JP2002502599A - 増殖され遺伝子的に修飾されたヒト造血幹細胞集団 - Google Patents
増殖され遺伝子的に修飾されたヒト造血幹細胞集団Info
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Abstract
(57)【要約】
ヒト造血幹細胞の遺伝的に修飾され増殖された集団に関する。
【解決手段】本発明は、ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子運搬ビークルをｍｐｌリガンド（特に、トロンボポイエチン）、ｆｌｔ３リガンド及びインターロイキン６（ＩＬ６）の有効量を含む培地中で造血幹細胞を培養することから成る、培養中での造血幹細胞の生存及び／又は増殖を促進させる方法を提供する。更に、ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子運搬ビークルをトロンボポイエチン及びｆｌｔ３リガンドの有効量の存在下で造血幹細胞集団と接触させることから成る、造血幹細胞の修飾方法、並びに、対象における造血能を回復する方法に関する。
Description
【０００１】 発明の背景 血液細胞の生産は、唯１つの細胞型、即ち、造血幹細胞に由来し、該造血幹細
胞は増殖及び分化を経て、全ての造血システムを産生する（生み出す）。造血幹
細胞は自己再生、即ち、それ自身の幹細胞集団の増殖をする能力を有し、更に、
多分化能、即ち、造血システムにおける如何なる細胞にも分化する能力がある。
このような稀な細胞集団から、リンパ球、骨髄性細胞（赤血球、巨大核細胞、顆
粒球及びマクロファージ）を含む全ての成熟した造血システムが形成される。Ｂ
細胞及びＴ細胞を含むリンパ系列により、抗体が生産され、細胞免疫システムが
調節され、血液中の異物 (foreign agents) が検出され、及び、宿主に対して外
来性の細胞が検出されたりする。単球、顆粒球、巨大核細胞、及びその他の細胞
を含む骨髄系列により、外来性生物 (foreign bodies) の存在が監視され、腫瘍
細胞から防御し、及び、外来性物質を捜して処理し、血小板を生産したりする。
赤血球系列により赤血液細胞が生産され、これは酸素運搬体として機能する。成
熟血液細胞の寿命は短いので、それらの生産は成人の一生を通じて連続的に行わ
れる。このような一生に亘る成熟血液細胞の生産は、主に骨髄に存在する多分化
能の造血幹細胞（ＨＳＣ）の小集団の活性に依存している。
胞は増殖及び分化を経て、全ての造血システムを産生する（生み出す）。造血幹
細胞は自己再生、即ち、それ自身の幹細胞集団の増殖をする能力を有し、更に、
多分化能、即ち、造血システムにおける如何なる細胞にも分化する能力がある。
このような稀な細胞集団から、リンパ球、骨髄性細胞（赤血球、巨大核細胞、顆
粒球及びマクロファージ）を含む全ての成熟した造血システムが形成される。Ｂ
細胞及びＴ細胞を含むリンパ系列により、抗体が生産され、細胞免疫システムが
調節され、血液中の異物 (foreign agents) が検出され、及び、宿主に対して外
来性の細胞が検出されたりする。単球、顆粒球、巨大核細胞、及びその他の細胞
を含む骨髄系列により、外来性生物 (foreign bodies) の存在が監視され、腫瘍
細胞から防御し、及び、外来性物質を捜して処理し、血小板を生産したりする。
赤血球系列により赤血液細胞が生産され、これは酸素運搬体として機能する。成
熟血液細胞の寿命は短いので、それらの生産は成人の一生を通じて連続的に行わ
れる。このような一生に亘る成熟血液細胞の生産は、主に骨髄に存在する多分化
能の造血幹細胞（ＨＳＣ）の小集団の活性に依存している。
【０００２】 多分化能ＨＳＣは、病気の治療の理想的な候補、及び、遺伝子治療の理想的な
標的であると考えられる。造血細胞に影響を及ぼす多くの病気があり、遺伝子治
療及び／又は骨髄移植はこれらの病気を治療したり軽減・緩和するのに有効であ
ると思われる。このような病気として、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、慢性
骨髄白血病（ＣＭＬ）、β―サラセミア、及び、鎌状赤血球貧血等を挙げること
が出きる。血液細胞の生活サイクルには限りがある為に、Ｔ細胞のようなより成
熟した造血細胞に遺伝子を導入した場合には、せいぜい一過性の効果を挙げるこ
とが出きるのみである。例えば、ＳＣＩＤ患者を、正常なＡＤＡ遺伝子を患者の
リンパ球に生体外 (ex vivo) で導入し、形質導入されたリンパ球を再び患者に 注入することによって治療した例がある (Biotechnology News (1993) 13:14) 。効果的な治療の為には、ＡＤＡを有するリンパ球を６ヶ月毎に患者に再注入し
なければならなかった。ＡＤＡ遺伝子をＨＳＣに導入すれば、ＡＤＡを有する幹
細胞は骨髄を再集団化（再形成）し、病気を完全に治療することができる為に、
このような治療の繰り返しを避けることが出来るであろう。遺伝子治療において
は、ＨＳＣへ形質導入及び移植することによって、遺伝子的に修飾された造血細
胞が患者の生存期間中、連続的に供給する手段が確保されることから、その試み
がこのＨＳＣに集中して行われている。ＨＳＣは、造血システムが何らかの方法
で失われた場合に血液細胞の数を回復する為の最終的な役割を担っている。
標的であると考えられる。造血細胞に影響を及ぼす多くの病気があり、遺伝子治
療及び／又は骨髄移植はこれらの病気を治療したり軽減・緩和するのに有効であ
ると思われる。このような病気として、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、慢性
骨髄白血病（ＣＭＬ）、β―サラセミア、及び、鎌状赤血球貧血等を挙げること
が出きる。血液細胞の生活サイクルには限りがある為に、Ｔ細胞のようなより成
熟した造血細胞に遺伝子を導入した場合には、せいぜい一過性の効果を挙げるこ
とが出きるのみである。例えば、ＳＣＩＤ患者を、正常なＡＤＡ遺伝子を患者の
リンパ球に生体外 (ex vivo) で導入し、形質導入されたリンパ球を再び患者に 注入することによって治療した例がある (Biotechnology News (1993) 13:14) 。効果的な治療の為には、ＡＤＡを有するリンパ球を６ヶ月毎に患者に再注入し
なければならなかった。ＡＤＡ遺伝子をＨＳＣに導入すれば、ＡＤＡを有する幹
細胞は骨髄を再集団化（再形成）し、病気を完全に治療することができる為に、
このような治療の繰り返しを避けることが出来るであろう。遺伝子治療において
は、ＨＳＣへ形質導入及び移植することによって、遺伝子的に修飾された造血細
胞が患者の生存期間中、連続的に供給する手段が確保されることから、その試み
がこのＨＳＣに集中して行われている。ＨＳＣは、造血システムが何らかの方法
で失われた場合に血液細胞の数を回復する為の最終的な役割を担っている。
【０００３】 しかしながら、多分化能を維持してＨＳＣを長期間生体外で培養することは困
難であることが示されている。更に、遺伝子導入が成功するには、生体外で培養
される幹細胞が有糸分裂を経る必要がある (Hajihosseini et al., (1993) EMBO
12:4969; Lewis & Emennan (1994) J. Virol., 68:510) 。新たに分離されたＨ
ＳＣの大部分は静止状態にあると考えられている為 (Ogawa (1993) Blood 81:28
44) 、遺伝子操作されたＨＳＣを用いて充分な臨床的治療を達成するには、分化
した結果、多系列への多分化能を喪失することなく、ＨＳＣ分裂を刺激するよう
な適当な生体外条件を提供することが必要である。ストロマはこのような条件を
提供する為に必要であると思われているが、臨床的な遺伝子治療にストロマ培養
を使用することは技術的に困難であるために、ストロマなしでヒトＨＳＣの生体
外での複製及び維持を刺激するような適当な培養条件は未だ明確に定義されてい
ない。
難であることが示されている。更に、遺伝子導入が成功するには、生体外で培養
される幹細胞が有糸分裂を経る必要がある (Hajihosseini et al., (1993) EMBO
12:4969; Lewis & Emennan (1994) J. Virol., 68:510) 。新たに分離されたＨ
ＳＣの大部分は静止状態にあると考えられている為 (Ogawa (1993) Blood 81:28
44) 、遺伝子操作されたＨＳＣを用いて充分な臨床的治療を達成するには、分化
した結果、多系列への多分化能を喪失することなく、ＨＳＣ分裂を刺激するよう
な適当な生体外条件を提供することが必要である。ストロマはこのような条件を
提供する為に必要であると思われているが、臨床的な遺伝子治療にストロマ培養
を使用することは技術的に困難であるために、ストロマなしでヒトＨＳＣの生体
外での複製及び維持を刺激するような適当な培養条件は未だ明確に定義されてい
ない。
【０００４】 ストロマなしでのＨＳＣのレトロウイルスによる遺伝子導入の試みとして、Ｉ
Ｌ−３及びＩＬ−６をＫＬ（ｋｉｔリガンド）又はＬＩＦ（白血病阻害因子）と
組み合わせてストロマなしの培養に添加することが行われた (Nolta et al. (19
95) Blood 86:101; Junker et al. (1997) Blood 89:4229) 。これらの培養ＨＳ
Ｃ細胞への遺伝子導入効率は依然として低いものであった。更に、ＨＳＣを生体
外でＩＬ−３と培養すると始原又は初代 (primitive) ＨＳＣの機能を維持する ことに悪影響を及ぼす可能性があることが、致死量の放射線照射を受けたマウス
での再ＨＳＣ構成能力が低下することで示された (Knobel et al. (1994) Exp.
Hematol. 22:1227; Yonemura et al. (1996) PNAS USA 93:4040) 。
Ｌ−３及びＩＬ−６をＫＬ（ｋｉｔリガンド）又はＬＩＦ（白血病阻害因子）と
組み合わせてストロマなしの培養に添加することが行われた (Nolta et al. (19
95) Blood 86:101; Junker et al. (1997) Blood 89:4229) 。これらの培養ＨＳ
Ｃ細胞への遺伝子導入効率は依然として低いものであった。更に、ＨＳＣを生体
外でＩＬ−３と培養すると始原又は初代 (primitive) ＨＳＣの機能を維持する ことに悪影響を及ぼす可能性があることが、致死量の放射線照射を受けたマウス
での再ＨＳＣ構成能力が低下することで示された (Knobel et al. (1994) Exp.
Hematol. 22:1227; Yonemura et al. (1996) PNAS USA 93:4040) 。
【０００５】 培養がＩＬ−３で誘発された場合には、ヒト造血細胞におけるレトロウイルス
介在による遺伝子発現と増殖因子による刺激とは逆の相関があった。更に、ＩＬ
−３にはＢリンパ球能を失わせる可能性があり、早期骨髄造血の正の調節因子で
ある (Hirayama et al. (1994) PNAS USA 91:469) 。更に、ＩＬ−３の存在下で
３−６日間培養すると、初代ヒトＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ローダミン (Rhl23)lo 細 胞の分裂を誘発するのみならず、分化も誘発（ＣＤ３４発現の喪失）した (Murr
ay et al. (1995) Blood 86 (Suppl. 1):256a:1009; Young et al. (1996) Bloo
d 88:1619) 。このように、ＩＬ−３を培養に添加するとＨＳＣの長期間に亘る 再構成能力が失われることに関する証拠が現在では多く存在する (Knobel et al
. 上記、Yonemura et al. (1996) 上記、Yonemura et al. (1997) Blood 89:191
5; Dao et al. (1997) Blood 89:446) 。
介在による遺伝子発現と増殖因子による刺激とは逆の相関があった。更に、ＩＬ
−３にはＢリンパ球能を失わせる可能性があり、早期骨髄造血の正の調節因子で
ある (Hirayama et al. (1994) PNAS USA 91:469) 。更に、ＩＬ−３の存在下で
３−６日間培養すると、初代ヒトＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ローダミン (Rhl23)lo 細 胞の分裂を誘発するのみならず、分化も誘発（ＣＤ３４発現の喪失）した (Murr
ay et al. (1995) Blood 86 (Suppl. 1):256a:1009; Young et al. (1996) Bloo
d 88:1619) 。このように、ＩＬ−３を培養に添加するとＨＳＣの長期間に亘る 再構成能力が失われることに関する証拠が現在では多く存在する (Knobel et al
. 上記、Yonemura et al. (1996) 上記、Yonemura et al. (1997) Blood 89:191
5; Dao et al. (1997) Blood 89:446) 。
【０００６】 精製された骨髄幹／前駆細胞を、ＩＬ−３，ＩＬ−１α，ｂＦＧＦ，ＧＭ−Ｃ
ＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，ＣＳＦ−１及びＳ１因子から成るサイトカインカクテルに応
答させて、インビトロでＧ０／Ｇ１期からＳ期へ同調的に進ませることができた
(Reddy et al. (1995) Exp. Hematol. 23:813) 。ＩＬ−３，ＩＬ−６，ＩＬ−
１１，ＳＣＦから成るサイトカインカクテルを用いてインビトロで骨髄性細胞を
４８時間培養してマウス造血前駆細胞を増殖させた (Peters et al. (1995) Exp
. Hematol. 23:461) 。トロンボポイエチン（ＴＰＯ）を含むその他のサイトカ インカクテルについても報告されている (Kaushansky et al. (1996) Exp. Hema
tol. 24:265-9; Ramsfjell et al. (1997) J. Immunol. 158:5169-77) 。しかし
ながら、幾つかの場合には、これらのサイトカインカクテルによる処理によって
細胞の分化が引き起こされ、その結果、多分化能が失われる。
ＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，ＣＳＦ−１及びＳ１因子から成るサイトカインカクテルに応
答させて、インビトロでＧ０／Ｇ１期からＳ期へ同調的に進ませることができた
(Reddy et al. (1995) Exp. Hematol. 23:813) 。ＩＬ−３，ＩＬ−６，ＩＬ−
１１，ＳＣＦから成るサイトカインカクテルを用いてインビトロで骨髄性細胞を
４８時間培養してマウス造血前駆細胞を増殖させた (Peters et al. (1995) Exp
. Hematol. 23:461) 。トロンボポイエチン（ＴＰＯ）を含むその他のサイトカ インカクテルについても報告されている (Kaushansky et al. (1996) Exp. Hema
tol. 24:265-9; Ramsfjell et al. (1997) J. Immunol. 158:5169-77) 。しかし
ながら、幾つかの場合には、これらのサイトカインカクテルによる処理によって
細胞の分化が引き起こされ、その結果、多分化能が失われる。
【０００７】 もう１つの試みとして、マウス骨髄性細胞をイソロイシン無添加培地で培養す
ることによってＧ０／Ｇ１期に捕捉した (Reddy et al. (1995) Exp. Hematol.
23:813) 。サイトカインを含有する培地で単離したマウス骨髄性細胞を４８時間
前刺激して、その後、更に４８時間、同じサイトカイン含有培地でレトロウイル
ス生産細胞系と共培養し、その後、細胞を宿主マウスに注入した (Kittler et a
l. (1994) Blood 84:344A) 。しかしながら、Kittlerのレジュメでは骨髄におけ
る生着レベルが低く、骨髄又は末梢血液におけるレトロウイルス形質導入細胞を
得ることが出来なかった。
ることによってＧ０／Ｇ１期に捕捉した (Reddy et al. (1995) Exp. Hematol.
23:813) 。サイトカインを含有する培地で単離したマウス骨髄性細胞を４８時間
前刺激して、その後、更に４８時間、同じサイトカイン含有培地でレトロウイル
ス生産細胞系と共培養し、その後、細胞を宿主マウスに注入した (Kittler et a
l. (1994) Blood 84:344A) 。しかしながら、Kittlerのレジュメでは骨髄におけ
る生着レベルが低く、骨髄又は末梢血液におけるレトロウイルス形質導入細胞を
得ることが出来なかった。
【０００８】 造血幹細胞治療の長期間に亘る効果を得るために、幹細胞の多分化能を維持す
る、効率的な生体外での非ストロマ培養システムが必要とされている。多分化能
を喪失することなく、誘発、活性化又はＨＳＣサイクルをもたらすような生体外
培養を達成することが望まれている。更に、この方法では、治療を受ける各個人
に対する毒性が最小であるような生体内（インビボ）使用に適した細胞を得るこ
とが必要である。本発明は、以上の要求を満たし、同時に、それらに関連した利
点を提供するものである。
る、効率的な生体外での非ストロマ培養システムが必要とされている。多分化能
を喪失することなく、誘発、活性化又はＨＳＣサイクルをもたらすような生体外
培養を達成することが望まれている。更に、この方法では、治療を受ける各個人
に対する毒性が最小であるような生体内（インビボ）使用に適した細胞を得るこ
とが必要である。本発明は、以上の要求を満たし、同時に、それらに関連した利
点を提供するものである。
【０００９】 発明の開示 本発明の一態様において、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）のようなｍｐｌリガ
ンド、ｆｌｔ３リガンド、及びインターロイキン６（ＩＬ−６）の有効量の存在
下で細胞を培養することから成る、該培養中の造血幹細胞の増殖を促進させる方
法を提供する。他のサイトカインを単独又は組み合わせて培養に追加することも
可能であり、好ましくは、これらの他のサイトカインはインターロイキン３（Ｉ
Ｌ−３）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、及び／又はｃ−ｋｉｔリガンドの有効量
である。一具体例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，及びＬＩＦ
である。別の具体例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，及びＩＬ
３である。更に、一例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，ＬＩＦ
及びＩＬ３である。更に、一例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６
，及びｃ−ｋｉｔリガンドである。更に、一例として、サイトカインは、ＴＰＯ
，ＦＬ，ＩＬ６，ＬＩＦ，ＩＬ３及びｃ−ｋｉｔリガンドである。更に、一例と
して、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，ＬＩＦ，及びｃ−ｋｉｔリガン
ドである。
ンド、ｆｌｔ３リガンド、及びインターロイキン６（ＩＬ−６）の有効量の存在
下で細胞を培養することから成る、該培養中の造血幹細胞の増殖を促進させる方
法を提供する。他のサイトカインを単独又は組み合わせて培養に追加することも
可能であり、好ましくは、これらの他のサイトカインはインターロイキン３（Ｉ
Ｌ−３）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、及び／又はｃ−ｋｉｔリガンドの有効量
である。一具体例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，及びＬＩＦ
である。別の具体例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，及びＩＬ
３である。更に、一例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，ＬＩＦ
及びＩＬ３である。更に、一例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６
，及びｃ−ｋｉｔリガンドである。更に、一例として、サイトカインは、ＴＰＯ
，ＦＬ，ＩＬ６，ＬＩＦ，ＩＬ３及びｃ−ｋｉｔリガンドである。更に、一例と
して、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，ＬＩＦ，及びｃ−ｋｉｔリガン
ドである。
【００１０】 本発明の培養方法によって、自己再生 (self-renewal) する能力及び全ての造
血細胞系列を発生（産生）させる能力によって特徴付けられる造血幹細胞の集団
が生じる。本発明の一態様において、造血幹細胞はヒト造血幹細胞であり、好ま
しくは、ＣＤ３４＋であり、より好ましくはＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋であり、更
により好ましくは、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−である。
血細胞系列を発生（産生）させる能力によって特徴付けられる造血幹細胞の集団
が生じる。本発明の一態様において、造血幹細胞はヒト造血幹細胞であり、好ま
しくは、ＣＤ３４＋であり、より好ましくはＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋であり、更
により好ましくは、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−である。
【００１１】 本発明の別の態様として、（ａ）ＴＰＯのようなｍｐｌリガンド、ｆｌｔ３リ
ガンド、及びインターロイキン６（ＩＬ−６）の存在下、造血幹細胞集団の増殖
に好適な条件で造血幹細胞を含む集団を培養し、（ｂ）対象に、有効量の上記増
殖させた集団を投与することから成る、該対象における造血能（力）の回復方法
を提供する。他のサイトカインを単独又は組み合わせて培養に追加することも可
能であり、好ましくは、これらの他のサイトカインはインターロイキン３（ＩＬ
−３）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、及び／又はｃ−ｋｉｔリガンドの有効量で
ある。一具体例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，及びＬＩＦで
ある。別の具体例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，及びＩＬ３
である。更に、一例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，ＬＩＦ及
びＩＬ３である。更に、一例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，
及びｃ−ｋｉｔリガンドである。更に、一例として、サイトカインは、ＴＰＯ，
ＦＬ，ＩＬ６，ＬＩＦ，及びｃ−ｋｉｔリガンドである。更に、一例として、サ
イトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，ＩＬ３，及びｃ−ｋｉｔリガンド，又は
、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，ＬＩＦ，ＩＬ３，及びｃ−ｋｉｔリガンドである。本
発明の一態様において、造血幹細胞はヒト造血幹細胞であり、好ましくは、ＣＤ
３４＋であり、より好ましくはＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋であり、更により好まし
くは、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−である。一態様において、サイトカイン
で培養され対象に投与される造血幹細胞は同種 (allogeneic) である。別の態様
では、該造血幹細胞は自家 (autologous) である。
ガンド、及びインターロイキン６（ＩＬ−６）の存在下、造血幹細胞集団の増殖
に好適な条件で造血幹細胞を含む集団を培養し、（ｂ）対象に、有効量の上記増
殖させた集団を投与することから成る、該対象における造血能（力）の回復方法
を提供する。他のサイトカインを単独又は組み合わせて培養に追加することも可
能であり、好ましくは、これらの他のサイトカインはインターロイキン３（ＩＬ
−３）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、及び／又はｃ−ｋｉｔリガンドの有効量で
ある。一具体例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，及びＬＩＦで
ある。別の具体例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，及びＩＬ３
である。更に、一例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，ＬＩＦ及
びＩＬ３である。更に、一例として、サイトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，
及びｃ−ｋｉｔリガンドである。更に、一例として、サイトカインは、ＴＰＯ，
ＦＬ，ＩＬ６，ＬＩＦ，及びｃ−ｋｉｔリガンドである。更に、一例として、サ
イトカインは、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，ＩＬ３，及びｃ−ｋｉｔリガンド，又は
、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，ＬＩＦ，ＩＬ３，及びｃ−ｋｉｔリガンドである。本
発明の一態様において、造血幹細胞はヒト造血幹細胞であり、好ましくは、ＣＤ
３４＋であり、より好ましくはＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋であり、更により好まし
くは、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−である。一態様において、サイトカイン
で培養され対象に投与される造血幹細胞は同種 (allogeneic) である。別の態様
では、該造血幹細胞は自家 (autologous) である。
【００１２】 本発明の別の態様として、ポリヌクレオチド配列を有する遺伝子運搬ビークル
を、ｍｐｌリガンド、及びｆｌｔ３リガンドの有効量の存在下で培養した造血幹
細胞集団と接触させることから成る、造血幹細胞の修飾方法を提供する。他の分
子を単独又は組み合わせて培養に追加することも可能であり、好ましくは、これ
らの他の分子はｃ−ｋｉｔリガンド，インターロイキン６（ＩＬ−６）、インタ
ーロイキン３（ＩＬ−３）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、及び／又はフィブロネ
クチンである。第一具体例として、これら分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，及びｃ−ｋｉ
ｔリガンドである。第二具体例として、これら分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，及びＩＬ
−６である。第三具体例として、これら分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ−６及びＬ
ＩＦである。第四具体例として、これら分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ−６，ＬＩ
Ｆ及びＩＬ３である。第五具体例として、これら分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ−
６，ＩＬ３及びｃ−ｋｉｔリガンドである。第六具体例として、これら分子は、
ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ−６，ＩＬ３，ｃ−ｋｉｔリガンド及びＬＩＦである。更に
具体例として、分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ−６及びフィブロネクチン（RetroN
ectinTM）である。別の具体例として、分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ−６，ＬＩ Ｆ，及びフィブロネクチン（RetroNectinTM）である。更に別の具体例では、分 子はＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，ＩＬ３，及びフィブロネクチン（RetroNectinTM） であり、更にＬＩＦは加えても加えなくてもよい。これらの如何なる培養条件に
おいても、ポリヌクレオチド配列は、ペプチド、リボザイム及びアンチセンス配
列から成る群から選択される産物をコードしており、遺伝子運搬ビークルは、レ
トロウイルスベクター、ＤＮＡベクター、及びリポソーム運搬ビークルから成る
群から選択される。
を、ｍｐｌリガンド、及びｆｌｔ３リガンドの有効量の存在下で培養した造血幹
細胞集団と接触させることから成る、造血幹細胞の修飾方法を提供する。他の分
子を単独又は組み合わせて培養に追加することも可能であり、好ましくは、これ
らの他の分子はｃ−ｋｉｔリガンド，インターロイキン６（ＩＬ−６）、インタ
ーロイキン３（ＩＬ−３）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、及び／又はフィブロネ
クチンである。第一具体例として、これら分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，及びｃ−ｋｉ
ｔリガンドである。第二具体例として、これら分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，及びＩＬ
−６である。第三具体例として、これら分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ−６及びＬ
ＩＦである。第四具体例として、これら分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ−６，ＬＩ
Ｆ及びＩＬ３である。第五具体例として、これら分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ−
６，ＩＬ３及びｃ−ｋｉｔリガンドである。第六具体例として、これら分子は、
ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ−６，ＩＬ３，ｃ−ｋｉｔリガンド及びＬＩＦである。更に
具体例として、分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ−６及びフィブロネクチン（RetroN
ectinTM）である。別の具体例として、分子は、ＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ−６，ＬＩ Ｆ，及びフィブロネクチン（RetroNectinTM）である。更に別の具体例では、分 子はＴＰＯ，ＦＬ，ＩＬ６，ＩＬ３，及びフィブロネクチン（RetroNectinTM） であり、更にＬＩＦは加えても加えなくてもよい。これらの如何なる培養条件に
おいても、ポリヌクレオチド配列は、ペプチド、リボザイム及びアンチセンス配
列から成る群から選択される産物をコードしており、遺伝子運搬ビークルは、レ
トロウイルスベクター、ＤＮＡベクター、及びリポソーム運搬ビークルから成る
群から選択される。
【００１３】 発明の実施の態様 様々な刊行物、特許及び公開特許明細書が引用される。これらの開示内容は、
本発明が関連する技術分野の技術水準をより完全に記載する為に、引用されるこ
とで本明細書の開示内容に取り込まれるものである。
本発明が関連する技術分野の技術水準をより完全に記載する為に、引用されるこ
とで本明細書の開示内容に取り込まれるものである。
【００１４】 本発明の実施に際しては、特に他に指示のない限り、当該技術分野に含まれる
、分子生物学、微生物学、細胞生物学、及び組換えＤＮＡの従来技術を使用する
。例えば、Sambrook, Fritsch, Mmaniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY
MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, (F.M
. Ausubel et al. Eds., 1987); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic
Press, Inc.); PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. McPherson, B.D. Hames a
nd G.R. Taylor eds., 1995); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney. Ed., 198
7); ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow et al., eds., 1987)を参照さ れたし。
、分子生物学、微生物学、細胞生物学、及び組換えＤＮＡの従来技術を使用する
。例えば、Sambrook, Fritsch, Mmaniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY
MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, (F.M
. Ausubel et al. Eds., 1987); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic
Press, Inc.); PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. McPherson, B.D. Hames a
nd G.R. Taylor eds., 1995); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney. Ed., 198
7); ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow et al., eds., 1987)を参照さ れたし。
【００１５】 本明細書中における幾つかの用語は以下に定義された意味を有する。 「造血幹細胞」とは、動物、特に哺乳類、好ましくは、ヒトの造血幹細胞を意
味し、その他の細胞型の幹細胞を意味しない。「幹細胞」とは、インビボにおけ
る全ての長期間の生着能力を有する造血細胞集団も意味する。ヒト造血幹細胞集
団候補の長期間の生着能力に対する動物モデルには、ＳＣＩＤ−ｈｕ骨モデル (
Kyoizumi et al. (1992) Blood 79:1704; Murray et al. (1995) Bllod 85(2) 3
68-378) 及びインウテロ (in utero) ヒツジモデル (Zanjani et al. (1992) J.
