーゲンを全て除去した。次いで、溶液をフィルター滅菌した。　トロンビンｌ単位／ｍｌ溶液は、トロンボスタット（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｔａｔ　　）をＰＢＳで連続希釈して調製した。　トロンボスタットは、ニューシャーシー州モリスプレインズのバークデビス（Ｐａｒｋｅ　Ｄａｖｉｓ）　　から市販で入手可能である。

フィブリノーゲン溶液２．０　ｍｌを管Ａに加えた。　トロンビン溶液０．２　ｍｌを管Ｂに加えた。両管は密封し、氷水中で冷却した。

実施例１で使用した細胞懸濁液を使用して、細胞懸濁液０．９＋ｎｌを管Ａに加えた。得られた混合物は、直径３４　ｍｎの組織培養ベトリ板中に注いだ。板には覆いをし、３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、ＤＭＥ／Ｆ１２溶液３．０＋ｎｌをベトリ板に加えた。これらの技術を使用すると、フィブリン−細胞マ）・リックスが直尾良く形成され、大部分の細胞を捕捉していた。

但し、このマトリックスはその後、２９３細胞によって産生されたフィブリン分解酵素によって分解された。　しかし乍ら、フイブ’ｌ　ンｆ；！　ＡＦＰ−２７ハイブリドーマのような、同様な溶血または分解ファクターを産生じない種々の細胞タイプで使用することもやはりできる。

これらの実施例は、生物共存性の、実質的に不溶性のマトリックス中に如何に多様な細胞が導入されそして維持されるかを示している。このマトリックス捕捉技術を使用すると、細胞が細胞産生物を連続的に高濃度で産生ずるのを妨げることなく、所望の細胞産生物を採取することができる。実質的に不溶性のマトリックスはまた、細胞生存性を妨げることなく細胞産生物の長時間の連続的分泌も可能にする。以下の実施例は、本願発明のバイオリアクター装置の平板未実施態様で形成されるマトリックスを使用している。

実施例　６：　コラーゲンで支持されたバイオリアクター装置での２９３細胞前辺て組み立てそして蒸気滅菌した平板床リアクター１００を使用して、更に実施例１から５で一層十分に記載された技術の大部分を再び使用して、以下の実験を実施した。管Ａの内容物には７．２ｍｌの２倍濃度のＤＭＥ溶液、１０容量％のＦＢＳおよび０．ＩＮ　Ｎａ０Ｂ０．４８ｍ１が含まれていた。管Ｂは５．４ｍｌのビトローゲン１００　　を有していた。

２９３細胞は実施例１で論じたようにトリプシン処理した。得られた細胞懸濁液は５．２０Ｘ１０’細胞／ｍｌの濃度を有していた。無菌技術を使用して、管Ａの内容物を管Ｂに加え、良く混合した。

その後直ちに、細胞懸濁液を管Ｂに加えてマトリックスプリカーサーー細胞懸濁液を形成させた。次いで、マトリックスプリカーサーー細胞懸濁液を、第２の液体入り口手段１３２を通して細胞増殖叛意１４４に急速に注入した。

培地容器１５６は、５容量％のＦＢＳ、　　３００　μｇ／ｍｌのゼネチシン、２００ｇｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢおよび１部ｇ／１１１のビタミンＫを含有するＤＭＥ　３００　ｉｔで満たした。培地は容器１５６から汲み上げてバイオリアクター内を通１．た。装置全体は、約３７℃の温度を有する室内に置いた。

試料は、ｐＨ，グルコースおよび細胞産生物濃度を分析するために、第２の液体出口手段１３６と流れで連絡しているｒＴＪバルブを通して細胞増殖敬意１４４から毎日採取した。

細胞は、この装置内で９０日間、　タンパク質を連続１．て産生１．なから成功裡に維持された。

実施例　７：　コラーゲンで支持された中空ファイバーリアクター中の２９３細胞中空ファイバーバイオリアクター装置２００を使用して、更に実施例１から５で記載された技術を再び使用して、以下の実験を実施した。滅菌管Ａに、１０容量％のＦＢＳ、　８００μｇ／１１１１のゼネチンン、４００μｇ／ｍｌのヒグロマインンＢ、　　２μｇ／ｍｌのビタミンＫを含有する２倍濃度のＤＭＥおよび０．４ｍｌの０．Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨからなる溶液？、Ｏｍｌを加えた。管Ｂは７．０　ｍｌのビトロゲン］、ＣＩＯを含有していた。次いで、両管は氷水浴中に入れた。

