DE69929174T2

DE69929174T2 - Vermehrte und genetisch modifizierte populationen menschlicher hämatopoitischer stammzellen

Info

Publication number: DE69929174T2
Application number: DE69929174T
Authority: DE
Inventors: Jean Lesley MURRAY; Carol Judy YOUNG; J. Robert TUSHINSKI
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1998-02-05
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2019-01-30
Also published as: WO1999040180A3; CA2318819A1; EP1053302A2; IL137304A0; ES2252932T3; NZ505997A; AU2721299A; JP2002502599A; IL137304A; NZ524254A; WO1999040180A2; ATE314461T1; AU755344B2; DE69929174D1; EP1053302B1; WO1999040180A9

Description

Die Blutzellproduktion geht auf einen einzelnen Zelltyp, die hämatopoietische Stammzelle zurück, welche durch Proliferation und Differenzierung das gesamte hämatopoietische System verursacht. Von den hämatopoietischen Stammzellen wird angenommen, dass sie zur Selbsterneuerung fähig sind – dass sie ihre eigene Population an Stammzellen vermehren – und sie sind pluripotent – in der Lage, sich in jede Zelle in dem hämatopoietischen System zu differenzieren. Aus dieser seltenen Zellpopulation wird das gesamte reife hämatopoietische System, umfassend Lymphozyten und Myeloidzellen (Erythrozyten, Megakaryozyten, Granulozyten und Makrophagen) gebildet. Die Lymphoidlinie, umfassend B-Zellen und T-Zellen, sorgt für die Produktion von Antikörpern, die Regulation des zellulären Immunsystems, die Detektion von Fremdstoffen in dem Blut, die Detektion von für den Wirt fremden Zellen und Ähnliches. Die Myeloidlinie, welche Monozyten, Granulozyten, Megakaryozyten, ebenso wie andere Zellen einschließt, kontrolliert im Hinblick auf die Anwesenheit von Fremdkörpern, sorgt für Schutz gegen neoplastische Zellen, fängt Fremdmaterialien ein, erzeugt Blutplättchen und Ähnliches. Die Erythroidlinie sorgt für rote Blutzellen, welche als Sauerstoffträger wirken. Die Herstellung reifer Blutzellen ist während des erwachsenen Lebens fortdauernd, da die reifen Zellen kurzlebig sind. Eine lebenslange Produktion reifer Blutzellen hängt von der Aktivität des kleinen Pools pluripotenter hämatopoietischer Stammzellen (HSC) ab, die hauptsächlich in dem Knochenmark lokalisiert sind.
Pluripotente HSCs werden als ideale Kandidaten für die Therapie von Krankheiten und als ideale Zielzellen für die Gentherapie erachtet. Es gibt viele Krankheiten, die hämatopoietische Zellen angreifen, für welche Gentherapie und/oder Knochenmarktransplantation nützlich sein könnten, um die Erkrankung zu erleichtern oder zu heilen. Solche Krankheiten schließen schwere kombinierte Immunschwäche (SCID), chronische myelogene Leukämie (CML), β-Thalassämie, Sichelzellenanämie und Ähnliche ein. Da Blutzellen einen endlichen Lebenszyklus haben, sorgt Gentransfer in gereiftere hämatopoietische Zellen wie T-Zellen im besten Fall für einen nur vorübergehenden therapeutischen Nutzen. Zum Beispiel wurde eine SCID-Patientin durch das Einführen eines normalen ADA-Gens in ihre Lymphozyten ex vivo und durch das erneute Injizieren der transduzierten Lymphozyten zurück in die Patientin behandelt (Biotechnology News (1993) 13:14). Für eine wirksame Therapie müssen ADA-tragende Lymphozyten in den Patienten alle sechs Monte erneut injiziert werden. Das Einführen des ADA-Gens in HSCs könnte wiederholte Behandlungen überflüssig machen, da die ADA-tragenden Stammzellen das Knochenmark erneut bevölkern könnten und vollständig die Krankheit heilen könnten. Folglich werden Gentherapieanstrengungen auf HSCs fokussiert, da die Transduktion und Transplantation dieser Zellen für ein Mittel zur Sicherung einer fortdauernden Versorgung mit genetisch modifizierten hämatopoietischen Zellen während der Lebensdauer des Patienten sorgen könnten. HSCs sind letztlich auch verantwortlich für die Wiederherstellung von Blutzellzahlen, falls das hämatopoietische System in irgendeiner Weise entleert wurde.
Es hatte sich jedoch die Aufrechterhaltung von Ex-vivo-Langzeitkulturen von HSCs, die pluripotent bleiben, als schwierig herausgestellt. Zusätzlich müssen die ex vivo kultivierten Stammzellen für eine erfolgreiche Gentransduktion eine Mitose durchmachen. (Hajihosseini et al. (1993) EMBO 12: 4969; Lewis & Emennan (1994) J. Virol. 68: 510). Da von der Mehrheit frisch isolierter HSCs gedacht wird, dass sie inaktiv sind (siehe z. B. Ogawa (1993) Blood 81: 2844), ist es notwendig, geeignete Ex-vivo-Bedingungen bereitzustellen, um die HSC-Teilung ohne Differenzierung und anschließendem. Verlust des pluripotenten Multilinienzustands zu stimulieren, um eine effiziente klinische Therapie mit genmanipulierten HSC zu erzielen. Stroma scheint erforderlich zu sein, um solche Bedingungen bereitzustellen, aber wegen der technischen Schwierigkeiten der Verwendung von Stromakulturen für die klinische Gentherapie wurden die passenden Kulturbedingungen, welche die Ex-vivo-Replikation und -Aufrechterhaltung menschlicher HSC in der Abwesenheit von Stroma stimulieren, nicht deutlich definiert.
Um eine retrovirale Gentransduktion von HSC in der Abwesenheit von Stroma zu erzielen, wurden IL-3 und IL-6 in Kombination mit KL oder LIF zu den stromafreien Kulturen hinzugefügt. (Nolta et al. (1995) Blood 86: 101; Junker et al. (1997) Blood 89: 4299). Die Effizienz der Gentransduktion in diese kultivierten HSCs bleibt jedoch niedrig. Zusätzlich kann die Ex-vivo-Kultur von HSC mit IL-3 für die Aufrechterhaltung der unmodifizierten HSC-Funktion schädlich sein, wie durch eine abnehmende Rekonstitutionsfähigkeit von HSC in letal bestrahlten Mäusen angezeigt worden ist (siehe Knobel et al. (1994) Exp. Hematol. 22: 1227; Yonemura et al. (1996) PNAS USA 93: 4040).
Die retrovirusvermittelte Genexpression in menschlichen hämatopoietischen Zellen korrelierte umgekehrt mit der Wachstumsfaktorstimulation, wenn die Kulturen IL-3 einschlossen. Zusätzlich kann IL-3 das B-Lymphoidpotential aufheben und ist ein positiver Regulator der frühen Myelopoiese. (Hirayama et al. (1994) PNAS USA 91: 469). Weiterhin induzieren 3 bis 6 Tage Kultur in der Anwesenheit von IL-3 nicht nur Zellteilung der unmodifizierten menschlichen CD34⁺Liri^–Rhodamin-(Rhl23)^lo-Zellen, sondern auch die Differenzierung (Verlust der CD34-Expression). (Murray et al. (1995) Blood 86 (Suppl. 1): 256a:1009; Young et al. (1996) Blood 88: 1619). Folglich gibt es nun einen zunehmenden Beleg, dass der Einschluss von IL-3 in Kulturen in dem Verlust der Langzeit-Rekonstitutionfähigkeit von HSC resultiert. (Knobel et al., oben; Yonemura et al. (1996) oben; Yonemura et al. (1997) Blood 89: 1915; Dao et al. (1997) Blood 89: 446).
Reddy et al. (1995) Exp. Hematol. 23: 813 berichteten, dass gereinigte Knochenmarkstamm/-progenitorzellen synchron von der G0/G1- bis zur S-Phase in vitro fortschritten als Antwort auf einen Cytokincocktail, bestehend aus IL-3, IL-1α, bFGF, GM-CSF, G-CSF, CSF-1 und Steel Factor. Peters et al. (1995) Exp. Hematol. 23: 461 beschrieben einen Cytokincocktail aus IL-3, IL-6, IL-11 und SCF, der verwendet wurde, um hämatopoietische Mausprogenitorzellen in 48-Stunden-in-vitro-Kulturen aus Knochenmark zu vermehren. Von anderen Cytokincocktails, die Thrombopoietin (TPO) einschlossen, wurden berichtet (Kaushansky et al. (1996) Exp. Hematol 24: 265-9; Ramsfjell et al. (1997) J. Immunol. 158: 5169-77). In gewissen Fällen löst jedoch die Behandlung mit diesen und anderen Cocktails aus Cytokinen die Differenzierung der Zelle aus; deshalb ist die Pluripotenz verloren.
In einem anderen Ansatz wurden Mausknochenmarkzellen in der G1/G0-Phase durch Kultivieren der Zellen in isoleucinfreiem Medium arretiert (Reddy et al. (1995) Exp. Hematol. 23: 813). Kittler et al. (1994) Blood 84: 344A beschreiben ein Vorgehen, in welchem isolierte Mausknochenmarkzellen in Medium, welches einen Cocktail aus Cytokinen enthielt, für 48 Stunden vorstimuliert worden sind, und dann für zusätzliche 48 Stunden in demselben Medium und mit Cytokinen mit der retroviralen Producer-Zelllinie co-kultiviert worden sind. Die Zellen wurden dann in Wirtsmäuse injiziert. Kittlers Plan produzierte jedoch niedrige Spiegel an Transplantatinkorporation im Knochenmark und schlug fehl, retroviral transduzierte Zellen in dem Knochenmark oder in peripherem Blut zu erzielen.
Ramsfjell et al. (1997) J. Immunol. 158: 5169 berichteten, dass Thrombopoietin direkt das Multilinienwachstum und die Progenitorzellvermehrung aus primitiven menschlichen Knochenmarkprogenitorzellen stimuliert. Young et al. (1996) Blood 88: 1619 berichteten, dass Thrombopoietin die Megakaryozytopoese, Myelopoiese und die Vermehrung von CD34⁺-Progenitorzellen aus einzelnen primitiven CD34^–Thy-1⁺Lin^–-Progenitorzellen stimuliert. Die WO 97/16535 beschreibt ähnlich, wie myeloproliferierende Leukämierezeptorliganden (mpl-Liganden), wie Thrombopoietin, auf eine primitive Unterpopulation menschlicher Stammzellen mit den Eigenschaften der Selbsterneuerung und der Fähigkeit, sämtliche hämatopoietischen Zelllinien hervorzurufen, wirkt.
Für eine Langzeiteffizienz der hämatopoietischen Stammzelltherapie bleibt ein Bedarf für ein wirksames Ex-vivo-Nichtstroma-Zellkultursystem, welches die Stammzellpluripotenz bewahrt. Es ist wünschenswert ein Ex-vivo-Kulturverfahren zu erzielen, welches in der Induktion oder Aktivierung oder HSC-Zyklisierung ohne Verlust der Pluripotenz resultiert. Zusätzlich sollte das Verfahren in Zellen resultieren, die für die In-vivo-Verwendung mit einer minimalen Toxizität für das die Behandlung erhaltende Individuum geeignet sind. Die vorliegende Erfindung befriedigt diese Bedürfnisse und stellt auch damit im Zusammenhang stehende Vorteile bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Fördern der Vermehrung hämatopoietischer Stammzellen in Kultur, umfassend das Kultivieren der Zellen in der Anwesenheit einer wirksamen Menge eines mpl-Liganden (wie Thrombopoietin (TPO)), eines flt3-Liganden und Interleukin 6 (IL6). Andere Cytokine können zu der Kultur hinzugefügt werden, alleine oder in Kombination, bevorzugt sind die Cytokine eine wirksame Menge aus Interleukin 3 (IL3), Leukämie-Hemmfaktor (LIF) und/oder c-kit-Ligand. In einem solchen Verfahren sind die Cytokine TPO, FL, IL6 und LIF. In einem weiteren Verfahren sind die Cytokine TPO, FL, IL6 und IL3. In einem anderen Verfahren sind die Cytokine TPO, FL, IL6, LIF und IL3. In noch einem anderen Verfahren sind die Cytokine TPO, FL, IL6 und ein c-kit-Ligand. In immer noch einem anderen Verfahren sind die Cytokine TPO, FL, IL6, LIF, IL3 und ein c-kit-Ligand. In noch einem anderen Verfahren sind die Cytokine TPO, FL, IL6, LIF und ein c-kit-Ligand.
Die hierin beschriebenen Kulturverfahren rufen Populationen an hämatopoietischen Stammzellen hervor, die durch die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und durch die Fähigkeit, sämtliche hämatopoietische Zelllinien entstehen zu lassen, gekennzeichnet sind. In einem solchen Verfahren sind die hämatopoietischen Stammzellen menschliche hämatopoietische Stammzellen, bevorzugt CD34⁺, bevorzugter CD34⁺Thy-1⁺ und sogar noch bevorzugter CD34⁺Thy-1⁺Lin^–.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Wiederherstellung der hämatopoietischen Fähigkeit in einem Patienten, umfassend: (a) Kultivieren einer Population, umfassend hämatopoietische Stammzellen, in der Anwesenheit eines mpl-Liganden, besonders TPO, eines flt3- (FL-) Liganden und Interleukin 6 (IL6) unter Bedingungen, welche die Vermehrung der hämatopoietischen Stammzellpopulation begünstign; und (b) Verabreichen einer wirksamen Menge dieser vermehrten Population aus Stammzellen an den Patienten. Andere Cytokine können ebenfalls hinzugefügt werden, alleine oder in Kombination, zum Beispiel eine wirksame Menge aus Leukämie-Hemmfaktor (LIF), Interleukin 3 (IL3) und/oder ein c-kit-Ligand. In einem solchen Verfahren sind die Cytokine TPO, FL, IL6 und LIF. In einem anderen Verfahren sind die Cytokine TPO, FL, IL6 und IL3.
In noch einem anderen Verfahren sind die Cytokine TPO, FL, IL6, IL3 und LIF. In einem weiteren Verfahren sind die Cytokine TPO, FL, IL6 und ein c-kit-Ligand. In noch einem anderen Verfahren sind die Cytokine TPO, FL, IL6, LIF und ein c-kit-Ligand. Ein anderes Verfahren umfasst die Cytokine TPO, FL, IL6, IL3 und ein e-kit-Ligand oder TPO, FL, IL6, LIF, IL3 und ein c-kit-Ligand. Die hämatopoietischen Stammzellen können menschliche hämatopoietische Stammzellen, bevorzugt CD34⁺, bevorzugter CD34⁺Thy-1⁺ und sogar noch bevorzugter CD34⁺Thy-1⁺Lin^–, sein. Die hämatopoietischen Stammzellen, die in den Cytokinen kultiviert und dem Patienten verabreicht werden, können allogen sein. Die in den Cytokinen kultivierten und dem Patienten verabreichten hämatopoietischen Stammzellen können autolog sein.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Modifikation einer hämatopoietischen Stammzelle bereit, umfassend das In-Kontakt-Bringen eines Genzufuhrvehikels, umfassend eine Polynukleotidsequenz, mit einer Population hämatopoietischer Stammzellen, die mit Fibronectin oder RetroNectin^TM und in der Anwesenheit einer wirksamen Menge eines mpl-Liganden und eines flt3-Liganden (FL) kultiviert worden sind. Andere Moleküle können ebenfalls zu der Kultur hinzugefügt werden, alleine oder in Kombination, zum Beispiel ein c-kit-Ligand, Interleukin 6 (IL6), Interleukin 3 (IL3), Leukämie-Hemmfaktor (LIF) und/oder Fibronectin. In einer Ausführung sind die hinzugefügten Moleküle ein TPO, FL und ein c-kit-Ligand. In einer zweiten Ausführung sind die hinzugefügten Moleküle TPO, FL und IL6. In einer dritten Ausführung sind die hinzugefügten Moleküle TPO, FL, IL6 und LIF. In einer vierten Ausführung sind die hinzugefügten Moleküle TPO, FL, IL6, LIF und IL3. In einer fünften Ausführung sind die hinzugefügten Moleküle TPO, FL, IL6, IL3 und ein c-kit-Ligand. In einer sechsten Ausführung sind die hinzugefügten Moleküle TPO, FL, IL6, IL3, ein c-kit-Ligand und LIF. In einer weiteren Ausführung sind die Moleküle TPO, FL, IL6, IL3. In jeder dieser Kulturbedingungen kodiert die Polynukleotidsequenz ein Produkt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Peptid, einem Ribozym und einer Gegensinnsequenz, und das Genzufuhrvehikel wird ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem retroviralen Vektor, einem DNS-Vektor und einem liposomalen Zufuhrvehikel. Weitere Ausführungen der vorliegenden Erfindung werden in den angehängten Ansprüchen dargelegt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1, Abbildungen A bis G, bilden die FACS-Analyse von mit PKH26 gefärbten CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Knochenmarkzellen (BM-Zellen) für 6 Tage in verschiedenen Cytokinkombinationen, enthaltend FL, ab. Die Zahlen zeigen die Prozentsätze an Zellen in jedem Quadrant aus einem repräsentativen Experiment. Verlust an PKH26-Fluoreszenz zeigt Zellteilung an. Verlust der CD34-Expression zeigt Differenzierung an. Kontrollzellen wurden über Nacht kultiviert (D0) oder für 6 Tage (D6) ohne Cytokine, und Quadranten wurden unter Verwendung von lebend durchgelassenen ungeteilten Zehen eingestellt. Die Prozentsätze ungeteilter Zellen (UR- und UL-Quadranten) sind kombiniert.
2 erläutert mehrfache Zunahme in entweder Gesamt-CAFC oder CAFC in einer FACS-sortierten CD34^hiPKH^lo-Zellpopulation aus Kulturen aus CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-BM-Zellen mit zahlreichen Cytokinen. Gestreifte Säulen bilden IL3-, IL6- und LIF-Behandlung ab. Graue Säulen bilden TPO- und KL-Behandlung ab. Ausgefüllte Säulen bilden TPO-, FL- und KL-Behandlung ab.
3 erläutert den Prozentsatz positiver Transplantate gegen die Anzahl unkultivierter CD34⁺Thy-1⁺Lin^–(BM)-Zellen, die pro Transplantat injiziert worden sind. Dies wurde getan, um die Dosis von 10K-Thy-1⁺-Zellen auszuwählen.
4, Abbildungen A bis L, zeigen FACS-Analyse der Transplantatinkorporation menschlicher Donorzellen 8 Wochen nach SCID-hu-Knocheninjektion von 10.000 Zellen pro Transplantat. CD34⁺-Zellen, die sich innerhalb von 6 Kulturtagen in TPO, KL und FL teilten (CD34⁺ PKH^lo), bewahrten ihre Fähigkeit zur In-vivo-Knochenmark-Repopulation (Abbildungen C, F, I, L), wenn sie mit unkultivierten BM-CD34⁺Thy-1⁺Lin^–(Abbildungen B, E, H, K) verglichen werden. Die x-Achse zeigt die Färbung für den Donor-HLA-Allotyp. Die y-Achse zeigt das Färben für menschliche Gesamtzellen (W6/32, anti-menschlich Klasse I MHC) oder Linienmarker.
5 zeigt den Prozentsatz an CD34⁺- und den Prozentsatz an CD34⁺Thy-1⁺-Zellen, bestimmt aus FACS, Dot-Plots, von MPB-CD34⁺-Zellen, die für 90 Stunden kultiviert worden sind. Säulen sind die Mittelwerte von 3 bis 12 Experimenten an Zellen aus verschiedenen normalen Donoren und Fehlerbalken sind die Standardabweichungen des Mittelwertes. T = Thrombopoietin, K = kit-Ligand, F = flt3-Ligand, L = LIF, 3 = IL-3, 6 = IL-6.
6 zeigt die x-fache Zunahme von CD4⁺Thy-1⁺-Zellen nach 90 Stunden, berechnet aus der Gesamtanzahl an CD4⁺Thy-1⁺-Zellen am Tage 0 und an dem Ende der Kultur. Säulen sind die Mittelwerte von 3 bis 12 Experimenten und Fehlerbalken sind die Standardabweichungen des Mittelwertes. Gestreifte Säulen repräsentieren Gesamtzellen und ausgefüllte Säulen repräsentieren CD4⁺Thy-1⁺-Zellzahlen. T = Thrombopoietin, K = kit-Ligand, F = flt3-Ligand, L = LIF, 3 = IL-3, 6 = IL-6.
7 zeigt die x-fache Zunahme in CAFC-Zellen unter MPB-Zellen, die für 5 Tage in verschiedenen Cytokinen kultiviert worden sind, und CD4⁺Thy-1⁺-Zellen im Vergleich mit unkultivierten Zellen.
8 erläutert die Transplantatinkorporation von SCID-hu-Knochen mit CFSE-markierten CD34⁺-MPB-Zellen, die für 5 Tage kultiviert worden sind. Kultivierte CD34⁺-Zellen wurden sortiert, wobei einzelne Teilungen mittels CFSE-Farbstoffrückhaltung segregiert worden sind. Jeder Datenpunkt repräsentiert ein einzelnes Knochentransplantat. Transplantate, die weniger als 1 % menschliche Donorzellen der Gesamtzellen in dem Transplantat enthielten, wurden als keine Transplantatinkorporation aufweisend erachtet. Typischerweise konnten wenigstens 10.000 Zellen (sowohl menschliche als auch Maus) aus den Transplantaten erhalten werden, deshalb repräsentierte 1 % wenigstens 100 zelluläre Ereignisse.
9 zeigt die Lyt2-Transgenexpression nach in vitro erfolgter Langzeit-Stromakultur von transduzierten MPB-CD34⁺-Zellen.
