DE60036470T2 - Untereinheiten von myeloid-progenitorzellen von säugern - Google Patents

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Description

  • Hintergrund
  • Das Immunsystem von Säugetieren spielt eine essentielle Rolle beim Schutz vor Krankheiten, seine Wirksamkeit beruht jedoch auf einem fragilen Kräftegleichgewicht. Exzessive oder ungeeignete Antworten führen zu Autoimmunerkrankungen, während ein Versagen der Immunantwort zu Immundefizienz führt. Treten solche Zustände auf, so kann ein therapeutisches Einschreiten erforderlich sein. Es ist jedoch nicht einfach, solch ein komplexes System erfolgreich zu manipulieren.
  • Die reifen Zellen des Immunsystems, T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen, differenzieren sich durch eine Reihe an Zellteilungen fortwährend von hämatopoetischen Stammzellen. Es wird angenommen, dass das Entwicklungspotential der Tochterzellen nach jeder Zellteilung entweder erhalten wird oder im Verhältnis zur Mutterzelle weiter eingeschränkt wird, jedoch niemals erweitert wird. Es wird daher beobachtet, dass pluripotente Stammzellen zu Vorläuferzellen führen, die an Multizelllinien gebunden sind und die zu spezifischen Linien und schließlich zu reifen Zellen führen. Die koordinierten Veränderungen zellulärer Eigenschaften, die zu irreversibler Einschränkung der Bindung an Lilnien führen, können auf eine sequentielle Aktivierung oder ein Verstummen verschiedener Gene zurückgeführt werden.
  • Der Phänotyp langlebiger, pluripotenter, hämatopoetischer Stammzellen wurde bereits beschrieben. Die Identifikation von bipotenten oder oligopotenten Zwischen-Vorläufern erwies sich jedoch als schwierig, da die Evaluierung des Differenzierungspotentials von einem möglichen Versagen der Zellen, eine detektierbare Differenzierung zu bestimmten Linien abzulesen, gestört werden kann, was auf ein Versagen des Erreichens geeigneter Mikroumgebungen in vivo, auf eine ungenügende Expansion zur Detektion in vivo oder auf die stochastische Art der Linienbindung, zumindest in vitro, zurückgeführt werden kann.
  • Die Verwendung des Pluripotentials liniengebundener Vorläuferzellen verhindert zahlreiche der Probleme, die sich aus dem Transfer reifer Zellen ergeben würden. Solche Vorläuferzellen sind jedoch von anderen hämatopoetischen Zellen zu trennen. Die Trennung erfordert eine Identifikation der Zelle und eine Beschreibung phänotypischer Unterschiede, die in einem Trennungsverfahren verwendet werden können. Zellen, die einer genetischen Manipulation zugänglich sind, sind besonders wünschenswert.
  • Relevante Literatur
  • Es wurde eine Reihe von Übersichtsartikeln veröffentlicht, die sich mit dem Phänotyp von Zellen in hämatopoetischen Linien beschäftigen. Die Gesamtentwicklung des hämatolymphoiden Systems wird in Orkin, Curr. Opin. Genet. Dev. 6, 597–602 (1996), beschrieben. Die Rolle von Transkriptionsfaktoren bei der Regulation der hämatopoetischen Differenzierung wird in Georgopoulos et al., Annu. Rev. Immunol. 15, 155–176 (1997), sowie in Singh, Curr. Opin. Immunol. 8, 160–165 (1996), beschrieben.