中空ファイバー組立品２００は５ρの蒸留水でさっと流し、約１２１℃で３０分間蒸気滅菌しながら蒸留水に浸けて滅菌した。容器２１２および他の全てのりアタタ一単位も蒸気滅菌１．た。滅菌後、全組立品を４℃に冷却し、薄層流フード内で無菌的に組み立てた。

２９３細胞は実施例１　で諭したようにして）・リブンン処理し、１゜４７ｘＩＤ”細胞／ｍｌの濃度を何する細胞懸濁液５．２５　ｍｌを生じさせた。無菌技術を使用して、管Ａの内容物を管Ｂに加え、良く混合した。次いで、得られた混合を直ちに２９３細胞懸濁液と一緒にして細胞−マトリックスプリカーサ−混合物を形成させた。この細胞−マトリックスプリカーサ−混合物は第１の液体入り口手段２０２を通して中空ファイバー２１０中に導入した。

容器２１２は５ｚのＦＢＳ、　３００　μｓ／ｍｌのゼネチシン、２００　μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢおよびｌ　μｓ／ｍｌのビタミンＫを含有するＤＭＥ３００　ｎｌで満たした。ヒドロキシエヂルビベラジンエチルスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）　　（８ｇ／ρ）も重炭酸ナトリウムの代わりに培地容器に加えた。培地は、第２の液体入り口手段２０４、毛細管外空間２１６および第２の液体出口手段２０８を通して容器２１２から送り込んだ。小試料を第１の液体入り口手段２０２から毎日採取し、ｐｉｔ。

グルコースおよびタンパク質Ｃ濃度を分析した。Ｉ　Ｎ　Ｎａ０）ｌの小分食を定期的に加えてｐＨを７．Ｌ−７，４の範囲に維持した。この系を使用すると、細胞は５０日間成功裡に維持された。細胞産生物はこの期間中連続して採集した。

本発明の原理の適用を示すために多くの特別の実施態様を示（５、詳細に説明したが、本発明はこのような原理から離れることなく他の態様で実施できることが当該技術分野の熟練者に理解されるであろう。例えば、毛細管外空間の中空ファイバーの長さに沿って移動する、慣用の栄養培地流を使用して中空ファイバー組立品を記載したが、栄養培地が中空ファイバーに対して一般に垂直に流れるような交叉流系も使用することができる。実際、交叉流系は、より多くの捕捉された細胞により高度の酸素輸送をもたらすことができる。