Clin. Invest. 89:1179) がある。ヒト造血の動物モデルに関しては、Srour et
al. (1992) J. Hematother. 1:143-153 、及びそこに引用されている文献を参 照されたし。現在のところ、幹細胞の最も優れたインビトロアッセイは、５−８
週間のストロマとの共培養後に生産されるクローン生産性細胞数の限界希釈分析
に基づく、長期培養開始細胞(long-term culture-initiating cell: LTCIC) ア ッセイ(Sutherland et al. (1990) Proc. Nat'l Aca. Sci. 87:3584-3588) であ
る。LTCICアッセイはコブルストーン領域形成細胞 (cobblestone area forming
cell: CAFC) アッセイ、及びインビボでの長期間生着能力のような、その他の通
常使用されている幹細胞アッセイと相関することが示されている (Breems et al
. (1994) Leukemia 8:1095) 。幹細胞集団が非常に高く濃縮 又は濃厚(enrichme
nt) にされた例としては、米国特許明細書第5,061,620号に記載されているＣＤ ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−表現型である。この表現型集団は典型的には約１／
２０の平均ＣＡＦＣ頻度を示す(Murray et al. (1995) 上記; Lansdorp e al. (
1993) J. Exp. Med. 177:1331) 。如何なる細胞集団における濃縮も、採用され る選択基準及び所与の選択技術によって達成される純度に依存することは当業者
には自明である。
味し、その他の細胞型の幹細胞を意味しない。「幹細胞」とは、インビボにおけ
る全ての長期間の生着能力を有する造血細胞集団も意味する。ヒト造血幹細胞集
団候補の長期間の生着能力に対する動物モデルには、ＳＣＩＤ−ｈｕ骨モデル (
Kyoizumi et al. (1992) Blood 79:1704; Murray et al. (1995) Bllod 85(2) 3
68-378) 及びインウテロ (in utero) ヒツジモデル (Zanjani et al. (1992) J.
Clin. Invest. 89:1179) がある。ヒト造血の動物モデルに関しては、Srour et
al. (1992) J. Hematother. 1:143-153 、及びそこに引用されている文献を参 照されたし。現在のところ、幹細胞の最も優れたインビトロアッセイは、５−８
週間のストロマとの共培養後に生産されるクローン生産性細胞数の限界希釈分析
に基づく、長期培養開始細胞(long-term culture-initiating cell: LTCIC) ア ッセイ(Sutherland et al. (1990) Proc. Nat'l Aca. Sci. 87:3584-3588) であ
る。LTCICアッセイはコブルストーン領域形成細胞 (cobblestone area forming
cell: CAFC) アッセイ、及びインビボでの長期間生着能力のような、その他の通
常使用されている幹細胞アッセイと相関することが示されている (Breems et al
. (1994) Leukemia 8:1095) 。幹細胞集団が非常に高く濃縮 又は濃厚(enrichme
nt) にされた例としては、米国特許明細書第5,061,620号に記載されているＣＤ ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−表現型である。この表現型集団は典型的には約１／
２０の平均ＣＡＦＣ頻度を示す(Murray et al. (1995) 上記; Lansdorp e al. (
1993) J. Exp. Med. 177:1331) 。如何なる細胞集団における濃縮も、採用され る選択基準及び所与の選択技術によって達成される純度に依存することは当業者
には自明である。
【００１６】 本明細書中で、「増殖」という用語は、培養開始に使用された多分化能幹細胞
から前駆細胞の数が増大することを認めるものである。「生存」という用語は、
生存状態又は活性化状態を維持し続ける能力を意味する。細胞培養を開始する為
に使用される造血幹細胞は、成人又は胎児の骨髄、サイトカイン又は化学剤によ
り可動化された末梢血、胎児の肝臓又は臍帯血を含む如何なる原料に由来するも
のでも良い。 一般的に、培養に先だって、培養開始（接種）集団を腫瘍細胞から分離するこ
とが望ましい。幹細胞の腫瘍細胞からの選択は、セルソーター、磁気ビーズ、充
填カラム等の如何なる方法でも可能である。ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋ＣＤ１４− ＣＤ１５−表現型を複数のミエローマ患者から分離することによって、腫瘍障壁
を精製細胞１０５個当り１個未満の腫瘍細胞にまで減少することができた。 本明細書において、「ｆｌｔ３リガンド」及び「mplリガンド」は夫々、ｆｌ ｔ３及びｍｐｌ受容体に充分な特異性で結合し、ｆｌｔ３又はＴＰＯ介在生物活
性を引き出すことの出来る化合物を含む。
から前駆細胞の数が増大することを認めるものである。「生存」という用語は、
生存状態又は活性化状態を維持し続ける能力を意味する。細胞培養を開始する為
に使用される造血幹細胞は、成人又は胎児の骨髄、サイトカイン又は化学剤によ
り可動化された末梢血、胎児の肝臓又は臍帯血を含む如何なる原料に由来するも
のでも良い。 一般的に、培養に先だって、培養開始（接種）集団を腫瘍細胞から分離するこ
とが望ましい。幹細胞の腫瘍細胞からの選択は、セルソーター、磁気ビーズ、充
填カラム等の如何なる方法でも可能である。ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋ＣＤ１４− ＣＤ１５−表現型を複数のミエローマ患者から分離することによって、腫瘍障壁
を精製細胞１０５個当り１個未満の腫瘍細胞にまで減少することができた。 本明細書において、「ｆｌｔ３リガンド」及び「mplリガンド」は夫々、ｆｌ ｔ３及びｍｐｌ受容体に充分な特異性で結合し、ｆｌｔ３又はＴＰＯ介在生物活
性を引き出すことの出来る化合物を含む。
【００１７】 本明細書において、「サイトカイン」という用語は、例えば、増殖のような、
細胞に対して様々な影響を与える数多くの因子のうちの任意の一つを意味する。
本発明の実施において単独又は組み合わせで使用されるサイトカインの非限定的
な例としては、インターロイキン２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、イン
ターロイキン３（ＩＬ−３）、可溶性インターロイキン６を含むインターロイキ
ン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球
―マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン１α（
ＩＬ−１α）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１α、白血病阻
害因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、及び
ｆｌｔ３リガンドを挙げることが出来る。本発明は又、一つ又はそれ以上のサイ
トカインが培地から特異的に排除された培養条件を含むものである。サイトカイ
ンは、例えば、アムジェン(Thousand Oaks, CA) 、Ｒ＆Ｄシステムズ、及びイム
ネックス (Seattle, WA) 等の幾つかの販売者から市販されている。本明細書中 で常に明記される訳ではないが、野生型又は精製されたサイトカインと類似の生
物学的活性を有する分子（例えば，組換えによって生産されたもの）も、本発明
の技術的思想及び範囲内で使用することが意図されている。
細胞に対して様々な影響を与える数多くの因子のうちの任意の一つを意味する。
本発明の実施において単独又は組み合わせで使用されるサイトカインの非限定的
な例としては、インターロイキン２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、イン
ターロイキン３（ＩＬ−３）、可溶性インターロイキン６を含むインターロイキ
ン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球
―マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン１α（
ＩＬ−１α）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１α、白血病阻
害因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、及び
ｆｌｔ３リガンドを挙げることが出来る。本発明は又、一つ又はそれ以上のサイ
トカインが培地から特異的に排除された培養条件を含むものである。サイトカイ
ンは、例えば、アムジェン(Thousand Oaks, CA) 、Ｒ＆Ｄシステムズ、及びイム
ネックス (Seattle, WA) 等の幾つかの販売者から市販されている。本明細書中 で常に明記される訳ではないが、野生型又は精製されたサイトカインと類似の生
物学的活性を有する分子（例えば，組換えによって生産されたもの）も、本発明
の技術的思想及び範囲内で使用することが意図されている。
【００１８】 「ｍｐｌ（骨髄増殖性白血病）リガンド」、「ｆｌｔ３（ＦＬ）リガンド」及
び「ｃ−ｋｉｔ（ＫＬ）リガンド」は、夫々、ｍｐｌ，ｆｌｔ３（ＦＬ）及びｃ
−ｋｉｔ（ＫＬ，幹細胞因子（Ｓｔｌ），又はマスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）と
も呼ばれる）受容体に結合し、これらの野生型受容体への結合に関連する一つ又
はそれ以上の生物学的活性を引き起こすような化合物を意味する。生物学的活性
とは、（１）自己再生能力及び全ての造血細胞系列を発生させる能力を維持する
ように、培養における幹細胞の生存を促進させること、（２）自己再生能力及び
全ての造血細胞系列を発生させる能力を維持するように、幹細胞集団を増殖させ
ること、及び、（３）幹細胞が活性化され分裂し、その結果得られる細胞が自己
再生能力及び全ての造血細胞系列を発生させる能力を維持するように、静止状態
の幹細胞を活性化すること、を含む。
び「ｃ−ｋｉｔ（ＫＬ）リガンド」は、夫々、ｍｐｌ，ｆｌｔ３（ＦＬ）及びｃ
−ｋｉｔ（ＫＬ，幹細胞因子（Ｓｔｌ），又はマスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）と
も呼ばれる）受容体に結合し、これらの野生型受容体への結合に関連する一つ又
はそれ以上の生物学的活性を引き起こすような化合物を意味する。生物学的活性
とは、（１）自己再生能力及び全ての造血細胞系列を発生させる能力を維持する
ように、培養における幹細胞の生存を促進させること、（２）自己再生能力及び
全ての造血細胞系列を発生させる能力を維持するように、幹細胞集団を増殖させ
ること、及び、（３）幹細胞が活性化され分裂し、その結果得られる細胞が自己
再生能力及び全ての造血細胞系列を発生させる能力を維持するように、静止状態
の幹細胞を活性化すること、を含む。
【００１９】 更に、「ｍｐｌリガンド」、「ｆｌｔ３リガンド」及び「ｃ−ｋｉｔリガンド
」には、上記一つ又はそれ以上の生物学的活性を引き起こすように、これらの適
当な受領体に結合することの出来る、該受容体に対する抗体も含まれるものであ
る。このような抗体は、異なるエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体の
集合体、又は、個々のモノクローナル抗体であり得る。「ｍｐｌリガンド」、「
ｆｌｔ３リガンド」及び「ｃ−ｋｉｔリガンド」には、更に、上記一つ又はそれ
以上の生物学的活性を引き起こすように、これらの適当な受容体に結合すること
の出来る、該受容体に対する小分子である、「擬似体(mimetic)」分子も含まれ るものである。例えば、ＴＰＯ擬似体分子の例は Cwirla et al. (1997) Scienc
e 276:1696 に記載されている。
」には、上記一つ又はそれ以上の生物学的活性を引き起こすように、これらの適
当な受領体に結合することの出来る、該受容体に対する抗体も含まれるものであ
る。このような抗体は、異なるエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体の
集合体、又は、個々のモノクローナル抗体であり得る。「ｍｐｌリガンド」、「
ｆｌｔ３リガンド」及び「ｃ−ｋｉｔリガンド」には、更に、上記一つ又はそれ
以上の生物学的活性を引き起こすように、これらの適当な受容体に結合すること
の出来る、該受容体に対する小分子である、「擬似体(mimetic)」分子も含まれ るものである。例えば、ＴＰＯ擬似体分子の例は Cwirla et al. (1997) Scienc
e 276:1696 に記載されている。
【００２０】 培養培地に加えることの出来るその他の分子として、例えば、フィブロネクチ
ン又はRetroNectinTM（宝酒造（株）滋賀県大津市から市販されている）のよう な接着分子を挙げることが出来る。「フィブロネクチン」という用語は、生体内
で見出される糖蛋白質であり、結合組織においてその濃度は特に高く、そこでは
コラーゲンと複合体を形成する。フィブロネクチンは細胞の増殖、分化、及び、
接着を調節する役割を担っていると考えられている。
ン又はRetroNectinTM（宝酒造（株）滋賀県大津市から市販されている）のよう な接着分子を挙げることが出来る。「フィブロネクチン」という用語は、生体内
で見出される糖蛋白質であり、結合組織においてその濃度は特に高く、そこでは
コラーゲンと複合体を形成する。フィブロネクチンは細胞の増殖、分化、及び、
接着を調節する役割を担っていると考えられている。
【００２１】 「培養」という用語は、様々な種類の培地内又はその上にて、生物 (organism
s) 又は細胞を増殖させることを意味する。培養中の細胞の子孫は親細胞とは完 全に同一ではない（形態的、遺伝的、又は表現型的）可能性があることを認識す
べきである。
s) 又は細胞を増殖させることを意味する。培養中の細胞の子孫は親細胞とは完 全に同一ではない（形態的、遺伝的、又は表現型的）可能性があることを認識す
べきである。
【００２２】 「有効量」とは、有益な又は所望の結果を奏効するに充分な量を意味する。有
効量は一回又は数回で投与することが出来る。本発明の目的の為に、使用するサ
イトカインの有効量とは、造血幹細胞の生存、増殖、及び／又は形質導入（遺伝
子運搬ビークルによる）を促進するのに充分な量のことである。一具体例におい
て、様々なサイトカインの個々の有効量は、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ
／ｍＬ、通常、約５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ、更に通常約１０ｎｇ／ｍ
Ｌ〜約１００ｎｇ／ｍＬである。もう一つの具体例において、サイトカインは培
地に含有され、培地を振りかけることによって補充される。
効量は一回又は数回で投与することが出来る。本発明の目的の為に、使用するサ
イトカインの有効量とは、造血幹細胞の生存、増殖、及び／又は形質導入（遺伝
子運搬ビークルによる）を促進するのに充分な量のことである。一具体例におい
て、様々なサイトカインの個々の有効量は、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ
／ｍＬ、通常、約５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ、更に通常約１０ｎｇ／ｍ
Ｌ〜約１００ｎｇ／ｍＬである。もう一つの具体例において、サイトカインは培
地に含有され、培地を振りかけることによって補充される。
【００２３】 細胞集団の「分離（単離）」又は「精製」とは、天然において関連する細胞及
び物質を実質的に含有しないことを意味する。実質的に精製されこれらの物質を
実質的に含有しないとは、集団の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０
％、より好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも９０％が造血
幹細胞であり、それ以上にはそれらが天然で関連する非多分化能細胞を含有しな
いことを意味する。「実質的にストロマ細胞を含有しない」とは、上記培養シス
テムにおいて、細胞集団が接着細胞層を形成しないことを意味する。
び物質を実質的に含有しないことを意味する。実質的に精製されこれらの物質を
実質的に含有しないとは、集団の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０
％、より好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも９０％が造血
幹細胞であり、それ以上にはそれらが天然で関連する非多分化能細胞を含有しな
いことを意味する。「実質的にストロマ細胞を含有しない」とは、上記培養シス
テムにおいて、細胞集団が接着細胞層を形成しないことを意味する。
【００２４】 「対象」とは、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトである
。哺乳動物には、マウス、猿、家畜動物、競技動物 (sport animals) 、及び愛 玩動物（ペット）等が含まれる。
。哺乳動物には、マウス、猿、家畜動物、競技動物 (sport animals) 、及び愛 玩動物（ペット）等が含まれる。
【００２５】 本明細書において「遺伝的修飾」という用語は、細胞の通常のヌクレオチドへ
の付加、欠失、又は混乱 (disruption) を意味する。本発明方法は、非限定的な
例として、ウイルス介在遺伝子導入、リポソーム介在導入、形質転換、トランス
フェクション、形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びヘ
ルペスウイルスのようなＤＮＡウイルス、並びにレトロウイルスに基づくベクタ
ーを使用するウイルス介在遺伝子導入を含む、造血幹細胞への遺伝子導入に関す
る任意の方法を包含するものである。「ウイルスベクター」は、組換えによって
製造された、生体内（インビボ）、生体外（エキソビボ）、試験管内（インビト
ロ）にて宿主細胞内へ運搬されるポリヌクレオチドを含むウイルス又はウイルス
粒子、と定義される。ウイルスベクターの例として、レンチウイルスベクターの
ようなレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ関連ウイ
ルスベクター等がある。レトロウイルスベクターによって遺伝子が導入されるよ
うな場合には、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノム又はその一部、及び治
療の為の遺伝子を含むポリヌクレオチドを意味する。
の付加、欠失、又は混乱 (disruption) を意味する。本発明方法は、非限定的な
例として、ウイルス介在遺伝子導入、リポソーム介在導入、形質転換、トランス
フェクション、形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びヘ
ルペスウイルスのようなＤＮＡウイルス、並びにレトロウイルスに基づくベクタ
ーを使用するウイルス介在遺伝子導入を含む、造血幹細胞への遺伝子導入に関す
る任意の方法を包含するものである。「ウイルスベクター」は、組換えによって
製造された、生体内（インビボ）、生体外（エキソビボ）、試験管内（インビト
ロ）にて宿主細胞内へ運搬されるポリヌクレオチドを含むウイルス又はウイルス
粒子、と定義される。ウイルスベクターの例として、レンチウイルスベクターの
ようなレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ関連ウイ
ルスベクター等がある。レトロウイルスベクターによって遺伝子が導入されるよ
うな場合には、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノム又はその一部、及び治
療の為の遺伝子を含むポリヌクレオチドを意味する。
【００２６】 「レトロウイルス介在遺伝子導入」と「レトロウイルス形質導入」とは同義で
あり、ウイルスが宿主細胞に侵入しそのゲノムを外宿主細胞のゲノム内に組み込
むことによって、遺伝子又は核酸配列が該細胞に安定的に導入されるプロセスを
意味する。ウイルスはその通常の感染メカニズムによって細胞に侵入するか、又
は、宿主細胞の異なる表面受容体又はリガンドに結合して細胞に侵入するように
修飾される。本明細書中では、「レトロウイルスベクター」とは、ウイルス又は
ウイルス様侵入 (entry) メカニズムによって外来性核酸を細胞に導入する能力 を有するウイルス粒子を意味する。
あり、ウイルスが宿主細胞に侵入しそのゲノムを外宿主細胞のゲノム内に組み込
むことによって、遺伝子又は核酸配列が該細胞に安定的に導入されるプロセスを
意味する。ウイルスはその通常の感染メカニズムによって細胞に侵入するか、又
は、宿主細胞の異なる表面受容体又はリガンドに結合して細胞に侵入するように
修飾される。本明細書中では、「レトロウイルスベクター」とは、ウイルス又は
ウイルス様侵入 (entry) メカニズムによって外来性核酸を細胞に導入する能力 を有するウイルス粒子を意味する。
【００２７】 レトロウイルスはその遺伝情報をＲＮＡの形態で保持している。しかしながら
、一旦、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡがＤＮＡ形態に逆転写され、それ
が感染細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。この組み込まれたＤＮＡはプロウイ
ルスと呼ばれる。
、一旦、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡがＤＮＡ形態に逆転写され、それ
が感染細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。この組み込まれたＤＮＡはプロウイ
ルスと呼ばれる。
【００２８】 アデノウイルス（Ａｄs）ベクター、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベク ター等のＤＮＡウイルスベクターによって遺伝子が導入されるような場合には、
ベクター構築物は、該ゲノム又はその一部、及び治療の為の遺伝子を含むポリヌ
クレオチドを意味する。アデノウイルスの特徴は比較的良く解明されており、５
０以上の血清型を含むウイルスの均一グループがある。WO95/27071参照されたし
。アデノウイルス（Ａｄs）は容易に増殖出来，宿主細胞ゲノムに組み込まれる 必要はない。アデノウイルス由来組換えベクター、特に、野生型ウイルスの組換
え及び出現頻度 (potential)を低下させたものも構築されている (WO95/00655;
WO95/11984 を参照されたし)。
ベクター構築物は、該ゲノム又はその一部、及び治療の為の遺伝子を含むポリヌ
クレオチドを意味する。アデノウイルスの特徴は比較的良く解明されており、５
０以上の血清型を含むウイルスの均一グループがある。WO95/27071参照されたし
。アデノウイルス（Ａｄs）は容易に増殖出来，宿主細胞ゲノムに組み込まれる 必要はない。アデノウイルス由来組換えベクター、特に、野生型ウイルスの組換
え及び出現頻度 (potential)を低下させたものも構築されている (WO95/00655;
WO95/11984 を参照されたし)。
【００２９】 アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）も遺伝子導入システムで使用されてきた（米国
特許第5,693,531号及び5,691,176号参照）。野生型ＡＡＶは宿主細胞ゲノム内に
組み込まれる際に、高い感染性及び特異性を有する (Hermonat and Muzyczka (1
984) PNAS USA 81:6466-6470; Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3
988-3996) 。高力価の組換えＡＡＶベクターが製造され、それは高効率で標的細
胞に形質導入された。
特許第5,693,531号及び5,691,176号参照）。野生型ＡＡＶは宿主細胞ゲノム内に
組み込まれる際に、高い感染性及び特異性を有する (Hermonat and Muzyczka (1
984) PNAS USA 81:6466-6470; Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3
988-3996) 。高力価の組換えＡＡＶベクターが製造され、それは高効率で標的細
胞に形質導入された。
【００３０】 プロモーター及びポリヌクレオチドが機能的に結合されるクローニング部位の
双方を有するベクターは当業者には周知である。このようなベクターはインビト
ロ又はインビボでＲＮＡを転写することが出来、Stratagene（LaJolla,CA）及び
Promega Biotech (Madison, WI) から市販されている。発現及び／又はインビト
ロ転写を最適化するために、クローンの５’及び／又は３’非翻訳部分を付加、
又は改変し、余分で可能性のある不適切な代替翻訳開始コドン、又は、転写又は
翻訳レベルでの発現を妨害したり低下させたりするその他の配列を除去する必要
がある。又は、発現を増強するために、開始コドンの５’直前にコンセンサスな
リボソーム結合部位を挿入することが出来る。ベクターの例として、様々な真核