  • Verweise
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  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine im Wesentlichen angereicherte, hämatopoetische Säugetierzellen-Subpopulation wird bereitgestellt, die durch eine Vorläuferzellaktivität für myeloische Linien gekennzeichnet ist, der jedoch das Potential fehlt, in Lymphoidlinien zu differenzieren. Diese Population wird als gemeine myeloische Vorläuferzelle (CMP) bezeichnet. Es werden Verfahren zur Isolation und zum Züchten dieser Subpopulationen bereitgestellt. Die CMP-Population bildet die Grundlage für alle myeloischen Stammbäume und kann zu zwei zusätzlichen Vorläufer-Populationen führen, die ausschließlich entweder an die erythroiden/megakaryozytischen (MEP) oder die myelomonozytischen Linien (GMP) gebunden sind. Sowohl MEP als auch GMP können im Wesentlichen angereichert, isoliert und gezüchtet werden. Die drei Vorläuferzell-Populationen sind in der Transplantation, zur experimentellen Evaluierung und als Quelle für Stammbaum- und zellspezifische Produkte von Nutzen, unter anderem für mRNA-Spezies, die bei der Identifikation von Genen nützlich sind, die spezifisch in diesen Zellen exprimiert werden, sowie als Ziele für die Entdeckung von Faktoren oder Molekülen, die diese beeinflussen können.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1. Identifikation von myeloischen Vorläuferzellen in Knochenmark von Mäusen. (A) Lebende IL-7R--Linie--Zellen wurden durchgelassen und bezüglich der Expression der c-Kit- und Sca-1-Oberflächenmarker sichtbar gemacht. (B) Die Lin-IL-7R-Sca-1-c-Kit+-Fraktion wurde in (a) FcγRloCD34+-, (b) FcγRloCD34-- und (c) FcγRhiCD34+-Populationen unterteilt. Die Expression von G-CSFR, M-CSFR und βc war ausschließlich in der FcγRhiCD34+-Population zu sehen. (C) Erneute Analyse der sortier ten FcγRloCD34+-, FcγRloCD34-- und FcγRhiCD34+-Populationen. Alle Populationen wurden für In-vivo- und In-vitro-Tests einer doppelten Sortierung unterzogen.
  • 2. Klonogene myeloische Kolonieablesung in Methylzellulose. (A) Es wurden 288 Wells, die jeweils eine einzelne Zelle erhielten, aus jeder sortierten Vorläufer-Population bewertet. Die FcγRloCD34+-Zellen sowie HSC bildeten verschiedene myeloische Kolonien, unter anderem CFU-GEMM, wohingegen FcγRloCD34-- und FcγRhiCD34+-Populationen nur zu Meg/E- bzw. G/M-Kolonien führten (links). Alle myeloischen Vorläufer-Populationen erforderten kein SLF, FL oder IL-11 zur Koloniebildung (rechts). (B) Die Meg/E-Koloniebildung aus den FcγRloCD34+/--Fraktionen war vollständig von Epo und Tpo abhängig. Myeloische CD34+-Vorläufer bilden in Gegenwart von nur IL-3 und GM-CSF myelomonozytische Kolonien (rechts).
  • 3. Morphologie von Kolonien von Tag 7, die von sortierten myeloischen Vorläufern abstammen. Zweihundert Zellen jeder Population wurden in Methylzellulose, enthaltend SLF, IL-3, IL-11, GM-CSF, Epo und Tpo, in 35-mm-Schalen gezüchtet. Die oberen Felder zeigen das Aussehen von Kolonien, die von (A) FcγRloCD34+CMP, (B) FcγRloCD34-MEP-Vorläufern und (C) FcγRhiCD34+G/M-Vorläufern abstammen. Die unteren Felder zeigen die zelluläre Morphologie von 5 gepoolten Kolonien, die aus jeder Kultur gesammelt wurden (Giemsa-Färbung 1000X).
  • 4. In-vivo-Differenzierungspotential von myeloischen Vorläufern. Splenozyten von tödlich bestrahlten, kongenen Rezipientenmäusen wurden sechs Tage nach der intravenösen Injektion von entweder 10.000 CMP-, Meg/E- oder GMP-Vorläufern analysiert. Die oberen Felder zeigen die Mac-1/Gr-1-Profile von Zellen, die von Spendern stammen (CD45.1), in Rezipientenmäusen (CD45.2). Die unteren Felder zeigen CD45.1/TER119-Profile von den oben gezeigten Mac-1-Gr-1-Fraktionen.
  • 5. Linien-Beziehungen unter den myeloischen Vorläufer-Untergruppen. (A) FcγRloCD34+CMP ergab 60 Stunden nach dem Sortieren auf stromale S17-Schichten FcγRloCD34-MEP-Vorläufer und FcγRhiCD34+G/M-Vorläufer. (B) RT-PCR für GATA- 1- und Epo-R-Expression. Bei FcγRloCD34+CMP ist eine niedrige Expression zu sehen, am stärksten ist sie in den FcγRloCD34-MEP-Vorläufern ausgeprägt. Die FcγRhiCD34+GMP-Vorläufer exprimieren keines der Gene.
  • BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Es werden hämatopoetische Säugetier-Vorläuferzellen bereitgestellt, die an myeloische Linien gebunden sind. Diese Zellen werden in drei verschiedene Untergruppen unterteilt: eine gemeine myeloische Vorläuferzelle (CMP); eine gebundene Granulozyten-Monozyten-(GMP-)Vorläuferzelle; sowie eine gebundene Erythroid/Megakaryozyten-(MEP-)Vorläuferzelle. Die CMP führt zu den zwei anderen Untergruppen.
  • Die CMP-Population ist bei der Transplantation, um einen Rezipienten mit myeloischen Zellen, unter anderem Megakaryozyten, Plättchen und Erythrozyten, zu versorgen, und zwar zusätzlich zu Monozyten und Granulozyten; für das Arzneimittelscreening; für experimentelle Modelle hämatopoetischer Differenzierung und Wechselwirkung; zum Screening von In-vitro-Tests zur Definition von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren sowie um Gene zu beschreiben, die in die myeloische Entwicklung und Regulation involviert sind; und dergleichen von Nutzen. Die nativen Zellen können für diese Zwecke verwendet werden, oder sie können genetisch modifiziert werden, um veränderte Fähigkeiten bereitzustellen.
  • CMPs werden von einem komplexen Gemisch an Zellen unter Verwendung von Reagenzien getrennt, die spezifisch Marker auf der Zelloberfläche erkennen, unter anderem CDw127 (IL-7-Rezeptor α); CD117-(c-kit-)Protein und einen Cocktail an Markern, die auf liniengebundenen Zellen exprimiert werden. Murine myeloische Vorläuferzellen der Erfindung werden auch als Zellen beschrieben, denen die Expression von Sca-1 (Ly-6E und Ly-6A) fehlt. In menschlichen Zellen ist das Ausmaß der Färbung bei CD34 und c-kit gering. Die drei Vorläuferzellen-Untergruppen werden alle als IL-7Rα-negativ, sca-l-negativ, liniennegativ und als ein hohes Ausmaß an c-kit aufweisend beschrieben.
  • Die Zellpopulation, welche die Lin--IL-7R--Sca-1--c-Kit+-Fraktion umfasst, kann auf der Grundlage der Expression von CD34 und dem Fcγ-Rezeptor (FcγR) in die Vorläuferpopulationen der Erfindung unterteilt werden. Die FcγRloCD34+-Population stellt den gemeinen myeloischen Vorläufer bereit. FcγRloCD34- stellt die MEP-Vorläufer-Population bereit; und die FcγRhiCD34+-Population stellt die GMP-Vorläufer-Untergruppe bereit.
  • In Gegenwart von Steelfaktor (SLF), flt-3-Ligand (FL), Interleukin-(IL-) 3, IL-11, GM-CSF, Thrombopoietin (Tpo) und Erythropoietin (Epo) führen die FcγRloCD34+-Zellen zu verschiedenen Typen myeloerythroider Kolonien, unter anderem CFU-GEMMeg, Burst-Forming-Unit-Erythroid (BFU-E), CFU-Megakaryozyten (CFU-Meg), CFU-Granulozyten/Makrophagen (CFU-GM), CFU-Granulozyten (CFU-G) und CFU-Makrophagen (CFU-M).
  • Die FcγRhiCD34+-Population erzeugt CFU-M-, CFU-G- oder CFU-GM-Kolonien, die Makrophagen und/oder Granulozyten enthalten, als Reaktion auf die oben genannten Wachstumsfaktoren. Im Gegensatz dazu führen FcγRloCD34--Zellen zu CFU-Meg-, BFU-E- oder CFU-MEP-Kolonien, die nur Megakaryozyten und/oder Erythrozyten enthalten, als Reaktion auf IL-3, GM-CSF, Tpo und Epo, bilden jedoch in Abwesenheit von Tpo und Epo keine Kolonien. Alle drei myeloischen Vorläufer-Populationen erfordern keine „frühzeitig agierenden Zytokine", wie z. B. SLF, FL und IL-11, um die Koloniebildung zu initiieren.