ψ 込へ＠Ｓへ％（ＪＧ’皇家一部特表千３−５０５９６５　（１４）特表千３−５０５９６５　（１５）１１１ｗ１ｌ□Ａ１ｍｐ’１ｍ４ｐＣＴ／ＴＩＳ、口／ｖつ５Ｏａ

Claims

【特許請求の範囲】１．所望の細胞産生物を連続的に産生させるために動物細胞およびそれらの遺伝子的に改変された誘導物をインビトロで持続した期間に亘って維持すも新規バイオリアクター装置であって、該装置は（ａ）近位端および遠位端を有する上記装置を収容する手段；（ｂ）上記収容手段の上記近位端から上記遠位端に延びている上記収容手段内の少なくとも１つの選択的透過性膜、その際該膜は上記収容手段の内部を細胞室と供給および廃物室とに分けており、そして上記膜は栄養素および細胞老廃物の上記両室間の通過を選択的に可能にするが所望の細胞産生物を細胞室内に維持する；（ｃ）上記細胞を捕捉するために上記細胞室で形成される実質的に不溶性で生物共存性のマトリックス手段；および（ｄ）上記細胞を維持する栄養培地を供給しそして消費された栄養培地および細胞老廃物を回収するための上記供給および廃物室と連絡している手段；からなる装置。２．所望の細胞産生物を回収するための上記細胞室と流れで連絡している手段から更になる請求の範囲第１項に記載の装置。３．マトリックスプリカーサー細胞懸濁液を上記細胞室内に導入するための上記細胞室と流れで連絡している手段から更になる請求の範囲第１項に記載の装置。４．第２の供給および廃物室と上記第１並びに第２の供給および廃物室の中間にある上記細胞室とを形成する、上記収容手段の上記近位端から上記遠位端まで延びている第２の選択的透過性膜から更になる請求の範囲第１項に記載の装置。５．上記供給および廃物室並びに上記細胞室が上記収容手段内で交互になるように多数の上記供給および廃物室並びに多数の上記細胞室を形成する、上記収容手段の上記近位端か上記遠位端まで延びている多数の選択的透過性膜から更になる請求の範囲第４塩に記載の装置。６．上記マトリックス手段が上記細胞室内でマトリックスプリカーサー細胞懸濁液によって占有されていた元の容量の一般的に９０％以下にその場所で収縮している請求の範囲第３項に記載の装置。７．上記マトリックス手段が上記細胞室内でマトリックスプリカーサー細胞懸濁液によって占有されていた元の容量の一般的に７５％以下にその場所で収縮している請求の範囲第３項に記載の装置。８．上記マトリックス手段が上記細胞室内でマトリックスプリカーサー細胞懸濁液によって占有されていた元の容量の一般的に５０％以下にその場所で収縮している請求の範囲第３項に記載の装置。９．上記マトリックス手段が上記細胞室内でマトリックスプリカーサー細胞懸濁液によって占有されていた元の容量の一般的に３３％以下にその場所で収縮している請求の範囲第３項に記載の装置。１０．上記膜がセルロース誘導体から構成された膜からなる請求の範囲第１項に記載の装置。１１．上記膜がポリスルホンである請求の範囲第１項に記載の装置。１２．上記マトリックス手段がテレオペプチド天然コラーゲン、アテレオペプチド天然コラーゲンまたはそれらの誘導体からなる請求の範囲第１項に記載の装置。１３．上記マトリックス手段がキトサンまたはその誘導体からなる請求の範囲第１項に記載の装置。１４．上記マトリックス手段がコラーゲン−キトサン混合物から形成される請求の範囲第１項に記載の装置。１５．上記マトリックス手段がフィプリンから形成される請求の範囲第１項に記載の装置。１６．上記マトリックス手段が一般的に２から５．５までの範囲のｐＨ値で培地に可溶性であり、そして一般的に６．８から７．４までのｐＨ値で培地に少なくとも部分的に不溶性であるポリアミンから形成される請求の範囲第１項に記載の装置。１７．上記マトリックス手段がポリアニオンポリマーおよびポリカチオンポリマーの混合物から形成される請求の範囲第１項の装置。１８．上記マトリックス手段が一般的に０℃から３０℃までの範囲の温度で細胞培地に可溶性であり、そして一般的に３２℃から４５℃までの範囲の温度で細胞培地に不溶性であるポリマーから形成される請求の範囲第１項に記載のバイオリアクター装置。１９．