ARTEN DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird, solange nicht anderweitig angezeigt, gewöhnliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, Zellbiologie und rekombinanten DNS-Technik nutzen, die im Fachwissen liegen. Siehe z. B. Sambrook, Fritsch und Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al., Hrsg., 1987); die Reihen METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. McPherson. B. D. Hames und G. R. Taylor, Hrsg., 1995); ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, Hrsg., 1987); und ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow et al., Hrsg., 1987).
Definitionen
Wie hierin verwendet, werden gewisse Begriffe definitive Bedeutungen haben.
Der Begriff „hämatopoietische Stammzelle" bezieht sich auf tierische, besonders Säuger-, bevorzugt menschliche hämatopoietische Stammzellen und nicht auf Stammzellen anderer Zelltypen. „Stammzellen" bezieht sich ebenfalls auf eine Population hämatopoietischer Zellen, die sämtlich das Potential zu Langzeittransplantatinkorporation in vivo haben. Tiermodelle für das Potential der Langzeittransplantatinkorporation von menschlichen hämatopoietischen Kandidaten-Stammzell-Populationen schließen das SCID-hu-Knochenmodell (Kyoizumi et al. (1992) Blood 79: 1704; Murray et al. (1995) Blood 85 (2) 368-378) und das in utero erfolgende Schafmodell (Zanjani et al. (1992) J. Clin. Invest. 89: 1179) ein. Für einen Überblick der Tiermodelle der menschlichen Hämatopoiese siehe Srour et al. (1992) J. Hematother. 1: 143-153 und die darin zitierten Verweise. Gegenwärtig ist der beste In-vitro-Test für Stammzellen der Longterm-Culture-Initiating-Cells-Test (LTCIC-Test), basierend auf einer begrenzenden Verdünnungsanalyse der Anzahl klonogener Zellen, die in einer Stroma-Co-Kultur nach 5 bis 8 Wochen erzeugt werden (Sutherland et al., (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. 87: 3584-3588). Von dem LTCIC-Test wurde gezeigt, dass er mit einem anderen üblicherweise verwendeten Stammzelltest korreliert, den Cobblestone-Area-Forming-Cell-Test (CAFC-Test), und mit Potential für Langzeittransplantatinkorporation in vivo. (Breems et al. (1994) Leukemia 8: 1095). Beispielhaft für eine hoch angereicherte Stammzellpopulation ist eine Population, die den CD34⁺Thy-1⁺LIN^–-Phänotypen hat, wie beschrieben im US-Patent Nr. 5,061,620. Eine Population dieses Phänotypen wird typischerweise eine durchschnittliche CAFC-Frequenz von annähernd 1/20 haben. Murray et al. (1995) oben; Lansdrop et al. (1993) J. Exp. Med. 177: 1331. Es wird von Fachleuten erkannt werden, dass die in jeder Stammzellpopulation bereitgestellte Anreicherung sowohl von den verwendeten Selektionskriterien abhängen wird, als auch von der durch die gegebenen Selektionstechniken erzielten Reinheit.
Wie hierin verwendet, wird von dem Begriff „Vermehrung (Expansion)" beabsichtigt, dass er bedeutet, dass Progenitorzellen erlaubt wird, in der Zellzahl von den pluripotenten Stammzellen, die verwendet worden sind, um die Kultur zu starten, anzusteigen. Der Begriff „überleben" bezieht sich auf die Fähigkeit, damit fortzufahren, lebend oder funktionierend zu bleiben.
Die hämatopoietischen Stammzellen, die verwendet worden sind, um die Zellkultur zu inokulieren, können aus jeder Quelle gewonnen werden, einschl. Knochenmark, sowohl adult als auch fötal, aus durch Cytokin oder Chemotherapie mobilisiertem peripherem Blut, fötaler Leber, Knochenmark oder Nabelschnurblut.
Allgemein ist es wünschenswert, die Ausgangsinokulationspopulation von neoplastischen Zellen vor der Kultur zu isolieren. Die Abtrennung von Stammzellen von neoplastischen Zellen kann durch jedes einer Anzahl von Verfahren durchgeführt werden, einschließlich Zellsortiergeräten, magnetischen Perlen, gepackten Säulen. Durch die Isolation des Phänotypen (CD34⁺Th-1⁺CD14^–CD15^–) aus Patienten mit multiplem Myelom wurde gezeigt, dass sie die Tumorlast auf weniger als 1 Tumor pro 10⁵ gereinigte Zellen reduziert.
Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, schließt die Singularform „ein" und „der/die/das" Bezugnahmen auf den Plural ein, solange bis der Zusammenhang deutlich das Gegenteil vorschreibt. Zum Beispiel schließt der Begriff „eine Stammzelle" eine Vielzahl von Zellen ein, einschl. Mischungen davon, und Bezugnahme auf „einen flt3-Liganden" oder „mpl-Liganden" schließt Bestandteile ein, die in der Lage sind, den flt3- oder mpl-Rezeptor mit ausreichender Spezifität zu binden, um eine flt3- oder TPO-vermittelte biologische Aktivität auszulösen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Cytokin" auf jeden einzelnen der zahlreichen Faktoren, die eine Reihe von Wirkungen auf Zellen zeigen, zum Beispiel das Induzieren von Wachstum oder Proliferation. Nichtbegrenzende Beispiele an Cytokinen, die alleine oder in Kombination bei der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Interleukin-2 (IL-2), Stammzellfaktor (SCF), Interleukin. 3 (IL-3), Interleukin 6 (IL-6), einschl. löslichem IL-6-Rezeptor, Interleukin 12 (IL-12), G-CSF, Granulozyten-Makrophagenkolonie-Stimulierungsfaktor (GM-CSF), Interleukin 1 alpha (IL-1α), Interleukin 11 (IL-11), MIP-1α, Leukämie-Hemmfaktor (LIF), c-kit:-Ligand, Thrombopoietin (TPO) und flt3-Ligand ein. Die vorliegende Erfindung schließt auch Kulturbedingungen ein, in welchen eines oder mehrere Cytokine spezifisch von dem Medium ausgeschlossen werden. Cytokine sind im Handel erhältlich von etlichen Verkäufern wie zum Beispiel Amgen (Thousand Oaks, CA), R&D Systems und Immunex (Seattle, WA). Es wird beabsichtigt, obwohl nicht immer explizit festgestellt, dass von Molekülen, die eine ähnliche biologische Aktivität wie Wildtyp- oder gereinigte Cytokine (z. B. rekombinant erzeugte) haben, ebenfalls beabsichtigt ist, dass sie verwendet werden.
Mit den Begriffen „mpl-Ligand (Ligand für myeloproliferierende Leukämie)", „flt3- (,FL'-) Ligand" und „c-kit- (,KL'-) Ligand" sind alle Verbindungen gemeint, die in der Lage sind, an die mpl-, flt3- (FL-) und c-kit- (KL-, auch Steel Factor (Stl), Mastzellwachstumsfaktor (MGF) genannt) Rezeptoren zu binden bzw. so zu binden, dass eine oder mehrere mit dem Binden des Wildtyprezeptors im Zusammenhang stehende biologische Wirkungen gestartet werden. Biologische Aktivität schließt ein (1) die Förderung des Überlebens von Stammzellen in Kultur, so dass die Zelle die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit, alle hämatopoietischen Zelllinien hervorzurufen, bewahrt, (2) die Vermehrung von Stammzellpopulationen, so dass die Zelle die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit, sämtliche hämatopoietischen Zelllinien hervorzurufen, bewahrt, und (3) die Aktivierung von inaktiven Stammzellen, so dass die Stammzelle aktiviert wird, sich zu teilen, und dass die resultierenden Zellen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit, sämtliche hämatopoietischen Zelllinien hervorzurufen, bewahren.
Die mpl-, flt3- und c-kit-Liganden schließen auch Antikörper für diese Rezeptoren ein, die in der Lage sind, sich an den geeigneten Rezeptor zu binden, so dass eine oder mehrere der oben beschriebenen biologisch vermittelten Wirkungen gestartet werden. Solche Antikörper können vereinigte monoklonale Antikörper mit unterschiedlichen Epitopspezifitäten sein oder können gesonderte monoklonale Antikörper sein. Die Begriffe „mpl-Ligand", „flt3-Ligand", oder „c-kit-Ligand" schließen weiter „mimetische" Moleküle ein, das heißt, kleine Moleküle, die in der Lage sind, diese Rezeptoren zu binden, so dass eine oder mehrere der oben beschriebenen biologischen Wirkungen gestartet werden. Ein Beispiel eines TPO-Mimetikums wird gefunden in Cwirla et al. (1997) Science 276: 1696.
Andere Moleküle können zu den Kulturmedien hinzugefügt werden, zum Beispiel Adhäsions-Moleküle wie Fibronectin oder RetroNectin^TM (kommerziell hergestellt durch Takara Shuzo Co. Ltd., Otsu Shigi, Japan). Der Begriff „Fibronectin" bezieht sich auf ein Glykoprotein, das durch den ganzen Körper hindurch gefunden wird, und seine Konzentration ist besonders hoch in Bindegeweben, wo es einen Komplex mit Kollagen bildet. Von Fibronectin wird gedacht, dass es eine Rolle beim Kontrollieren von Zellwachstum und -differenzierung und bei der Zelladhäsion spielt.
Der Begriff „kultivieren" bezieht sich auf die Vermehrung von Zellen oder Organismen auf oder in Medien unterschiedlicher Arten. Es wird verstanden, dass die Abkömmlinge eines Zellwachstums in Kultur mit der elterlichen Zelle nicht vollständig identisch (entweder morphologisch, genetisch oder phänotypisch) sein könnten.
Eine „effektive Menge" ist eine Menge, die ausreichend ist, günstige oder erwünschte Ergebnisse zu bewirken. Eine wirksame Menge kann in einer oder mehreren Applikationen verabreicht werden. Für Zwecke dieser Erfindung ist eine wirksame Menge der hierin verwendeten Cytokine eine Menge, die ausreichend ist, das Überleben, die Vermehrung und/oder Transduktion (mit einem Genzufuhrvehikel) von hämatopoietischen Stammzellen zu fördern. In einer Ausführung kann eine wirksame Menge der einzelnen verschiedenen Cytokine von ungefähr 0,1 ng/ml bis ungefähr 500 ng/ml, gewöhnlich von ungefähr 5 ng/ml bis ungefähr 200 ng/ml und noch gewöhnlicher von ungefähr 10 ng/ml bis ungefähr 100 ng/ml sein. In einer anderen Ausführung sind die Cytokine in den Medien enthalten und werden durch Medienperfusion wieder aufgefüllt.
Eine „isolierte" oder „gereinigte" Population an Zellen ist im Wesentlichen frei von Zellen und Materialien, mit welchen sie in der Natur verbunden ist. Mit im Wesentlichen frei oder im Wesentlich gereinigt ist gemeint, dass wenigstens 50 % der Population hämatopoietische Stammzellen sind, bevorzugt zu wenigstens 70 %, bevorzugter zu wenigstens 80 % und sogar noch bevorzugter zu wenigstens 90 % frei von nicht-pluripotenten Zellen, mit welchen sie in der Natur verbunden sind. „Im Wesentlichen frei von Stromazellen" soll eine Zellpopulation bedeuten, welche, wenn sie in ein wie hierin beschriebenes Kultursystem gegeben wird, eine anhaftende Zellschicht nicht bildet.
Ein „Subjekt" ist ein Vertebrat, bevorzugt ein Säuger, bevorzugter ein Mensch. Säuger schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Mäuse, Affen, Bauernhoftiere, Sporttiere und Haustiere.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine „genetische Modifikation" auf jede Addition, Deletion oder Zerstörung der normalen Nukleotide einer Zelle. Von den Verfahren dieser Erfindung ist beabsichtigt, dass sie alle Verfahren des Gentransfers in hämatopoietische Stammzellen einschließen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt, auf virusvermittelten Gentransfer, liposomenvermittelten Transfer, Transformation, Transfektion und Transduktion, z. B. virusvermittelter Gentransfer wie die Verwendung von auf DNS-Viren wie Adenovirus, adeno-assoziiertes Virus und Herpesvirus basierten Vektoren, ebenso wie retroviralbasierten Vektoren. Ein „viraler Vektor" ist als ein rekombinant erzeugtes Virus oder virales Partikel definiert, welches ein Polynukleotid umfasst, das in eine Wirtszelle geliefert werden soll, entweder in vivo, ex vivo oder in vitro. Beispiele viraler Vektoren schließen retrovirale Vektoren wie lentivirale Vektoren, Adenovirusvektoren, adeno-assoziiertes Virus-Vektoren und Ähnliches ein. In Aspekten, wo Gentransfer durch einen retroviralen Vektor vermittelt wird, bezieht sich ein Vektorkonstrukt auf das Polynukleotid, welches das retrovirale Genom oder einen Teil davon und ein therapeutisches Gen umfasst.
Wie hierin verwendet, tragen „retroviral vermittelter Gentransfer" oder „retrovirale Transduktion" dieselbe Bedeutung und beziehen sich auf den Vorgang, durch welchen ein Gen oder Nukleinsäuresequenzen stabil in die Wirtszelle transferiert werden, im Wege dessen, dass das Virus in die Zelle eintritt und sein Genom in das Wirtszellgenom integriert. Das Virus kann die Wirtszelle über seinen normalen Infektionsmechanismus betreten oder kann modifiziert sein, so dass es an einen unterschiedlichen Wirtszelloberflächenrezeptor oder Liganden bindet, um in die Zelle einzudringen. Wie hierin verwendet, bezieht sich retroviraler Vektor auf ein virales Partikel, das in der Lage ist, fremde Nukleinsäure in eine Zelle durch einen viralen oder virusähnlichen Eindringmechanismus einzuführen.
Retroviren tragen ihre genetische Information in der Form von RNS; wenn jedoch das Virus erst einmal eine Zelle infiziert, so wird die RNS in die DNS-Form revers transkribiert, welche in die genomische DNS der infizierten Zelle integriert. Die integrierte DNS-Form wird ein Provirus genannt.
In Aspekten, wo Gentransfer durch einen viralen DNS-Vektor vermittelt wird, wie ein Adenovirus (Ad) oder adeno-assoziiertes Virus (AAV), bezieht sich ein Vektorkonstrukt auf das Polynukleotid, welches das retrovirale Genom oder einen Teil davon und ein therapeutisches Gen umfasst. Adenoviren (Ads) sind verhältnismäßig gut charakterisierte, homogene Virusgruppen, einschließend über 50 Serotypen (siehe z. B. WO 95/27071). Ads sind leicht wachsen zu lassen und erfordern die Integration in das Wirtszellgenom nicht. Rekombinante, Ad-abgeleitete Vektoren, besonders jene, die das Potential für die Rekombination und Schaffung des Wildtypvirus reduzieren, wurden ebenfalls konstruiert (siehe WO 95/00655; WO 95/11984).
Adeno-assoziiertes Virus (AAV) wurde ebenfalls als ein Gentransfersystem verwendet (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,693,531 und 5,691,176). Wildtyp-AAV hat eine hohe Infektiosität und Spezifität beim Integrieren in das Wirtszellgenom. (Hermonat und Muzyczka (1984) PNAS USA 81: 6466-6470; Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 3988-3996). Rekombinante AAV-Vektoren wurden in hohen Titern produziert und welche Zielzellen in einer hohen Effizienz transduzieren können.
Vektoren, die sowohl einen Promotor als auch eine Klonierstelle enthalten, in welche ein Polynukleotid operabel gekoppelt werden kann, sind in der Technik bekannt. Solche Vektoren sind in der Lage, RNS in vitro oder in vivo zu transkribieren, und sind im Handel von Quellen wie Stratagene (La Jolla, CA) und Promega Biotech (Madison, WI) erhältlich. Um die Expression und/oder In-vitro-Transkription zu optimieren, kann es notwendig sein, 5'- und/oder 3'-untranslatierte Teile der Klone zu entfernen, hinzuzufügen oder zu ändern, um zusätzliche, möglicherweise ungeeignete alternative Translationsstartkodons oder andere Sequenzen zu eliminieren, welche die Expression stören oder reduzieren könnten, entweder auf dem Niveau der Transkription oder der Translation. Alternativ können Konsensus-Ribosomen-Bindungsstellen unmittelbar 5' von dem Startkodon inseriert werden, um die Expression zu steigern. Beispiele von Vektoren sind Viren wie Baculovirus und Retrovirus, Bakteriophagen, Cosmid, Plasmid, Pilzvektoren und andere Rekombinationsvehikel, die typischerweise in der Technik verwendet werden, welche für die Expressionen in einer Reihe von eukaryotischen und prokaryotischen Wirten beschrieben worden sind und die für die Gentherapie ebenso wie für die einfache Proteinexpression verwendet werden können.
Unter diesen sind etliche nicht-virale Vektoren, einschließlich DNS/Liposomen-Komplexen und gerichteten viralen Protein-DNS-Komplexen. Um die Zufuhr zu einer Zelle zu steigern, können die Nukleinsäuren oder Proteine dieser Erfindung an Antikörper oder Bindungsfragmente davon konjugiert sein, welche Zelloberflächen-Antigene, z. B. TCR, CD3 oder CD4, binden. Liposomen, welche auch einen Targeting-Antikörper oder ein Fragment davon umfassen, können bei den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Diese Erfindung stellt auch die Targetingkomplexe für die Verwendung in den hierin offenbarten Verfahren bereit.
Polynukleotide werden in Vektorgenome unter Verwendung von in der Technik wohlbekannten Verfahren inseriert. Zum Beispiel können Insert- und Vektor-DNS unter geeigneten Bedingungen mit einem Restriktionsenzym in Kontakt gebracht werden, um komplementäre Enden an jedem Molekül zu schaffen, welche miteinander paaren können und mit einer Ligase verbunden werden können. Alternativ können synthetische Nukleinsäurelinker an die Enden des beschränkten Polynukleotids ligiert werden. Diese synthetischen Linker enthalten Nukleinsäuresequenzen, die einer bestimmten Restriktionsstelle in der Vektor-DNS entsprechen. Zusätzlich kann ein Oligonukleotid, das ein Terminationskodon und eine geeignete Restriktionsstelle enthält, für die Insertion in einen Vektor ligiert werden, der zum Beispiel einige oder Sämtliches der Folgenden enthält: ein selektierbares Markergen, wie das Neomycingen für die Selektion von stabilen oder transienten Transfektanten in Säugerzellen; Enhancer-/Promotor-Sequenzen von dem Immediate-early-Gen von menschlichem CMV für höhere Transkriptionsspiegel; Transkriptionsterminations- und RNS-Verarbeitungssignale von SV40 für mRNS-Stabilität; SV40-Polyoma-Replikationsstartpunkte und CoIE1 für die exakte episomale Replikation; vielseitige multiple Klonierstellen, und T7- und SP6-RNS-Promotoren für die In-vitro-Transkription von Sinn- und Gegensinn-RNS. Andere Mittel sind wohl bekannt und in der Technik zugänglich.
Ex-Vivo-Kulturen hämatopoietischer Stammzellen
In einer Ausführung umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Expansion und/oder das Überleben einer hämatopoietischen Stammzell- (HSC-) Kultur. Zellpopulationen, die beim Bereitstellen einer Quelle an HSCs für dieses Verfahren nützlich sind, schließen ein und sind nicht beschränkt auf Zellpopulationen, die aus Knochenmark, sowohl adult als auch fötal, aus mobilisiertem peripherem Blut (MPB) und Nabelschnurblut erhalten werden. Hämatopoietische Stammzellen können aus jeder bekannten Quelle an hämatopoietischen Stammzellen isoliert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Knochenmark, sowohl adult als auch fötal, aus mobilisiertem peripherem Blut (MPB) und Nabelschnurblut. Die Verwendung von Nabelschnurblut wird zum Beispiel in Issaragrishi et al. (1995) N. Engl. J. Med. 332: 367-369 diskutiert. Am Anfang können Knochenmarkzellen aus einer Knochenmarkquelle gewonnen werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Ilium (z. B. aus dem Hüftknochen über den Darmbeinkamm), Tibia, Femur, den Wirbeln oder anderen Knochenkavitäten. Andere Stammzellquellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf den embryonalen Dottersack, fötale Leber und fötale Milz.