細胞及び原核細胞宿主内での発現用に記載され、遺伝子治療及び単純な蛋白質発
現の為に使用されてきた、バキュロウイルス及びレトロウイルスのようなウイル
ス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、菌ベクター、及びその他の当
該技術分野で典型的に使用されている組換えビークルを挙げることが出来る。
双方を有するベクターは当業者には周知である。このようなベクターはインビト
ロ又はインビボでＲＮＡを転写することが出来、Stratagene（LaJolla,CA）及び
Promega Biotech (Madison, WI) から市販されている。発現及び／又はインビト
ロ転写を最適化するために、クローンの５’及び／又は３’非翻訳部分を付加、
又は改変し、余分で可能性のある不適切な代替翻訳開始コドン、又は、転写又は
翻訳レベルでの発現を妨害したり低下させたりするその他の配列を除去する必要
がある。又は、発現を増強するために、開始コドンの５’直前にコンセンサスな
リボソーム結合部位を挿入することが出来る。ベクターの例として、様々な真核
細胞及び原核細胞宿主内での発現用に記載され、遺伝子治療及び単純な蛋白質発
現の為に使用されてきた、バキュロウイルス及びレトロウイルスのようなウイル
ス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、菌ベクター、及びその他の当
該技術分野で典型的に使用されている組換えビークルを挙げることが出来る。
【００３１】 これらの中には、ＤＮＡ／リポソーム複合体及び標的ウイルス蛋白質複合体を
含む、幾つかの非ウイルスベクターがある。細胞への運搬を増強させるために、
本発明の核酸又は蛋白質は、例えば、ＴＣＲ，ＣＤ３又はＣＤ４等のような細胞
表面抗原に結合する抗体又はその結合断片と複合体を形成させることが出来る。
標的抗体又はその断片を含むリポソームも、本発明において使用することが出来
る。本発明は、又、本発明方法において使用するこのような標的複合体を提供す
るものである。
含む、幾つかの非ウイルスベクターがある。細胞への運搬を増強させるために、
本発明の核酸又は蛋白質は、例えば、ＴＣＲ，ＣＤ３又はＣＤ４等のような細胞
表面抗原に結合する抗体又はその結合断片と複合体を形成させることが出来る。
標的抗体又はその断片を含むリポソームも、本発明において使用することが出来
る。本発明は、又、本発明方法において使用するこのような標的複合体を提供す
るものである。
【００３２】 ポリヌクレオチドは当該技術分野で周知の方法でベクターゲノム内に挿入され
る。例えば、挿入物とベクターＤＮＡが適当な条件下で接触し、制限酵素によっ
て各々の分子に相補末端が形成され、互いに対となり、リガーゼによって連結さ
れる。別の方法として,合成核酸リンカーを制限ポリヌクレオチド末端に連結す ることが出来る。これらの合成リンカーは該ベクターＤＮＡ中の特定制限部位に
対応する核酸配列を有する。更に、終結コドン及び適当な制限部位を有するオリ
ゴヌクレオチドは、例えば、哺乳動物細胞内での安定的又は一過性のトランスフ
ェクションを選択する為のネオマイシン遺伝子のような選択マーカー遺伝子；高
レベルの転写をさせる為のヒトＣＭＶの前初期遺伝子由来エンハンサー／プロモ
ーター配列；ｍＲＮＡ安定化の為のＳＶ４０由来のＲＮＡプロセシング及び転写
終結シグナル；適当なエピソーム複製の為のＣｏｌＥ１及びＳＶ４０ポリオーマ
の複製起点；汎用の複数クローニング部位；及びセンス及びアンチセンスＲＮＡ
のインビトロ転写の為の及びＴ７及びＳＰ６ＲＮＡプロモーター、の全て、又は
その幾つかを有するベクター内に挿入し連結することが出来る。その他の手段は
当業者に周知であり、利用することが出来る。
る。例えば、挿入物とベクターＤＮＡが適当な条件下で接触し、制限酵素によっ
て各々の分子に相補末端が形成され、互いに対となり、リガーゼによって連結さ
れる。別の方法として,合成核酸リンカーを制限ポリヌクレオチド末端に連結す ることが出来る。これらの合成リンカーは該ベクターＤＮＡ中の特定制限部位に
対応する核酸配列を有する。更に、終結コドン及び適当な制限部位を有するオリ
ゴヌクレオチドは、例えば、哺乳動物細胞内での安定的又は一過性のトランスフ
ェクションを選択する為のネオマイシン遺伝子のような選択マーカー遺伝子；高
レベルの転写をさせる為のヒトＣＭＶの前初期遺伝子由来エンハンサー／プロモ
ーター配列；ｍＲＮＡ安定化の為のＳＶ４０由来のＲＮＡプロセシング及び転写
終結シグナル；適当なエピソーム複製の為のＣｏｌＥ１及びＳＶ４０ポリオーマ
の複製起点；汎用の複数クローニング部位；及びセンス及びアンチセンスＲＮＡ
のインビトロ転写の為の及びＴ７及びＳＰ６ＲＮＡプロモーター、の全て、又は
その幾つかを有するベクター内に挿入し連結することが出来る。その他の手段は
当業者に周知であり、利用することが出来る。
【００３３】造血幹細胞の生体外（エキソビボ）培養 本発明の一態様として、造血幹細胞（ＨＳＣ）培養の増殖及び／又は生存を促
進させる方法を提供する。本発明方法の為のＨＳＣ源を提供するに役立つ細胞集
団は、限定的ではないが、成人又は胎児の骨髄から得られる細胞集団、可動化末
梢血（ＭＰＢ）及び臍帯血である。臍帯血の使用は、例えば、Issaragrishi et
al. (1995) N. Engl. J. Med. 332:367-369 ) で議論されている。最初に、骨髄
性細胞が、非限定的な例として、腸骨（股部から腸骨稜を経て）、（内反）けい
骨、大たい骨、脊椎、及びその他の骨腔を含む骨髄の源から取得される。幹細胞
の他の源は、非限定的に、胚性卵黄嚢、胎児性肝臓、及び胎児性脾臓を挙げるこ
とが出来る。
進させる方法を提供する。本発明方法の為のＨＳＣ源を提供するに役立つ細胞集
団は、限定的ではないが、成人又は胎児の骨髄から得られる細胞集団、可動化末
梢血（ＭＰＢ）及び臍帯血である。臍帯血の使用は、例えば、Issaragrishi et
al. (1995) N. Engl. J. Med. 332:367-369 ) で議論されている。最初に、骨髄
性細胞が、非限定的な例として、腸骨（股部から腸骨稜を経て）、（内反）けい
骨、大たい骨、脊椎、及びその他の骨腔を含む骨髄の源から取得される。幹細胞
の他の源は、非限定的に、胚性卵黄嚢、胎児性肝臓、及び胎児性脾臓を挙げるこ
とが出来る。
【００３４】 その他の幹細胞特異的マーカーに対して陽性選択を行うことによる幹細胞分離
の為の更なる濃縮又は富化(enrichment) 又は精製の操作又は段階も本発明に含 まれる。適当な陽性幹細胞マーカーには、非限定的に、ＣＤ３４＋及びＴｈｙ−
１＋を挙げることが出来る。好ましくは造血幹細胞はヒトであるが、例えば、ヒ
ト、サル、ブタ又はマウス等のような適当な動物に由来するものでも良い。
の為の更なる濃縮又は富化(enrichment) 又は精製の操作又は段階も本発明に含 まれる。適当な陽性幹細胞マーカーには、非限定的に、ＣＤ３４＋及びＴｈｙ−
１＋を挙げることが出来る。好ましくは造血幹細胞はヒトであるが、例えば、ヒ
ト、サル、ブタ又はマウス等のような適当な動物に由来するものでも良い。
【００３５】 骨髄の分離のためには、非限定的な例として、従来のように胎児血清（ＦＣＳ
）又は天然因子が添加された塩類溶液を、通常約５−２５ｍＭのような低濃度の
許容可能な緩衝液と組み合わせた適当な溶液で、骨を洗い流す。従来の緩衝液と
しては、例えば、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が非限定的例として
挙げられる。他の方法としては、従来の方法で骨髄を骨から吸引することが出来
る。
）又は天然因子が添加された塩類溶液を、通常約５−２５ｍＭのような低濃度の
許容可能な緩衝液と組み合わせた適当な溶液で、骨を洗い流す。従来の緩衝液と
しては、例えば、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が非限定的例として
挙げられる。他の方法としては、従来の方法で骨髄を骨から吸引することが出来
る。
【００３６】 好ましくは、造血幹細胞の源は、まず、系列特異的マーカーを発現する細胞を
除去し、系列陰性（Lin−）である細胞を保持するような陰性選択手段にかける 。Lin−細胞は、一般的には、Ｔ細胞に関連するマーカー（ＣＤ２，３，４及び ８）、Ｂ細胞に関連するマーカー（ＣＤ１０，１９，及び２０）、骨髄性細胞に
関連するマーカー（ＣＤ１４，１５，１６及び３３）、ナテュラルキラー（ＮＫ
）細胞に関連するマーカー（ＣＤ２，１６及び５６）、赤血球に関連するマーカ
ー（グリコフォリンＡ）、巨大核顆粒球に関連するマーカー（ＣＤ４１）、マス
ト細胞に関連するマーカー、好酸球又は好塩基球に関連するマーカーのようなマ
ーカーを欠いている細胞を意味する。このような系列特異的マーカーの発現が欠
如又は低いことは、陰性選択に有用である、このような細胞特異的マーカーに特
異的な抗体が結合しないことで同定される。系列特異的マーカーの非限定的な例
として、好ましくは、少なくともＣＤ２，ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ１６，ＣＤ
１９，ＣＤ２０，ＣＤ３８，ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ７１のいずれか一つ、より好
ましくは、少なくともＣＤ１４，ＣＤ１５，及びＣＤ１９の内のいずれか一つで
ある。本明細書中で、Lin−は、少なくとも一つの系列特異的マーカーの欠如に 基づき選択された細胞集団を意味する。非常に濃縮された組成物はＣＤ３４＋Li
n−である細胞の選択分離によって得ることが出来る。
除去し、系列陰性（Lin−）である細胞を保持するような陰性選択手段にかける 。Lin−細胞は、一般的には、Ｔ細胞に関連するマーカー（ＣＤ２，３，４及び ８）、Ｂ細胞に関連するマーカー（ＣＤ１０，１９，及び２０）、骨髄性細胞に
関連するマーカー（ＣＤ１４，１５，１６及び３３）、ナテュラルキラー（ＮＫ
）細胞に関連するマーカー（ＣＤ２，１６及び５６）、赤血球に関連するマーカ
ー（グリコフォリンＡ）、巨大核顆粒球に関連するマーカー（ＣＤ４１）、マス
ト細胞に関連するマーカー、好酸球又は好塩基球に関連するマーカーのようなマ
ーカーを欠いている細胞を意味する。このような系列特異的マーカーの発現が欠
如又は低いことは、陰性選択に有用である、このような細胞特異的マーカーに特
異的な抗体が結合しないことで同定される。系列特異的マーカーの非限定的な例
として、好ましくは、少なくともＣＤ２，ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ１６，ＣＤ
１９，ＣＤ２０，ＣＤ３８，ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ７１のいずれか一つ、より好
ましくは、少なくともＣＤ１４，ＣＤ１５，及びＣＤ１９の内のいずれか一つで
ある。本明細書中で、Lin−は、少なくとも一つの系列特異的マーカーの欠如に 基づき選択された細胞集団を意味する。非常に濃縮された組成物はＣＤ３４＋Li
n−である細胞の選択分離によって得ることが出来る。
【００３７】 先ず系列化した細胞を除去することによって細胞を分離する為に、様々な方法
を用いることが出来る。モノクローナル抗体は特定の細胞系列および／又は分化
段階に関連するマーカーを同定する際に特に有用である。この抗体は、粗分離の
目的で固体支持体に結合させて使用することが出来る。用いる分離技術は回収す
る画分の生存率を最大限保持するものでなければ成らない。「比較的」粗い分離
を行うために、効率の異なる様々な技術を用いることが出来る。このような分離
は、全細胞の１０％、通常は約５％以下、好ましくは約１％以下のマーカーを有
していない細胞が保持される細胞集団に残ることができる。使用される特定の技
術は分離効率、関連する細胞毒性、操作の容易性及び迅速性、及び高度な装置及
び／又は技能の必要性に依存する。
を用いることが出来る。モノクローナル抗体は特定の細胞系列および／又は分化
段階に関連するマーカーを同定する際に特に有用である。この抗体は、粗分離の
目的で固体支持体に結合させて使用することが出来る。用いる分離技術は回収す
る画分の生存率を最大限保持するものでなければ成らない。「比較的」粗い分離
を行うために、効率の異なる様々な技術を用いることが出来る。このような分離
は、全細胞の１０％、通常は約５％以下、好ましくは約１％以下のマーカーを有
していない細胞が保持される細胞集団に残ることができる。使用される特定の技
術は分離効率、関連する細胞毒性、操作の容易性及び迅速性、及び高度な装置及
び／又は技能の必要性に依存する。
【００３８】 分離操作には、例えば、物理的分離、抗体で被覆された磁気ビーズを使用する
磁気による分離、アフィニティクロマトグラフィ、モノクローナル抗体に結合、
又は複合体化された、例えば、補体及び細胞毒のような細胞毒性剤、及び、例え
ば、プレートのような固体マトリックスに結合した抗体とのパニング、エルトリ
エーション（飛び出し）又はその他の従来の如何なる技術が含まれる。
磁気による分離、アフィニティクロマトグラフィ、モノクローナル抗体に結合、
又は複合体化された、例えば、補体及び細胞毒のような細胞毒性剤、及び、例え
ば、プレートのような固体マトリックスに結合した抗体とのパニング、エルトリ
エーション（飛び出し）又はその他の従来の如何なる技術が含まれる。
【００３９】 物理的分離には、例えば、物理的（密度勾配遠心分離及び向流遠心分離エルト
リエーション）、細胞表面（レクチン及び抗体との親和性）、及び生体染色性（
ミトコンドリア結合色素rho123及びＤＮＡ結合色素ヘキスト３３３４２）に置け
る差異に基づくものがある。これらの操作は当業者に周知である。
リエーション）、細胞表面（レクチン及び抗体との親和性）、及び生体染色性（
ミトコンドリア結合色素rho123及びＤＮＡ結合色素ヘキスト３３３４２）に置け
る差異に基づくものがある。これらの操作は当業者に周知である。
【００４０】 正確な分離を行う技術の非限定的な例としては、例えば、複数のカラーチャン
ネル、低角度、及び鈍角な光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネル、
等、その複雑さに様々な程度があるフローサイトメトリーがある。細胞は光散乱
特性に基づくフローサイトメトリーによっても選択することが出来、その場合に
は、幹細胞は低い側方（横方）散乱、並びに低及び中程度の前方散乱プロフィー
ルに基づき選択される。サイトスピン調製物によれば、濃縮された幹細胞は成熟
リンパ球系細胞と成熟顆粒球との間の大きさを有することが示された。
ネル、低角度、及び鈍角な光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネル、
等、その複雑さに様々な程度があるフローサイトメトリーがある。細胞は光散乱
特性に基づくフローサイトメトリーによっても選択することが出来、その場合に
は、幹細胞は低い側方（横方）散乱、並びに低及び中程度の前方散乱プロフィー
ルに基づき選択される。サイトスピン調製物によれば、濃縮された幹細胞は成熟
リンパ球系細胞と成熟顆粒球との間の大きさを有することが示された。
【００４１】 別の方法として、第一の分離において、典型的には約１ｘ１０８−９，好まし
くは約５ｘ１０８−９個の細胞、ＩＣＤ３４を用いて第一の蛍光色素でラベルし
、一方、様々な系列化に対する抗体を第一の蛍光色素と異なり識別可能なスペク
トル特性を有する蛍光色素に結合させることが出来る。各系列は一つ以上の分離
工程で分離することが出来、ある細胞がＨＳＣｓとして陽性選択されるのと同時
に系列化した細胞を選択することが望ましい。死滅細胞に関連した色素（例えば
、プロピジウムヨード：ＰＩ）を使用することで、細胞を死滅細胞から選択・分
離することが出来る。好ましくは、細胞はを２％ＦＣＳ（牛胎児血清）含有培地
中に回収する。分離の特定の順番は本発明に必須のものではない。
くは約５ｘ１０８−９個の細胞、ＩＣＤ３４を用いて第一の蛍光色素でラベルし
、一方、様々な系列化に対する抗体を第一の蛍光色素と異なり識別可能なスペク
トル特性を有する蛍光色素に結合させることが出来る。各系列は一つ以上の分離
工程で分離することが出来、ある細胞がＨＳＣｓとして陽性選択されるのと同時
に系列化した細胞を選択することが望ましい。死滅細胞に関連した色素（例えば
、プロピジウムヨード：ＰＩ）を使用することで、細胞を死滅細胞から選択・分
離することが出来る。好ましくは、細胞はを２％ＦＣＳ（牛胎児血清）含有培地
中に回収する。分離の特定の順番は本発明に必須のものではない。
【００４２】 上記のようにして得られた細胞は、直ちに使用されるか、又は液体窒素温度で
凍結・長期間保存され、その後、解凍して再使用することが出来る。通常、細胞
は１０％ＤＭＳＯ，５０％ＦＣＳ、４０％ＲＰＭＩ１６４０培地中で保存される
。一旦、解凍した後に、増殖因子及び／又は幹細胞の増殖及び分化に関与するス
トロマ細胞を使用することで増殖させることが出来る。
凍結・長期間保存され、その後、解凍して再使用することが出来る。通常、細胞
は１０％ＤＭＳＯ，５０％ＦＣＳ、４０％ＲＰＭＩ１６４０培地中で保存される
。一旦、解凍した後に、増殖因子及び／又は幹細胞の増殖及び分化に関与するス
トロマ細胞を使用することで増殖させることが出来る。
【００４３】 好適具体例において、培養前に、ＨＳＣｓの中で細胞表面マーカーＣＤ３４及
びLin−を発現する細胞を濃縮する。好ましくは、これら細胞は特異的前駆細胞 に関連する系列特異的マーカーをも発現しないものである。これら細胞は、 「L
in−」と呼ばれる。ＣＤ３４及びThy-1−に対して特異的な抗体は市販されてお り、ＡＴＣＣ(American Tissue Type Collection) からハイブリドーマを得るこ
とが可能でる。
びLin−を発現する細胞を濃縮する。好ましくは、これら細胞は特異的前駆細胞 に関連する系列特異的マーカーをも発現しないものである。これら細胞は、 「L
in−」と呼ばれる。ＣＤ３４及びThy-1−に対して特異的な抗体は市販されてお り、ＡＴＣＣ(American Tissue Type Collection) からハイブリドーマを得るこ
とが可能でる。
【００４４】 増殖方法は、造血幹細胞が実質的に濃縮され、ストロマ細胞を実質的含まない
細胞集団を増殖容器内の適当量の培地に接種する。好ましくは、細胞密度は、培
地１ｍＬ当り、少なくとも約１ｘ１０２個、好ましくは約２ｘ１０３個、より好
ましくは約２ｘ１０４個から約１ｘ１０６個であり、さらに好ましくは約１ｘ１
０５個から約５ｘ１０５個の範囲である。開始時の酸素濃度は約２から２０％で
あり、好ましくは８％より低い。一具体例では、細胞の接種集団は骨髄由来であ
り、約７，０００個／ｍＬから２０，０００個／ｍＬ、好ましくは約２０，００
０個／ｍＬである。別の具体例では、細胞の接種集団は可動化末梢血由来であり
、約２０，０００個／ｍＬから５０，０００個／ｍＬ、好ましくは約５０，００
０個／ｍＬである。
細胞集団を増殖容器内の適当量の培地に接種する。好ましくは、細胞密度は、培
地１ｍＬ当り、少なくとも約１ｘ１０２個、好ましくは約２ｘ１０３個、より好
ましくは約２ｘ１０４個から約１ｘ１０６個であり、さらに好ましくは約１ｘ１
０５個から約５ｘ１０５個の範囲である。開始時の酸素濃度は約２から２０％で
あり、好ましくは８％より低い。一具体例では、細胞の接種集団は骨髄由来であ
り、約７，０００個／ｍＬから２０，０００個／ｍＬ、好ましくは約２０，００
０個／ｍＬである。別の具体例では、細胞の接種集団は可動化末梢血由来であり
、約２０，０００個／ｍＬから５０，０００個／ｍＬ、好ましくは約５０，００
０個／ｍＬである。
【００４５】 任意の適当な増殖容器、フラスコ、又は適当な管、例えば、２４穴プレート、
１２．５ｃｍ２Ｔフラスコ又はガス透過性バッグ等を本発明方法で使用すること
が出来る。このような培養容器は、例えば、Falcon, Corning, 及びCostar 等か
ら市販されている。本明細書中で、「増殖容器」とは、本明細書中で記載されて
いるバイオリアクターのような増殖装置内に組み込まれているか又はそれとは自
由に設置されているかを問わず、如何なるチャンンバー（部屋）又はコンテナー
も含有するものである。かかる増殖容器の一具体例では、押されてくぼんだ表面
と平面で構成され、細胞支持表面残部が方向付けされている、チャンンバーの少
容積の空間である。
１２．５ｃｍ２Ｔフラスコ又はガス透過性バッグ等を本発明方法で使用すること
が出来る。このような培養容器は、例えば、Falcon, Corning, 及びCostar 等か
ら市販されている。本明細書中で、「増殖容器」とは、本明細書中で記載されて
いるバイオリアクターのような増殖装置内に組み込まれているか又はそれとは自
由に設置されているかを問わず、如何なるチャンンバー（部屋）又はコンテナー
も含有するものである。かかる増殖容器の一具体例では、押されてくぼんだ表面
と平面で構成され、細胞支持表面残部が方向付けされている、チャンンバーの少
容積の空間である。
【００４６】 幹細胞の増殖には様々な種類の培地を使用することが出来る。例として、Dulb
ecco's MEM, IMDM, X-Vivo 15 （血清非含有）及びRPMI-1640があり、それらに 様々な種類の栄養素、増殖因子、サイトカインを添加することが出来る。培地に
は牛胎児血清又は自家血清を適当量含有しても良いし、しなくても良い。しかし
ながら、増殖細胞又は細胞集団をヒト治療に使用する場合には、培地は無血清又
は自家血清である。かかる培地の好適例はX-Vivo 15 （血清非含有）である。
ecco's MEM, IMDM, X-Vivo 15 （血清非含有）及びRPMI-1640があり、それらに 様々な種類の栄養素、増殖因子、サイトカインを添加することが出来る。培地に
は牛胎児血清又は自家血清を適当量含有しても良いし、しなくても良い。しかし
ながら、増殖細胞又は細胞集団をヒト治療に使用する場合には、培地は無血清又
は自家血清である。かかる培地の好適例はX-Vivo 15 （血清非含有）である。
【００４７】 上記のように,一具体例において、ＨＳＣｓ増殖の為の培地調製物にはｍｐｌ 及びＦＬリガンド（好ましくはＴＰＯ及びＦＬ）が約０．１ｎｇ／ｍＬから約５
００ｎｇ／ｍＬの濃度、特に通常は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬ
の濃度で添加される。更に、ＩＬ６、ＬＩＦ、及び適宜ＩＬ３も添加される。実
施例に記載されているように、これら分子の擬似体（mimetics） も同様に添加 することが出来る。別の具体例では、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＫＬ）又は幹細胞因
子（Steel factor: Ｓｔｌ）、マスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）も同程度の濃度で
添加することが出来る。以下に記載するように、ＨＳＣｓに遺伝子運搬ビークル
を形質導入する際に、培地調製物には好ましくはｍｐｌ（好ましくはＴＰＯ）、
ｆｌｔ３リガンド、及び適宜、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＬＩＦ、
フィブロネクチン及び／又はRetroNectin も添加される。単独又は組み合わせて
添加することが出来る他のサイトカインとして、Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｉ
Ｌ−１α、ＩＬ−１１及びＭＩＰ−１αを挙げることが出来る。幾つかの例では
、培養条件は一つ又はそれ以上のサイトカイン、例えば、ＩＬ３を特異的に排除
する。
００ｎｇ／ｍＬの濃度、特に通常は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬ
の濃度で添加される。更に、ＩＬ６、ＬＩＦ、及び適宜ＩＬ３も添加される。実
施例に記載されているように、これら分子の擬似体（mimetics） も同様に添加 することが出来る。別の具体例では、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＫＬ）又は幹細胞因
子（Steel factor: Ｓｔｌ）、マスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）も同程度の濃度で
添加することが出来る。以下に記載するように、ＨＳＣｓに遺伝子運搬ビークル
を形質導入する際に、培地調製物には好ましくはｍｐｌ（好ましくはＴＰＯ）、
ｆｌｔ３リガンド、及び適宜、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＬＩＦ、
フィブロネクチン及び／又はRetroNectin も添加される。単独又は組み合わせて
添加することが出来る他のサイトカインとして、Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｉ
Ｌ−１α、ＩＬ−１１及びＭＩＰ−１αを挙げることが出来る。幾つかの例では
、培養条件は一つ又はそれ以上のサイトカイン、例えば、ＩＬ３を特異的に排除
する。
【００４８】 一具体例では、サイトカインは培地に含有され、、培地を振りかけることによ
って補充される。バイオレアクターシステムを使用する別の例では、サイトカイ
ンは培地の補充としてではなく、別の入力ポート (inlet port) から濃縮溶液と
して別途添加される。このようにサイトカインが培地の補充としてではなく添加
される場合には、典型的には、バイオリアクター内の容積と同容積からその１／
１０〜１／１００の容積の１０ｘ又は１００ｘ溶液として、２乃至４日毎に新た
なサイトカインが添加される。更に、この新たな濃縮サイトカインは、培地の補
充によるものの他に、別途に添加することも可能である。
って補充される。バイオレアクターシステムを使用する別の例では、サイトカイ
ンは培地の補充としてではなく、別の入力ポート (inlet port) から濃縮溶液と