  • Alle diese Vorläufer sind in vivo zu einer schnellen Differenzierungsaktivität in der Lage. CMP-Zellen führen zu myelomonozytischen Gr-1+/Mac-1+-Zellen und megakaryotischen Kolonien sowie zu erythroiden TER119+-Zellen in der Milz und im Knochenmark. Die GMP-Vorläufer-Population führt zu Gr-1+/Mac-1+-Zellen; und die MEP-Vorläufer-Population führt zu Megakaryozyten und Erythrozyten.
  • Es werden Verfahren zur Anreicherung myeloischer Vorläuferzell-Untergruppen bereitgestellt. Die angereicherte Zellpopulation weist normalerweise zumindest etwa 90 % Zellen des ausgewählten Phänotyps auf, noch häufiger zumindest 95% Zellen des ausgewählten Phänotyps. Die betreffenden Zellpopulationen werden von anderen Zellen, z. B. hämatopoetischen Zellen, auf der Grundlange spezifischer Marker getrennt, die mit Affinitätsreagenzien, z. B. monoklonalen Antikörpern, identifiziert werden.
  • Die myeloischen Vorläufer-Untergruppen werden aus einer beliebigen Quelle hämatopoetischer Vorläuferzellen isoliert, wobei es sich um fötale, neonatale, jugendliche oder erwachsene Zellen handelt, unter anderem aus Knochenmark, der Milz, der Leber, aus Nabelschnurblut, peripherem Blut, mobilisiertem peripherem Blut, dem Dottersack etc. Zur autologen oder allogenen Transplantation werden Knochenmark und mobilisiertes peripheres Blut als Ausgangsmaterialien bevorzugt. Bei peripherem Blut werden Vorläufer-Zellen nach der Behandlung mit Chemotherapie; G-CSF oder GM-CSF, oder beidem, aus dem Mark-Kompartiment in die periphere Blutbahn mobilisiert. Eine Reihe Einzel- und Kombinationschemotherapeutika wurde verwendet, um PBPCs zu mobilisieren. Bei der Verabreichung dieser Mittel muss in allen Fällen eine Balance gefunden werden zwischen wirksamer PBPC-Mobilisierung und möglichem Schaden des hämatopoetischen Stammzellen-Pools sowie einer allgemeinen Toleranz des Patienten. Von Paclitaxel wurde herausgefunden, dass es PBPCs wirksam mobilisierte, ohne den Stammzellen-Pool zu schädigen. Ein Bericht über Peripherblut-Stammzellen ist in Shpall et al., Annu. Rev. Med. 48, 241–251 (1997), zu finden, und die Charakterisierung der Stammzellen-Mobilisierung ist in Moog et al., Ann. Hematol. 77 (4), 143–7 (1998), zu finden. Als eine alternative Zellquelle können hämatopoetische Stammzellen, wie in den US-Patenten Nr. 5.061.620 , ausgegeben am 29. Oktober 1991, und 5.087.570 , ausgegeben am 11. Februar 1992, beschrieben, in vivo oder in vitro gezüchtet werden, um als Zellquelle zu dienen.
  • Die Vorläuferzellen können von jeder Säugetier-Spezies, unter anderem von Pferden, Rindern, Schweinen, Hunden, Katzen, Nagetieren, z. B. Mäusen, Ratten, Hamstern, Primaten etc., insbesondere von Menschen, erhalten werden. Das Gewebe kann durch eine Biopsie oder Apherese von einem lebenden Spender erhalten werden, oder es kann von einem toten oder sterbenden Spender innerhalb von etwa 48 Stunden nach dem Tod erhalten werden oder aus frisch eingefrorenem Gewebe, aus Gewebe, das innerhalb von etwa 12 Stunden nach dem Tod eingefroren wurde und bei einer Temperatur von etwa –20°C gehalten wurde, normalerweise unbegrenzt bei einer Temperatur von flüssigem Stickstoff (–180°C).
  • Die jeweiligen myeloischen Vorläuferzellen sind durch ihre Expression von Zelloberflächenmarkern gekennzeichnet. Für mehrere dieser Marker ist die Expression gering oder liegt bei einer mittleren Menge. Während es häufig vorkommt, Zellen als „positiv" oder „negativ" für einen bestimmten Marker zu bezeichnen, sind die Mengen der tatsächlichen Expression ein quantitatives Merkmal. Die Molekülanzahl auf der Zelloberfläche kann um mehrere Logs variieren und trotzdem als „positiv" charakterisiert werden. Die Beschreibung des Färbungsausmaßes erlaubt geringfügige Unterscheidungen zwischen Zellpopulationen.