Die Verfahren können weitere Anreicherungs- oder Reinigungsvorgänge oder -schritte für die Stammzellisolation durch positive Selektion für andere stammzellspezifische Marker einschließen. Geeignete positive Stammzellmarker schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf CD34⁺ und Thy-1⁺. Bevorzugt sind die hämatopoietischen Zellen menschlich, sie können jedoch aus jedem anderen geeigneten Tier erhalten werden, z. B. vom Menschen, vom Affen, vom Schwein oder von der Maus.
Für die Isolation von Knochenmark kann eine geeignete Lösung verwendet werden, um den Knochen zu spülen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Salzlösung, gewöhnlich ergänzt mit fötalem Kälberserum (FCS) oder anderen natürlich vorkommenden Faktoren, in Verbindung mit einem annehmbaren Puffer in niedriger Konzentration, allgemein von ungefähr 5 bis 25 mM. Gewöhnliche Puffer schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf HEPES, Phosphatpuffer und Lactatpuffer. Anderweitig kann Knochenmark aus dem Knochen in Übereinstimmung mit üblichen Techniken angesaugt werden.
Bevorzugt wird die Quelle hämatopoietischer Stammzellen anfänglich Gegenstand von negativen Selektionstechniken, um jene Zellen zu entfernen, die linienspezifische Marker exprimieren, und um jene Zellen zu bewahren, die liniennegativ („Lin^–") sind. Lin^–-Zellen beziehen sich allgemein auf Zellen, denen Marker fehlen wie jene in Verbindung mit T-Zellen (wie CD2, 3, 4, und 8), B-Zellen (wie CD10, 19 und 20), Myeloidzellen (wie CD14, 15, 16 und 33), natürliche Killer- („NK"-) Zellen (wie CD2, 16 und 56), RBC (wie Glycophorin A), Megakaryocyten (CD41), Mastzellen, Eosinophile oder Basophile. Verfahren zur negativen Selektion sind in der Technik bekannt. Das Fehlen oder die niedrige Expression solcher linienspezifischer Marker ist durch das Fehlen der Bindung von Antikörpern, die für die zellspezifischen Marker spezifisch sind, identifiziert, was nützlich ist bei der so genannten „negativen Selektion". Vorzugsweise schließen die linienspezifischen Marker ein, sind jedoch nicht beschränkt auf wenigstens einen von CD2, CD14, CD15, CD16, DC19, CD20, CD38, HLA-DR und CD71; bevorzugter, wenigstens einen von CD14, CD15 und CD19. Wie hierin verwendet, bezieht sich Lin^– auf eine Zellpopulation, die auf dem Fehlen von Expression von wenigstens einem linienspezifischen Marker basierend selektiert worden ist. Eine hoch angereicherte Zusammensetzung kann durch die selektive Isolation von Zellen, die CD34⁺Lin^– sind, erhalten werden.
Zahlreiche Techniken können genutzt werden, um die Zellen abzutrennen, indem anfänglich Zellen der dedizierten Linie entfernt werden. Monoklonale Antikörper sind besonders nützlich zum Identifizieren von Markern in Verbindung mit bestimmten Zelllinien und/oder Stadien der Differenzierung. Die Antikörper können an einen festen Untergrund angeheftet werden, um für die Grobauftrennung zu sorgen. Die genutzten Separationstechniken sollten das Bewahren der Lebensfähigkeit der zu sammelnden Fraktion maximieren. Zahlreiche Techniken unterschiedlicher Effizienz können genutzt werden, um „verhältnismäßig grobe" Auftrennungen zu erhalten. Solche Auftrennungen sind bis zu 10 %, gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 5 %, bevorzugt nicht mehr als ungefähr 1 % der vorhandenen Gesamtzellen, die den Marker nicht haben; diese können mit der zurückzuhaltenden Zellpopulation verbleiben. Die bestimmte genutzte Technik wird von der Effizienz der Abtrennung, der damit verbundenen Zytotoxizität, der Leichtigkeit und Schnelligkeit der Durchführung und der Notwendigkeit für anspruchsvolle Ausrüstung und/oder technisches Können abhängig sein.
Separationsvorgänge können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf physikalische Abtrennung, magnetische Abtrennung und durch Verwendung von mit Antikörpern überzogenen Magnetperlen, Affinitätschromatographie, zytotoxische Mittel, die an einen monoklonalen Antikörper gebunden sind oder die in Verbindung mit einem monoklonalen Antikörper verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Komplement und Zytotoxine und das „Auswaschen" mit einem Antikörper, der an eine feste Matrix angeheftet ist, z. B. Platten-, Elutriations- oder jede andere übliche Technik.
Die Verwendung physikalischer Separationstechniken schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf jene, die auf Unterschiede in physikalischen (Dichtegradientenzentrifugation und Gegenstromzentrifugalauswaschung), Zelloberflächen- (Lektin- und Antikörperaffinität) und Vitalfärbeeigenschaften (Mitochondrien-bindender Färbstoff rho123 und DNS-bindender Farbstoff Hoechst 33342) basieren. Diese Vorgänge sind Fachleuten wohlbekannt.
Techniken, die eine akkurate Separation bereitstellen, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Durchflusszytometrie, welche variierende Entwicklungsgrade haben kann, z. B. eine Vielzahl von Farbkanälen, einen niedrigen Winkel und stumpfe Lichtstreudetektionskanäle, Impedanzkanäle etc. Die Zellen können auch durch auf Lichtstreueigenschaften basierter Durchflusszytometrie selektiert werden, wo Stammzellen selektiert werden, basierend auf einer niedrigen Seitenstreuung und niedrigen bis mittleren Vorwärtsstreuprofilen. Cytospin-Zubereitungen zeigen, dass die angereicherten Stammzellen eine Größe zwischen reifen Lymphoidzellen und reifen Granulozyten haben.
Alternativ kann in einer ersten Auftrennung, typischerweise beginnend mit ungefähr 1 × 10^8-9, bevorzugt bei ungefähr 5 × 10^8-9, Zellen, ICD34 mit einem ersten Fluorochrom markiert werden, während die Antikörper für die verschiedenen dedizierten Linien an ein Fluorochrom mit von dem ersten Fluorochrom verschiedenen und unterscheidbaren spektralen Eigenschaften konjugiert sein können. Während jede der Linien in mehr als einem „Auftrennungs"-Schritt abgetrennt werden kann, werden die Linien wünschenswerterweise zur selben Zeit abgetrennt, wenn einer positiv selektierend für HSCs ist. Die Zellen können von toten Zellen selektiert und isoliert werden durch die Nutzung von mit toten Zellen verbundenen Farbstoffen (einschl. jedoch nicht beschränkt auf Propidiumiodid (PI)). Bevorzugt werden die Zellen in einem Medium gesammelt, das 2 % FCS enthält. Die bestimmte Reihenfolge der Auftrennung ist für diese Erfindung nicht kritisch.
Die wie oben beschrieben gewonnenen Zellen können unmittelbar verwendet werden oder können bei Temperaturen von flüssigem Stickstoff eingefroren und für lange Zeiträume gelagert werden, aufgetaut werden und sind in der Lage, wieder verwendet zu werden. Die Zellen werden gewöhnlich in 10 % DMSO, 50 % fötales Kälberserum (FCS), 40 % RPMI-1640-Medium gelagert werden. Wenn sie einmal aufgetaut sind, können die Zellen durch die Verwendung von Wachstumsfaktoren und/oder Stromazellen, verbunden mit Stammzellproliferation und -Differenzierung, vermehrt werden.
In einer bevorzugten Ausführung werden die HSCs vor dem Kultivieren für Zellen angereichert, die die Zelloberflächenmarker CD34 und Thy-1 exprimieren. Bevorzugt exprimieren diese Zellen auch nichtlinienspezifische Marker in Verbindung mit spezifischen Progenitorzellen. Diese Zellen werden Lin^– genannt. Für CD34 und Thy-1 spezifische Antikörper sind erhältlich und Hybridome können von der American Tissue Type Collection (ATTC) erhalten werden.
Das Expansionsverfahren erfordert das Inokulieren der Zollpopulation, im Wesentlichen angereichert an hämatopoietischen Stammzellen und im Wesentlichen frei von Stromazellen, in einen Expansionsbehälter und in einem Volumen eines geeigneten Mediums. Bevorzugt beträgt die Zelldichte von wenigstens ungefähr 1 × 10² Zellen, bevorzugt 2 × 10³, bevorzugter 2 × 10⁴ bis ungefähr 1 × 10⁶ Zellen/ml Medium und sogar noch bevorzugter von ungefähr 1 × 10⁵ bis ungefähr 5 × 10⁵ Zellen/ml Medium bei einer anfänglichen Sauerstoffkonzentration von ungefähr 2 bis 20 % und vorzugsweise weniger als 8 %. In einer Ausführung liegt die anfängliche Sauerstoffkonzentration in einem Bereich von ungefähr 4 % bis ungefähr 6 %. In einem Aspekt wird die inokulierende Population an Zellen von Knochenmark erhalten und beträgt von ungefähr 7.000 Zellen/ml bis ungefähr 20.000 Zellen/ml und bevorzugt ungefähr 20.000 Zellen/ml. In einem gesonderten Aspekt wird die Inokulationspopulation an Zellen von mobilisiertem peripherem Blut erhalten und liegt von ungefähr 20.000 Zellen/ml bis ungefähr 50.000 Zellen/ml, vorzugsweise 50.000 Zellen/ml.
Jeder geeignete Expansionsbehälter, Kolben oder geeignete Röhrchen wie eine 24-Well-Platte, 12,5cm²-T-Kolben oder gaspermeable Beutel kann bei dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Solche Kulturbehälter sind im Handel erhältlich von Falcon, Corning oder Costar. Wie hierin verwendet, ist von „Expansionsbehälter" auch beabsichtigt, dass er jede Kammer oder jeden Behälter zum Vermehren von Zellen einschließt, ob er frei steht oder nicht oder in einem Expansionsgerät, wie die hierin beschriebenen Bioreaktoren, eingebaut ist oder nicht. In einer Ausführung ist der Expansionsbehälter ein Raum mit reduziertem Volumen der Kammer, welcher durch eine abgesenkte Oberfläche und eine Ebene, in welcher eine verbleibende Zellabstützungsoberfläche orientiert ist, gebildet wird.
Verschiedene Medien können für die Vermehrung der Stammzellen verwendet werden. Beispielhafte Medien schließen Dulbecco's MEM, IMDM, X-Vivo 15 (Serum-abgereichert) und RPMI-1640 ein, welche mit einer Reihe von verschiedenen Nährstoffen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen etc. ergänzt sein können. Die Medien können serumfrei sein oder können mit geeigneten Mengen an Serum wie fötales Kälberserum oder autologes Serum ergänzt sein. Vorzugsweise ist das Medium serumfrei oder mit autologem Serum ergänzt, falls die vermehrten Zellen oder zellulären Produkte bei der menschlichen Therapie verwendet werden sollen. In der bevorzugten Ausführung ist das Medium X-Vivo 15 (Serumabgereichert).
Wie oben festgestellt, werden in einem Aspekt die Medienformulierungen für die Expansion von HSCs mit einem mpl- und FL-Liganden (vorzugsweise TPO und FL) in einer Konzentration von ungefähr 0,1 ng/ml bis ungefähr 100 ng/ml, gewöhnlicher 10 ng/ml bis 100 ng/ml ergänzt. Zusätzlich können IL6, LIF und wahlweise IL3 eingeschlossen sein. Wie in den Beispielen beschrieben, sind Mimetika dieser Moleküle ebenfalls geeignet. In einem anderen Aspekt wird ein c-kit-Ligand (KL) (auch Steel Factor (St1), Mastzellenwachstumsfaktor (MGF) genannt) ebenfalls in ähnlichen Konzentrationen hinzugefügt. Wie unten beschrieben, werden die Medienformulierungen für die Verwendung der vorliegenden Erfindung zum Modifizieren von HSCs mit einem mpl-Liganden (besonders TPO), einem flt3-Liganden, Fibronectin und/oder RetroNectin^TM und wahlweise einem c-kit-Liganden, IL-3, IL-6, LIF ergänzt. Andere Cytokine, die allein oder in Kombination zugefügt werden können, sind G-CSF, GM-CSF, IL-1α, IL-11 und MIP-1α. In gewissen Aspekten werden die Kulturbedingungen spezifisch ein oder mehrere Cytokin(e), zum Beispiel IL3, ausschließen.
In einer Ausführung sind die Cytokine in den Medien enthalten und werden durch Medienperfusion wieder aufgefüllt. Alternativ dazu können, wenn ein Bioreaktorsystem verwendet wird, die Cytokine gesondert ohne Medienperfusion hinzugefügt werden als eine konzentrierte Lösung durch gesonderte Einlässe. Wenn Cytokine ohne Perfusion hinzugefügt werden, werden sie typischerweise als eine 10X- bis 100X-Lösung hinzugefügt werden in einer Menge, die gleich ist einem Zehntel bis 1/100 des Volumens in den Bioreaktoren mit frischen Cytokinen, die annähernd alle 2 bis 4 Tage hinzugefügt werden. Weiterhin können frisch konzentrierte Cytokine ebenfalls gesondert zusätzlich zu Cytokinen in den perfundierten Medien hinzugefügt werden.
Transduktion hämatopoietischer Stammzellkulturen
Von den Verfahren dieser Erfindung ist beabsichtigt, dass sie jedes Verfahren des Gentransfers in hämatopoietische Stammzellen umfassen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf virusvermittelten Gentransfer, liposomenvermittelten Gentransfer, Transformation, Transfektion und Transduktion, z. B. virusvermittelter Gentransfer wie die Verwendung von auf DNS-Viren wie Adenovirus, adeno-assoziiertes Virus und Herpesvirusbasierten Vektoren, ebenso wie retroviralbasierten Vektoren. Die Verfahren sind besonders geeignet für die Integration einer Nukleinsäure, die in einem Vektor oder Konstrukt enthalten ist, welchem ein Kernlokalisierungselement oder -sequenz fehlt, so dass die Nukleinsäure in dem Zytoplasma bleibt. In diesen Fällen ist die Nukleinsäure oder das therapeutische Gen in der Lage, in den Kern während der M- (Mitose-) Phase einzudringen, wenn die Kernmembran zusammenbricht und die Nukleinsäure oder das therapeutische Gen zu dem Wirtszellchromosom Zugang erlangt. In einer Ausführung sind Nukleinsäurevektoren oder Konstrukte mit einem Kernlokalisierungselement oder -sequenz spezifisch ausgeschlossen.
Die hierin beschriebenen HSC-Kulturen sind besonders geeignet für den retroviral vermittelten Gentransfer. Bei der retroviralen Transduktion werden die transferierten Sequenzen stabil in die chromosomale DNS der Zielzelle integriert. Bedingungen, die die stabile provirale Integration begünstigen, schließen aktiv zyklisierende Zellen, wie jene, für die hierin gesorgt wird, ein.
Die Terminologie für die verschiedenen Zustände des Zellzyklus ist wie gewöhnlich verwendet und in der Technik verstanden. G0 bezieht sich auf den ruhenden oder nicht wachsenden Zustand in dem Zellzyklus; G0-Zellen werden als nicht-zyklisierend angesehen. Zellen können induziert werden, um die GO-Phase zu verlassen und in den aktiven Zyklus einzutreten, d. h. die G1-, S-, G2- und M-Phasen. In Kultur wurde dies durch die vorliegende Erfindung, zum Beispiel durch das Einführen von Wachstumsfaktoren in das Kulturmedium, erzielt.
Die HSC-Zellen werden mit einem therapeutischen Gen transduziert. Bevorzugt geschieht die Transduktion über einen Vektor wie einen retroviralen Vektor. Die transduzierten Zellen, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gewonnen werden, können anschließend einem Empfänger verabreicht werden. Folglich bezieht sich die Erfindung auf die Behandlung von Erkrankungen, die dem Gentransfer in HSC zugänglich sind. Zum Beispiel können Erkrankungen, einschließliech, jedoch nicht beschränkt auf β-Thalassämie, Sichelzellenanämie, Adenosin-Desaminasemangel, Rekombinasemangel, Rekombinase-Regulationsgenmangel etc., durch das Einführen eines therapeutischen Gens korrigiert werden. Andere Indikationen der Gentherapie sind das Einführen von Arzneimittelresistenzgenen, um normalen Stammzellen zu ermöglichen, dass sie einen Vorteil haben und Gegenstand von Selektionsdruck während der Chemotherapie sind. Geeignete Arzneimittelresistenzgene schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf das Gen, welches das Mehrfacharzneimittelresistenz- (MDR-) Protein kodiert.
Andere Erkrankungen als jene im Zusammenhang mit hämatopoietischen Zellen können auch durch genetische Modifikation behandelt werden, wo die Erkrankung im Zusammenhang mit dem Fehlen eines bestimmten sezernierten Produktes steht, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Hormone, Enzyme, Interferone, Wachstumsfaktoren oder Ähnliches. Durch Nutzen einer geeigneten Regulationsstartregion kann die induzierbare Produktion des Mangelproteins erzielt werden, so dass die Produktion des Proteins der natürlichen Produktion gleichen wird, und das sogar, obwohl die Produktion in einem zu dem Zelltyp unterschiedlichen Zelltyp geschehen wird, der normalerweise solch ein Protein produziert. Es ist auch möglich, ein Ribozym, Gegensinn oder eine andere Botschaft zu inserieren, um bestimmte Genprodukte oder die Empfänglichkeit für Erkrankungen, besonders hämatolymphotrope Erkrankungen, zu inhibieren.
Bei den Verfahren dieser Erfindung nützliche retrovirale Vektoren werden rekombinant durch Verfahren hergestellt, die bereits in der Technik gelehrt werden. Zum Beispiel beschreiben WO 94/29438, WO 97/21824 und WO 97/21825 die Konstruktion von retroviralen Verpackungsplasmiden und Verpackungszelllinien. Wie es dem kundigen Fachmann ersichtlich ist, sind die bei den Verfahren dieser Erfindung nützlichen retroviralen Vektoren in der Lage, HSCs zu infizieren. Die Techniken, die verwendet werden, um Vektoren zu konstruieren und um Zellen zu transfizieren und zu infizieren, werden in der Technik weit praktiziert. Beispiele von retroviralen Vektoren sind jene, die von Maus-, Vogel- oder Primatenretroviren abgeleitet werden. Retrovirale Vektoren, die auf dem Moloney- (Mo-) Mausleukämievirus (MuLV) basiert sind, sind die am häufigsten verwendeten wegen der Erhältlichkeit von retroviralen Varianten, die wirksam menschliche Zellen infizieren. Andere geeignete Vektoren schließen jene ein, die auf dem Gibbon-Ape-Leukemia-Virus (Gibbonaffenleukämievirus) (GALV) oder HIV basiert sind.
Bei der Erzeugung retroviraler Vektorkonstrukte, erhalten von dem Moloney-Mausleukämievirus (MoMLV), werden in den meisten Fällen die viralen gag-, pol- und env-Sequenzen von dem Virus entfernt, wodurch Raum für die Insertion fremder DNS-Sequenzen geschaffen wird. Durch die Fremd-DNS kodierte Gene werden gewöhnlich unter der Kontrolle des starken viralen Promoters in den LTR exprimiert. Solch ein Konstrukt kann in Viruspartikel effizient gepackt werden, falls die gag-, pol- und env-Funktionen in trans durch eine Verpackungszelllinie bereitgestellt werden. Folglich kommen die durch die Zelle produzierten gag-, pol- und env-Proteine, wenn das Vektorkonstrukt in die Verpackungszelle eingeführt wird, mit der Vektor-RNS zusammen, um infektiöse Virionen zu produzieren, die in das Kulturmedium sezerniert werden. Das demzufolge produzierte Virus kann die Zielzelle infizieren und in die DNS der Zielzelle integrieren, produziert jedoch keine infektiösen viralen Partikel, da ihm essentielle Verpackungssequenzen fehlen. Die meisten der gegenwärtig in Verwendung befindlichen Verpackungszelllinien wurden mit gesonderten Plasmiden transfiziert, wobei jedes eine der notwendigen. Kodierungssequenzen enthält, so dass mehrfache Rekombinationsereignisse notwendig sind, ehe ein replikationskompetentes Virus erzeugt werden kann. Alternativ trägt die Verpackungszelllinie ein integriertes Provirus. Das Provirus wurde verkrüppelt, so dass seine eigene RNS nicht in das Virus verpackt werden kann, obwohl es sämtliche der Proteine produziert, die erforderlich sind, um infektiöse Viren zusammenzubauen. Stattdessen wird die von dem rekombinanten Virus produzierte RNS verpackt. Der aus den Verpackungszellen freigesetzte Virusstamm enthält nur rekombinantes Virus.