して別途添加される。このようにサイトカインが培地の補充としてではなく添加
される場合には、典型的には、バイオリアクター内の容積と同容積からその１／
１０〜１／１００の容積の１０ｘ又は１００ｘ溶液として、２乃至４日毎に新た
なサイトカインが添加される。更に、この新たな濃縮サイトカインは、培地の補
充によるものの他に、別途に添加することも可能である。
【００４９】造血幹細胞培養物の形質導入 本発明方法は、非限定的例として、ウイルス介在遺伝子導入、例えば、アデノ
ウイルス、アデノ関連ウイルス及びヘルペスウイルス等のＤＮＡウイルス並びに
レトロウイルスに基づくベクターを使用するウイルス介在遺伝子導入、リポソー
ム介在導入、形質転換、トランスフェクション、及び形質導入等を含む、あらゆ
る種類の造血幹細胞への遺伝子導入を含有すべく意図するものである。本発明方
法は、特に、核酸が細胞質中に留まるように、核局在化要素又は配列を欠いたベ
クター又は構築物に含まれる核酸を組み込むのに適している。これらの場合には
、核酸又は治療遺伝子は、核膜が破壊され、該核酸又は治療遺伝子が宿主細胞の
染色体に接触することが出来るＭ期（有糸分裂期）の間に核に侵入することが可
能である。一具体例では、核局在化要素又は配列を有する核酸ベクター及び構築
物は特異的に排除される。
ウイルス、アデノ関連ウイルス及びヘルペスウイルス等のＤＮＡウイルス並びに
レトロウイルスに基づくベクターを使用するウイルス介在遺伝子導入、リポソー
ム介在導入、形質転換、トランスフェクション、及び形質導入等を含む、あらゆ
る種類の造血幹細胞への遺伝子導入を含有すべく意図するものである。本発明方
法は、特に、核酸が細胞質中に留まるように、核局在化要素又は配列を欠いたベ
クター又は構築物に含まれる核酸を組み込むのに適している。これらの場合には
、核酸又は治療遺伝子は、核膜が破壊され、該核酸又は治療遺伝子が宿主細胞の
染色体に接触することが出来るＭ期（有糸分裂期）の間に核に侵入することが可
能である。一具体例では、核局在化要素又は配列を有する核酸ベクター及び構築
物は特異的に排除される。
【００５０】 本発明のＨＳＣｓ培養は、レトロウイルス介在遺伝子導入に特に適している。
レトロウイルス形質導入においては、導入される配列は標的細胞の染色体ＤＮＡ
に安定的に組み込まれる。安定したプロウイルス組み込みに好適な条件には、本
明細書に記載するような細胞周期が活性化されていることが挙げられる。
レトロウイルス形質導入においては、導入される配列は標的細胞の染色体ＤＮＡ
に安定的に組み込まれる。安定したプロウイルス組み込みに好適な条件には、本
明細書に記載するような細胞周期が活性化されていることが挙げられる。
【００５１】 細胞周期の様々な段階に関する用語は当該技術分野で共通に使用され理解され
ている。Ｇ０期とは、細胞周期における静止又は非増殖段階を意味する。Ｇ０期
は非周期と考えられている。細胞はＧ０期を外れて、活性な周期、即ち、Ｇ１，
Ｓ，Ｇ２，及びＭ期に入る。本発明方法の培養では、細胞周期へ入ることは、例
えば、増殖因子を培養培地に添加することによって達成される。
ている。Ｇ０期とは、細胞周期における静止又は非増殖段階を意味する。Ｇ０期
は非周期と考えられている。細胞はＧ０期を外れて、活性な周期、即ち、Ｇ１，
Ｓ，Ｇ２，及びＭ期に入る。本発明方法の培養では、細胞周期へ入ることは、例
えば、増殖因子を培養培地に添加することによって達成される。
【００５２】 のＨＳＣｓは治療遺伝子によって形質導入される。好ましくは、形質導入はレ
トロウイルスベクターのようなベクターを介して行われる。生体外（エキソビボ
）で形質導入された細胞は、その後、患者に投与される。このように、本発明は
、遺伝子を生体外又は生体内で投与することによるＨＳＣｓ内への遺伝子導入を
受け入れられる病気（疾患）の治療方法も含むものである。例えば、非限定的な
例として、β―サラセミア、鎌状細胞貧血、アデノシンデアミナーゼ欠損症、リ
コンビナーゼ欠損症、リコンビナーゼ調節遺伝子欠損症等を治療遺伝子の導入に
よって治すことが出来る。他の遺伝子治療の方法として、薬剤耐性遺伝子を正常
幹細胞に導入して利点を与え、その後、化学治療の間に選択圧をかけるというも
のである。適当な薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性（ＭＤＲ）蛋白質
をコードする遺伝子を挙げることが出来る。
トロウイルスベクターのようなベクターを介して行われる。生体外（エキソビボ
）で形質導入された細胞は、その後、患者に投与される。このように、本発明は
、遺伝子を生体外又は生体内で投与することによるＨＳＣｓ内への遺伝子導入を
受け入れられる病気（疾患）の治療方法も含むものである。例えば、非限定的な
例として、β―サラセミア、鎌状細胞貧血、アデノシンデアミナーゼ欠損症、リ
コンビナーゼ欠損症、リコンビナーゼ調節遺伝子欠損症等を治療遺伝子の導入に
よって治すことが出来る。他の遺伝子治療の方法として、薬剤耐性遺伝子を正常
幹細胞に導入して利点を与え、その後、化学治療の間に選択圧をかけるというも
のである。適当な薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性（ＭＤＲ）蛋白質
をコードする遺伝子を挙げることが出来る。
【００５３】 例えば、非限定的な例として、ホルモン、酵素、インターフェロン、増殖因子
等の特定の分泌産物の欠失に関連するような、造血細胞に関連する病気以外の病
気も遺伝子修飾によって治療することが出来る。適当な調節開始領域を含むこと
によって、欠損した蛋白質の誘導生産が行われ、このような蛋白質を通常生産す
る細胞型とは異なる細胞型で生産がおこなわれるにも係わらず、該蛋白質の生産
は天然の生産に匹敵する。更に、特に造血リンパ親和性疾患のような疾患に対す
る感受性又は特定遺伝子産物を阻止するために、リボソーム、アンチセンス又は
他のメッセージを挿入することも可能である。
等の特定の分泌産物の欠失に関連するような、造血細胞に関連する病気以外の病
気も遺伝子修飾によって治療することが出来る。適当な調節開始領域を含むこと
によって、欠損した蛋白質の誘導生産が行われ、このような蛋白質を通常生産す
る細胞型とは異なる細胞型で生産がおこなわれるにも係わらず、該蛋白質の生産
は天然の生産に匹敵する。更に、特に造血リンパ親和性疾患のような疾患に対す
る感受性又は特定遺伝子産物を阻止するために、リボソーム、アンチセンス又は
他のメッセージを挿入することも可能である。
【００５４】 本発明で有利に使用することが出来るレトロウイルスベクターは、当該技術分
野において既に記載した製造者が組換えによって製造している。例えば、WO94／
29438，WO97／21824及びWO97／21825には、レトロウイルスパッケージングプラ スミド及びパッケージング細胞系の構築について記載されている。当業者には自
明であるが、本発明で有用なレトロウイルスベクターはＨＳＣｓに感染すること
が出来るものである。ベクターの構築、細胞へのトランスフェクション及び感染
に使用される技術手段は当業界において広範囲に実施されている。レトロウイル
スベクターの例として、マウス、鳥類又は霊長類のレトロウイルス由来のものが
ある。ヒト細胞へ効率良く感染するレトロウイルス変異体が利用できるために、
モロニー（Ｍｏ）マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）に基づくレトロウイルスベ
クターは最も通常使用される。他の適当なベクターの例として、ギボン猿白血病
ウイルス（ＧＡＬＶ）又はＨＩＶに基づくベクターを挙げることが出来る。
野において既に記載した製造者が組換えによって製造している。例えば、WO94／
29438，WO97／21824及びWO97／21825には、レトロウイルスパッケージングプラ スミド及びパッケージング細胞系の構築について記載されている。当業者には自
明であるが、本発明で有用なレトロウイルスベクターはＨＳＣｓに感染すること
が出来るものである。ベクターの構築、細胞へのトランスフェクション及び感染
に使用される技術手段は当業界において広範囲に実施されている。レトロウイル
スベクターの例として、マウス、鳥類又は霊長類のレトロウイルス由来のものが
ある。ヒト細胞へ効率良く感染するレトロウイルス変異体が利用できるために、
モロニー（Ｍｏ）マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）に基づくレトロウイルスベ
クターは最も通常使用される。他の適当なベクターの例として、ギボン猿白血病
ウイルス（ＧＡＬＶ）又はＨＩＶに基づくベクターを挙げることが出来る。
【００５５】 モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＬＶ）に基づくレトロウイルスベクター
由来のレトロウイルスベクター構築物を製造する際に、多くの場合には、ウイル
スｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖ配列をウイルスから除去し、外来性ＤＮＡ配列を挿
入する為のスペースを作る。該が外来性DNAにコードされている遺伝子は、通常L
TR内の強力なウイルスプロモーターの調節下で発現される。このような構築物は
、もしｇａｇ，ｐoｌ及びｅｎｖ機能がパッケージング細胞系によって外部から （in trans）与えられれば、ウイルス粒子内に効率良く包み込むことが出来る。
即ち、ベクター構築物がパッケージング細胞に導入され、該細胞によって生産さ
れるｇａｇ，ｐoｌ及びｅｎｖ蛋白質がベクターＲＮＡと組み合わされて感染性 ビリオンが生産され、それが培養培地内に分泌される。こうして生産されたウイ
ルスは標的細胞に感染し、そのＤＮＡ内に組み込まれるが、必須のパッケージン
グ配列が欠けているために、感染性ウイルス粒子を生産することはない。現在使
用することが出来るパッケージング細胞系の殆どは、夫々が必要なコード領域の
一つを含有している別のプラスミドで既にトランスフェクトされているために、
複製成分ウイルスが生産される為には複数の組換え現象が必要である。別の方法
では、パッケージング細胞系は既に組み込まれたプロウイルスを有している。こ
の場合には該細胞は感染性ウイルスを構成するのに必要な全ての蛋白質を生産す
るが、障害を受けているために (crippled) 、それ自身のＲＮＡをウイルスにパ
ッケージすることが出来ない。代わりに、組換えウイルスによって生産されたＲ
ＮＡがパッケージされる。従って、パッケージング細胞から放出されたウイルス
ストックは組換えウイルスのみを含有する。
由来のレトロウイルスベクター構築物を製造する際に、多くの場合には、ウイル
スｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖ配列をウイルスから除去し、外来性ＤＮＡ配列を挿
入する為のスペースを作る。該が外来性DNAにコードされている遺伝子は、通常L
TR内の強力なウイルスプロモーターの調節下で発現される。このような構築物は
、もしｇａｇ，ｐoｌ及びｅｎｖ機能がパッケージング細胞系によって外部から （in trans）与えられれば、ウイルス粒子内に効率良く包み込むことが出来る。
即ち、ベクター構築物がパッケージング細胞に導入され、該細胞によって生産さ
れるｇａｇ，ｐoｌ及びｅｎｖ蛋白質がベクターＲＮＡと組み合わされて感染性 ビリオンが生産され、それが培養培地内に分泌される。こうして生産されたウイ
ルスは標的細胞に感染し、そのＤＮＡ内に組み込まれるが、必須のパッケージン
グ配列が欠けているために、感染性ウイルス粒子を生産することはない。現在使
用することが出来るパッケージング細胞系の殆どは、夫々が必要なコード領域の
一つを含有している別のプラスミドで既にトランスフェクトされているために、
複製成分ウイルスが生産される為には複数の組換え現象が必要である。別の方法
では、パッケージング細胞系は既に組み込まれたプロウイルスを有している。こ
の場合には該細胞は感染性ウイルスを構成するのに必要な全ての蛋白質を生産す
るが、障害を受けているために (crippled) 、それ自身のＲＮＡをウイルスにパ
ッケージすることが出来ない。代わりに、組換えウイルスによって生産されたＲ
ＮＡがパッケージされる。従って、パッケージング細胞から放出されたウイルス
ストックは組換えウイルスのみを含有する。
【００５６】 レトロウイルス又はレトロウイルスベクターに感染される宿主細胞の範囲はウ
イルスのエンベロープ蛋白質によって決まる。組換えウイルスは実際に、パッケ
ージング細胞によって提供されるenv蛋白質によって認識されるあらゆる型の細 胞に感染することが出来、ウイルスゲノムを形質導入した細胞に組み込み、外来
性遺伝子産物を安定的に生産する。一般的に、ＭｏＭＬＶのマウス同種指向性en
v はげっし類細胞に感染することが出来るが、両種指向性env は、げっし類、鳥
類細胞、及びヒト細胞を含む幾つかの霊長類類細胞に感染することが出来る。Ｍ
ｏＭＬＶシステムで使用することが出来る両種指向性パッケージング細胞系は当
業界で公知であり、市販されている。その非限定的例として、ＰＡ１２及びＰＡ
３１７を挙げることが出来る (Miller et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-
437; Miller et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902; Danos et al. (19
88) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6460-6464 )。ヒト細胞への感染が可能で ある異種指向性ベクターシステムも存在する。
イルスのエンベロープ蛋白質によって決まる。組換えウイルスは実際に、パッケ
ージング細胞によって提供されるenv蛋白質によって認識されるあらゆる型の細 胞に感染することが出来、ウイルスゲノムを形質導入した細胞に組み込み、外来
性遺伝子産物を安定的に生産する。一般的に、ＭｏＭＬＶのマウス同種指向性en
v はげっし類細胞に感染することが出来るが、両種指向性env は、げっし類、鳥
類細胞、及びヒト細胞を含む幾つかの霊長類類細胞に感染することが出来る。Ｍ
ｏＭＬＶシステムで使用することが出来る両種指向性パッケージング細胞系は当
業界で公知であり、市販されている。その非限定的例として、ＰＡ１２及びＰＡ
３１７を挙げることが出来る (Miller et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-
437; Miller et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902; Danos et al. (19
88) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6460-6464 )。ヒト細胞への感染が可能で ある異種指向性ベクターシステムも存在する。
【００５７】 レトロウイルスベクターの宿主範囲は基本（第一）ウイルスのenv蛋白質を第 二ウイルスのenv蛋白質と置換することによって変更することが可能である。そ の結果得られる「擬型 (psuedotyped) 」ウイルスはエンベロープ蛋白質を支配 するウイルスの宿主範囲を有し、パッケージング細胞系によって発現される。最
近、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧ糖蛋白質がＭｏＭＬＶのenv蛋白 質と置換された (Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:8033-80
37; WO92/14829) 。感染は特異的受容体に依存することはないので、ＶＳＶ−Ｇ
擬型ベクターは広い宿主範囲を有する。
近、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧ糖蛋白質がＭｏＭＬＶのenv蛋白 質と置換された (Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:8033-80
37; WO92/14829) 。感染は特異的受容体に依存することはないので、ＶＳＶ−Ｇ
擬型ベクターは広い宿主範囲を有する。
【００５８】 通常は、ベクターは少なくとも二つの外来性遺伝子又は遺伝配列：（ｉ）導入
される治療遺伝子、及び（ｉｉ）感染細胞の追跡を可能にするマーカー遺伝子を
含有する。本明細書中で、「治療遺伝子」とは、完全遺伝子又は内在性遺伝子の
欠陥から生じる疾患を補償することが出来る該遺伝子の機能的活性断片のみを意
味する。更に治療遺伝子はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンス抑
制に有用な遺伝子並びにリボザイム介在治療のためのリボザイムをも含むもので
ある。優性阻害オリゴヌクレオチド及びペプチドをコードする治療遺伝子、並び
に調節蛋白質及びオリゴヌクレオチドをコードする遺伝子も本発明の範囲に含ま
れる。特定疾患の治療の為には一つ以上の遺伝子が必要かもしれないが、一般的
には、遺伝子治療とは、単一の治療遺伝子を導入することから成る。一具体例で
は、治療遺伝子は、欠陥遺伝子の正常、即ち、野生型のコピー、又はその機能的
相同体（ホモログ）である。別の具体例では、治療遺伝子は野生型の優性変異体
である。一つのベクター当り１以上の遺伝子を投与することが出来、又は、幾つ
かの適合ベクター (compatible vector) を使用して一つ以上の遺伝子を運搬す ることも可能である。遺伝的欠陥に応じて、治療遺伝子は調節及び非翻訳配列を
含むことが出来る。ヒト患者における遺伝子治療においては、治療遺伝子は一般
的にはヒト由来であるが、高い相同性、及びヒトにおいて生物学的に同一又は等
価な機能を示すような、密接に関連する他の種由来の遺伝子も使用することが出
来る。例えば、ヒト体内でグルコースをグリコーゲンに変換することが出来る産
物の遺伝子である霊長類インシュリン遺伝子は、ヒト遺伝子の機能的な等価物と
考えられる。治療で使用するのに適した治療遺伝子は病気に応じて変わる。例え
ば、鎌状細胞貧血治療に適した治療遺伝子は、βグロブリン遺伝子の正常なコピ
ーである。ＳＣＩＤ治療に適した遺伝子は正常なＡＤＡ遺伝子である。
される治療遺伝子、及び（ｉｉ）感染細胞の追跡を可能にするマーカー遺伝子を
含有する。本明細書中で、「治療遺伝子」とは、完全遺伝子又は内在性遺伝子の
欠陥から生じる疾患を補償することが出来る該遺伝子の機能的活性断片のみを意
味する。更に治療遺伝子はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンス抑
制に有用な遺伝子並びにリボザイム介在治療のためのリボザイムをも含むもので
ある。優性阻害オリゴヌクレオチド及びペプチドをコードする治療遺伝子、並び
に調節蛋白質及びオリゴヌクレオチドをコードする遺伝子も本発明の範囲に含ま
れる。特定疾患の治療の為には一つ以上の遺伝子が必要かもしれないが、一般的
には、遺伝子治療とは、単一の治療遺伝子を導入することから成る。一具体例で
は、治療遺伝子は、欠陥遺伝子の正常、即ち、野生型のコピー、又はその機能的
相同体（ホモログ）である。別の具体例では、治療遺伝子は野生型の優性変異体
である。一つのベクター当り１以上の遺伝子を投与することが出来、又は、幾つ
かの適合ベクター (compatible vector) を使用して一つ以上の遺伝子を運搬す ることも可能である。遺伝的欠陥に応じて、治療遺伝子は調節及び非翻訳配列を
含むことが出来る。ヒト患者における遺伝子治療においては、治療遺伝子は一般
的にはヒト由来であるが、高い相同性、及びヒトにおいて生物学的に同一又は等
価な機能を示すような、密接に関連する他の種由来の遺伝子も使用することが出
来る。例えば、ヒト体内でグルコースをグリコーゲンに変換することが出来る産
物の遺伝子である霊長類インシュリン遺伝子は、ヒト遺伝子の機能的な等価物と
考えられる。治療で使用するのに適した治療遺伝子は病気に応じて変わる。例え
ば、鎌状細胞貧血治療に適した治療遺伝子は、βグロブリン遺伝子の正常なコピ
ーである。ＳＣＩＤ治療に適した遺伝子は正常なＡＤＡ遺伝子である。
【００５９】 治療遺伝子のヌクレオチド配列は一般的には当業界で公知であるか、又は、Ge
nBankのような様々なデータベースから入手することが出来る。治療遺伝子自体 は一般的に入手可能であり、又は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Perkin-Elm
er）及び他の標準的な組換え技術を使用して単離・クローニングすることが出来
る。当業者であれば、如何なる治療遺伝子も適合制限酵素で切り出し、造血細胞
中で該治療遺伝子を適切に発現するようにベクターに挿入することが可能である
ことを容易に認識するであろう。
nBankのような様々なデータベースから入手することが出来る。治療遺伝子自体 は一般的に入手可能であり、又は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Perkin-Elm
er）及び他の標準的な組換え技術を使用して単離・クローニングすることが出来
る。当業者であれば、如何なる治療遺伝子も適合制限酵素で切り出し、造血細胞
中で該治療遺伝子を適切に発現するようにベクターに挿入することが可能である
ことを容易に認識するであろう。
【００６０】 ＤＮＡ構築物が組み込まれなかった細胞に対して、組み込まれた細胞を選択し
、形質導入が成功したか否かを追跡する目的で、マーカー遺伝子をベクターに含
有させることが出来る。例えば、様々なマーカー遺伝子の非限定的な例として、
Ｇ４１８又はハイグロマイシンのような抗生物質に対する耐性マーカーを挙げる
ことが出来る。便宜性では劣るが、例えば、マーカーとして、アシクロビル又は
ガンシクロビルのような薬剤に対して細胞を感受性にするＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を
マーカーとして使用するような、陰性選択も可能である。又は、ＦＡＣＳソーテ
ィングにより導入遺伝子を発現する幹細胞を選択する為の適当な細胞表面マーカ
ーを採用することによっても選択が可能である。ＮｅｏＲ（ネオマイシン／Ｇ４
１８耐性）遺伝子が通常使用されるが、受容細胞には存在していない配列を有す
る、あらゆる従来のマーカー遺伝子を使用することが出来る。
、形質導入が成功したか否かを追跡する目的で、マーカー遺伝子をベクターに含
有させることが出来る。例えば、様々なマーカー遺伝子の非限定的な例として、
Ｇ４１８又はハイグロマイシンのような抗生物質に対する耐性マーカーを挙げる
ことが出来る。便宜性では劣るが、例えば、マーカーとして、アシクロビル又は
ガンシクロビルのような薬剤に対して細胞を感受性にするＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を
マーカーとして使用するような、陰性選択も可能である。又は、ＦＡＣＳソーテ
ィングにより導入遺伝子を発現する幹細胞を選択する為の適当な細胞表面マーカ
ーを採用することによっても選択が可能である。ＮｅｏＲ（ネオマイシン／Ｇ４
１８耐性）遺伝子が通常使用されるが、受容細胞には存在していない配列を有す
る、あらゆる従来のマーカー遺伝子を使用することが出来る。
【００６１】 粒子の安定性を高め、感染における宿主の範囲又は細胞型特異的なターゲッテ
ィング (targeting) を拡大する為に、キメラエンベロープ蛋白質又は非ウイル ス膜蛋白質をレトロウイルス粒子内にとり込ませることによってウイルスベクタ
ーを修飾することが出来る。宿主範囲が変更されたレトロウイルスベクターの製
造に関しては、例えば、WO92/14829 及び WO93/14188に教示されている。インビ
ボにおける特異的な細胞型に対するターゲッティングを行うことが可能なレトロ
ウイルスベクターは、例えば、Kasahara et al. (1994) Science 266:1373-1376
にも記載されている。このKasahara et al.には、ヒトエリスロポイエチン（Ｅ
ＰＯ）及びとウイルスエンベロープ蛋白質とが融合して成るキメラエンベロープ
蛋白質を有するモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）の構築に関して記
載されている。このハイブリッドウイルスはＥＰＯに対する受容体を有するヒト
赤血球前駆細胞に対する向性を有しており、それ故に鎌状細胞貧血及びサラセミ
アの遺伝子治療に有用である。ＨＳＣｓに対して特異的にターゲッティングして
感染するレトロウイルスベクターはインビボ遺伝子治療に好適である。
ィング (targeting) を拡大する為に、キメラエンベロープ蛋白質又は非ウイル ス膜蛋白質をレトロウイルス粒子内にとり込ませることによってウイルスベクタ
ーを修飾することが出来る。宿主範囲が変更されたレトロウイルスベクターの製
造に関しては、例えば、WO92/14829 及び WO93/14188に教示されている。インビ
ボにおける特異的な細胞型に対するターゲッティングを行うことが可能なレトロ
ウイルスベクターは、例えば、Kasahara et al. (1994) Science 266:1373-1376
にも記載されている。このKasahara et al.には、ヒトエリスロポイエチン（Ｅ
ＰＯ）及びとウイルスエンベロープ蛋白質とが融合して成るキメラエンベロープ
蛋白質を有するモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）の構築に関して記
載されている。このハイブリッドウイルスはＥＰＯに対する受容体を有するヒト
赤血球前駆細胞に対する向性を有しており、それ故に鎌状細胞貧血及びサラセミ
アの遺伝子治療に有用である。ＨＳＣｓに対して特異的にターゲッティングして
感染するレトロウイルスベクターはインビボ遺伝子治療に好適である。