  • Die Färbungsintensität von Zellen kann mittels Durchflusszytometrie beobachtet werden, wo Laser die quantitativen Mengen an Fluorochrom detektieren (die proportional zu der Menge an Zelloberflächenantigen ist, das von den Antikörpern gebunden ist). Durchflusszytometrie, oder FACS, kann auch verwendet werden, um Zellpopulationen basierend auf der Intensität der Antikörperfärbung sowie auf anderen Parametern, wie z. B. Zellgröße und Lichtstreuung, zu trennen. Obwohl sich die absolute Menge der Färbung mit einem bestimmten Fluorochrom und einem bestimmten Antikörperpräparat unterscheiden kann, können die Daten an eine Kontrolle normalisiert werden.
  • Um die Verteilung an eine Kontrolle zu normalisieren, wird jede Zelle als ein Datenpunkt mit einer bestimmten Färbungsintensität aufgenommen. Diese Datenpunkte können einer Log-Skala entsprechend dargestellt werden, auf der die Maßeinheit die willkürliche Färbungsintensität ist. In einem Beispiel werden die hellsten Zellen in einer Knochenmarksprobe als um 4 Logs intensiver dargestellt als die Zellen mit dem geringsten Färbungsausmaß. Bei Darstellung auf diese Art und Weise ist klar, dass die Zellen, die in die Kategorie der höchsten Log-Färbungsintensität fallen, hell sind, während jene mit der niedrigsten Intensität negativ sind. Die Färbungszellen mit „geringer Intensität", die in den 2.–3. Log der Färbungsintensität fallen, besitzen Eigenschaften, die sich von den negativen und positiven Zellen auf einzigartige Weise unterscheiden. Eine alternative Kontrolle kann ein Substrat mit einer definierten Antigendichte auf seiner Oberfläche verwenden, z. B. eine angefertigte Perle oder Zelllinie, die bezüglich der Intensität die positive Kontrolle darstellt. Die Bezeichnung „geringe Intensität" deutet darauf hin, dass das Ausmaß der Färbung über der Helligkeit einer übereingestimmten Isotyp-Kontrolle liegt, jedoch nicht so intensiv ist wie die am hellsten färbenden Zellen, die normalerweise in Knochenmark zu finden sind.
  • Die jeweiligen myeloischen Vorläufer-Untergruppen sind durch ihre Expression von Wachstumsfaktor-Rezeptoren gekennzeichnet. Zusätzlich zur Bereitstellung eines passenden Markers zur Trennung sind die verwandten Liganden auf CMPs biologisch aktiv. Die jeweiligen Zellen exprimieren hohe Mengen an c-kit (CD117) auf ihrer Zelloberfläche. Antikörper, die c-kit in Menschen, Mäusen, Ratten etc. spezifisch binden, sind nach dem Stand der Technik bekannt. Alternativ dazu kann der c-kit-Ligand Steelfaktor (Slf) zur Identifikation von Zellen, die c-kit exprimieren, verwendet werden.
  • Die myeloischen Vorläufer-Untergruppen besitzen auch den Phänotyp der fehlenden Expression von linienspezifischen Markern, z. B. B220, CD4, CD8, CD3, Gr-1 und Mac-1. Für Färbungszwecke kann ein Cocktail an Bindungsreagenzien, hierin „lin" benannt, verwendet werden. Das lin-Feld umfasst Bindungsreagenzien, z. B. Antikörper und funktionale Bindungsfragmente davon, Liganden, Peptidomimetika etc., die zwei oder mehr der Linienmarker erkennen. Ein lin-Feld umfasst allgemein zumindest einen Marker, der auf reifen B-Zellen, auf reifen T-Zellen, auf reifen Granulozyten und auf reifen Makrophagen exprimiert wird. Marker, die zur Verwendung in einem Linien-Feld geeignet sind, werden typischerweise auf diesen reifen Zellen exprimiert, sind jedoch nicht auf mehrfachen Linien oder auf Stamm- oder Vorläuferzellen vorhanden.