所望の細胞産生物を連続的に産生させるために動物細胞およびそれらの遺伝子的に改変された誘導物を持続した期間に亘ってインビトロで維持する方法であって、該方法は（ａ）細胞室内の実質的に不溶性で生物共存性のマトリックス手段内で上記動物細胞を捕捉し：（ｂ）供給および廃物室に通じている入り口手段を通して栄養素を通過させることによって上記細胞に栄養培地を供給し、その際上記供給および廃物室は選択的透過性膜によって上記細胞室から分離されている、そして上記膜を通して上記栄養培地を上記細胞室に灌流し：そして（ｃ）上記透過性膜を通して上記細胞室から上記供給および廃物室に移動している消費された栄養培養地および細胞老廃物を出口手段を通して該供給および廃物室から回収する、工程からなる方法。２０．上記細胞室と流れで連絡している第２の出口を通して上記細胞室から所望の細胞産生物を回収する工程から更になる請求の範囲第１９項に記載の方法。２１．上記マトリックス手段がテレオペプチド天然コラーゲン、アテレオペプチド天然コラーゲンまたはそれらの誘導体からなる請求の範囲第１９項に記載の方法。２２．上記膜が加工したセルロース誘導体である請求の範囲第１９項の方法。２３．上記膜がポリスルホンである請求の範囲第１９項に記載の方法。２４．上記マトリックス手段がコラーゲン−キトサン混合物から形成される請求の範囲第１９項に記載の方法。２５．上記マトリックス手段がフィプリンから形成される請求の範囲第１９項に記載の方法。２６．上記膜がポリスルホンからなる請求の範囲第１９項に記載の方法。２７．上記選択的透過性膜が一般的に１２，０００以下の分子量を有する化合物の通過を可能にする請求の範囲第１９項に記載の方法。２８．上記選択的透過性膜が一般的に３０，０００以下の分子量を有する化合物の通過を可能にする請求の範囲第１９項に記載の方法。２９．上記選択的透過性膜が一般的に１００，０００以下の分子量を有する化合物の通過を可能にする請求の範囲第１９項に記載の方法。３０．細胞−マトリックスプリカーサー懸濁液を上記細胞室に導入する工程から更になる請求の範囲第１９項に記載の方法。３１．上記細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求の範囲第１９項に記載の方法。３２．血清不含培地が上記細胞室に導入され、上記細胞によるグルコース消費度の実質的低下がない請求の範囲第１９項に記載の方法。３３．上記細胞がＡＦＰ−２７ハイプリドーマ細胞である請求の範囲第１９項に記載の方法。３４．上記細胞室内へのタンパク質不含細胞培地の添加によって上記細胞のグルコース消費度を低下させない請求の範囲第１９項に記載の方法。３５．所望の細胞産生物を連続的に産生させるために動物細胞およびそれらの遺伝子的に改変された誘導物を持続した期間に亘ってインビトロで維持するバイオリアクター装置であって、該装置は、（ａ）第１の基板および第２の基板を有する収容器、その際第１の基板は第１および第２の液体入り口手段を有し、そして第２の基板は第１および第２の液体出口手段を有する；（ｂ）実質的に第２の液体入り口手段から第２の液体出口手段までの長さに延びる縦方向窓を有する少なくとも１つの細胞増殖板；（ｃ）実質的に第１の液体入り口手段から第１の液体出口手段までの長さに延びる窓を有する少なくとも１つの栄養培地板；および（ｄ）栄養素および細胞老廃物の通過に対しては透過性であるが上記動物細胞、それらの誘導物および所望の細胞産生物の通過に対しては不透過性である少なくとも１つの選択的に透過し得る生物共存性膜、からなっており、その際基板、増殖板、培地板および膜は一緒に組み立てられて、各増殖板が各栄養培地板と交互になり、膜が各培地板を各増殖板と分離している；これによって各増殖板は隣接膜と一緒になって、第２の液体流入り口手段と第２の液体流出口手段との間で流れで連絡している細胞室を形成し、そしてこれによって各栄養培地板は隣接膜と一緒になって、第１の液体入り口手段と第１の液体出口手段との間で流れで連絡している栄養室を形成するバイオリアクター。３６．各細胞室内の動物細胞が該細胞室内のその場で形成された実質的に不溶で生物共存性のマトリックス手段によって捕捉されている請求の範囲第３５項に記載のバイオリアクター。３７．第１の基板上の第１および第２の液体流人り口多岐管並びに第２の基板上の第１及び第２の液体流出口多岐管から更になる請求の範囲第３５項に記載のバイオリアクター。３８．無菌操作可能な細流バイオリアクターを提供するために基板、培地板および膜が固定具によって一緒に固定されている請求の範囲第３６項に記載のバイオリアクター。３９．選択的透過性膜が、一般的に１２，０００から１４，０００の範囲の分子量までの化合物の通過に対して実質的に透過性のセルロース誘導物である、請求の範囲第３６項に記載のバイオリアクター。