【００６２】 ウイルス構築物は様々な従来技術により作成することが可能である。長い末端
反復配列（ＬＴＲ）、マーカー遺伝子及び制限部位等の所望の特性を有する数多
くのベクターが市販されていおり、当該技術分野で公知の方法にてそれらを更に
修飾することも可能でる。このような構築物は、細胞表面又は分泌蛋白質をコー
ドする遺伝子が適切に翻訳後プロセッシングされ、必要に応じて細胞表面に発現
されるように、シグナルペプチド配列をコードすることも出来る。好ましくは、
外来性遺伝子は細胞特異的プロモーターの調節下に置かれる。
反復配列（ＬＴＲ）、マーカー遺伝子及び制限部位等の所望の特性を有する数多
くのベクターが市販されていおり、当該技術分野で公知の方法にてそれらを更に
修飾することも可能でる。このような構築物は、細胞表面又は分泌蛋白質をコー
ドする遺伝子が適切に翻訳後プロセッシングされ、必要に応じて細胞表面に発現
されるように、シグナルペプチド配列をコードすることも出来る。好ましくは、
外来性遺伝子は細胞特異的プロモーターの調節下に置かれる。
【００６３】 導入された遺伝子の発現は、遺伝子導入の目的及び所望効果に応じて様々な方
法で調節される。即ち、形質導入された遺伝子は、構成的に発現させるか、特異
的な生理的条件下のみで発現させるか、又は、特定の細胞型においてのみ発現さ
せるようなプロモーターの調節下に置かれる。
法で調節される。即ち、形質導入された遺伝子は、構成的に発現させるか、特異
的な生理的条件下のみで発現させるか、又は、特定の細胞型においてのみ発現さ
せるようなプロモーターの調節下に置かれる。
【００６４】 レトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）は殆どの造血細胞中でインビボ
活性であり、一般的に挿入配列の転写及びその構成的発現に関して関与する ((O
hashi et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:11332; Correll et al. (199
2) Blood 80:331) 。その他の適当なプロモーターには、例えば、ヒトサイトメ ガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、及びモロニーマウス肉腫ウイルス
（ＭＭＳＶ），ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、又は脾臓フォーカス形成ウイル
ス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域プロモーターが有る。
活性であり、一般的に挿入配列の転写及びその構成的発現に関して関与する ((O
hashi et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:11332; Correll et al. (199
2) Blood 80:331) 。その他の適当なプロモーターには、例えば、ヒトサイトメ ガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、及びモロニーマウス肉腫ウイルス
（ＭＭＳＶ），ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、又は脾臓フォーカス形成ウイル
ス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域プロモーターが有る。
【００６５】 特異的細胞型において導入配列を発現させることが出来るプロモーターの例に
は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞における発現用のグランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ）Ａ
、幹細胞及び前駆細胞における発現用のＣＤ３４プロモーター、細胞障害性Ｔ細
胞における発現用のＣＤ８プロモーター、及び骨髄性細胞における発現用のＣＤ
１１ｂプロモーターがある。
は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞における発現用のグランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ）Ａ
、幹細胞及び前駆細胞における発現用のＣＤ３４プロモーター、細胞障害性Ｔ細
胞における発現用のＣＤ８プロモーター、及び骨髄性細胞における発現用のＣＤ
１１ｂプロモーターがある。
【００６６】 ある生理的条件下での遺伝子発現用には、誘導プロモーターを使用することが
出来る。例えば、求電子的分子に応答して化学物質耐性遺伝子の発現を誘導する
には求電子的応答要素が使用される。適当な局在化配列を付することによって、
例えば、核等の適切な細胞部位に遺伝子産物をターゲッティングさせることによ
り、治療効果を更に増大させることが出来る。
出来る。例えば、求電子的分子に応答して化学物質耐性遺伝子の発現を誘導する
には求電子的応答要素が使用される。適当な局在化配列を付することによって、
例えば、核等の適切な細胞部位に遺伝子産物をターゲッティングさせることによ
り、治療効果を更に増大させることが出来る。
【００６７】 感染性ビリオンを生み出すパッケージング細胞系内にベクター構築物を導入す
ることが出来る。複製欠損組換えウイルスを高力価（タイター）で生産すること
が出来るパッケージング細胞系は、例えば、WO94/29438 に記載されているよう に当業者に公知である。インビボ感染の為に、トランスフェクションの48時間後
の上清のろ過等の当業界で公知の方法によって、ウイルス粒子は細胞上清から回
収・精製される。ウイルス力価はウイルス上清の滴定で一定数の（レトロウイル
スの種類に応じた）適当な細胞を感染させることによって決定する。形質導入効
率はＦＡＣＳ及びサザンブロッティングの両方によって４８時間後にアッセイす
ることが出来る。
ることが出来る。複製欠損組換えウイルスを高力価（タイター）で生産すること
が出来るパッケージング細胞系は、例えば、WO94/29438 に記載されているよう に当業者に公知である。インビボ感染の為に、トランスフェクションの48時間後
の上清のろ過等の当業界で公知の方法によって、ウイルス粒子は細胞上清から回
収・精製される。ウイルス力価はウイルス上清の滴定で一定数の（レトロウイル
スの種類に応じた）適当な細胞を感染させることによって決定する。形質導入効
率はＦＡＣＳ及びサザンブロッティングの両方によって４８時間後にアッセイす
ることが出来る。
【００６８】 ウイルスによる形質導入後に、形質導入された幹細胞又は前駆細胞中のウイス
ルベクターの存在はＰＣＲ等の方法で確認することが出来る。ＰＣＲによって、
マーカー遺伝子又は他のウイルス形質導入配列を検出することが出来る。一般的
には、定期的に血液試料をとり、例えば、Ｎｅｏ耐性遺伝子がマーカーとして使
用されているような場合には、Ｎｅｏプローブを用いて従来の方法でＰＣＲを行
う。骨髄性細胞又は成熟造血細胞中にウイルス形質導入配列が存在することによ
って、形質導入ＨＳｃｓによって再構成が成功したことが証明される。ＰＣＲ技
術及びその試薬は当該技術分野で周知であり、一般的には、PCR Protocols, A g uide to Methods and Applications . Innis, Gelfand, Sninsky & White, eds.
(Academic Press, Inc. San Diego, 1990) 及び 市販品(Perkin-Elmer) を参照 されたし。
ルベクターの存在はＰＣＲ等の方法で確認することが出来る。ＰＣＲによって、
マーカー遺伝子又は他のウイルス形質導入配列を検出することが出来る。一般的
には、定期的に血液試料をとり、例えば、Ｎｅｏ耐性遺伝子がマーカーとして使
用されているような場合には、Ｎｅｏプローブを用いて従来の方法でＰＣＲを行
う。骨髄性細胞又は成熟造血細胞中にウイルス形質導入配列が存在することによ
って、形質導入ＨＳｃｓによって再構成が成功したことが証明される。ＰＣＲ技
術及びその試薬は当該技術分野で周知であり、一般的には、PCR Protocols, A g uide to Methods and Applications . Innis, Gelfand, Sninsky & White, eds.
(Academic Press, Inc. San Diego, 1990) 及び 市販品(Perkin-Elmer) を参照 されたし。
【００６９】 本発明が提供する方法によって、従来のＨＳｃｓへの遺伝子導入プロトコール
における少なくとも３つの欠陥が克服される。即ち、本明細書に記載された培養
条件によって、従来のサイトカイン処理で見られたような付随的分化又は他の薬
剤で見られたヒト毒性がなく、レトロウイルス感染に必須の活性周期化されたＨ
ＳＣｓが得られ、更に、遺伝子導入及び移植に必要なＨＳＣｓの数を増大させる
ことが出来る。
における少なくとも３つの欠陥が克服される。即ち、本明細書に記載された培養
条件によって、従来のサイトカイン処理で見られたような付随的分化又は他の薬
剤で見られたヒト毒性がなく、レトロウイルス感染に必須の活性周期化されたＨ
ＳＣｓが得られ、更に、遺伝子導入及び移植に必要なＨＳＣｓの数を増大させる
ことが出来る。
【００７０】 本明細書に記載の細胞集団、培養条件、サイトカイン、接着分子及び誘導体は
、本明細書中に記載の治療方法に使用する薬剤の調製に使用することができる。
、本明細書中に記載の治療方法に使用する薬剤の調製に使用することができる。
【００７１】 以下の実施例は、本発明を如何なる意味でも限定するものではない。
【００７２】
【実施例】抗体 ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞を濃縮するために、、Ｔｕｋ３（Dr. Zi
egler, University of Berlin, Berlin , Germanyから入手した抗ＣＤ３４抗体 ）を直接スルホローダミン（ＳＲ）に結合させ、ＧＭ２０１（Dr. W. Rettig, L
udwig Cancer Research Institute, New York, NY から入手した抗ヒトＴｈｙ−
１抗体）を直接フィコエリトリン（ＰＥ: SyStemix, Palo Alto, CA ）に結合さ
せた。ＳＲ（SyStemix）に結合したＦＬＯＰＣ２１マウスＩｇＧ３(Sigma, St.
Louis, MO) を抗ＣＤ３４（Ｔｕｋ３）染色に対するイソタイプ対照として使用 した。ＰＥ（SyStemix）に結合した精製マウスＩｇＧ１(Becton Dickinson, Mou
ntain View, CA) 抗Ｔｈｙ−１染色に対するイソタイプ対照として使用した。フ
ルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合した、Ｌｅｕ−５ｂ（抗Ｃ
Ｄ２）、Ｌｅｕ−Ｍ３（抗ＣＤ１４））、Ｌｅｕ−Ｍｌ（抗ＣＤ１５）、Ｌｅｕ
−ｌｌａ（抗ＣＤ１６）、及びＳＪ２５Ｃｌ（抗ＣＤ１９）抗体の系列パネル、
ＦＩＴＣに結合したマウスＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ、ＰＥ−及びＦＩＴＣ−結合
ＢＰＣＡ−２（抗ＣＤ３４）、並びにＰＥに結合したＬｅｕ−１２（抗ＣＤ１９
）及びＬｅｕ−Ｍ９（抗ＣＤ３３）はBecton Dickinsonから購入した。ＦＩＴＣ
に結合した抗体Ｄ２．１０（抗グリコフォリンＡ）はＡＭＡＣ(Westbrook, ME)
から購入した。ＨＬＡ分子の単一型(monomorphic) 又は多型 (polymorphic) 決 定基に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマはＡＴＣＣから購入
した。
egler, University of Berlin, Berlin , Germanyから入手した抗ＣＤ３４抗体 ）を直接スルホローダミン（ＳＲ）に結合させ、ＧＭ２０１（Dr. W. Rettig, L
udwig Cancer Research Institute, New York, NY から入手した抗ヒトＴｈｙ−
１抗体）を直接フィコエリトリン（ＰＥ: SyStemix, Palo Alto, CA ）に結合さ
せた。ＳＲ（SyStemix）に結合したＦＬＯＰＣ２１マウスＩｇＧ３(Sigma, St.
Louis, MO) を抗ＣＤ３４（Ｔｕｋ３）染色に対するイソタイプ対照として使用 した。ＰＥ（SyStemix）に結合した精製マウスＩｇＧ１(Becton Dickinson, Mou
ntain View, CA) 抗Ｔｈｙ−１染色に対するイソタイプ対照として使用した。フ
ルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合した、Ｌｅｕ−５ｂ（抗Ｃ
Ｄ２）、Ｌｅｕ−Ｍ３（抗ＣＤ１４））、Ｌｅｕ−Ｍｌ（抗ＣＤ１５）、Ｌｅｕ
−ｌｌａ（抗ＣＤ１６）、及びＳＪ２５Ｃｌ（抗ＣＤ１９）抗体の系列パネル、
ＦＩＴＣに結合したマウスＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ、ＰＥ−及びＦＩＴＣ−結合
ＢＰＣＡ−２（抗ＣＤ３４）、並びにＰＥに結合したＬｅｕ−１２（抗ＣＤ１９
）及びＬｅｕ−Ｍ９（抗ＣＤ３３）はBecton Dickinsonから購入した。ＦＩＴＣ
に結合した抗体Ｄ２．１０（抗グリコフォリンＡ）はＡＭＡＣ(Westbrook, ME)
から購入した。ＨＬＡ分子の単一型(monomorphic) 又は多型 (polymorphic) 決 定基に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマはＡＴＣＣから購入
した。
【００７３】実施例１：ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞の濃縮（富化） 骨髄からのＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞の精製： 正常ドナーからのヒト成人骨髄（ＡＢＭ）細胞について、磁気ビーズ選択装置
（SyStemix）を使用してＣＤ３４＋細胞に対して前濃縮した。ＣＤ３４＋細胞は
二人の多臓器提供者のＢＭからも選択し、使用前に凍結した。ＣＤ３４＋細胞を
氷上で１０分間、２ｍｇ／ｍｌ熱不活性化ヒトガンマグロブリン(Gamunune, Mil
es Inc., Elkhart, IN) と共にインキュベートして非特異的Ｆｃ結合をブロック
した。次いで、細胞を染色緩衝液（ＳＢ）で洗浄した。ＳＢはハンクス調整塩溶
液 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) 、０．５％牛血清アルブミン (Sigma) 、及
び１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Sigma) を含有するものである。抗ＣＤ−３４−ＳＲ （６μｇ／ｍｌ）、抗Ｔｈｙ−１−ＰＥ（１０μｇ／ｍｌ）及びＦＩＴＣ結合抗
体の系列パネルと共に、細胞を氷上で３０分間染色した。上記のように適当なイ
ソタイプ対照を使用した。細胞をＳＢで洗浄し、１μｇ／ｍｌプロピジウムヨー
ド（ＰＩ）(Molecular Probes Inc., Eugene, OR) 含有ＳＢ中に１０６個／ｍｌ
の濃度で再懸濁した。バンテージ蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ： Becton
Dickinson, Immunocytometry Systems, San Jose, CA) を使用して、生存する（
ＰＩｌｏ）ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞をソート（選択）した。このソ
ートを再度アッセイし、細胞亜集団がきれいに選択されたことを確認した。
（SyStemix）を使用してＣＤ３４＋細胞に対して前濃縮した。ＣＤ３４＋細胞は
二人の多臓器提供者のＢＭからも選択し、使用前に凍結した。ＣＤ３４＋細胞を
氷上で１０分間、２ｍｇ／ｍｌ熱不活性化ヒトガンマグロブリン(Gamunune, Mil
es Inc., Elkhart, IN) と共にインキュベートして非特異的Ｆｃ結合をブロック
した。次いで、細胞を染色緩衝液（ＳＢ）で洗浄した。ＳＢはハンクス調整塩溶
液 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) 、０．５％牛血清アルブミン (Sigma) 、及
び１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Sigma) を含有するものである。抗ＣＤ−３４−ＳＲ （６μｇ／ｍｌ）、抗Ｔｈｙ−１−ＰＥ（１０μｇ／ｍｌ）及びＦＩＴＣ結合抗
体の系列パネルと共に、細胞を氷上で３０分間染色した。上記のように適当なイ
ソタイプ対照を使用した。細胞をＳＢで洗浄し、１μｇ／ｍｌプロピジウムヨー
ド（ＰＩ）(Molecular Probes Inc., Eugene, OR) 含有ＳＢ中に１０６個／ｍｌ
の濃度で再懸濁した。バンテージ蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ： Becton
Dickinson, Immunocytometry Systems, San Jose, CA) を使用して、生存する（
ＰＩｌｏ）ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞をソート（選択）した。このソ
ートを再度アッセイし、細胞亜集団がきれいに選択されたことを確認した。
【００７４】実施例２：細胞増殖に対するＴＰＯ／ＦＬ／ＫＬ効果 ａ．ＰＫＨ２６蛍光色素ラベリング 無血清ＰＢＳで細胞を洗浄した。ＰＫＨ２６蛍光色素 (Sigma) をキット希釈 剤で１：２５０に希釈した。細胞ペレットを１０７個／ｍｌの濃度で再懸濁した
。この細胞懸濁液に等量のＰＫＨ２６を加えて、室温（ＲＴ）で正確に４分間イ
ンキュベートした。等量のＦＢＳ (Gemini BioProducts, Calabases, CA) を添 加し、室温（ＲＴ）で更に１分間インキュベートした。１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤ
Ｍを等量添加した。細胞を計数して、遠心分離した。ペレットを１０５個／ｍｌ
の濃度で、１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ（サイトカイン含有又は非含有）に再懸濁
し、短期間懸濁培養した。細胞を丸底９６穴プレートに１００μｌ／穴で接種し
た。
。この細胞懸濁液に等量のＰＫＨ２６を加えて、室温（ＲＴ）で正確に４分間イ
ンキュベートした。等量のＦＢＳ (Gemini BioProducts, Calabases, CA) を添 加し、室温（ＲＴ）で更に１分間インキュベートした。１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤ
Ｍを等量添加した。細胞を計数して、遠心分離した。ペレットを１０５個／ｍｌ
の濃度で、１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ（サイトカイン含有又は非含有）に再懸濁
し、短期間懸濁培養した。細胞を丸底９６穴プレートに１００μｌ／穴で接種し
た。
【００７５】 ｂ．短期間懸濁培養 丸底９６穴プレート内の様々なサイトカインを含有する培地（１０％ＦＢＳ含
有ＩＭＤＭ）中で、ＰＫＨ２６標識ＢＭ ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞
を１０４個／１００μｌの濃度で６日間培養した。使用したサイトカインは、Ｉ
Ｌ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＬＩＦ（５０ｎｇ／
ｍｌ）(Novartis, Basel, Switzerland) 、ＴＰＯ（１０−１５ｎｇ／ｍｌ）(R&
D Systems, Minneapolis, MN) 、ＫＬ（５０−７５ｎｇ／ｍｌ）及びＦＬ（５０
−７５ｎｇ／ｍｌ）(SyStemix) であった。これらの濃度は本実施例に記載のＢ Ｍ試験の際に使用した濃度である。細胞数は細胞計測計（ヘマトサイトメーター
）及び死滅細胞の除去にトリパンブルーを使用して測定した。
有ＩＭＤＭ）中で、ＰＫＨ２６標識ＢＭ ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞
を１０４個／１００μｌの濃度で６日間培養した。使用したサイトカインは、Ｉ
Ｌ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＬＩＦ（５０ｎｇ／
ｍｌ）(Novartis, Basel, Switzerland) 、ＴＰＯ（１０−１５ｎｇ／ｍｌ）(R&
D Systems, Minneapolis, MN) 、ＫＬ（５０−７５ｎｇ／ｍｌ）及びＦＬ（５０
−７５ｎｇ／ｍｌ）(SyStemix) であった。これらの濃度は本実施例に記載のＢ Ｍ試験の際に使用した濃度である。細胞数は細胞計測計（ヘマトサイトメーター
）及び死滅細胞の除去にトリパンブルーを使用して測定した。
【００７６】 ｃ．ＣＤ３４＋細胞数及び全細胞数の増加 ＰＫＨ２６標識ＢＭ ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞の６日間の懸濁培
養によって、サイトカイン（単独、二種、及び三種の組み合わせ）の効果を試験
した。１０４個／１００μｌの濃度で６日間培養した。ＰＫＨ２６を使用した事
前の試験によれば、ＰＫＨ２６標識は細胞機能に悪影響を及ぼさないことが示さ
れている。
養によって、サイトカイン（単独、二種、及び三種の組み合わせ）の効果を試験
した。１０４個／１００μｌの濃度で６日間培養した。ＰＫＨ２６を使用した事
前の試験によれば、ＰＫＨ２６標識は細胞機能に悪影響を及ぼさないことが示さ
れている。
【００７７】 全細胞数及びＣＤ３４＋ヒトＢＭ細胞の６日間培養における増加（倍数）の比較
【００７８】
【表１】
【００７９】 表１の脚注 これらの培養物からのＣＤ３４亜集団（分裂又は非分裂）をＣＡＦＣアッセイ
で分析した。ＴＰＯ，ＫＬ及びＦＬに対する値は６つの実験の平均＋ＳＥＭであ
る。その他の全ての条件（ＴＰＯ（１）及びＫＬ（２）を除く）は３つの実験の
平均＋ＳＥＭである。
で分析した。ＴＰＯ，ＫＬ及びＦＬに対する値は６つの実験の平均＋ＳＥＭであ
る。その他の全ての条件（ＴＰＯ（１）及びＫＬ（２）を除く）は３つの実験の
平均＋ＳＥＭである。
【００８０】 表１に示されるように、単独のサイトカインは全細胞数又はＣＤ３４＋細胞数
を増加させることはなかった。ＴＰＯ，ＫＬ及びＦＬのうちの二つの組み合わせ
によって、ＣＤ３４＋細胞数を維持し、全細胞数中をわずかに増加させた（１．
７倍）。以上の試験結果の中で、ＴＰＯ，ＫＬ及びＦＬの三つサイトカインの組
み合わせが全細胞数（４．７倍）及びＣＤ３４＋細胞数（３．４倍）の双方につ
き、最も高い倍数を誘起した。ＩＬ‐３,ＩＬ‐6及びＬＩＦの三つの因子の組み
合わせは全細胞数を増加するような刺激は生起しなかった。
を増加させることはなかった。ＴＰＯ，ＫＬ及びＦＬのうちの二つの組み合わせ
によって、ＣＤ３４＋細胞数を維持し、全細胞数中をわずかに増加させた（１．
７倍）。以上の試験結果の中で、ＴＰＯ，ＫＬ及びＦＬの三つサイトカインの組
み合わせが全細胞数（４．７倍）及びＣＤ３４＋細胞数（３．４倍）の双方につ
き、最も高い倍数を誘起した。ＩＬ‐３,ＩＬ‐6及びＬＩＦの三つの因子の組み
合わせは全細胞数を増加するような刺激は生起しなかった。
【００８１】実施例３：培養細胞からのＣＤ３４／ＰＫＨサブセットのＦＡＣＳソーティング 分裂を経た始原造血前駆細胞（Primitive hemopoietic progenitors :ＰＨＰ ）数が維持されているか、又は増加しているかを決定するために、ＣＤ３４ｈｉ ＢＭ細胞中の非分裂（ＰＫＨｈｉ）及び分裂（ＰＫＨｌｏ）亜集団を上記の濃度
で様々なサイトカイニンを組み合わせて含有する６日間の培養物から精製した。
ＦＬ単独又はその他のサイトカインの一つ又はそれ以上との組み合わせの効果に
ついては３−６の実験を実施した（図１）。ＦＬ単独で培養した場合、殆どのＣ
Ｄ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞（ＢＭ）は非分裂ＰＫＨ２６ｈｉ（７８％）
であった。分裂後細胞の６８％（平均７３％）はＣＤ３４発現を喪失した。ＫＬ
をＦＬに追加すると非分裂細胞の割合が半分（４０％）になり、分裂後細胞の５
５％（平均５８％）がＣＤ３４発現を喪失した。ＴＰＯを更にＫＬ及びＦＬに追
加すると、非常に高い分裂を示し（４％が非分裂で残存）、分裂後のＣＤ３４の
喪失も僅か２９％（平均２７％）であった。ＴＰＯを含有するその他の組み合わ
せ、例えば、ＴＰＯ及びＦＬ、又は、ＴＰＯ，ＩＬ−３及びＦＬでは、約３０％
の割合で、分裂後細胞のＣＤ３４発現の喪失が起こった。ＩＬ−３はヒトＨＳＣ
ｓの分裂、及び分化（ＣＤ３４の喪失）を誘導することが以前示されている (Yo
ung et al. (1996), Blood 88:1619) 。ＴＰＯを添加することにより、細胞分裂
を増加させるだけでなく、ＩＬ−３の分化促進作用を打ち消すことが示されたも
のと思われる。
で様々なサイトカイニンを組み合わせて含有する６日間の培養物から精製した。
ＦＬ単独又はその他のサイトカインの一つ又はそれ以上との組み合わせの効果に
ついては３−６の実験を実施した（図１）。ＦＬ単独で培養した場合、殆どのＣ
Ｄ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞（ＢＭ）は非分裂ＰＫＨ２６ｈｉ（７８％）
であった。分裂後細胞の６８％（平均７３％）はＣＤ３４発現を喪失した。ＫＬ
をＦＬに追加すると非分裂細胞の割合が半分（４０％）になり、分裂後細胞の５