  • Die jeweiligen Untergruppen werden aus einem komplexen Gemisch an Zellen mittels Verfahren getrennt, die Zellen mit den oben genannten Merkmalen anreichern. Für eine Isolation von Zellen aus Gewebe kann eine geeignete Lösung zur Dispersion oder Suspension verwendet werden. Solch eine Lösung umfasst allgemein eine ausgewogene Salzlösung, z. B. normale Salzlösung, PBS, ausgewogene Hank-Salzlösung etc., die in geeigneter Weise mit fötalem Kälberserum oder anderen, natürlich auftretenden Faktoren ergänzt ist, zusammen mit einem annehmbaren Puffer in geringer Konzentration, allgemein von 5–25 mM. Passende Puffer umfassen HEPES, Phosphatpuffer, Lactatpuffer etc.
  • Die Trennung der betreffenden Zellpopulationen verwendet anschließend das Verfahren der Affinitätstrennung, um eine im Wesentlichen reine Population bereitzustellen. Verfahren zur Affinitätstrennung können eine magnetische Trennung, die Verwendung antikörperbeschichteter Magnetperlen, eine Affinitätschromatographie, zytotoxische Mittel, die an einen monoklonalen Antikörper gebunden sind oder zusammen mit einem monoklonalen Antikörper verwendet werden, z. B. Komplement und Zytotoxine, sowie das „Panning" mit einem Antikörper, der an eine feste Matrix, z. B. eine Platte, gebunden ist, oder andere passende Verfahren umfassen. Verfahren, die eine genaue Trennung bereitstellen, umfassen fluoreszenzaktivierte Zellsortierer, die unterschiedlich weit entwickelt sein können, z. B. multiple Farbkanäle, Kanäle, welche die Kleinwinkel-Lichtstreuung und Stumpfwinkel-Lichtstreuung detektieren, Impedanzkanäle etc. Die Zellen können gegen tote Zellen unter Verwendung von Farbstoffen selektiert werden, die mit toten Zellen assoziiert sind (z. B. Propidiumiodid). Es kann jedes beliebige Verfahren verwendet werden, das der Lebensfähigkeit der selektierten Zellen keinen übermäßigen Schaden zufügt.
  • Die Affinitätsreagenzien können spezifische Rezeptoren oder Liganden für die oben angeführten Zelloberflächenmoleküle sein. Zusätzlich zu Antikörper-Reagenzien können Peptid-MHC-Antigen- und T-Zellen-Rezeptor-Paare verwendet werden; Peptid-Liganden und Rezeptoren; Effektor- und Rezeptor-Moleküle und dergleichen. Antikörper und T-Zellen-Rezeptoren können monoklonal oder polyklonal sein und können von transgenen Tieren, immunisierten Tieren, immortalisierten menschlichen oder tierischen B-Zellen, Zellen, die mit DNA-Vektoren transfiziert sind, die für den Antikörper oder T-Zellen-Rezeptor kodieren, etc. produziert werden. Die Details der Herstellung von Antikörpern und ihre Eignung zur Verwendung als spezifische Bindungsteile sind dem Fachmann wohlbekannt.
  • Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Antikörpern als Affinitätsreagenzien. Diese Antikörper werden passenderweise mit einer Markierung zur Verwendung in der Trennung konjugiert. Markierungen umfassen Magnetperlen, die eine direkte Trennung ermöglichen, Biotin, das mit Avidin oder Streptavidin entfernt werden kann, das an einen Träger gebunden ist, Fluorochrome, die mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer verwendet werden können, oder dergleichen, um eine leichte Trennung des bestimmten Zelltyps zu ermöglichen. Fluorochrome, die Verwendung finden, umfassen Phycobiliproteine, z. B. Phycoerythrin und Allophycocyanine, Fluorescein und Texas-Rot. Oftmals wird jeder Antikörper mit einem anderen Fluorochrom markiert, um eine unabhängige Sortierung für jeden Marker zu ermöglichen.