Der Wirtszellbereich, der durch ein Retrovirus oder einen retroviralen Vektor infiziert werden kann, wird durch das virale Hüllprotein bestimmt. Das rekombinante Virus kann verwendet werden, um praktisch jeden anderen von dem durch die Verpackungszelle bereitgestellten env-Protein erkannten Zelltyp zu infizieren, was in der Integration des viralen Genoms in der transduzierten Zelle und der stabilen Produktion des fremden Genproduktes resultiert. Allgemein erlaubt das ecotrope Maus-env von MoMLV die Infektion von Nagerzellen, wohingegen das amphotrope env die Infektion von Nager-, Vögel- und gewissen Primatenzellen, einschließlich menschlichen Zellen, erlaubt. Amphotrope Verpackungszelllinien für die Verwendung bei MoMLV-Systemen sind in der Technik bekannt und im Handel erhältlich und schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf PA12 und PA317. Miller et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 431-437; Miller et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 2895-2902; und Danos et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460-6464. Xenotrope Vektorsysteme existieren, die ebenfalls die Infektion von menschlichen Zellen erlauben.
Der Wirtsbereich retroviraler Vektoren wurde durch Substituieren des env-Proteins des Basisvirus mit jenem eines zweiten Virus geändert. Das resultierende „pseudotypisierte" Virus hat den Wirtsbereich des Virus, das das Hüllprotein gibt und durch die Verpackungszelllinie exprimiert wird. Kürzlich wurde das MoMLV-Env-Protein durch das G-Glykoprotein aus vesikulärem Stomatitisvirus (VSV-G) ersetzt. Burns et al. (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037 und PCT-Patentanmeldung WO 92/14829. Da die Infektion nicht von einem spezifischen Rezeptor abhängig ist, haben pseudotypisierte VSV-G-Vektoren einen breiten Wirtsbereich.
Gewöhnlich werden die Vektoren wenigstens zwei heterologe Gene oder Gensequenzen enthalten: (i) das zu transferierende therapeutische Gen; und (ii) ein Markergen, welches das Aufspüren infizierter Zellen ermöglicht. Wie hierin verwendet, kann „therapeutisches Gen" ein gesamtes Gen oder nur das funktionell aktive Fragment des Gens sein, das in der Lage ist, den Mangel in dem Patienten, welcher aus dem defekten endogenen Gen herrührt, zu kompensieren. Therapeutisches Gen schließt auch Gegensinn-Oligonukleotide oder Gene ein, die für die Gegensinnunterdrückung nützlich sind, und Ribozyme für ribozymvermittelte Therapie. Therapeutische Gene, die dominante inhibitorische Oligonukleotide und Peptide kodieren, ebenso wie Gene, welche regulatorische Proteine kodieren, und Oligonukleotide sind ebenfalls von dieser Erfindung umfasst. Allgemein wird Gentherapie den Transfer eines einzelnen therapeutischen Gens einschließen, obwohl mehr als ein Gen notwendig sein mag für die Behandlung von bestimmten Erkrankungen. In einer Ausführung ist das Gen eine normale, d. h. Wildtyp-, Kopie des defekten Gens oder ein funktionales Homolog. In einer gesonderten Ausführung ist das therapeutische Gen eine dominante inhibierende Mutante des Wildtyps. Es kann mehr als ein Gen pro Vektor verabreicht werden oder, alternativ, mehr als ein Gen kann unter Verwendung von etlichen kompatiblen Vektoren zugeführt werden. In Abhängigkeit von dem genetischen Defekt kann das therapeutische Gen die regulatorischen und untranslatierten Sequenzen einschließen. Für die Gentherapie in menschlichen Patienten wird das therapeutische Gen allgemein von menschlichem Ursprung sein, ebenso Gene aus eng verwandten Arten, die eine hohe Homologie und biologisch identische oder äquivalente Funktion im Menschen zeigen, falls das Genprodukt nicht eine gegenteilige Immunreaktion in dem Empfänger induziert. Zum Beispiel würde ein Primateninsulingen, dessen Genprodukt in der Lage ist, Glukose zu Glykogen im Menschen umzuwandeln, als ein funktionales Äquivalent des menschlichen Gens erachtet werden. Das für die Verwendung bei der Behandlung geeignete therapeutische Gen wird mit der Erkrankung variieren. Zum Beispiel ist ein geeignetes therapeutisches Gen zur Behandlung von Sichelzellanämie eine normale Kopie des γ-Globingens. Ein geeignetes therapeutisches Gen für die Behandlung von SCID ist das normale ADA-Gen.
Nukleotidsequenzen für das therapeutische Gen werden allgemein in der Technik bekannt sein oder können von zahlreichen Sequenzdatenbanken wie GenBank erhalten werden. Das therapeutische Gen selber wird allgemein erhältlich sein oder kann isoliert werden und kloniert werden unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion PCR (Perkin-Elmer) und anderen Standardrekombinationstechniken. Der gelehrte Fachmann wird leicht erkennen, dass jedes therapeutische Gen als ein kompatibles Restriktionsfragment ausgeschnitten und in einem Vektor in solch einer Weise platziert werden kann, um die saubere Expression des therapeutischen Gens in hämatopoietischen Zellen zu ermöglichen.
Ein Markergen kann in den Vektor für den Zweck des Überwachens der erfolgreichen Transduktion und für die Selektion von Zellen, in welche die DNS integriert worden ist, im Gegensatz zu Zellen, welche das DNS-Konstrukt nicht integriert haben, eingeschlossen werden. Zahlreiche Markergene schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Antibiotikaresistenzmarker wie Resistenz gegen G418 oder Hygromycin. Weniger üblich kann negative Selektion verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Fälle, bei denen der Marker das HSV-tk-Gen ist, welches die Zellen für Mittel wie Acyclovir und Gancyclovir empfindlich macht. Alternativ dazu könnten Selektionen durch das Nutzen eines stabilen Zelloberflächenmarkers bewerkstelligt werden, um für transgenexprimierende Stammzellen durch FACS-Sortieren zu selektieren. Das NeoR- (Neomycin/G418-Resistenz) Gen wird gewöhnlich verwendet, es kann jedoch jedes übliche Markergen, dessen Sequenzen nicht bereits in der Empfängerzelle vorhanden sind, verwendet werden.
Der virale Vektor kann modifiziert sein, um chimäre Hüllproteine oder nicht-virale Membranproteine in retrovirale Partikel einzubauen, um die Partikelstabilität zu verbessern und den Wirtsbereich auszudehnen oder um ein zelltypspezifisches Targeting während der Infektion zu erlauben. Die Produktion retroviraler Vektoren, die einen geänderten Wirtsbereich haben, wird zum Beispiel in WO 92/14829 und WO 93/14188 gelehrt. Retrovirale Vektoren, die spezifische Zelltypen in vivo zum Ziel nehmen können, werden ebenfalls gelehrt, zum Beispiel in Kasahara et al. (1994) Science 266: 1373-1376. Kasahara et al. beschreiben die Konstruktion eines Moloney-Leukämievirus (MoMLV) mit einem chimären Hüllprotein, bestehend aus menschlichem Erythropoietin (EPO), verschmolzen mit dem viralen Hüllprotein. Dieses Hybridvirus zeigt einen Gewebetropismus für menschliche rote Blutprogenitorzellen, welche den Rezeptor für EPO tragen, und ist deshalb nützlich bei der Gentherapie von Sichelzellanämie und Thalassämie. Retrovirale Vektoren, die in der Lage sind, die Infektion von HSCs spezifisch zum Ziel zu nehmen, werden für die In-vivo-Gentherapie bevorzugt.
Die viralen Konstrukte können auf einer Reihe von gewöhnlichen Wegen zubereitet werden. Zahlreiche Vektoren sind nun erhältlich, welche die gewünschten Eigenschaften bereitstellen, wie lange terminate Wiederholungen (engt.: long terminal repeats), Markergene und Restriktionsstellen, welche weiter durch im Stand der Technik bekannte Techniken modifiziert sein können. Die Konstrukte können eine Signalpeptidsequenz kodieren, um sicherzustellen, dass Gene, die Zelloberflächen- oder sezenierte Proteine kodieren, posttranslational sauber verarbeitet werden und auf der Zelloberfläche exprimiert werden, falls zutreffend. Vorzugsweise befinden sich das/die Fremdgen/e unter der Kontrolle eines zellspezifischen Promotors.
Die Expression des transferierten Gens kann auf einer Reihe von Wegen in Abhängigkeit von dem Zweck des Gentransfers und der gewünschten Wirkung kontrolliert werden. Folglich kann das eingeführte Gen unter die Kontrolle eines Promotors gestellt werden, welcher das Gen dazu bringen wird, konstitutiv, nur unter spezifischen physiologischen Bedingungen oder in bestimmten Zelltypen exprimiert zu werden.
Die retrovirale LTR (lange terminale Wiederholung) ist in den meisten hämatopoietischen Zellen in vivo aktiv und auf sie wird man sich allgemein verlassen für die Transkription der inserierten Sequenzen und ihre konstitutive Expression (Ohashi et al. (1992) Proc. Acad. Sci. 89: 11332; Correll et al. (1992) Blood 80: 331). Andere geeignete Promotoren schließen den Immediate-early-Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (CMV) und den U3-Regionpromotor des Moloney-Maussarkomvirus (MMSV), Rous-Sarkomvirus (RSV) oder Spleen-Focus-Forming-Virus (SFFV) ein.
Beispiele von Promotoren, die verwendet werden können, um Expression der eingeführten Sequenz in spezifischen Zelltypen zu bewirken, schließen Granzym A für die Expression in T-Zellen und NK-Zellen, den CD34-Promotor für die Expression in Stamm- und Progenitorzellen, den CD8-Promotor für die Expression in zytotoxischen T-Zellen und den CD11b-Promotor für die Expression in Myeloidzellen ein.
Induzierbare Promotoren können für die Genexpression unter gewissen physiologischen Bedingungen verwendet werden. Zum Beispiel kann ein elektrophiles Antwortelement verwendet werden, um die Expression eines Chemoresistenzgens in Antwort auf elektrophile Moleküle zu induzieren. Der therapeutische Nutzen kann weiter gesteigert werden durch Richtung des Genproduktes auf die geeignete zelluläre Örtlichkeit, zum Beispiel den Kern, durch Anheften der geeigneten Lokalisierungssequenzen.
Das Vektorkonstrukt wird in eine Verpackungszelllinie eingeführt, welche infektiöse Virionen erzeugen wird. Verpackungszelllinien, die in der Lage sind, hohe Titer an replikationsdefizienten, rekombinanten Viren zu schaffen, sind in der Technik bekannt, siehe zum Beispiel WO 94/29438. Virale Partikel werden aus dem Zellüberstand geerntet und für die In-vivo-Infektion unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren gereinigt, wie durch Filtration von Überständen 48 Stunden nach der Transfektion. Der Virustiter wird durch Infektion einer konstanten Anzahl geeigneter Zellen (in Abhängigkeit von dem Retrovirus) mit Titrationen viraler Überstände bestimmt. Die Transduktionseffizienz kann 48 Stunden später durch sowohl FACS als auch Southern Blotting untersucht werden.
Nach viraler Transduktion kann die Anwesenheit des viralen Vektors in den transduzierten Stammzellen oder ihren Nachfahren durch Verfahren wie PCR verifiziert werden. PCR kann durchgeführt werden, um das Markergen oder andere viral transduzierte Sequenzen zu detektieren. Allgemein werden periodisch Blutproben entnommen, und PCR wird üblicherweise durchgeführt unter Verwendung von zum Beispiel Neo-Sonden, falls das Neo-Resistenzgen als Marker verwendet wird. Die Anwesenheit viral transduzierter Sequenzen in Knochenmarkzellen oder reifen hämatopoietischen Zellen ist ein Anzeichen für die erfolgreiche Rekonstitution durch die transduzierten HSCs. PCR-Techniken und -Reagenzien sind in der Technik wohlbekannt, siehe allgemein PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications. Innis, Gelfand, Sninsky & White, Hrsg. (Academic Press, Inc., San Diego, 1990) und im Handel erhältlich (Perkin-Elmer).
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Verfahren überwinden wenigstens 3 Mängel üblicher Protokolle für den Gentransfer in HSCs: Die hierin beschriebenen Kulturbedingungen erzeugen aktiv zyklisierende HSCs, was für die retrovirale Infektion und die Nukleinsäureintegration kritisch ist, ohne die gleichzeitige Differenzierung, welche mit gewöhnlicher Cytokinbehandlung gesehen wird, oder die menschliche Toxizität, die mit anderen Arzneimitteln beobachtet wird, ebenso wie Steigerungen der Anzahl an HSCs, die für den Gentransfer oder die Transplantation zugänglich sind.
Die Zellpopulationen, Kulturbedingungen, Cytokine, Adhäsionsmoleküle und Derivate, wie sie hierin beschrieben sind, können für die Zubereitung von Medikamenten zur Verwendung bei den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden.
Von den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, dass sie die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise beschränken.
BEISPIELE
ANTIKÖRPER
Um für CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen anzureichern, wurde Tuk3 (anti-CD34, erhalten von Dr. A. Ziegler, Universität Berlin, Berlin, Deutschland) direkt an Sulforhodamin (SR) konjugiert und GM201 (anti-menschliches Thy-1 von Dr. W. Rettig, Ludwig Cancer Research Institute, New York, NY) wurde direkt an Phycoerythrin (PE) (SyStemix, Palo Alto, CA) konjugiert.
FLOPC-21-Maus-IgG₃ (Sigma, St. Louis, MO), konjugiert an SR (SyStemix), wurde als eine Isotopenkontrolle für anti-CD34 (Tuk3) verwendet. Gereinigtes Maus-IgG₁ (Becton Dickinson, Mountain View, CA), konjugiert an PE (SyStemix), wurde als eine Kontrolle für die Anti-Thy-1-Färbung verwendet. Die Linienplatte der mit Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) konjugierten Antikörper Leu-Sb (anti-CD2), Leu-M3 (anti-CD14), Leu-M1 (anti-CD15), Leu-IIa (anti-CD16) und SJ25C1 (anti-CD19), FITC-konjugiertes Maus-IgG₁ und IgG_2a, PE- und FITC-konjugiertes BPCA-2 (anti-CD34), ebenso wie PE-konjugiertes Leu-12 (anti-CD19) und Leu-M9 (anti-CD33) wurden von Becton Dickinson erworben. FITC-konjugierter Antikörper D2.10 (Anti-Glycophorin A) wurde von AMAC (Westbrook, ME) erworben. Hybridome, welche monoklonale Antikörper gegen monomorphe oder polymorphe Determinanten von HLA-Molekülen erzeugen, wurden von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, erworben.
Beispiel 1: Anreicherung für CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen
Aufreinigung von CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen aus Knochenmark. Menschliche adulte Knochenmark- (ABM-) Zellen von normalen Donoren wurden für CD34⁺-Zellen unter Verwendung einer Magnetperlenselektionsvorrichtung (SyStemix) vor-angereichert. CD34⁺-Zellen wurden ebenfalls aus BM aus zwei Multiorgandonoren selektiert und vor der Verwendung eingefroren. CD34⁺-Zellen wurden für 10 Minuten (Min.) auf Eis mit 2 mg/ml hitzeinaktiviertem menschlichem Gammaglobulin (Gamunune, Miles Inc., Elkhart, IN) inkubiert, um unspezifische Fc-Bindung zu hemmen. Danach wurden die Zellen mit „Färbungspuffer" (SB) gewaschen. SB enthielt Hanks Salzlösung (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 0,5 % Rinderserumalbumin (Sigma), 10 mM HEPES (Sigma). Zellen wurden für 30 Minuten auf Eis mit anti-CD4-SR (6 μg/ml), anti-Thy-1-PE (10 μm/ml) und der Linienplatte an FITC-konjugierten Antikörpern gefärbt. Es wurden geeignete Isotypkontrollen verwendet, wie oben beschrieben. Die Zellen wurden dann mit SB gewaschen und in einer Konzentration von 10⁶/ml in SB, enthaltend 1 μg/ml Propidiumiodid (PI) (Molecular Probes Inc., Eugene, OR), resuspendiert. Ein fluoreszenzaktiviertes Zellsortiergerät (FACS) vom Vantage-Typ (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) wurde verwendet, um lebende (PI^lo)-CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen auszusortieren. Die Sortierungen wurden erneut analysiert, um eine saubere Abtrennung von Zellsubpopulationen sicherzustellen.
Beispiel 2: TPO/FL/KL-Wirkung auf die Zellproliferation
a. PKH26-Fluoreszenzfarbstoffmarkierung. Zellen wurden mit proteinfreier PBS gewaschen. Der PKH26-Farbstoff (Sigma) wurde 1:250 in dem Kit-Verdünnungsmittel verdünnt. Das Zellpellet wurde in einer Konzentration von 10⁷/ml resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde dann zu einem gleichen Volumen an PKH26 hinzugefügt und für genau 4 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Ein gleiches Volumen FBS (fötales Rinderserum) (Gemini BioProducts, Calabasas, Kalifornien) wurde hinzugefügt und für eine zusätzliche Minute bei RT inkubiert. Ein gleiches Volumen an IMDM, enthaltend 10 % FBS, wurde hinzugefügt. Die Zellen wurden gezählt und zentrifugiert. Das Pellet wurde bei einer Konzentration von 10⁵/ml in IMDM/10 % FBS mit und ohne Cytokine für eine Kurzzeitsuspensionskultur resuspendiert. Die Zellen wurden 96-Well-Platten mit rundem Boden mit 100 μl/Vertiefung ausplattiert.
b. Kurzzeitsuspensionskultur. PKH26-markierte CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-BM-Zellen wurden für 6 Tage mit 10⁴ Zellen/100 μl Medium (IMDM, 10 % FBS) in 96-Well-Platten mit rundem Boden in Suspensionskulturen, enthaltend verschiedene Cytokinkombinationen, kultiviert. Die verwendeten Cytokine schlossen IL-3 (10 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml), LIF (50 ng/ml) (Novartis, Basel, Schweiz), TPO (10 bis 15 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN), KL (50 bis 75 ng/ml) und FL (50 bis 75 ng/ml) (SyStemix) ein. Diese Konzentrationen wurden in den hierin beschriebenen BM-Studien verwendet. Zellzahlen wurden bestimmt unter Verwendung eines Hämozytometers und Trypan-Blau, um tote Zellen auszuschließen.
c. Steigerung der Gesamtzellzahl und der CD34⁺-Zellzahl. Die Wirkungen von einzelnen, doppelten und dreifachen Cytokinkombinationen wurden in 6-Tage-Suspensionskulturen von PKH26-markierten CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-BM-Zellen untersucht. Vorangegangene Studien unter Verwendung von PKH26 zeigten eine schädigende Wirkung der PKH26-Markierung auf die Zellfunktion nicht. Tabelle 1 Vergleich der Zunahme an Gesamtzellen und menschlichen CD34⁺-BM-Zellen in 6-Tage-Kulturen
Fußnote zu Tabelle 1