４０．上記マトリックス手段がコラーゲン；コラーゲン−キトサン混合物；フィプリン；一般的に２から５．５までの範囲のｐＨ値で細胞培地に可溶性でありそして一般的に６．８から７．４までの範囲のｐＨ値で細胞培地に少なくとも部分的に不溶性のポリアミン；ポリアニオンポリマーとポリカチオンポリマーとの混合物；または一般的に０℃から３０℃までの範囲の温度で細胞培地に可溶性でありそして一般的に３７℃から４５℃までの範囲の温度で細胞培地に少なくとも部分的に不溶性のポリマーから形成される請求の範囲第３６項に記載のバイオリアクター。４１．所望の細胞産生物を連続的に産生させるために動物細胞またはその遺伝子的に改変された誘導物を持続した期間に亘ってインビトロで維持する中空ファイバーバイオリアクター装置であって、該装置は（ａ）間隔の離れた末端部分を有しそしてその間に１つの室を区画している収容手段；（ｂ）栄養素および細胞老廃物の通過に対して実質的に透過性であるが上記動物細胞および所望の細胞産生物の通過に対しては不透過性の少なくとも１つの選択的透過性の中空ファイバー、その際上記室は上記中空ファイバーの壁によって上記中空ファイバー内の毛細管内空間と上記中空ファイバー外の毛細管外空間に分けられており、そして上記毛細管内空間と上記毛細管外空間は上記中空ファイバーの壁だけによってお互いに連絡している；（ｃ）上記細胞を捕捉するために上記毛細管内空間内のその場で形成される実質的に不溶性で生物共存性のマトリックス手段；（ｄ）マトリックスプリカーサーと混合している上記細胞を導入しそして所望の細胞産生物を回収するための上記毛細管内空間と流れで連絡している手段；および（ｅ）上記細胞を維持する栄養培地を導入しそして消費された栄養培地および細胞老廃物を上記毛細管外空間から回収するための上記毛細管外空間と流れで連絡している手段、からなるバイオリアクター装置。４２．多数の選択的透過性の中空ファイバーから更になる請求の範囲第４１項に記載のバイオリアクター装置。４３．上記選択的透過性の中空ファイバーがポリスルホンである請求の範囲第４２項に記載のバイオリアクター装置。４４．上記マトリックスがコラーゲン；コラーゲン−キトサン混合物；フィプリン；一般的に２から５．５までの範囲のｐＨ値で細胞培地に可溶性でありそして一般的に６．８から７．４までの範囲のｐＨ値で細胞培地に少なくとも部分的に不溶性であるポリアミン；ポリアニオンポリマーとポリカチオンポリマーとの混合物；または一般的に０℃から３０℃までの温度で細胞培地に可溶性でそして一般的に３２℃から４５℃までの範囲の温度で細胞培地に少なくとも部分的に不溶性であるポリマーから形成される請求の範囲第４１項に記載のバイオリアクター。４５．マトリックスプリカーサー手段溶液に動物細胞またはそれらの遺伝子的に改変された誘導物を懸濁しそして上記マトリックス手段の形成を開始させる工程からなる、インビトロで上記細胞またはそれらの誘導物を捕捉するための実質的に不溶性で生物共存性のマトリックス手段の形成方法。４６．上記開始工程が細胞−マトリックスプリカーサー手段懸濁液の温度を一般的に３２℃から４５℃の範囲にまで上昇させること係わる請求の範囲第４５項に記載の方法。４７．上記開始工程が細胞−マトリックスプリカーサー懸濁液のｐＨを一般的に６．８から７．４の範囲にまで上昇させることに係わる請求の範囲第４５項に記載の方法。４８．上記開始工程が同時に細胞−マトリックスブリカーサー懸濁液の温度を一般的に３２℃から４５℃の範囲の温度にまで上昇させることに係わる請求の範囲第４７項に記載の方法。４９．所望の細胞産生物を連続的に産生させるために動物細胞およびそれらの遺伝子的に改変された誘導物を持続した期間に亘ってインビトロで維持する中空ファイバーバイオリアクター装置であって、該装置は（ａ）間隔の離れた末端部分を有しそしてその間に室を区画している収容手段；（ｂ）上記室内に存在する第１の選択的透過性膜中空ファイバー、その際第１の中空ファイバーは栄養素および細胞老廃物の通過に対しては実質的に透過性であるが上記動物細胞および少なくとも１つの所望の細胞産生物の通過に対しては不透過性である；（ｃ）上記第１の中空ファイバーと同心円の第２の選択的透過性中空ファイバー、その際上記第２の中空ファイバーは栄養素および上記動物細胞の細胞老廃物の通過に対しては実質的に透過性であるが全ての所望の細胞産生物の通過に対しては不透過性であり、上記室