５％（平均５８％）がＣＤ３４発現を喪失した。ＴＰＯを更にＫＬ及びＦＬに追
加すると、非常に高い分裂を示し（４％が非分裂で残存）、分裂後のＣＤ３４の
喪失も僅か２９％（平均２７％）であった。ＴＰＯを含有するその他の組み合わ
せ、例えば、ＴＰＯ及びＦＬ、又は、ＴＰＯ，ＩＬ−３及びＦＬでは、約３０％
の割合で、分裂後細胞のＣＤ３４発現の喪失が起こった。ＩＬ−３はヒトＨＳＣ
ｓの分裂、及び分化（ＣＤ３４の喪失）を誘導することが以前示されている (Yo
ung et al. (1996), Blood 88:1619) 。ＴＰＯを添加することにより、細胞分裂
を増加させるだけでなく、ＩＬ−３の分化促進作用を打ち消すことが示されたも
のと思われる。
【００８２】実施例４：ＣＡＦＣアッセイ 分裂を経た後のＣＤ３４ｈｉ発現の維持が機能的な始原造血前駆細胞 (Primit
ive hemopoietic progenitors :ＰＨＰ)の維持と関連するか否かを決定するため
に、３種類サイトカイン条件下で培養した後にＣＤ３４／ＰＫＨ２６サブセット
を精製し、ＣＡＦＣ活性についてアッセイした。
ive hemopoietic progenitors :ＰＨＰ)の維持と関連するか否かを決定するため
に、３種類サイトカイン条件下で培養した後にＣＤ３４／ＰＫＨ２６サブセット
を精製し、ＣＡＦＣ活性についてアッセイした。
【００８３】 ａ．コブルストーン領域形成細胞アッセイ (cobblestone area-forming assay) Murray et al. (1995) Blood 85:368 に記載されたCＡＦＣアッセイにおいて 、細胞の一部を限界希釈で培養した。簡潔に述べると、１ｍＭピルビン酸ナトリ
ウム (JRH BioSciences) 、５ｘ１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール(sigma) 、１０％ＦＢＳ，ＩＬ−６及びＬＩＦを含有する１：１ＩＭＤＭ／ＲＰＭＩ培地
中でマウスストローマ細胞系（Ｓｙｓ−１）を前接種した丸底９６穴プレート内
で細胞を培養した限界希釈は、１００個／穴から０．７８個／穴の範囲であった
。５週間後、コブルストーン領域を含む穴を計数し、Frzekas de St. Groth (19
82) J. Immunol. Methods 49:R11 に記載されたＳＡＳソフトウェアーによる最 尤推測を使用して、細胞集団のＣＡＦＣ頻度を計算した。培養細胞集団間のＣＡ
ＦＣ頻度差の統計的有意性はＡＮＯＶＡによって決定した。培養細胞及び開始細
胞集団の間のＣＡＦＣ数の差の統計的有意性はステューデントｔテストを用いて
決定した。コブルストーン領域を含む（少なくとも試料グループ当り１０）代表
的な穴は、ＣＤ３３＋未成熟骨髄性細胞、ＣＤ１９＋Ｂリンパ系細胞、及びＣＤ
３４＋前駆細胞集団の存在に関して、ＦＡＣＳにより個別的に分析し、元の細胞
の多系列能を評価した。
ウム (JRH BioSciences) 、５ｘ１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール(sigma) 、１０％ＦＢＳ，ＩＬ−６及びＬＩＦを含有する１：１ＩＭＤＭ／ＲＰＭＩ培地
中でマウスストローマ細胞系（Ｓｙｓ−１）を前接種した丸底９６穴プレート内
で細胞を培養した限界希釈は、１００個／穴から０．７８個／穴の範囲であった
。５週間後、コブルストーン領域を含む穴を計数し、Frzekas de St. Groth (19
82) J. Immunol. Methods 49:R11 に記載されたＳＡＳソフトウェアーによる最 尤推測を使用して、細胞集団のＣＡＦＣ頻度を計算した。培養細胞集団間のＣＡ
ＦＣ頻度差の統計的有意性はＡＮＯＶＡによって決定した。培養細胞及び開始細
胞集団の間のＣＡＦＣ数の差の統計的有意性はステューデントｔテストを用いて
決定した。コブルストーン領域を含む（少なくとも試料グループ当り１０）代表
的な穴は、ＣＤ３３＋未成熟骨髄性細胞、ＣＤ１９＋Ｂリンパ系細胞、及びＣＤ
３４＋前駆細胞集団の存在に関して、ＦＡＣＳにより個別的に分析し、元の細胞
の多系列能を評価した。
【００８４】 ｂ．コブルストーン領域のＣＡＦＣ頻度及び表現型の分析 ソートされた培養細胞のＣＤ３４／ＰＫＨ２６亜集団のＰＨＰ活性を、ＣＡＦ
Ｃアッセイにより、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞の開始集団のＣＡＦＣ
頻度と比較して、インビトロで評価した。ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞
の開始集団のＣＡＦＣ平均頻度は１／２１から１／４６（細胞集密度 (confiden
ce) ９５％限界１／１６から１／５２）であった（表２）。新たな各ＢＭから得
られた細胞数に限界があった為に、各実験に唯一つのサイトカインの組み合わせ
しか使用することが出来なかった。その為に、或程度の組織間の変動が生じた。
ＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＬＩＦの場合には、非分裂ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｈｉ亜
集団は始原の状態を維持し、培養前のＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞集団
と同じ平均ＣＡＦＣ頻度を保持した。しかしながら、ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ小
亜集団内のＣＡＦＣ頻度は、平均１／４４０（１／２４９１／８１３）まで２１
倍減少した。
Ｃアッセイにより、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞の開始集団のＣＡＦＣ
頻度と比較して、インビトロで評価した。ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞
の開始集団のＣＡＦＣ平均頻度は１／２１から１／４６（細胞集密度 (confiden
ce) ９５％限界１／１６から１／５２）であった（表２）。新たな各ＢＭから得
られた細胞数に限界があった為に、各実験に唯一つのサイトカインの組み合わせ
しか使用することが出来なかった。その為に、或程度の組織間の変動が生じた。
ＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＬＩＦの場合には、非分裂ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｈｉ亜
集団は始原の状態を維持し、培養前のＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞集団
と同じ平均ＣＡＦＣ頻度を保持した。しかしながら、ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ小
亜集団内のＣＡＦＣ頻度は、平均１／４４０（１／２４９１／８１３）まで２１
倍減少した。
【００８５】 ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬのサイトカイン組み合わせの場合には、全細胞がＰＫ
Ｈｌｏであり、これらをＣＤ３４ｈｉとＣＤ３４ｌｏのサブセットに分割してＣ
ＡＦＣアッセイにかけ、細胞分裂後のＰＨＰ頻度及び多系列能を測定した。表２
で確認されているように、ＣＡＦＣは主にＣＤ３４ｈｉ集団内に含まれているた
めに、ＣＤ３４ｈｉ細胞を細胞分裂に基づき更に分割する際にＣＤ３４ｌｏ亜集
団を実質的に除去した。
Ｈｌｏであり、これらをＣＤ３４ｈｉとＣＤ３４ｌｏのサブセットに分割してＣ
ＡＦＣアッセイにかけ、細胞分裂後のＰＨＰ頻度及び多系列能を測定した。表２
で確認されているように、ＣＡＦＣは主にＣＤ３４ｈｉ集団内に含まれているた
めに、ＣＤ３４ｈｉ細胞を細胞分裂に基づき更に分割する際にＣＤ３４ｌｏ亜集
団を実質的に除去した。
【００８６】 ６日間培養物からのＣＤ３４／ＰＫＨ２６細胞サブセットの平均ＣＡＦＣ頻度
【００８７】
【表２】
【００８８】 表２の脚注 ＳＡＳソフトウェアーによる最尤推測を使用して、５週間目でＣＡＦＣ頻度を
計算した。９５％細胞集密度限界を括弧内に示した。ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬに
ついては６つの実験の平均、その他のサイトカインの組み合わせについては２つ
の実験の平均である。 ＊ ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬ内の培養６日後に全細胞が分裂した為に測定不可。
計算した。９５％細胞集密度限界を括弧内に示した。ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬに
ついては６つの実験の平均、その他のサイトカインの組み合わせについては２つ
の実験の平均である。 ＊ ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬ内の培養６日後に全細胞が分裂した為に測定不可。
【００８９】 ＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＬＩＦの場合には培養細胞の大部分は６日目までに
は分裂せず（平均７５％）、従って、ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ（平均７．５％）
に対してＣＤ３４ｈｉＰＫＨｈｉをソートした（表２）。細胞の平均５３％が非
分裂のまま維持され平均２３％がＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏである、ＴＰＯ及びＫ
Ｌでの培養からも同じ細胞集団をソートした。ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬでは、全
細胞が分裂し、従って、分化した分裂後細胞のＣＤ３４ｌｏ／−ＰＫＨｌｏ（平
均２６％）に対してＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ（平均７１％）をソートした。
は分裂せず（平均７５％）、従って、ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ（平均７．５％）
に対してＣＤ３４ｈｉＰＫＨｈｉをソートした（表２）。細胞の平均５３％が非
分裂のまま維持され平均２３％がＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏである、ＴＰＯ及びＫ
Ｌでの培養からも同じ細胞集団をソートした。ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬでは、全
細胞が分裂し、従って、分化した分裂後細胞のＣＤ３４ｌｏ／−ＰＫＨｌｏ（平
均２６％）に対してＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ（平均７１％）をソートした。
【００９０】 長期間ストロマ培養におけるＢリンパ球能及びＣＤ３４＋前駆細胞
【００９１】
【表３】
【００９２】 表３の脚注 表面マーカーに関して細胞の１％より多くが陽性である場合は、陽性のスコア
にした。分析した全てのコブルストーン領域はＣＤ３３＋骨髄性細胞を含んでい
た。値は、２つの実験に関する平均＋ＳＥＭ（ＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＬＩＦ
、並びにＴＰＯ及びＩＬ）、６つの実験に関する平均＋ＳＥＭ（ＴＰＯ、ＫＬ、
及びＦＬ）である。ＮＤは、コブルストーン領域を含む穴がないか又はその数が
限られているために測定できないことを意味している。
にした。分析した全てのコブルストーン領域はＣＤ３３＋骨髄性細胞を含んでい
た。値は、２つの実験に関する平均＋ＳＥＭ（ＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＬＩＦ
、並びにＴＰＯ及びＩＬ）、６つの実験に関する平均＋ＳＥＭ（ＴＰＯ、ＫＬ、
及びＦＬ）である。ＮＤは、コブルストーン領域を含む穴がないか又はその数が
限られているために測定できないことを意味している。
【００９３】 ＴＰＯ及びＫＬで培養した後に、非分裂ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｈｉ細胞は非培養
ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞集団に類似したＣＡＦＣ頻度を示した。こ
れらの条件下で、分裂ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞集団の平均ＣＡＦＣ頻度は、
開始細胞集団と比較して、２．３倍減少した（表２）。限界希釈において、ＣＤ
３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞は、ＣＡＦＣアッセイにおいて５週間培養後にＣＤ３３ ＋ 骨髄性細胞、ＣＤ１９＋Ｂリンパ系細胞、及びＣＤ３４＋前駆細胞集団を生じ
る能力を保持していた。しかしながら、１％より高いＣＤ３４＋細胞を含む穴の
割合は、開始細胞集団と比較して２２倍減少していた（表３）。各細胞集団につ
いて、分析した全コブルストーン領域はＣＤ３３＋骨髄性細胞を含有していた。
ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞集団に類似したＣＡＦＣ頻度を示した。こ
れらの条件下で、分裂ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞集団の平均ＣＡＦＣ頻度は、
開始細胞集団と比較して、２．３倍減少した（表２）。限界希釈において、ＣＤ
３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞は、ＣＡＦＣアッセイにおいて５週間培養後にＣＤ３３ ＋ 骨髄性細胞、ＣＤ１９＋Ｂリンパ系細胞、及びＣＤ３４＋前駆細胞集団を生じ
る能力を保持していた。しかしながら、１％より高いＣＤ３４＋細胞を含む穴の
割合は、開始細胞集団と比較して２２倍減少していた（表３）。各細胞集団につ
いて、分析した全コブルストーン領域はＣＤ３３＋骨髄性細胞を含有していた。
【００９４】 ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬを使用した６つの実験に関する平均値は表３に示した
。平均ＣＡＦＣ頻度はＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞亜集団において、開始ＣＤ３
４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞集団と同程度に維持された。これらの細胞は限界希釈にお
いても、ＣＤ１９＋Ｂリンパ系細胞、ＣＤ３３＋骨髄性細胞、及びＣＤ３４＋前
駆細胞集団を生じる能力を保持していた。ＣＤ１９＋細胞は、非培養ＣＤ３４＋ Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞及び培養後のＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏの双方で検出さ
れたコブルストーン領域において似た割合（約５０％）で観察された。ＣＤ３４ ｈｉ ＰＫＨｌｏ細胞から生じたコブルストーン領域の４９％はＣＤ３４＋細胞を
含有していた。一方, 非培養ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞のそれの６７
％にはＣＤ３４＋細胞が含まれていた（表３）。予想されたように、ＣＤ３４ｌ ｏ／‐ ＰＫＨｌｏ細胞のＣＡＦＣ頻度は低かった（平均１／３０００）。この細
胞集団から生じた最小１０個の小さいコブルストーン領域の分析によると、ＩＬ
−３、ＩＬ−６、及びＬＩＦ含有培地からの分裂ＣＤ３４ｈｉ細胞はＣＤ３３＋ 骨髄性細胞のみを生じることが示された（表３）。
。平均ＣＡＦＣ頻度はＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞亜集団において、開始ＣＤ３
４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞集団と同程度に維持された。これらの細胞は限界希釈にお
いても、ＣＤ１９＋Ｂリンパ系細胞、ＣＤ３３＋骨髄性細胞、及びＣＤ３４＋前
駆細胞集団を生じる能力を保持していた。ＣＤ１９＋細胞は、非培養ＣＤ３４＋ Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞及び培養後のＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏの双方で検出さ
れたコブルストーン領域において似た割合（約５０％）で観察された。ＣＤ３４ ｈｉ ＰＫＨｌｏ細胞から生じたコブルストーン領域の４９％はＣＤ３４＋細胞を
含有していた。一方, 非培養ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞のそれの６７
％にはＣＤ３４＋細胞が含まれていた（表３）。予想されたように、ＣＤ３４ｌ ｏ／‐ ＰＫＨｌｏ細胞のＣＡＦＣ頻度は低かった（平均１／３０００）。この細
胞集団から生じた最小１０個の小さいコブルストーン領域の分析によると、ＩＬ
−３、ＩＬ−６、及びＬＩＦ含有培地からの分裂ＣＤ３４ｈｉ細胞はＣＤ３３＋ 骨髄性細胞のみを生じることが示された（表３）。
【００９５】 全細胞及びＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞中のＣＡＦＣ数の増大 異なる培養条件下でＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞からのＣＡＦＣ数の
増加を比較した（表２）。分析した３種類の異なるサイトカイン組み合わせの中
で、ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬのみが全細胞、ＣＤ３４＋細胞、及びＣＡＦＣの平
均数を増大させた（表１及び図２）。ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ集団中のＣＡＦＣ
の数を培養に供した元のＣＡＦＣの数と比較すると、ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬの
みが、その値は維持から７．６倍の増加までの範囲を有するものであるが、分裂
細胞中でのＣＡＦＣの数を増大させた（平均３．２倍）。ＴＰＯ及びＫＬ培養の
６日培養後の分裂ＣＤ３４ｈｉ細胞中のＣＡＦＣ数は、０日目におけるＣＤ３４ ＋ Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞中で測定したＣＡＦＣ数と有意な差はなかった（ｎ
＝２，Ｐ＝０．１９）。しかしながら、ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬ培養中のＣＤ３
４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞中のＣＡＦＣ数の増加は統計的有意性に達するものであっ
た（ｎ＝６，Ｐ＝０．０７）。ＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＬＩＦ培養からの分裂
ＣＤ３４ｈｉ細胞中の測定可能なＣＡＦＣ数は有意に減少した（ｎ＝２，Ｐ＝０
．０３）。Ｄ６ＬＩ−３，ＩＬ−６、及びＬＩＦ培養中で検出可能な全てのＣＡ
ＦＣは非分裂ＣＤ３４ｈｉ細胞由来のものであった。
増加を比較した（表２）。分析した３種類の異なるサイトカイン組み合わせの中
で、ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬのみが全細胞、ＣＤ３４＋細胞、及びＣＡＦＣの平
均数を増大させた（表１及び図２）。ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ集団中のＣＡＦＣ
の数を培養に供した元のＣＡＦＣの数と比較すると、ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬの
みが、その値は維持から７．６倍の増加までの範囲を有するものであるが、分裂
細胞中でのＣＡＦＣの数を増大させた（平均３．２倍）。ＴＰＯ及びＫＬ培養の
６日培養後の分裂ＣＤ３４ｈｉ細胞中のＣＡＦＣ数は、０日目におけるＣＤ３４ ＋ Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞中で測定したＣＡＦＣ数と有意な差はなかった（ｎ
＝２，Ｐ＝０．１９）。しかしながら、ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬ培養中のＣＤ３
４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞中のＣＡＦＣ数の増加は統計的有意性に達するものであっ
た（ｎ＝６，Ｐ＝０．０７）。ＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＬＩＦ培養からの分裂
ＣＤ３４ｈｉ細胞中の測定可能なＣＡＦＣ数は有意に減少した（ｎ＝２，Ｐ＝０
．０３）。Ｄ６ＬＩ−３，ＩＬ−６、及びＬＩＦ培養中で検出可能な全てのＣＡ
ＦＣは非分裂ＣＤ３４ｈｉ細胞由来のものであった。
【００９６】実施例５：ＳＣＩＤ−ｈｕ骨アッセイ インビボでのＳＣＩＤ−ｈｕ骨再集団化 (SCID-hu bone repopulating) 活性 について、ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬ培養からのＣＤ３４ｈｉＰＫＨ２６ｌｏ及び
ＣＤ３４ｌｏＰＫＨ２６ｌｏサブセットをアッセイした。
ＣＤ３４ｌｏＰＫＨ２６ｌｏサブセットをアッセイした。
【００９７】 ａ．ＳＣＩＤ−ｈｕ骨アッセイ Murray et al. (1995) Blood 85:368; Chen et al. (1994) Blood 84:2497 に
記載の方法でＳＣＩＤ−ｈｕ骨アッセイを実施した。Ｃ．Ｂ−１７．scid／scid
マウスをヒト胎児骨移植片のレシピエントとして使用した。最初に、ＳＣＩＤ−
ｈｕ骨モデルでドナー再構成を生起する信頼性のあるＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌ
ｉｎ−細胞の投与量を決定する為に限界希釈を行った。注入の直前に全身照射（
４００ｍｄ）を受けたマウスに、ＨＬＡ不適合胎児骨移植片と該移植片一つ当り
１０００−３０，０００個の範囲の投与量のＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細
胞とを注入した。各投与に際して充分な移植片を確認する為に、４つの独立した
実験に４つの組織ドナーを使用した。注入の８週間後、骨移植片を回収し、骨髄
細胞を採取して、ＰＥ−結合の抗ＣＤ−１９，抗ＣＤ−３３，及び抗ＣＤ−３４
と、ＦＩＴＣ−結合のアロタイプ特異的ＨＬＡ抗体を用いてドナー細胞生着につ
いてアッセイした。全ヒト細胞はＷ６／３２−ＰＥ（ヒトＨＬＡクラスＩＭＨＣ
分子単一型決定基に対する抗体）を使用して検出した。細胞はＦＡＣＳｃａｎア
ナライザー (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) で分析した。ドナー
のＨＬＡ抗原を有する造血細胞を少なくとも１％有する移植片は陽性とみなした
。ドナー再構成を示した移植片の割合を試験した各細胞投与についてアッセイし
た。全ての移植片について、限界投与量の５培、又は１０，０００個の細胞にお
いてドナー再構成が観察された。
記載の方法でＳＣＩＤ−ｈｕ骨アッセイを実施した。Ｃ．Ｂ−１７．scid／scid
マウスをヒト胎児骨移植片のレシピエントとして使用した。最初に、ＳＣＩＤ−
ｈｕ骨モデルでドナー再構成を生起する信頼性のあるＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌ
ｉｎ−細胞の投与量を決定する為に限界希釈を行った。注入の直前に全身照射（
４００ｍｄ）を受けたマウスに、ＨＬＡ不適合胎児骨移植片と該移植片一つ当り
１０００−３０，０００個の範囲の投与量のＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細
胞とを注入した。各投与に際して充分な移植片を確認する為に、４つの独立した
実験に４つの組織ドナーを使用した。注入の８週間後、骨移植片を回収し、骨髄
細胞を採取して、ＰＥ−結合の抗ＣＤ−１９，抗ＣＤ−３３，及び抗ＣＤ−３４
と、ＦＩＴＣ−結合のアロタイプ特異的ＨＬＡ抗体を用いてドナー細胞生着につ
いてアッセイした。全ヒト細胞はＷ６／３２−ＰＥ（ヒトＨＬＡクラスＩＭＨＣ
分子単一型決定基に対する抗体）を使用して検出した。細胞はＦＡＣＳｃａｎア
ナライザー (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) で分析した。ドナー
のＨＬＡ抗原を有する造血細胞を少なくとも１％有する移植片は陽性とみなした
。ドナー再構成を示した移植片の割合を試験した各細胞投与についてアッセイし
た。全ての移植片について、限界投与量の５培、又は１０，０００個の細胞にお
いてドナー再構成が観察された。
【００９８】 非培養ＢＭＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞、並びにTＰＯ、ＫＬ、及び ＦＬ中のＤ６培養（６日目）からのＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ及びＣＤ３４ｌｏ／ − ＰＫＨｌｏ細胞をソートし、ＳＣＩＤ−ｈｕ骨移植片に注入した（１０，００