* Geteilte und ungeteilte CD34-Subpopulationen aus diesen Kulturen wurden in dem CAFC-Test analysiert. Die Werte für TPO, KL, FL repräsentieren die Mittelwerte ± SEM von 6 Experimenten. Alle anderen Bedingungen (mit der Ausnahme von TPO (1) und KL (2)) sind Mittelwerte ± SEM von 3 Experimenten.

Wie in Tabelle 1 gezeigt, steigerten einzelne Cytokine nicht die Anzahl von CD4⁺- oder Gesamtzellen. Kombinationen aus zwei Cytokinen aus TPO, KL und FL hielten die CD34⁺-Zellzahl mit einer leichten Zunahme (1,7-fach) bei der Gesamtzellzahl aufrecht. Unter den Getesteten, induzierte die Kombination von 3 Cytokinen, TPO, KL und FL, die höchsten Zunahmen von sowohl Gesamtzellen (4,7-fach) als auch der CD34⁺-Zellzahl (3,4-fach). Die Drei-Faktor-Kombination IL-3, IL-6 und LIF stimulierte eine Zunahme in der Gesamtzellzahl nicht.
Beispiel 3: FACS-Sortieren von CD34/PKH-Untergruppen aus kultivierten Zellen
Um zu bestimmen, ob PHP-Zahlen aufrecht erhalten wurden oder gesteigert wurden innerhalb der Population aus CD34^hi-Zellen, welche eine Teilung durchmacht hatten, wurden ungeteilte (PKH^hi-) und geteilte (PKH^lo-) Subpopulationen aus CD34^hi-BM-Zellen auf 6-Tage-Kulturen, enthaltend etliche Cytokinkombinationen, mit den oben angezeigten Konzentrationen gereinigt. Die Wirkung von FL alleine und in Kombination mit einem oder zwei anderen Cytokinen wurde in 3 bis 6 Experimenten untersucht (1). Wenn sie in FL alleine kultiviert worden sind, blieben die meisten CD34⁺Th-1⁺Lin^–-(BM)-Zellen ungeteilte PKH26^hi (78 %). 68 % (Mittelwert 73 %) der Zellen nach der Teilung verloren die CD34-Expression. Der Zusatz von KL zu FL reduzierte den Prozentsatz ungeteilter Zellen um die Hälfte (40 %), und 55 % (Mittelwert 58 %) der Zellen nach der Teilung verloren die CD34-Expression. Der Zusatz von TPO zu KL und FL stimulierte viel stärker die Teilung (4 % blieben ungeteilt) mit einem Verlust von CD34 auf nur 29 % (Mittelwert 27 %) der Zellen nach der Teilung. Mit anderen Kombinationen, enthaltend TPO, zum Beispiel TPO und FL oder TPO, IL-3 und FL, wurde beobachtet, dass der Verlust der CD34-Expression nur bei ungefähr 30 % der Zellen nach der Teilung geschah. Es wurde kürzlich gezeigt, dass IL-3 die Teilung induziert und auch die Differenzierung (CD34-Verlust) von menschlichen HSC. (Young et al. (1996), Blood 88: 1619). Der Zusatz von TPO schien nicht nur zu einer stärkeren Zellteilung beizutragen, sondern auch die Wirkung von IL-3 zu überwinden, um die Differenzierung zu fördern.
Beispiel 4: CAFC-Tests
Um festzustellen, ob die Bewahrung der CD34^hi-Expression nach der Teilung mit der Bewahrung funktioneller primitiver hämopoetischer Progenitorzellen, PHP, korrelierte, wurden CD34/PKH26-Untergruppen nach der Kultur in drei verschiedenen Cytokinbedingungen gereinigt und für die CAFC-Aktivität getestet.
a. Cobblestone Area-Forming-Cell- (CAFC) Test. Ein Teil der Zellen wurde bei begrenzender Verdünnung in dem CAFC-Test kultiviert, wie es kürzlich in Murray et al. (1995) Blood 85: 368 beschrieben worden ist. Kurz, Zellen wurden in 96-Well-Platten, die mit einer Maus-Stromazelllinie (Sys-1) vorausgesät worden ist, in 1:1 IMDM/RPMI-Medium (JRH BioSciences, Woodland, CA), enthaltend 1 mM Natriumpyruvat (JRH BioSciences) und 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol (Sigma), 10 % FBS, IL6 und LIF, ausgesät. Die begrenzende Verdünnung erstreckte sich von 100 Zellen pro Vertiefung bis zu 0,78 Zellen pro Vertiefung. Nach 5 Wochen wurden Vertiefungen, die Cobblestone-Bereiche (pflasterartige Bereiche) enthielten, nummeriert und die CAFC-Häufigkeit der Zellpopulation wurde unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Estimation (Abschätzung der maximalen Wahrscheinlichkeit) mit SAS-Software, wie in Frzekas de St. Groth (1982) J. Immunol. Methods 49: R11 beschrieben, berechnet. Die statistische Signifikanz des CAFC-Häufigkeitsunterschiedes zwischen kultivierten Zellpopulationen wurde durch ANOVA bestimmt. Statistische Signifikanz des CAFC-Zahlunterschiedes zwischen kultivierten und Startzellpopulationen wurde bestimmt unter Verwendung des Student t-Tests. Repräsentative Vertiefungen, die Cobblestone-Bereiche enthielten (wenigstens 10 pro Probengruppe), wurden einzeln durch FACS für die Anwesenheit von unreifen CD33⁺-Myeloid, CD19⁺-B-Lymphoid und CD34⁺-Progenitorzellpopulationen analysiert, um das Multilinienpotential der Ausgangszellen abzuschätzen.
b. Analyse der CAFC-Häufigkeiten und des Phänotypen der Cobblestone-Bereiche. Die PHP-Aktivität der sortierten CD34/PKH26-Subpopulationen kultivierter Zellen wurde in vitro durch die Verwendung des CAFC-Tests abgeschätzt, wobei die CAFC-Häufigkeiten mit der Ausgangspopulation aus CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen verglichen wurden. Die mittleren Häufigkeiten von CAFC in der Ausgangspopulation an CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen erstreckte sich von 1/21 bis zu 1/46 (95 % Vertrauensgrenzen 1/16 bis 1/52) (Tabelle 2). Wegen der begrenzten Anzahl an Zellen, die aus frischem BM gewonnen wurden, konnte nur eine Cytokinkombination pro Experiment getestet werden, was eine gewisse Gewebevariation bewirkte. In dem Falle von IL-3, IL-6 und LIF blieb die ungeteilte CD34^hiPKH^hi- Subpopulation primitiv, wobei dieselbe mittlere CAFC-Häufigkeit wie die Vorkultur CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Population bewahrt wurde. Die Häufigkeit von CAFC innerhalb der kleinen CD34^hiPKH^lo-Subpopulation hatte jedoch um das 21-Fache auf einen Mittelwert von 1/440 (1/2491/813) abgenommen.
Für die Cytokinkombination aus TPO, KL und FL waren sämtliche Zellen PKH^lo und diese waren in die CD34^hi- und CD34^lo/–-Untergruppen unterteilt, welche in den CAFC-Test gegeben wurden, um die PHP-Häufigkeit und das Multilinienpotential der Zellen nach der Teilung zu bestimmen. Durch Unterteilung von CD34^hi-Zellen, basierend auf der Zellteilung, wurde die CD34^lo/–-Subpopulation im Wesentlichen ausgeschlossen, da bekannt ist, dass CAFC hauptsächlich innerhalb der CD34^hi-Population enthalten sind, wie in Tabelle 2 bestätigt. Tabelle 2 Mittlere CAFC-Häufigkeiten von CD34/PKH26-Zelluntergruppen aus Sechs-Tage-Kulturen
Fußnote zu Tabelle 2