は上記第１のファイバーおよび第２のファイバーによって３つの領域、即ち第１の中空ファイバーの毛細管内空間内の第１の領域、上記第１の中空ファイバーと上記第２の中空ファイバーの中間にある毛細管内空間内の第２の領域並びに上記第２の中空ファイバーと上記収容体との中間にある毛細管外空間内の第３の領域に分けられている；（ｄ）上記細胞を捕捉するための上記第１の領域内で形成される実質的に不溶性で生物共存性のマトリックス手段；（ｅ）マトリックスプリカーサーと混合している上記細胞を導入しそして所望の細胞産生物を回収するための上記第１の領域と流れで連絡している手段；（ｆ）所望の細胞産生物を回収するための上記第２の領域と流れで連絡している手段；および（ｇ）上記細胞を維持する栄養培地を導入しそして消費された栄養培地および細胞老廃物を上記第３の領域から回収するための上記第３の領域と流れで連絡している手段、からなる装置。５０．所望の細胞産生物を連続的に産生させるために動物細胞およびそれらの遺伝子的に改変された誘導物を持続した期間に亘ってインビトロで維持する中空ファイバーバイオリアクター装置であって、該装置は（ａ）間隔の離れた末端部分を有しそしてその間に室を区画している収容手段；（ｂ）上記室内に存在する第１の選択的透過性中空ファイバー、その際上記第１の中空ファイバーは栄養素、細胞老廃物および全ての所望の細胞産生物の通過に対しては実質的に透過性であるが上記動物細胞の通過に対しては不透過性である；（ｃ）上記第１の中空ファイバーと同心円の第２の選択的透過性中空ファイバー、その際上記第２の中空ファイバーは栄養素および上記動物細胞の細胞老廃物の通過に対しては実質的に透過性であるが少なくとも１つの所望の細胞産生物に対しては不透過性である；（ｄ）上記第２の中空ファイバーと同心円の第３の選択的透過性の中空ファイバー、その際上記第３の中空ファイバーは栄養素および細胞老廃物の通過に対しては実質的に透過性であるが少なくとも１つの所望の細胞産生物に対して不透過性であり、上記室は上記第１、第２および第３の中空ファイバーによって４つの領域、即ち上記第１の中空ファイバーの毛細管内空間内の第１の領域、上記第１の中空ファイバーと上記第２の中空ファイバーの中間にある毛細管内空間内の第２の領域、上記第３の中空ファイバーと上記第２の中空ファイバーの中間にある毛細管内空間内の第３の領域並びに上記第３の中空ファイバーと上記収容体の中間にある毛細管外空間内の第４の領域に分けられている；（ｅ）上記細胞を捕捉するための上記第１の領域内で形成される実質的に不溶性で生物共存性のマトリックス手段；（ｆ）マトリックスプリカーサーと混合している上記細胞を導入しそして所望の細胞産生物を回収するための上記の第１の領域と流れで連絡している手段；（ｇ）所望の細胞産生物を回収するための上記第３の領域と流れで連絡している手段；および（ｈ）上記細胞を維持するために栄養培地を導入しそして消費された栄養培地および細胞老廃物を上記第４の領域から回収するための上記第４の領域と流れで連絡している手段、からなるバイオリアクター装置。５１．上記室内の多数の選択的透過性の同心中空ファイバー、該ファイバーの各々は栄養素、細胞老廃物の通過に対しては実質的に透過性でありそして収容器に最も近い同心中空ファイバーは所望の全ての細胞産生物に対しては不透過性である、から更になる請求の範囲第５０項に記載のバイオリアクター装置。５２．所望の細胞産生物を回収するための上記第３の領域と流れで連絡している手段から更になる請求の範囲第５０項に記載のバイオリアクター装置。５３．選択的透過性の中空ファイバーがポリプロピレンである請求の範囲第４９項に記載の中空ファイバーバイオリアクター装置。５４．選択的透過性の中空ファイバーがポリプロピレンである請求の範囲第５１項に記載の中空ファイバーバイオリアクター装置。５５．マトリックス手段がコラーゲン；コラーゲン−キトサン混合物；フィプリン；一般的に２から５．５までの範囲のｐＨ値で細胞培地に可溶性でありそして一般的に６．８から７．４までの範囲のｐＨ値で細胞培地に少なくとも部分的に不溶性であるポリアミン；ポリアニオンポリマーとポリカチオンポリマーとの混合物；または一般的に０℃から３０℃までの温度で細胞培地に可溶性であり、一般的に３２℃から４５℃までの範囲の温度で細胞培地に少なくとも部分的不溶性であるポリマー、から形成される請求の範囲第５１項に記載の中空ファイバーバイオリアクター装置。