０個／移植片）。注入の８週間後、ドナーのＣＤ３３＋、ＣＤ１９＋、及びＣＤ
３４＋細胞の生着について骨移植片を分析した。
０個／移植片）。注入の８週間後、ドナーのＣＤ３３＋、ＣＤ１９＋、及びＣＤ
３４＋細胞の生着について骨移植片を分析した。
【００９９】 ｂ．ＳＣＩＤ−ｈｕ骨移植片の１００％の再構成を示す非培養ＣＤ３４＋Ｔｈｙ
−１＋Ｌｉｎ−細胞の投与量 試験したＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞の各投与量における、ドナー再
構成を示した移植片の割合を図４に示した。ポアソン分布分析により、ＳＣＩＤ
−ｈｕ骨再集団化細胞の頻度は２０００個のＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細
胞当り１つであった。この限度の５倍、又は１０，０００個の細胞において、骨
移植片の１００％の再構成が観察された。
−１＋Ｌｉｎ−細胞の投与量 試験したＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞の各投与量における、ドナー再
構成を示した移植片の割合を図４に示した。ポアソン分布分析により、ＳＣＩＤ
−ｈｕ骨再集団化細胞の頻度は２０００個のＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細
胞当り１つであった。この限度の５倍、又は１０，０００個の細胞において、骨
移植片の１００％の再構成が観察された。
【０１００】 ｃ．ＳＣＩＤ−ｈｕ骨における、ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬ中の培養６日目からの
ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞の生着 ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞のＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬ中の培養６日
目からのＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞のＣＡＦＣ頻度は増大していた。更に、当
該細胞集団がインビボでヒト骨を再集団化する能力を保持しているか否かについ
て、例えば、上記のMurray et al. 及び Chen et al.に記載されたＳＣＩＤ−ｈ
ｕ骨アッセイにより検討した。充分な細胞を得るために、多臓器ドナーから単離
された、凍結保存のＢＭCD３４’細胞からＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞
を精製した。非培養ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞及びＴＰＯ、ＫＬ、及
びＦＬ中の培養６日目からのＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞をヒト胎児骨移植片内
に注入した。移植片当り１０，０００個の細胞を注入した。何故ならば、この投
与量により非培養ＢＭＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞が常に確実に生着す
るからである（図３）。
ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞の生着 ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞のＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬ中の培養６日
目からのＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞のＣＡＦＣ頻度は増大していた。更に、当
該細胞集団がインビボでヒト骨を再集団化する能力を保持しているか否かについ
て、例えば、上記のMurray et al. 及び Chen et al.に記載されたＳＣＩＤ−ｈ
ｕ骨アッセイにより検討した。充分な細胞を得るために、多臓器ドナーから単離
された、凍結保存のＢＭCD３４’細胞からＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞
を精製した。非培養ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞及びＴＰＯ、ＫＬ、及
びＦＬ中の培養６日目からのＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞をヒト胎児骨移植片内
に注入した。移植片当り１０，０００個の細胞を注入した。何故ならば、この投
与量により非培養ＢＭＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞が常に確実に生着す
るからである（図３）。
【０１０１】 培養したＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞は、非培養集団であるＣＤ３４＋Ｔｈｙ
−１＋Ｌｉｎ−細胞と同程度のレベル（４／４移植片）で生着した（図４及び表
４）。実験Ａ（表４）では、ドナー細胞の平均割合は、ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ 細胞について３４．３＋２２．３％であり、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細
胞については２５．０＋１３．５％であった。ＦＡＣＳｃａｎ分析によれば、８
週間後の骨から単離した細胞がドナーＢリンパ球（ＣＤ１９＋）、骨髄性細胞（
ＣＤ３３＋）、及び前駆細胞（ＣＤ３４＋）細胞を誘導することから、多系列生
着が両方の場合に起こったことが示された（図４）。
−１＋Ｌｉｎ−細胞と同程度のレベル（４／４移植片）で生着した（図４及び表
４）。実験Ａ（表４）では、ドナー細胞の平均割合は、ＣＤ３４ｈｉＰＫＨｌｏ 細胞について３４．３＋２２．３％であり、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細
胞については２５．０＋１３．５％であった。ＦＡＣＳｃａｎ分析によれば、８
週間後の骨から単離した細胞がドナーＢリンパ球（ＣＤ１９＋）、骨髄性細胞（
ＣＤ３３＋）、及び前駆細胞（ＣＤ３４＋）細胞を誘導することから、多系列生
着が両方の場合に起こったことが示された（図４）。
【０１０２】 第二の実験（Ｂ）では、ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬ中の培養６日目からのＣＤ３
４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞と共に注入された移植片（４／４）は、多系列の生着を示
し、平均５９．０＋１２．０％のドナー細胞であった（表４）。これらの結果か
ら、培養６日後で、ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬ中の分裂後ＣＤ３４ｈｉ集団内にＣ
Ｄ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞のインビボ骨髄再集団化能は保持されている
ことが確認された。
４ｈｉＰＫＨｌｏ細胞と共に注入された移植片（４／４）は、多系列の生着を示
し、平均５９．０＋１２．０％のドナー細胞であった（表４）。これらの結果か
ら、培養６日後で、ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬ中の分裂後ＣＤ３４ｈｉ集団内にＣ
Ｄ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞のインビボ骨髄再集団化能は保持されている
ことが確認された。
【０１０３】 ＴＰＯ、ＫＬ、及びＦＬ中の６日間の培養中で分裂したＣＤ３４＋細胞は、ＳＣ
ＩＤ−ｈｕ骨アッセイにおいてインビボ骨髄再集団化能を保持する
ＩＤ−ｈｕ骨アッセイにおいてインビボ骨髄再集団化能を保持する
【０１０４】
【表４】
【０１０５】 表４の脚注 骨移植片当り１０，０００個の細胞を注入した。示された誤差はＳＥＭである。
注入後８週間の間、注入された細胞のＨＬＡマーケットを発現するドナー細胞を
分析した。ＮＤは測定していない。実験Ｂにおいて非培養ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１ ＋ Ｌｉｎ−細胞を注入されたマウスは、移植片分析の前に死亡した。＞は接種し
た６６００個の細胞内でＣＡＦＣが検出されなかったことを意味する。
注入後８週間の間、注入された細胞のＨＬＡマーケットを発現するドナー細胞を
分析した。ＮＤは測定していない。実験Ｂにおいて非培養ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１ ＋ Ｌｉｎ−細胞を注入されたマウスは、移植片分析の前に死亡した。＞は接種し
た６６００個の細胞内でＣＡＦＣが検出されなかったことを意味する。
【０１０６】実施例６：異なるサイトカイン中で９０時間培養されたＭＰＢ ＣＤ３４＋細胞 ａ．細胞培養及びサイトカイン 細胞を計数し、再懸濁し、グルタミン(JRH BioSciences, Lenexa, KS) 及び１
％牛血清アルブミン（ＢＳＡ：Sigma, St. Louis, MO）含有の無血清Ｘ−Ｖｉｖ
ｏ１５培地 (BioWhittaker, Walkersville, MD) １ｍｌ当り２ｘ１０５個の割合
で、平底の２４穴プレート(Corning Coatar Corp., Cambridge, MA) 内で３７℃
で９０時間培養した。培地には異なるサイトカインの組み合わせが含まれていた
。ここで使用したサイトカインは組換えヒトＩＬ３(20ng/ml) 、ＩＬ６(20ng/ml
)、ＬＩＦ(100ng/ml) (Novartis Pharmaceuticals Corp., Basel, Switzerland)
、ＴＰＯ(50‐100ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN) 、ＫＬ(100ng/ml)
、及びＦＬ(100ng/ml) (SyStemix, Palo Alto, CA) であった。
％牛血清アルブミン（ＢＳＡ：Sigma, St. Louis, MO）含有の無血清Ｘ−Ｖｉｖ
ｏ１５培地 (BioWhittaker, Walkersville, MD) １ｍｌ当り２ｘ１０５個の割合
で、平底の２４穴プレート(Corning Coatar Corp., Cambridge, MA) 内で３７℃
で９０時間培養した。培地には異なるサイトカインの組み合わせが含まれていた
。ここで使用したサイトカインは組換えヒトＩＬ３(20ng/ml) 、ＩＬ６(20ng/ml
)、ＬＩＦ(100ng/ml) (Novartis Pharmaceuticals Corp., Basel, Switzerland)
、ＴＰＯ(50‐100ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN) 、ＫＬ(100ng/ml)
、及びＦＬ(100ng/ml) (SyStemix, Palo Alto, CA) であった。
【０１０７】 培養前に、ＭＰＢ ＣＤ３４＋細胞試料を１mg/mlの熱不活性化ヒトガンマグ ロブリン(Gamimune, Miles Inc., Elkhart, IN) と氷上で１０分間インキュベー
トした。該細胞を抗ＣＤ３４−ＦＩＴＣ(HPCA-2-FITC, Becton Dickinson) 及び
抗Ｔｈｙ−１‐Ｃｙ５(PR13, Systemix) 、又は適当なイソタイプ対照ＩｇＧ１ −ＦＩＴＣ (Becton Dickinson, San Jose, CA) 及びＩｇＧ１−Ｃｙ５(SyStemi
x, Palo Alto, CA)で氷上で３０分間染色した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ(JRH BioS
ciences, Lenexa, KS)、２％牛胎児血清（ＦＣＳ：Hyclone, Logan, Utah） に 再懸濁し、FACS−Caliburフローサイトメーター (Becton Dickinson)で分析した
。
トした。該細胞を抗ＣＤ３４−ＦＩＴＣ(HPCA-2-FITC, Becton Dickinson) 及び
抗Ｔｈｙ−１‐Ｃｙ５(PR13, Systemix) 、又は適当なイソタイプ対照ＩｇＧ１ −ＦＩＴＣ (Becton Dickinson, San Jose, CA) 及びＩｇＧ１−Ｃｙ５(SyStemi
x, Palo Alto, CA)で氷上で３０分間染色した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ(JRH BioS
ciences, Lenexa, KS)、２％牛胎児血清（ＦＣＳ：Hyclone, Logan, Utah） に 再懸濁し、FACS−Caliburフローサイトメーター (Becton Dickinson)で分析した
。
【０１０８】 培養期間終了時に、細胞を収穫し、トリパンブルー除外を使用して生存数を測
定した。細胞を抗ＣＤ３４−Ｃｙ５(PR20, Systemix) 及び抗Ｔｈｙ−１‐ＰＥ(
PR13, Systemix) 、又は、適当なイソタイプ対照ＩｇＧ１−Ｃｙ５及びＩｇＧ１ −ＰＥ (SyStemix, Palo Alto, CA)で染色した後、FACS−Caliburフローサイト メーター (Becton Dickinson)で分析した。プロピジウムヨード含量が高い細胞 は分析から除外した。
定した。細胞を抗ＣＤ３４−Ｃｙ５(PR20, Systemix) 及び抗Ｔｈｙ−１‐ＰＥ(
PR13, Systemix) 、又は、適当なイソタイプ対照ＩｇＧ１−Ｃｙ５及びＩｇＧ１ −ＰＥ (SyStemix, Palo Alto, CA)で染色した後、FACS−Caliburフローサイト メーター (Becton Dickinson)で分析した。プロピジウムヨード含量が高い細胞 は分析から除外した。
【０１０９】 ｂ．全細胞数及びＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞サブセット数の増加 全ＣＤ３４＋前駆細胞及びより始原的なＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋サブセットの
割合を測定した。表５に、異なる３−１２のＭＰＢドナーからの平均値がしめさ
れている（図５）。９０％より高い割合の精製ＣＤ３４＋が選択された細胞で開
始し、ＴＰＯ単独添加の培養の終了時には８９％の細胞がＣＤ３４を発現してい
た。これに対して、ＫＬ又はＦＬ単独添加の場合には７９％であった。これらの
サイトカイン単独の間の差は１３−１４％であって、検出されるＣＤ３４＋Ｔｈ
ｙ−１＋サブセットの割合に有意な差異はなかった。ＴＰＯ及びＦＬ、並びにＴ
ＰＯ及びＫＬの組み合わせでは、９１−９２％のＣＤ３４＋細胞が保持されたが
、ＴＰＯ及びＦＬでは平均２０．７＋５．２％のＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞が
検出されたのに対して、ＴＰＯ及びＫＬの場合には、僅か５．５＋３％であった
（Ｐ＝０．００８４）。ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞の割合は、ＴＰＯ及びＦＬ
の組み合わせの場合（平均２０．７）にはＴＰＯ，ＦＬ及びＫＬの３つの組み合
わせ（平均６．８％）よりも高かった（Ｐ＜０．０００１）。この始原的な表現
型の保存割合は、ＴＰＯ，ＦＬ及びＫＬに較べて、ＩＬ−３，ＩＬ−６，及びＬ
ＩＦでは極めて低かった（平均３．７％）（Ｐ＝０．０２）。
割合を測定した。表５に、異なる３−１２のＭＰＢドナーからの平均値がしめさ
れている（図５）。９０％より高い割合の精製ＣＤ３４＋が選択された細胞で開
始し、ＴＰＯ単独添加の培養の終了時には８９％の細胞がＣＤ３４を発現してい
た。これに対して、ＫＬ又はＦＬ単独添加の場合には７９％であった。これらの
サイトカイン単独の間の差は１３−１４％であって、検出されるＣＤ３４＋Ｔｈ
ｙ−１＋サブセットの割合に有意な差異はなかった。ＴＰＯ及びＦＬ、並びにＴ
ＰＯ及びＫＬの組み合わせでは、９１−９２％のＣＤ３４＋細胞が保持されたが
、ＴＰＯ及びＦＬでは平均２０．７＋５．２％のＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞が
検出されたのに対して、ＴＰＯ及びＫＬの場合には、僅か５．５＋３％であった
（Ｐ＝０．００８４）。ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞の割合は、ＴＰＯ及びＦＬ
の組み合わせの場合（平均２０．７）にはＴＰＯ，ＦＬ及びＫＬの３つの組み合
わせ（平均６．８％）よりも高かった（Ｐ＜０．０００１）。この始原的な表現
型の保存割合は、ＴＰＯ，ＦＬ及びＫＬに較べて、ＩＬ−３，ＩＬ−６，及びＬ
ＩＦでは極めて低かった（平均３．７％）（Ｐ＝０．０２）。
【０１１０】 ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞の増加倍数は図６に示されている。個々のＴＰＯ
，ＦＬ及びＫＬでは、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞の数は増加しなかった。ＴＰ
Ｏ及びＦＬ、又はＴＰＯ及びＫＬの組み合わせの場合に、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１ ＋ 細胞数の増加が最大であった。ＭＰＢ使用における変動レベルを考慮すると、
ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞の数を少し増加させたり（１．２−１．５倍）、維
持した結果をもたらしたような培養の間には有意な差はなかった。
，ＦＬ及びＫＬでは、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞の数は増加しなかった。ＴＰ
Ｏ及びＦＬ、又はＴＰＯ及びＫＬの組み合わせの場合に、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１ ＋ 細胞数の増加が最大であった。ＭＰＢ使用における変動レベルを考慮すると、
ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞の数を少し増加させたり（１．２−１．５倍）、維
持した結果をもたらしたような培養の間には有意な差はなかった。
【０１１１】 ｃ．可動化 (mobilized) 末梢血液細胞におけるＣＡＦＣアッセイ 可動化 (mobilized) 末梢血液細胞においてもＣＡＦＣアッセイを実施した。 ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞をフローサイトメトリーを用いて末梢血液から精製
し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ：Sigma, St. Louis, MO）及び図７に示すサ
イトカイン含有Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地１ｍｌ当り４ｘ１０５個の割合で培養した
。培養５日後に、フローサイトメトリーを用いて、Ｔｈｙ−１について細胞を分
析し,上記のようにＣＡＦＣ活性を測定した。培養後の集団における全CAFC数の 標準集団に対する倍数変化を４つの実験の平均値として図７に示した。
し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ：Sigma, St. Louis, MO）及び図７に示すサ
イトカイン含有Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地１ｍｌ当り４ｘ１０５個の割合で培養した
。培養５日後に、フローサイトメトリーを用いて、Ｔｈｙ−１について細胞を分
析し,上記のようにＣＡＦＣ活性を測定した。培養後の集団における全CAFC数の 標準集団に対する倍数変化を４つの実験の平均値として図７に示した。
【０１１２】 ｄ．ＣＦＳＥ色素標識 可動化末梢血（ＭＰＢ）ＣＤ３４＋選択細胞をカルボキシフルオセインジアセ
テートサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）色素(Molecular Probes Inc., Euge
ne, OR) を用い、暗闇で室温下１０分間、時々攪拌しながら、フェノールレッド
(JRH Biosciences) 非含有のイスコフ変性ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中、細胞
濃度３ｘ１０６個／ｍＬ及び色素濃度１．２５μMで標識（ラベル）した。１／ ５容量のＦＣＳを添加して標識反応を停止した。１％ＢＳＡ含有Ｘ−Ｖｉｖｏ１
５培地１０ｍｌを細胞に加え、それを４００ｇで１０分間遠心処理した。
テートサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）色素(Molecular Probes Inc., Euge
ne, OR) を用い、暗闇で室温下１０分間、時々攪拌しながら、フェノールレッド
(JRH Biosciences) 非含有のイスコフ変性ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中、細胞
濃度３ｘ１０６個／ｍＬ及び色素濃度１．２５μMで標識（ラベル）した。１／ ５容量のＦＣＳを添加して標識反応を停止した。１％ＢＳＡ含有Ｘ−Ｖｉｖｏ１
５培地１０ｍｌを細胞に加え、それを４００ｇで１０分間遠心処理した。
【０１１３】 ｅ．HSC複製に対するＴＰＯ擬似体 (mimetics) の効果 細胞増殖に対するＴＰＯ擬似体の効果を試験した。使用したＴＰＯ擬似体は、
Cwirla et al. (1997) 上記に記載のアミノ酸配列を有する、ペプチドＡＦ１３ ９４８として知られている。細胞分裂を蛍光で測定可能にする為に、可動化抹消
血ＣＤ３４＋細胞を１．２５μMのＣＦＳＥ色素でラベルした。細胞を１％ＢＳ Ａ及び表５に記載のサイトカイン含有Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地中で細胞濃度２ｘ１
０５個／ｍＬで培養した。培養４日後、フローサイトメトリーを用いて、Ｔｈｙ
−１発現及び細胞分裂について分析した。全細胞数及び生存率の増加倍数はトリ
パンブルー染色試料の血球計数計により測定した。結果を表５にまとめた。
Cwirla et al. (1997) 上記に記載のアミノ酸配列を有する、ペプチドＡＦ１３ ９４８として知られている。細胞分裂を蛍光で測定可能にする為に、可動化抹消
血ＣＤ３４＋細胞を１．２５μMのＣＦＳＥ色素でラベルした。細胞を１％ＢＳ Ａ及び表５に記載のサイトカイン含有Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地中で細胞濃度２ｘ１
０５個／ｍＬで培養した。培養４日後、フローサイトメトリーを用いて、Ｔｈｙ
−１発現及び細胞分裂について分析した。全細胞数及び生存率の増加倍数はトリ
パンブルー染色試料の血球計数計により測定した。結果を表５にまとめた。
【０１１４】 細胞培養、増殖及び生存率
【０１１５】
【表５】
【０１１６】 トリパンブルーにより測定した生存率（％） ＫＬ＝ｃ−ｋｉｔリガンド ＴＰＯ＝トロンボポイエチン ＭＴＰＯ＝トロンボポイエチン擬似体
【０１１７】実施例７：各細胞分裂後のＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞内の幹細胞機能の保持 上記のようにＣＦＳＥでラベルされたＣＤ３４＋ＭＰＢ細胞を１％ＢＳＡ、並
びにＴＰＯ(50ng/ml)、ＦＬ(100ng/ml)、ＫＬ(100ng/ml) 、及びＩＬ６(20ng/ml
)の組み合わせを添加したＸ−Ｖｉｖｏ１５培地中で細胞濃度２ｘ１０５個／ｍ Ｌで、加湿インキュベーター内の平底の２４穴プレート内で３７℃で約１１２時
間培養した。
びにＴＰＯ(50ng/ml)、ＦＬ(100ng/ml)、ＫＬ(100ng/ml) 、及びＩＬ６(20ng/ml
)の組み合わせを添加したＸ−Ｖｉｖｏ１５培地中で細胞濃度２ｘ１０５個／ｍ Ｌで、加湿インキュベーター内の平底の２４穴プレート内で３７℃で約１１２時
間培養した。
【０１１８】 培養細胞を回収し、計数し、上記のように、抗ＣＤ３４−Ｃｙ５及び抗Ｔｈｙ
−１‐ＰＥ、又は適当なイソタイプ対照で染色した。上記のようにフローサイト
メトリーを使用して細胞をソートしてＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋集団を単離した。
Ｔｈｙ−１＋細胞における細胞分裂の分別のある数に対するソート領域（ＦＩＴ
Ｃ蛍光）は、パラホルムアルデヒド固定の非分裂対照集団、及び各分裂間で視覚
的に減少した事象密度（event density) に基づき確立した。ＴＰＯ、ＦＬ、及 びＫＬ内で培養したＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞は全細胞数が約２倍に増加した
。ＴＰＯ、ＦＬ、及びＩＬ６内で培養したＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞は開始の
細胞数を維持した（データ示さず）。Ｔｈｙ−１発現細胞の割合は、ＴＰＯ、Ｆ
Ｌ、及びＫＬの場合よりもＴＰＯ、ＦＬ、及びＩＬ６の場合のほうが若干高かっ
た（２７．４％対２０．６％）。しかしながら、ＴＰＯ、ＦＬ、及びＩＬ６の培