CAFC-Frequenzen nach 5 Wochen wurden unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Estimation mit SAS-Software berechnet. Die 95 %-Vertrauensgrenzen sind in Klammern gezeigt. Mittelwerte von 6 Experimenten für TPO, KL, FL und ein Mittelwert aus zwei Experimenten für die anderen Cytokinkombinationen.
* Nicht bestimmt, da sämtliche Zellen Teilung nach 6 Tagen in Kultur in TPO, KL, FL durchgemacht hatten.

Die Mehrheit der in IL-3, IL-6 und LIF kultivierten Zellen teilte sich gar nicht (Mittelwert 75 %) bis zum Tage 6 und deshalb sortierten wir CD34^hiPKH^hi gegen CD34^hiPKH^lo (Mittelwert 7,5 %) (Tabelle 2). Dieselben Zellpopulationen wurden aus Zellen mit TPO und KL sortiert, in welchen ein Mittelwert von 53 % Zellen ungeteilt blieb, und ein Mittelwert aus 23 % Zellen waren CD34^hiPKH^lo. In TPO, KL und FL hatten sich sämtliche Zellen geteilt und deshalb sortierten wir für die CD34^hiPKH^lo- (Mittelwert 71 %) im Gegensatz zu der CD34^lo/–-PKH^lo-Population (Mittelwert 26 %) differenzierter Zellen nach der Teilung. Tabelle 3 B-Lymphoid-Potential und CD34⁺-Progenitorzellen in Langzeitstromakulturen
Fußnote zur Tabelle 3

Vertiefungen wurden als positiv gewertet, falls > 1 % der Zellen für den Oberflächenmarker positiv waren. Sämtliche der analysierten Cobblestone-Bereiche enthielten CD33+-Myeloidzellen. Werte sind die Mittelwerte ± SEM für 2 Experimente ((IL-3, IL-6, LIF und TPO, IL) oder 6 Experimente (TPO, KL, FL). ND bedeutet nicht bestimmt wegen gar keiner oder einer beschränkten Anzahl von Vertiefungen, die Cobblestone-Bereiche enthielten.

Nach der Kultur mit TPO und KL hatten die ungeteilten CD34^hiPKH^hi-Zellen wiederum eine ähnliche CAFC-Frequenz wie die unkultivierte CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Population. Unter diesen Bedingungen wurde die mittlere Frequenz an CAFC in der geteilten CD34^hiPKH^lo-Subpopulation um das 2,3-Fache im Vergleich mit der Ausgangszellpopulation (Tabelle 2) reduziert. CD34^hiPKH^lo-Zellen bewahrten das Potential bei begrenzender Verdünnung, um CD 19⁺-B-Lymphoid-Zellen, CD33⁺-Myeloidzellen und CD34⁺-Progenitorzellen nach 5 Kulturwochen in dem CAFC-Test entstehen zu lassen. Der Anteil an Vertiefungen, die > 1 % CD34⁺-Zellen enthielt, war jedoch um das 22-Fache im Vergleich mit der Ausgangszellpopulation (Tabelle 3) reduziert. Bei jeder Zellpopulation enthielten sämtliche analysierten Cobblestone-Bereiche CD33⁺-Myeloidzellen.
Die Mittelwerte für 6 Experimente mit der Kombination aus TPO, KL und FL sind in Tabelle 3 gezeigt. Die mittlere CAFC-Frequenz blieb dieselbe in der CD34^hiPKH^lo-Subpopulation im Vergleich der CD34^hiPKH^lo-Ausgangszellpopulation. Diese Zellen bewahrten auch bei begrenzender Verdünnung ihre Fähigkeit, CD19⁺-B-Lymphoid-Progenitorzellen, CD33⁺-Myeloidzellen und CD34⁺-Progenitorzellen hervorzurufen. CD19⁺-Zellen wurden mit einem ähnlichen Anteil (ungefähr 50 %) an Cobblestone-Bereichen beobachtet, untersucht sowohl für die unkultivierten CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen als auch für CD34^hiPKH^lo-Zellen nach der Kultur. 49 % an Cobblestone-Bereichen, erzeugt von CD34^hiPKH^lo-Zellen, enthielten CD34⁺-Zellen im Vergleich mit 67 % für die unkultivierten CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen (Tabelle 3). Wie erwartet, hatten die CCD34^lo/–PKH^lo-Zellen eine sehr niedrige CAFC-Frequenz (Mittelwert von 1/3000). Die Analyse von einem Minimum aus 10 kleinen Cobblestone-Bereichen, die von dieser Population erzeugt wurden, zeigte, dass geteilte CD34^hi-Zellen aus Kulturen, enthaltend IL-3, IL-6 und LIF, nur CD33⁺-Myeloidzellen hervorriefen (Tabelle 3).
Zunahme in den CAFC-Zahlen unter Gesamt- und CD34^hiPKH^lo-Zellen. Wir verglichen die Zunahme von CAFC-Zahlen aus CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen (2). Von den 3 analysierten unterschiedlichen Cytokinkombinationen steigerten nur TPO, KL und FL die mittlere Anzahl an Gesamtzellen, CD34⁺-Zellen und CAFC (Tabelle 1 und 2). Wenn die Anzahl an CAFC innerhalb der CD34^hiPKH^lo-Population mit der Ausgangsanzahl an CAFC, die in Kultur gegeben worden ist, verglichen wird, hatten nur TPO, KL und FL CAFC-Zahlen, die unter den geteilten Zellen zunahmen (Mittelwert 3,2-fach), obwohl sich die Werte von der Aufrechterhaltung zu einer 7,6-fachen Zunahme erstreckten. Die CAFC-Zahlen unter geteilten CD34^hi-Zellen am Tage 6 war nicht signifikant verschieden von der Anzahl, die unter CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen am Tage 0 für TPO- und KL-Kulturen gemessen worden sind (n = 2, p = 0,19), aber eine erhöhte CAFC-Zahl unter CD34^hiPKH^lo-Zellen in TPO-, KL- und FL-Kulturen erreichte statistische Signifikanz (n = 6, p = 0,07). Die Zahl messbarer CAFC unter geteilten CD34^hi-Zellen aus IL-3-, IL-6- und LIF-Kulturen hatte signifikant abgenommen (n = 2, p = 0,03). Sämtliche in D6-IL-3, -IL-6 und -LIF-Kulturen detektierbaren CAFC waren von ungeteilten CD34^hi-Zellen abgeleitet.
Beispiel 5: SCID-hu-Knochentest
CD34^hiPKH26^lo- und CD34^loPKH26^lo-Untergruppen aus TPO-, KL- und FL-Kulturen wurden für die SCID-hu-Knochenrepopulationsaktivität in vivo untersucht.
a. SCID-hu-Knochentest. Der SCID-hu-Knochentest wurde durchgeführt, wie kürzlich beschrieben in Murray et al. (1995) Blood 85: 368 und Chen et al. (1994) Blood 84: 2497. C.B.-17-scid/scid-Mäuse wurden als Empfänger von menschlichen fötalen Knochentransplantaten verwendet. Als erstes wurde eine Analyse der begrenzenden Verdünnung durchgeführt, um die Dosis an CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen zu bestimmen, welche zuverlässig eine Donorrekonstitution in dem SCID-hu-Knochenmodell ergibt. Fötale Knochentransplantate mit unpassendem HLA wurden mit Zelldosen im Bereich von 1.000 bis 30.000 CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen pro Transplantat in Mäuse injiziert, welche eine Ganzkörperbestrahlung (400 md) kurz vor der Zellinjektion erhielten. Um eine ausreichende Anzahl an Transplantaten bei jeder Dosis zu erzielen, wurden vier Gewebedonoren in vier gesonderten Experimenten verwendet. Acht Wochen nach der Injektion wurden die Knochentransplantate wiedergewonnen und die Knochenmarkzellen wurden geerntet und für Donorzelltransplantateinbau unter Verwendung von FITC-Konjugaten an allotypspezifischen HLA-Antikörpern gegen PE-konjugierte anti-CD19, anti-CD33 und anti-CD34 analysiert. Menschliche Zellen insgesamt wurden detektiert mit W6/32-PE (anti-menschliche monomorphe Determinante für das HLA-Klasse-I-MHC-Molekül). Zellen wurden auf einem FACScan-Analysegerät (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) analysiert. Transplantate mit wenigstens 1 % hämatopoietischen Zellen, die Donor-HLA-Antigen tragen, wurden als positiv erachtet. Der Prozentsatz an Transplantaten, der Donorrekonstitution zeigte, wurde für jede getestete Zelldosis untersucht. Bei dem Fünffachen der Begrenzungsdosis oder 10.000 Zellen wurde in sämtlichen Transplantaten Donorrekonstitution beobachtet.
Unkultivierte BM-CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-, ebenso wie CD34^hi-, PKH^lo- und CD34^lo/–-, PKH^lo-Zellen aus D6-Kulturen in TPO, KL und FL wurden sortiert und (10.000 Zellen pro Transplantat) in SCID-hu-Knochentransplantate injiziert. Acht Wochen nach der Injektion wurden die Knochentransplantate für Transplantateinbau von Donor-CD33⁺-, -CD19⁺- und -DC34⁺-Zellen analysiert.
b. Dosis unkultivierter CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen, welche eine Rekonstitution von 100 % an SCID-hu-Knochentransplantaten ergibt. Der Prozentsatz an Knochentransplantaten, die eine Donorrekonstitution bei jeder getesteten CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zelldosis zeigt, ist in 4 gezeigt. Mittels Poisson-Verteilungsanalyse war die Häufigkeit an SCID-hu-Knochenrepopulationszellen 1 pro 2000 CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen. Bei dem Fünffachen dieser begrenzenden Dosis oder 10.000 Zellen wurde Donorrekonstitution in 100 % der Transplantate beobachtet.
c. Transplantateinbau von CD34^hiPKH^lo-Zellen aus 6-Tage-Kultur in TPO, KL und FL in SCID-hu-Knochen. CD34^hiPKH^lo-Zellen aus 6 Tage alten Kulturen an CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen in TPO, KL und FL enthielten erhöhte CAFC-Zahlen. Zusätzlich fragten wir, ob dieselbe Zellpopulation ihre Fähigkeit, menschlichen Knochen in vivo wieder zu bevölkern, bewahrte, unter Verwendung des SCID-hu-Knochentests, wie beschrieben zum Beispiel in Murray et al. (1995), oben, und Chen et al. (1994), oben. Um ausreichend Zellen zu gewinnen, wurden CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen aus kryokonservierten BM-CD34'-Zellen, die aus Multiorgandonoren isoliert worden sind, gereinigt. Unkultivierte CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen und CD34^hiThy-1^lo aus D6-TPO-, -KL- und -FL-Kulturen wurden in die fötalen menschlichen Knochentransplantate injiziert. 10.000 Zellen wurden pro Transplantat injiziert, da diese Zelldosis einen beständigen Transplantateinbau von unkultivierten BM-CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen bereitstellt (3).
Kultivierte CD34^hiThy-1^lo-Zellen bauten das Transplantat in einem ähnlichen Maße ein wie die unkultivierte Population aus CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen (4/4 Transplantate) (4 und Tabelle 4). In Experiment A (Tabelle 4) war der mittlere Prozentsatz an Donorzellen 34,3 ± 22,3 % für CD34^hiTKH^lo-Zellen, vergleichbar mit 25,0 ± 13,5 % für unkultivierte CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen. FACScan-Analyse zeigte, dass der Multilinientransplantateinbau in beiden Fällen geschah, da die aus dem Knochen nach 8 Wochen isolierten Zellen Donor-B-Lymphoid(CD19⁺), Myeolid- (CD33⁺) und Progenitorzellen (CD34⁺) (4) einschlossen.
In einem zweiten Experiment (B) zeigten 4/4 Transplantate, injiziert mit CD34^hiPKH^lo-Zellen aus D6-TPO-, -KL- und -FL-Kulturen einen multilinearen Transplantateinbau mit einem Mittelwert von 59,0 ± 12,0 % Donorzellen (Tabelle 4). Die Ergebnisse bestätigen, dass nach 6 Tagen in Kultur die In-vivo-Knochenmarkrepopulationsfähigkeit von CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen innerhalb der CD34^hi-Population nach der Teilung in TPO, KL und FL gewahrt wird. Tabelle 4 CD34⁺-Zellen, welche sich während 6 Tagen Kultur in TPO, KL und FL geteilt haben, bewahren ihre Fähigkeit zur Knochenmarkrepopulation in vivo in dem SCID-hu-Knochentest
Fußnote zu Tabelle 4

10.000 Zellen wurden pro Knochentransplantat injiziert. Die gezeigten Abweichungen sind SEM. Transplantate wurden 8 Wochen nach der Injektion auf Donorzellen analysiert, die das HLA-Angebot der injizierten Zellen exprimieren. ND bedeutet nicht bestimmt.
* Die für die Injektion unkultivierter CD34⁺Thy-1⁺Lin^–-Zellen in Experiment B verwendeten Mäuse starben vor der Analyse der Transplantate.
> Keine CAFC unter 6.600 ausplattierten Zellen detektiert.

Beispiel 6: MPB-CD34⁺-Zellen, kultiviert für 90 Stunden in verschiedenen Cytokinkulturen
a. Zellkulturen und Cytokine. Zellen wurden gezählt, resuspendiert und für 90 Stunden in einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen pro ml in serumfreiem X-Vivo-15-Medium (BioWhittaker, Walkersville, MD), enthaltend Glutamin (JRH BioSciences, Lenexa, KS) und 1 % Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma, St. Louis, MO); in Vertiefungen von 24-Well-Platten mit flachem Boden (Corning Costar Corp., Cambridge, MA) bei 37 °C kultiviert. Die Kulturen enthielten unterschiedliche Cytokinkombinationen. Die verwendeten Cytokine schlossen rekombinantes menschliches IL3 (20 ng/ml), IL6 (20 ng/ml), LIF (100 ng/ml) (Novartis Pharmaceuticals Corp., Basel, Schweiz), TPO (50 bis 100 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN), KL (100 ng/ml) und FL (100 ng/ml) (SyStemix, Palo Alto, CA) ein.
Vor dem Kultivieren wurde eine Probe aus MPB-CD34-Zellen mit 1 mg/ml hitzeinaktiviertem menschlichen Gamma-Globulin (Gamimune, Miles Inc. Elkhart, IN) für 10 Minuten (Min.) auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden dann mit anti-CD34-FITC (HPCA-2-FITC, Becton Dickinson) und anti-Thy-1-Cy5 (PR13, Systemix) oder mit geeigneten Isotopkontrollen IgG₁-FITC (Becton Dickinson, San Jose, CA) und IgG₁-Cy5 (Systemix, Palo Alto, CA) für 30 Minuten auf Eis gefärbt. Die Zellen wurden gewaschen und in PBS (JRH BioSciences, Lenexa, KS), 2 % fötales Kälberserum (FCS) (Hyclone, Logan, Utah); resuspendiert und auf einem FACS-Calibur-Durchflusszytometer (Becton Dickinson) analysiert.
An dem Ende der Kulturdauer wurden die Zellen geerntet und lebensfähige Zellzahlen wurden bestimmt unter Verwendung von Trypan-Blau-Ausschluss. Zellen wurden mit anti-CD34-Cy5 (PR20, SyStemix) und anti-Thy-1-PE (PR13, SyStemix) oder den geeigneten Isotopkontrollen IgG₁-Cy5 und IgG₁-PE (SyStemix) vor der Analyse auf einem FACS-Calibur-Durchflusszytometer gefärbt. Zellen mit hohem Propidiumiodidgehalt wurden von der Analyse ausgeschlossen.
b. Zunahme der Zahl an Gesamtzellen und an CD34⁺Thy-1⁺-Zelluntergruppen. Die Prozentsätze an Gesamt-CD34⁺-Progenitorzellen und der primitiveren CD34⁺Thy-1⁺-Untergruppe wurden gemessen. Die mittleren Daten aus 3 bis 12 unterschiedlichen MPB-Donoren sind in 5 gezeigt. Beginnend mit > 91) % reinen CD34⁺-selektierten Zellen exprimierten 89 % der Zellen CD34 an dem Ende der Kultur durch die Zugabe von TPO allein im Vergleich zu 79 % mit KL oder FL alleine. Es gab keinen signifikanten Unterschied in dem Prozentsatz an detektierbaren CD34⁺Thy-1⁺-Zellen, welcher 13 bis 14 % mit jeder dieser einzelnen Cytokine war. Obwohl beide Kombinationen aus TPO, FL und TPO, KL 91 bis 92 % der CD34⁺-Zellen bewahrten, wurde ein Mittelwert mit 20,7 +/– 5,2 % CD34⁺Thy-1⁺-Zellen in TPO und FL detektiert, verglichen mit nur 5,5 +/– 3 % in TPO und KL (P = 0,0084). Der Prozentsatz von CD34⁺Thy-1⁺-Zellen war ebenfalls höher (Mittelwert 20,7 %) in TPO und FL als in der Drei-Faktor-Kombination aus TPO, FL, KL (Mittelwert 6,8 %) (P < 0,0001). Bewahrung dieses primitiven Phänotypen war signifikant niedriger in IL-3, IL-6 und LIF (Mittelwert 3,7 %) als in TPO, FL, KL (P = 0,02).
Die x-fache Zunahme der CD34⁺Thy-1⁺-Zellzahl ist in 6 gezeigt. Einzeln vermochten TPO, FL und KL es jeweils nicht, die Zahl der CD34⁺Thy-1⁺-Zellen zu erhöhen. Kulturen, die TPO und FL oder TPO und KL in Kombination einschlossen, ergaben die höchste Zunahme der CD34⁺Thy-1⁺-Zellzahl. Unter Berücksichtigung des Variationsmaßes innerhalb der MPB-Proben gab es keinen signifikanten Unterschied unter solchen Kulturen, welche sämtlich in der Aufrechterhaltung oder einer kleinen Zunahme (1,2- bis 1,5-fach) der CD34⁺Thy-1⁺-Zellzahl resultierten.
c. CAFC-Tests in mobilisierten peripheren Blutzellen. CAFC-Tests wurden ebenfalls in mobilisierten peripheren Blutzellen durchgeführt. CD34⁺Thy-1⁺-Zellen wurden aus mobilisierten peripheren Blutzellen unter Verwendung von Durchflusszytometrie gereinigt und wurden in einer Konzentration von 4 × 10⁵ Zellen/ml in X-VIVO 15, 1 % BSA und den in 7 gezeigten Cytokinen kultiviert. Nach 5 Tagen in Kultur wurden die Zellen für die Thy-1-Expression durch Durchflusszytometrie analysiert und die CAFC-Aktivität wie oben beschrieben. Die x-fache Änderung in Gesamt-CAFC-Zahlen in den Thy-1⁺-Populationen nach der Kultur im Verhältnis zu der Ausgangspopulation sind in 7 als die Mittelwerte von 4 Experimenten gezeigt.
d. CFSE-Farbstoffmarkierung. Mobilisierte periphere, CD34+-selektierte Blut- (MPB-) Zellen wurden mit Carboxyfluoreszein-Diacetat-Succinimidylester- (CFSE-) Farbstoff (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) markiert, bei einer Zellkonzentration von 3 × 10⁶/ml und einer Farbstoffkonzentration von 1,25 μM in Iscove's modifiziertem Dulbecco's-Medium (IMDM) ohne Phenolrot (JRH Biosciences) im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 Minuten unter gelegentlichem Mischen. Die Markierung wurde durch die Zugabe von 1/5 Volumen FCS gestoppt. Zehn ml X-Vivo-15-Medium, enthaltend 1 % BSA, wurden dann zu den Zellen hinzugefügt, welche bei 400g für 10 Minuten zentrifugiert wurden.
e. Wirkung von TPO-Mimetika auf die HSC-Replikation. Die Wirkung eines TPO-Mimetikums auf die Zellvermehrung wurde ebenfalls untersucht. Das verwendete TPO- Mimetikum ist als Peptid AF13948 bekannt, mit der in Cwirla et al. (1997), oben, gezeigten Aminosäuresequenz. Mobilisierte periphere Blut-CD34⁺-Zellen wurden mit 1,25 μM CFSE-Farbstoff markiert, welcher es erlaubt, dass die Zellteilung fluorimetrisch gemessen wird. Die Zellen wurden dann in einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/ml in X-VIVO 15, 1 % BSA und den in Tabelle 5 angegebenen Cytokinen kultiviert. Nach 4 Tagen in Kultur wurden die Zellen für Thy-1-Expression und Zellteilung durch Durchflusszytometrie analysiert. Die x-fache Zunahme der Gesamtzellzahlen und Lebensfähigkeit wurde durch Hämozytometerzellen von mit Trypan-Blau gefärbten Proben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 5 Zellkultur und Vermehrung und Lebensfähigkeit