養で維持した全Ｔｈｙ−１発現細胞数は、より少なかった（開始細胞数の０．３
４対０．４３）。これらの差異は統計的に有意ではなかった（データ示さず）。
−１‐ＰＥ、又は適当なイソタイプ対照で染色した。上記のようにフローサイト
メトリーを使用して細胞をソートしてＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋集団を単離した。
Ｔｈｙ−１＋細胞における細胞分裂の分別のある数に対するソート領域（ＦＩＴ
Ｃ蛍光）は、パラホルムアルデヒド固定の非分裂対照集団、及び各分裂間で視覚
的に減少した事象密度（event density) に基づき確立した。ＴＰＯ、ＦＬ、及 びＫＬ内で培養したＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞は全細胞数が約２倍に増加した
。ＴＰＯ、ＦＬ、及びＩＬ６内で培養したＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞は開始の
細胞数を維持した（データ示さず）。Ｔｈｙ−１発現細胞の割合は、ＴＰＯ、Ｆ
Ｌ、及びＫＬの場合よりもＴＰＯ、ＦＬ、及びＩＬ６の場合のほうが若干高かっ
た（２７．４％対２０．６％）。しかしながら、ＴＰＯ、ＦＬ、及びＩＬ６の培
養で維持した全Ｔｈｙ−１発現細胞数は、より少なかった（開始細胞数の０．３
４対０．４３）。これらの差異は統計的に有意ではなかった（データ示さず）。
【０１１９】 １，２，３、又は４回の分裂を経た培養細胞集団をフローサイトメトリーを使
用して精製した。培養後にも依然としてＴｈｙ−１を発現する細胞のみを試験し
た。何故ならば、ＨＳＣ活性は主にこの集団に存在するからである。ＴＰＯ(100
ng/ml)、ＦＬ(100ng/ml)及びＫＬ(100ng/ml)の組み合わせ、又はＴＰＯ(100ng/m
l)、ＦＬ(100ng/ml)及びＩＬ６(20ng/ml) の組み合わせで培養したＴｈｙ−１＋ 細胞は、少なくとも２回の分裂後に、新鮮なＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞に対し
てＣＡＦＣ活性を保持していた。ＴＰＯ、ＦＬ、及びＫＬの場合には４回の分裂
後、ＴＰＯ、ＦＬ、及びＩＬ６の場合には３回の分裂後に、ＣＡＦＣ活性は低下
した（データ示さず）。ＳＣＩＤ−ｈｕ骨における生着が、移植片当り５，００
０又は１５，０００個の細胞を注入した場合に、両方のサイトカインの組み合わ
せに対して４回分裂の全てで観察された（図８）。注入した全体数に対してヒト
細胞を有する移植片の数（生着率）は、非培養ＣＤ３４＋細胞、及びいずれかの
サイトカイン組み合わせで様々な回数を分裂した培養ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１細胞
の間で有意な変化を示さなかった。ＴＰＯ、ＦＬ、及びＫＬで培養した細胞を注
入した移植片から回収したドナー細胞の平均数は、ＴＰＯ、ＦＬ、及びＩＬ６で
培養した細胞を注入した移植片から回収したドナー細胞の約２倍であり、非培養
ＣＤ３４＋細胞を注入した移植片から回収したドナー細胞の平均数と近かった。
ＴＰＯ、ＦＬ、及びＫＬ、又はＴＰＯ、ＦＬ、及びＩＬ６で培養したＣＤ３４＋ Ｔｈｙ−１＋細胞は、各細胞ベースで明らかなＨＳＣ機能を喪失することなく、
４回までは分裂することが可能であることが結論された。
用して精製した。培養後にも依然としてＴｈｙ−１を発現する細胞のみを試験し
た。何故ならば、ＨＳＣ活性は主にこの集団に存在するからである。ＴＰＯ(100
ng/ml)、ＦＬ(100ng/ml)及びＫＬ(100ng/ml)の組み合わせ、又はＴＰＯ(100ng/m
l)、ＦＬ(100ng/ml)及びＩＬ６(20ng/ml) の組み合わせで培養したＴｈｙ−１＋ 細胞は、少なくとも２回の分裂後に、新鮮なＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞に対し
てＣＡＦＣ活性を保持していた。ＴＰＯ、ＦＬ、及びＫＬの場合には４回の分裂
後、ＴＰＯ、ＦＬ、及びＩＬ６の場合には３回の分裂後に、ＣＡＦＣ活性は低下
した（データ示さず）。ＳＣＩＤ−ｈｕ骨における生着が、移植片当り５，００
０又は１５，０００個の細胞を注入した場合に、両方のサイトカインの組み合わ
せに対して４回分裂の全てで観察された（図８）。注入した全体数に対してヒト
細胞を有する移植片の数（生着率）は、非培養ＣＤ３４＋細胞、及びいずれかの
サイトカイン組み合わせで様々な回数を分裂した培養ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１細胞
の間で有意な変化を示さなかった。ＴＰＯ、ＦＬ、及びＫＬで培養した細胞を注
入した移植片から回収したドナー細胞の平均数は、ＴＰＯ、ＦＬ、及びＩＬ６で
培養した細胞を注入した移植片から回収したドナー細胞の約２倍であり、非培養
ＣＤ３４＋細胞を注入した移植片から回収したドナー細胞の平均数と近かった。
ＴＰＯ、ＦＬ、及びＫＬ、又はＴＰＯ、ＦＬ、及びＩＬ６で培養したＣＤ３４＋ Ｔｈｙ−１＋細胞は、各細胞ベースで明らかなＨＳＣ機能を喪失することなく、
４回までは分裂することが可能であることが結論された。
【０１２０】実施例８：培養造血細胞への遺伝子導入 実施例１−７に記載のように、ＴＰＯ(50-100ng/ml)、ＫＬ(100ng/ml)、ＦＬ(
100ng/ml)、ＩＬ３(20ng/ml)、ＩＬ６(20ng/ml)及び／又はＬＩＦ (100ng/ml)で
培養した造血幹細胞を（１）Ｌ Ｍｉｌｙベクター（Ｌｙｔ２を発現）又は（２
）ＬＭＴＮＬベクター（ＰＣＲによるｒｅｖ遺伝子マーキングを分析するため）
で感染した。これらの適当なベクターを培地に添加することによって細胞に感染
させた。以下の表６−８に示されるように、ＬＩ−３，ＩＬ−６及びＬＩＦで培
養した場合と比較して、ＴＰＯ、ＫＬ及びＦＬの培養では、４．９倍高いＬＴＣ
−ＣＦＣ遺伝子マーキング、５倍高いＳｙＳ１後のＣＤ３４＋前駆細胞内のＬｙ
ｔ２発現、及び４．７倍高いＳｙＳ１後のＣＤ１４＋単球内のＬｙｔ２発現を示
した。
100ng/ml)、ＩＬ３(20ng/ml)、ＩＬ６(20ng/ml)及び／又はＬＩＦ (100ng/ml)で
培養した造血幹細胞を（１）Ｌ Ｍｉｌｙベクター（Ｌｙｔ２を発現）又は（２
）ＬＭＴＮＬベクター（ＰＣＲによるｒｅｖ遺伝子マーキングを分析するため）
で感染した。これらの適当なベクターを培地に添加することによって細胞に感染
させた。以下の表６−８に示されるように、ＬＩ−３，ＩＬ−６及びＬＩＦで培
養した場合と比較して、ＴＰＯ、ＫＬ及びＦＬの培養では、４．９倍高いＬＴＣ
−ＣＦＣ遺伝子マーキング、５倍高いＳｙＳ１後のＣＤ３４＋前駆細胞内のＬｙ
ｔ２発現、及び４．７倍高いＳｙＳ１後のＣＤ１４＋単球内のＬｙｔ２発現を示
した。
【０１２１】 ｒｅｖマーキングされたＨＳＣの割合
【０１２２】
【表６】
【０１２３】 Ｌｙｔ２導入遺伝子を発現するＣＤ３４＋細胞の割合
【０１２４】
【表７】
【０１２５】 Ｌｙｔ２導入遺伝子を発現するＣＤ１４＋単球の割合
【０１２６】
【表８】
【０１２７】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）も様々なサイトカインの組み合わせで培養さ
れたＨＳＣ内への遺伝子導入を測定するために実施された。表９は導入遺伝子を
発現するコロニー及び移植片の割合をまとめたものである。
れたＨＳＣ内への遺伝子導入を測定するために実施された。表９は導入遺伝子を
発現するコロニー及び移植片の割合をまとめたものである。
【０１２８】
【表９】
【０１２９】実施例９：フィブロネクチン存在下でのＨＳＣの遺伝的修飾 RetroNectinTM (Takara Shuzo Co., Ltd., Otsu Shigi, Japan) の形質導入さ
れたＨＳＣの前駆体における導入遺伝子の発現を増強する能力を求める目的で、
RetroNectinTM 及び様々なサイトカインの存在下、非存在下で、ProPak をベー スとするPP-A.LＭiLy ベクターで形質導入されたＣＤ３４＋選択細胞を予形成し
たＳｙｓ１単層上で長期間インキュベートした。５週間後、ＣＤ３４及びＬｙｔ
２の細胞表面発現のＦＡＣＳ分析の為に培養内のヒト細胞を染色した。代表的な
実験の結果を図９及び図１０に示した。これらのデータから、長期間のＳｙｓ１
培養において維持されたＣＤ３４＋細胞における導入遺伝子の発現（Ｌｙｔ２発
現）が、ＩＬ３，ＩＬ６，ＬＩＦ，ＦＬ及びＴＰＯから成るサイトカイン混合物
（カクテル）の組み合わせを存在下で、RetroNectinTM被覆プレート上で細胞に
形質導入することによって有意に増強されることが示された。サイトカイン濃度
は実施例８に記載の通りである。図９で示されるように、RetroNectinTMなしで ＩＬ３，ＩＬ６，ＬＩＦ，ＦＬ及びＴＰＯと共に形質導入した集団におけるＬｙ
ｔ２発現は３．７％であるのに対し、RetroNectinTM被覆プレート上で同じサイ トカインと共に形質導入した集団におけるＬｙｔ２発現は１５．２％であった。
RetroNectinTMを使用することによって、約４倍の増強が見られた。ＴＰＯ非存 在下では増強は観察されなかった。RetroNectinTMの存在下又は非存在下で、様 々なサイトカインで形質導入した場合にも、長期間培養においてＣＤ３４表現型
を保存した細胞の割合については影響はなかった。
れたＨＳＣの前駆体における導入遺伝子の発現を増強する能力を求める目的で、
RetroNectinTM 及び様々なサイトカインの存在下、非存在下で、ProPak をベー スとするPP-A.LＭiLy ベクターで形質導入されたＣＤ３４＋選択細胞を予形成し
たＳｙｓ１単層上で長期間インキュベートした。５週間後、ＣＤ３４及びＬｙｔ
２の細胞表面発現のＦＡＣＳ分析の為に培養内のヒト細胞を染色した。代表的な
実験の結果を図９及び図１０に示した。これらのデータから、長期間のＳｙｓ１
培養において維持されたＣＤ３４＋細胞における導入遺伝子の発現（Ｌｙｔ２発
現）が、ＩＬ３，ＩＬ６，ＬＩＦ，ＦＬ及びＴＰＯから成るサイトカイン混合物
（カクテル）の組み合わせを存在下で、RetroNectinTM被覆プレート上で細胞に
形質導入することによって有意に増強されることが示された。サイトカイン濃度
は実施例８に記載の通りである。図９で示されるように、RetroNectinTMなしで ＩＬ３，ＩＬ６，ＬＩＦ，ＦＬ及びＴＰＯと共に形質導入した集団におけるＬｙ
ｔ２発現は３．７％であるのに対し、RetroNectinTM被覆プレート上で同じサイ トカインと共に形質導入した集団におけるＬｙｔ２発現は１５．２％であった。
RetroNectinTMを使用することによって、約４倍の増強が見られた。ＴＰＯ非存 在下では増強は観察されなかった。RetroNectinTMの存在下又は非存在下で、様 々なサイトカインで形質導入した場合にも、長期間培養においてＣＤ３４表現型
を保存した細胞の割合については影響はなかった。
【０１３０】 遺伝子導入：様々なサイトカイン混合物でのＭＰＢ−ＣＤ３４＋細胞。クローン
形成細胞 (Clonogenic Cells) の形質導入効率（％Ｒｅｖ＋）
形成細胞 (Clonogenic Cells) の形質導入効率（％Ｒｅｖ＋）
【０１３１】
【表１０】
【図１】パネルＡ〜Ｇは、ＦＬを含有する様々なサイトカイン組み合わせに
おけるＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−骨髄細胞（ＢＭ）の６日間の培養のＦＡ
ＣＳ分析を示す。数字は各クアドラントにおける代表実験例からの細胞の割合を
示す。ＰＫＨ２６蛍光の喪失は細胞分裂を意味する。ＣＤ３４発現の喪失は分化
を意味する。対照細胞は一晩（Ｄ０）又は６日間（Ｄ６）サイトカインなしで培
養し、ライブゲート（live-gated) な非分裂細胞を使用してクアドラントをセッ
トした。非分裂細胞（ＵＲ及びＵＬクアドラント）の割合を合わせた。
おけるＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−骨髄細胞（ＢＭ）の６日間の培養のＦＡ
ＣＳ分析を示す。数字は各クアドラントにおける代表実験例からの細胞の割合を
示す。ＰＫＨ２６蛍光の喪失は細胞分裂を意味する。ＣＤ３４発現の喪失は分化
を意味する。対照細胞は一晩（Ｄ０）又は６日間（Ｄ６）サイトカインなしで培
養し、ライブゲート（live-gated) な非分裂細胞を使用してクアドラントをセッ
トした。非分裂細胞（ＵＲ及びＵＬクアドラント）の割合を合わせた。
【図２】異なるサイトカインにおける、ＢＭ ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉ
ｎ−細胞培養からの、全ＣＡＦＣ、又はＦＡＣＳでソートしたＣＤ３４ｈｉＰＫ
Ｈｌｏ細胞集団内のＣＡＦＣにおける増加倍数を示す。横縞バーはＩＬ３，ＩＬ
６及びＬＩＦ処理を示し、灰色バーはＴＰＯ及びＫＬ処理を示し、黒色バーはＴ
ＰＯ、ＦＬ及びＫＬ処理を示す。
ｎ−細胞培養からの、全ＣＡＦＣ、又はＦＡＣＳでソートしたＣＤ３４ｈｉＰＫ
Ｈｌｏ細胞集団内のＣＡＦＣにおける増加倍数を示す。横縞バーはＩＬ３，ＩＬ
６及びＬＩＦ処理を示し、灰色バーはＴＰＯ及びＫＬ処理を示し、黒色バーはＴ
ＰＯ、ＦＬ及びＫＬ処理を示す。
【図３】移植片当りに注入された非培養ＢＭ ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉ
ｎ−細胞数に対する陽性移植片の割合を示す。これは１０ＫＴｈｙ−１＋細胞の
投与を選択して行った。
ｎ−細胞数に対する陽性移植片の割合を示す。これは１０ＫＴｈｙ−１＋細胞の
投与を選択して行った。
【図４】パネルＡ〜Ｌは、移植片当り１０，０００個の細胞をＳＣＩＤ−ｈ
ｕ骨に注射した８週間後のドナーヒト細胞の生着のＦＡＣＳ分析を示す。ＴＰＯ
，ＫＬ，及びＦＬでの６日間培養で分裂したＣＤ３４＋細胞（ＣＤ３４＋ＰＫＨ ｌｏ） 細胞は、非培養ＢＭ ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞（パネルＢ，
Ｅ，Ｈ，Ｋ）と比較して、インビボ骨髄再集団化能を保持していた（パネルＣ，
Ｆ，Ｉ，Ｌ）。Ｘ軸はドナーＨＬＡアロタイプの染色を示す。Ｙ軸は全ヒト細胞
（Ｗ６／３２，抗ヒトクラスＩＭＨＣ）又は系列マーカーの染色を示す
ｕ骨に注射した８週間後のドナーヒト細胞の生着のＦＡＣＳ分析を示す。ＴＰＯ
，ＫＬ，及びＦＬでの６日間培養で分裂したＣＤ３４＋細胞（ＣＤ３４＋ＰＫＨ ｌｏ） 細胞は、非培養ＢＭ ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−細胞（パネルＢ，
Ｅ，Ｈ，Ｋ）と比較して、インビボ骨髄再集団化能を保持していた（パネルＣ，
Ｆ，Ｉ，Ｌ）。Ｘ軸はドナーＨＬＡアロタイプの染色を示す。Ｙ軸は全ヒト細胞
（Ｗ６／３２，抗ヒトクラスＩＭＨＣ）又は系列マーカーの染色を示す
【図５】９０時間培養したＭＰＢ ＣＤ３４＋細胞からのＦＡＣＳドットプ
ロットから測定した、％ＣＤ３４＋及び％ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞を示す。
各カラムは異なる健常ドナーから得た３−１２の実験の平均であり、誤差は平均
の標準誤差である。Ｔはトロンボポイエチン，ＫはＫｉｔリガンド，Ｆはｆｌｔ
３リガンド，ＬはＬＩＦ，３はＩＬ−３，及び６はＩＬ−６を示す。
ロットから測定した、％ＣＤ３４＋及び％ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞を示す。
各カラムは異なる健常ドナーから得た３−１２の実験の平均であり、誤差は平均
の標準誤差である。Ｔはトロンボポイエチン，ＫはＫｉｔリガンド，Ｆはｆｌｔ
３リガンド，ＬはＬＩＦ，３はＩＬ−３，及び６はＩＬ−６を示す。
【図６】培養０日及び培養終了時の全ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞数から計
算した、９０時間培養におけるＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞の増加倍数を示す。
各カラムは３−１２の実験の平均であり、誤差は平均の標準誤差である。斜線バ
ーは全細胞数を示し、黒色バーはＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞数を示す。Ｔはト
ロンボポイエチン，ＫはＫｉｔリガンド，Ｆはｆｌｔ３リガンド，ＬはＬＩＦ，
３はＩＬ−３，及び６はＩＬ−６を示す。
算した、９０時間培養におけるＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞の増加倍数を示す。
各カラムは３−１２の実験の平均であり、誤差は平均の標準誤差である。斜線バ
ーは全細胞数を示し、黒色バーはＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞数を示す。Ｔはト
ロンボポイエチン，ＫはＫｉｔリガンド，Ｆはｆｌｔ３リガンド，ＬはＬＩＦ，
３はＩＬ−３，及び６はＩＬ−６を示す。
【図７】非培養細胞と比較した、、様々なサイトカインで５日間培養したＭ
ＰＢ細胞中のＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞のＣＡＦＣ数の倍数変化を示す。
ＰＢ細胞中のＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋細胞のＣＡＦＣ数の倍数変化を示す。
【図８】５日間培養したＣＦＳＥラベル化ＣＤ３４＋ＭＰＢ細胞とのＳＣＩ
Ｄ−ｈｕ骨の生着を示す。培養ＣＤ３４＋をソートし、ＣＦＳＥ色素の保持によ
って各分裂を分離した。各データの点は、個々の骨移植片を示す。移植片中の全
細胞に対して１％未満のヒトドナー細胞しか含有しない移植片は生着しないもの
とみなした。典型的には、少なくとも１０，０００個の細胞(ヒト及びマウスの 両者)が移植片から得られ、従って、１％とは少なくとも１００個の細胞を意味 するものであった。
Ｄ−ｈｕ骨の生着を示す。培養ＣＤ３４＋をソートし、ＣＦＳＥ色素の保持によ
って各分裂を分離した。各データの点は、個々の骨移植片を示す。移植片中の全
細胞に対して１％未満のヒトドナー細胞しか含有しない移植片は生着しないもの
とみなした。典型的には、少なくとも１０，０００個の細胞(ヒト及びマウスの 両者)が移植片から得られ、従って、１％とは少なくとも１００個の細胞を意味 するものであった。
【図９】形質導入したＭＰＢ ＣＤ３４＋細胞の長期間のインビトロでのス
トロマ培養後のＬｙｔ２導入遺伝子の発現を示す。
トロマ培養後のＬｙｔ２導入遺伝子の発現を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０９／２３７，２９１ (32)優先日 平成11年１月25日(1999．1．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ツシンスキー・ロバート・ジェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94040 マウンテインビュー ディリック スドライブ 2564 Ｆターム(参考） 4B065 AA93X AC12 AC14 BB23 BB34 BC41 BD42 CA23 CA24 4C084 AA13 CA18 CA34 CA56 DA01 DB01 NA14 ZA512 ZB271 ZC012 ZC411 ZC511 4C087 AA01 AA02 BB44 BB64 BB65 CA12 NA14 ZA51 ZB27 ZC01 ZC41 ZC51
Claims (30)
- 【請求項１】ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子運搬ビークルをｍｐｌリガ
ンド及びｆｌｔ３リガンドの有効量の存在下で造血幹細胞集団と接触させること
から成る、造血幹細胞の修飾方法。 - 【請求項２】更に、造血幹細胞をｃ−ｋｉｔリガンドの存在下で培養するこ
とを含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】更に、造血幹細胞をインターロイキン３（ＩＬ３）の存在下で
培養することを含む、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】ポリヌクレオチド配列がペプチド、リボザイム及びアンチセン
ス配列から成る群から選択される産物をコードする、請求項１乃至３のいずれか
一項に記載の方法。 - 【請求項５】遺伝子運搬ビークルがレトロウイルスベクター、ＤＮＡベクタ
ー及びリポソーム運搬ビークルから成る群から選択される、請求項１乃至４のい
ずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子運搬ビークルをトロンボポ
イエチンリガンド、ｆｌｔ３リガンド及びインターロイキン６（ＩＬ６）の有効
量の存在下で造血幹細胞集団と接触させることから成る、造血幹細胞の修飾方法
。 - 【請求項７】更に、造血幹細胞を有効量の白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在
下で培養することを含む、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】更に、造血幹細胞を有効量のインターロイキン３（ＩＬ３）の
存在下で培養することを含む、請求項６に記載の方法。 - 【請求項９】更に、造血幹細胞をｃ−ｋｉｔリガンドの存在下で培養するこ
とを含む、請求項６に記載の方法。 - 【請求項１０】更に、造血幹細胞をｃ−ｋｉｔリガンドの存在下で培養する
ことを含む、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】更に、造血幹細胞をフィブロネクチン又はRetroNectinTMの 存在下で培養することを含む、請求項６に記載の方法。
- 【請求項１２】ポリヌクレオチド配列がペプチド、リボザイム及びアンチセ
ンス配列から成る群から選択される産物をコードする、請求項６に記載の方法。 - 【請求項１３】遺伝子運搬ビークルがレトロウイルスベクター、ＤＮＡベク
ター及びリポソーム運搬ビークルから成る群から選択される、請求項６に記載の
方法。 - 【請求項１４】トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ｆｌｔ３リガンド及びイン
ターロイキン６（ＩＬ６）の有効量を含有する培地中で造血幹細胞を培養するこ
とから成る、培養における該造血幹細胞の増殖を促進する方法。 - 【請求項１５】更に、細胞を有効量のインターロイキン３（ＩＬ３）と共に
培養することを含む、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】更に、細胞を有効量の白血病阻害因子（ＬＩＦ）と共に培養
することを含む、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１７】更に、細胞を有効量のｃ−ｋｉｔリガンドと共に培養するこ
とを含む、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１８】造血幹細胞が自己再生能及び全造血細胞系列発生能によって
特徴づけられる、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１９】造血幹細胞がヒト造血幹細胞である、請求項１４に記載の方
法。 - 【請求項２０】ヒト造血幹細胞がＣＤ３４＋である、請求項１９に記載の方
法。 - 【請求項２１】ヒト造血幹細胞がＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋である、請求項１
９に記載の方法。 - 【請求項２２】ヒト造血幹細胞がＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋Ｌｉｎ−である、
請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２３】対象における造血能を回復させる方法であって、 （ａ）ｍｐｌリガンド、ｆｌｔ３リガンド及びインターロイキン６（ＩＬ６）の
存在下に造血幹細胞集団の増殖に好適な条件で造血幹細胞を含む集団を培養し、
及び （ｂ）増殖した造血幹細胞集団の有効量を対象に投与する、ことから成る前記方
法。 - 【請求項２４】更に、細胞をインターロイキン３（ＩＬ３）の存在下で培養
することを含む、請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２５】更に、細胞を有効量の白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下で
培養することを含む、請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２６】更に、細胞をｃ−ｋｉｔリガンドの存在下で培養することを
含む、請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２７】造血幹細胞がヒト造血幹細胞である、請求項２３に記載の方
法。 - 【請求項２８】ヒト造血幹細胞がＣＤ３４＋である、請求項２３に記載の方
法。 - 【請求項２９】造血幹細胞が同種対象に投与される、請求項２３に記載の方
法。 - 【請求項３０】造血幹細胞が自家対象に投与される、請求項２３に記載の方
法。
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Family Cites Families (2)
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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