* Prozentuale Lebensfähigkeit mittels Trypan-Blau gemessen
KL = c-kit-Ligand
TPO = Thrombopoietin
MTPO = Thrombopoietin-Mimetikum

Beispiel 7: Bewahrung der Stammzellfunktion unter CD34⁺Thy-1⁺-Zellen nach jeder Zellteilung
CFSE-markierte CD34⁺-MPB-Zellen, wie hierin oben beschrieben, wurden in X-VIVO-15-Medium, enthaltend 1 % BSA, ergänzt mit Kombinationen aus TPO (50 ng/ml), FL (100 ng/ml), KL (100 ng/ml) und IL6 (20 ng/ml), für annähernd 112 Stunden mit 2 × 10⁵ Zellen/ml in 24-Well-Platten mit flachem Boden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator kultiviert.
Kultivierte Zellen wurden geerntet, ausgezählt und mit anti-CD34-Cy5 und anti-Thy-1-PE oder den geeigneten Isotopenkontrollen, wie oben beschrieben, gefärbt. CD34⁺Thy-1⁺-Populationen wurden durch Durchflusszytometrie, wie oben für das Sortieren von Zellen beschrieben, isoliert. Sortierbereiche für gesonderte Zahlen an Zellteilungen (FITC-Fluoreszenz) unter den Thy-1⁺-Zellen wurden etabliert, basierend auf mit Paxaformaldehyd fixierten, ungeteilten Kontrollpopulationen und einer sichtbar verminderten Ereignisdichte zwischen jeder Teilung. Die in TPO, FL und KL kultivierten CD34⁺Thy-1⁺-Zellen nahmen ungefähr zweifach in der Gesamtzahl zu. Die in TPO, FL und IL6 kultivierten CD34⁺Thy-1⁺-Zellen hielten die Ausgangszellzahlen aufrecht (Daten nicht gezeigt). Der Prozentsatz an Zellen, der Thy-1 exprimiert, war geringfügig höher in TPO, FL, IL6 als in TPO, FL, KL (27,4 % gegen 20,6 %); die TPO-, FL-, IL6-Kulturen bewahrten jedoch weniger Thy-1-exprimierende Zellen insgesamt (0,34 gegen 0,43 der Ausgangszellzahl). Diese Unterschiede waren nicht statistisch signifikant (Daten nicht gezeigt).
Kultivierte Zellpopulationen, die 1, 2, 3 oder 4 Teilungen durchgemacht hatten, wurden durch Durchflusszytometrie gereinigt. Nur Zellen, die immer noch Thy-1 nach der Kultur exprimierten, wurden getestet, da die Mehrheit an HSC-Aktivität in dieser Population lag. Thy-1⁺-Zellen, die in TPO, FL, KL oder TPO, FL, IL6 mit 100 ng/ml TPO, 100 ng/ml FL, 100 ng/ml KL und 20 ng/ml IL6 kultiviert wurden, bewahrten die CAFC-Aktivität im Verhältnis zu frischen CD34⁺Thy-1⁺-Zellen nach wenigstens zwei Teilungen. Die CAFC-Aktivität nahm nach 4 Teilungen für TPO, FL, KL oder 3 Teilungen für TPO, FL, IL6 ab (Daten nicht gezeigt). Transplantateinbau in SCID-hu-Knochen wurde bei allen vier Teilungen für beide Cytokinkombinationen beobachtet, wenn entweder 5.000 oder 15.000 Zellen pro Transplantat injiziert worden sind (8). Trensplantatzahlen, die menschliche Zellen enthielten, aus der Gesamtzahl an injizierten Zellen (Transplantateinbaurate), änderten sich nicht signifikant zwischen unkultivierten CD34⁺-Zellen oder kultivierten CD34⁺Thy-1⁺-Zellen, die zahlreiche Zellteilungszahlen in jeder Cytokinkombination durchgemacht hatten. Die durchschnittliche Anzahl an Donorzellen, die aus den mit TPO, FL, KL kultivierten Zellen injizierten Transplantaten wiedergewonnen worden ist, war annähernd zweimal höher als Transplantate, die in mit TPO, FL, IL6 kultivierte Zellen injiziert worden sind, und war nahe der Zahl an Donorzellen, die aus Transplantaten gewonnen worden sind, welche mit unkultivierten CD34⁺-Zellen injiziert worden sind. Es wurde geschlossen, dass CD34⁺Thy-1⁺-Zellen, kultiviert in TPO, FL, KL oder TPO, FL, IL6, bis zu vier Teilungen durchmachen können, ohne dass sie die ersichtliche HSC-Funktion auf einer Pro-Zelle-Basis verlieren.
Beispiel 8: Gentransfer in kultivierte hämatopoietische Zellen

Hämatopoietische Stammzellen, die wie oben in den Beispielen 1 bis 7 beschrieben mit 50 bis 100 ng/ml TPO, 100 ng/ml KL, 100 ng/ml FL, 20 ng/ml IL3, 20 ng/ml IL6 und/oder 100 ng/ml LIF kultiviert worden sind, wurden mit entweder dem (1) L-Mily-Vektor (der Lyt2 exprimiert) oder (2) dem LMTNL-Vektor (um die rev-Genmarkierung durch PCR zu analysieren) infiziert. Die Zellen wurden durch Hinzufügten des geeigneten Vektors zu den Kulturmedien infiziert. Wie unten in den Tabellen 6 bis F3 gezeigt, ergaben TPO, KL und FL ein 4,9-fach höheres Genmarkieren von LTC-CFC, eine 5-fach höhere Lyt2-Expression unter den post-SyS1-CD34+-Progenitorzellen und eine 4,7-fach höhere Lyt2-Expression unter dem post-SyS1-CD14+-Monozyten im Vergleich mit Zellen, die in IL-3, IL-6 und LIF kultiviert worden sind. Tabelle 6 Prozentsatz an HSCs, die durch rev markiert sind

CYTOKINE IN KULTUR	% an ZELLEN MIT REV-MARKIERUNG in 5-WOCHEN-SyS1-KULTUR (Mittelwert aus 3 bis 4 Experimenten)
TPO, KL und FL	73,8 %
TPO, FL und IL-6	63,2 %
IL-3, IL-6 und LIF (Kontrolle)	25,1 %

Tabelle 7 Prozentsatz an CD34⁺-Zellen, die das Lyt2-Transgen exprimieren

CYTOKINE IN KULTUR	% an CD34+-ZELLEN, DIE LYT2-
	TRANSGEN in SyS1-KULTUR
	EXPRIMIEREN
	(Mittelwert 2 bis 4 Experimenten)
TPO, KL und FL	3,8 %
IL-3, IL-6, LIF, FL und TPO	1,9 %
TPO, FL und IL-6	1,6 %
IL-3, IL-6 und LIF (Kontrolle)	0,75 %

Tabelle 8 Prozentsatz an CD14⁺-Monozyten, die Lyt2-Transgen exprimieren

CYTOKINE IN KULTUR	% an CD14+-ZELLEN, DIE LYT2-TRANSGEN in SyS1-KULTUR EXPRIMIEREN (Mittelwert aus 2 bis 4 Experimenten)
TPO, KL und FL	8,0 %
IL-3, IL-6, LIF, FL und TPO	2,8 %
TPO, FL und IL-6	2,4 %
IL-3, IL-6 und LIF (Kontrolle)	0,33 %

Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde ebenfalls durchgeführt, um den Gentransfer in HSCs zu bestimmen, die in verschiedenen Cytokinkombinationen kultiviert worden sind. Tabelle 9 fasst den Prozentsatz an Kolonien und Transplantaten, die das Transgen exprimieren, zusammen.
Tabelle 9
Beispiel 9: Genetische Modifikation von HSCs in der Arwesenheit von Fibronectin
Um das Potential für RetroNectin^TM (Takara Shuzo Co. Ltd. Otsu Shigi, Japan) zu bestimmen, die Transgenexpression in den Nachfahren von transduzierten HSC zu steigern, wurden CD34⁺-selektierten Zellen, welche mit dem ProPak-basierten PP-A.LMiLy-Vektor in der Anwesenheit und Abwesenheit von RetroNectin^TM und einer Reihe von Cytokinen transduziert worden sind, auf vorgeformten Sys1-Monoschichten langzeitinkubiert. Nach fünf Wochen wurden die menschlichen Zellen in den Kulturen für die FACS-Analyse der Zelloberflächenexpression für CD34 und Lyt2 gefärbt. Die Ergebnisse der repräsentativen Experimente sind in 9 und Tabelle 10 gezeigt. Die Daten zeigen, dass die transgene Expression (Lyt2-Expression) auf CD34⁺-Zellen, die in der Langzeit-Sys1-Kultur aufrecht erhalten werden, signifikant erhöht ist durch Transduzieren von Zellen auf mit RetroNectin^TM überzogenen Platten in der Anwesenheit eines Cytokincocktails, umfassend IL3, IL6, LIF, FL und TPO. Cytokinkonzentrationen sind oben in Beispiel 8 beschrieben. Wie in 9 gezeigt, war die Lyt2-Expression 3,7 % in den Populationen, die mit IL3, IL6, LIF, FL und TPO ohne RetroNectin^TM transduziert worden sind, verglichen mit 15,2 % in den Populationen, die auf mit RetroNectin^TM überzogenen Platten in der Anwesenheit derselben Cytokine transduziert worden sind. Die Verwendung von RetroNectin^TM zeigte eine annähernd vierfache Steigerung. In der Abwesenheit von TPO wurde keine Steigerung gesehen. Es gab keine Wirkung auf den Prozentsatz an Zellen in den Langzeitkulturen, welche den CD34-Phänotypen bewahrten, ob mit unterschiedlichen Cytokincocktails in der Anwesenheit oder Abwesenheit von RetroNectin^TM transduziert oder nicht. Tabelle 10 Gentransfer: MPB-CD34⁺-Zellen in zahlreichen Cytokinkombinationen Transduktionseffizienz (% Rev⁺) von klonogenen Zellen
RetroNectin^TM-Protokoll

Claims

Verfahren zum Modifizieren einer hematopoietischen Stammzelle, umfassend das in Kontakt bringen eines Gen-Übermittlungs-Vehikels, umfassend eine Polynucleotidsequenz, mit einer Population an hematopoietischen Stammzellen, die mit Fibronectin oder RetroNectin^TM und in Anwesenheit einer Menge an mpl-Ligand und flt3-Ligand (FL) kultiviert werden, welche ausreicht, das Uberleben, die Expansion und/oder. die Transduktion der hematopoietischen Stammzellen zu fördern, worin: (i) das Verfahren keine Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers mittels Operation oder keine Therapie ist, und (ii) das Verfahren humanen Embryos nicht für industrielle oder kommerzielle Zwecke verwendet.
Verfahren nach Anspruch 1, zusätzlich umfassend das Kultivieren der hematopoietischen Stammzellen in Anwesenheit eines c-kit Liganden.
Verfahren nach Anspruch 2, zusätzlich umfassend das Kultivieren der hematopietischen Stammzellen in Anwesenheit von Interleukin 3 (IL3).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Polynucleotidsequenz ein Produkt kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Peptid, einem Ribozym und einer antisense Sequenz.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Gen-Übermittlungs-Vehikel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem retroviralen Vektor, einem DNS-Vektor und einem liposomalen Übermittlungs-Vehikel.
Verfahren zum Modifizieren einer hematopoietischen Stammzelle, umfassend das in Kontakt bringen eines Gen-Übermittlungs-Vehikels, umfassend eine Polynucleotidsequenz, mit einer Population hematopoietischer Stammzellen, die mit Fibronection oder RetroNectin^TM und in Anwesenheit einer Menge an Thrombopoietin (TPO), einem flt3-Liganden (FL) und Interleukin 6 (IL6) kultiviert werden, die ausreicht, das Überleben, die Expansion und/oder die Transduktion der der hemtopoietischen Stammzellen zu fördern, worin: (i) das Verfahren kein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers mittels Chirurgie oder keine Therapie ist und (ii) das Verfahren humane Embryos nicht für industrielle oder kommerzielle Zwecke verwendet.
Verfahren nach Anspruch 6, zusätzlich umfassend das Kultivieren der Stammzellen in Anwesenheit des Leukämie inhibitorischen Faktors (LIF).
Verfahren nach Anspruch 6, zusätzlich umfassend das Kultivieren der Stammzellen in Anwesenheit von Interleukin 3 (IL3).
Verfahren nach Anspruch 6, zusätzlich umfassend das Kultivieren der Stammzellen in Anwesenheit eines c-kit Liganden.
Verfahren nach Anspruch 8, zusätzlich umfassend das Kultivieren der Stammzellen in Anwesenheit eines c-kit Liganden.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Polynukleotidsequenz ein Produkt kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Peptid, einem Ribozym und einer antisense Sequenz.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Gen-Übermittlungs-Vehikel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem retroviralen Vektor, einem DNS-Vektor und einem liposomalen Übermittlungs-Vehikel.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, zusätzlich umfassend die Expansion der hematopoietischen Stammzellen in Kultur.
Verfahren nach Anspruch 13, zusätzlich umfassend das Kultivieren der Zellen mit Interleukin 3 (IL3).
Verfahren nach Anspruch 13, zusätzlich umfassend das Kultivieren der Zellen mit dem Leukämie inhibitorischen Faktor (LIF).
Verfahren nach Anspruch 13, zusätzlich umfassend das Kultivieren der Zellen mit einem c-kit Liganden.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die hematopoietischen Stammzellen durch die Fähigkeit der Selbsterneuerung und die Fähigkeit, alle hematopoietischen Zelllinien entstehen zu lassen, gekennzeichnet sind.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die hematopoietischen Stammzellen humane hematopoietische Stammzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 18, worin die humanen hematopoietischen Stammzellen CD34⁺ sind.
Verfahren nach Anspruch 18, worin die humanen hematopoietischen Stammzellen CD34⁺Thy-1⁺ sind.
Verfahren nach Anspruch 18, worin die humanen hematopoietischen Stammzellen CD34⁺Thy-1⁺Lin^– sind.