  • Die Antikörper werden zu einer Suspension von Zellen hinzugefügt und für eine Zeitspanne inkubiert, die ausreicht, um die erhältlichen Zelloberflächenantigene zu binden. Die Inkubation dauert normalerweise zumindest etwa 5 Minuten und normalerweise weniger als etwa 30 Minuten. Eine ausreichende Konzentration von Antikörpern im Reaktionsgemisch ist wünschenswert, so dass die Wirksamkeit der Trennung nicht durch das Fehlen des Antikörpers eingeschränkt ist. Die geeignete Konzentration wird mittels Titrierung bestimmt. Bei dem Medium, in dem die Zellen getrennt werden, kann es sich um ein beliebiges Medium handeln, das die Lebensfähigkeit der Zellen erhält. Ein bevorzugtes Medium ist eine phosphatgepufferte Salzlösung, die von 0,1 bis 0,5% BSA enthält. Verschiedene Medien sind im Handel erhältlich und können dem Wesen der Zellen entsprechend verwendet werden, unter anderem Dulbeccos Modifiziertes Eagle-Medium (dMEM), Basische Salzlösung nach Hank (HBSS), Dulbeccos phosphatgepufferte Salzlösung (dPBS), RPMI, Iscove-Medium, PBS mit 5 mM EDTA etc., häufig mit fötalem Kälberserum, BSA, HSA etc. ergänzt.
  • Die markierten Zellen werden anschließend bezüglich der Expression des c-kit-, IL-7Rα- und lin-Felds getrennt. Die selektierte Population weist ein hohes Ausmaß an c-kit auf, ist lin-negativ und IL-7Rα-negativ. Gegebenenfalls wird die Zellpopulation auch basierend auf der Expression von FcγR und CD34 in Untergruppen geteilt.
  • Die getrennten Zellen können in einem beliebigen geeigneten Medium gesammelt werden, das die Lebensfähigkeit der Zellen erhält, normalerweise mit einem Serumkissen am Boden des Sammelröhrchens. Es sind verschiedene Medien im Handel erhältlich und können dem Wesen der Zellen entsprechend verwendet werden, unter anderem dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, Iscove-Medium etc., häufig mit fötalem Kälberserum ergänzt.
  • Auf diese Art und Weise werden Zusammensetzungen erreicht, die bezüglich der myeloischen Vorläuferaktivität hochgradig angereichert sind. Die jeweilige Population liegt bei oder um etwa 90% oder mehr der Zellzusammensetzung und vorzugsweise bei oder um etwa 95% oder mehr der Zellzusammensetzung. Die gewünschten Zellen werden durch ihren Oberflächen-Phänotyp, durch die Fähigkeit, auf Wachstumsfaktoren zu antworten, und die Fähigkeit, in vivo und in vitro für die Entwicklung mehrfacher myeloischer Linien zu sorgen, identifiziert. Die angereicherte Zellpopulation kann sofort verwendet werden oder bei Temperaturen von flüssigem Stickstoff gefroren werden und für lange Zeitspannen gelagert werden, wonach sie aufgetaut und wiederverwendet werden kann. Die Zellen werden normalerweise in 10% DMSO, 50% FCS, 40% RPMI-1640-Medium gelagert. Einmal aufgetaut, können die Zellen durch die Verwendung von Wachstumsfaktoren oder stromalen Zellen, die mit hämatopoetischer Zellproliferation und -differenzierung assoziiert sind, vermehrt werden.
  • Die angereicherte Zellpopulation kann in vitro unter verschiedenen Kulturbedingungen gezüchtet werden. Das Kulturmedium kann flüssig oder halbfest sein, z. B. Agar, Methylzellulose etc. enthalten. Die Zellpopulation kann passenderweise in einem geeigneten Nährmedium suspendiert werden, wie z. B. modifiziertem Iscove-DMEM o der RPMI-1640, normalerweise mit fötalem Kälberserum (etwa 5–10%), L-Glutamin, einem Thiol, insbesondere 2-Mercaptoethanol, und Antibiotika, z. B. Penicillin und Streptomycin, ergänzt.
  • Die Kultur kann Wachstumsfaktoren enthalten, auf die die Zellen reagieren. Wachstumsfaktoren, wie hierin definiert, sind Moleküle, die in der Lage sind, Überleben, Wachstum und/oder Differenzierung von Zellen zu fördern, entweder in Kultur oder im intakten Gewebe durch spezifische Wirkungen auf einen Transmembran-Rezeptor. Wachstumsfaktoren umfassen Polypeptide und Nichtpolypeptid-Faktoren. Spezifische Wachstumsfaktoren, die beim Züchten der jeweiligen Zellen verwendet werden können, umfassen den Steelfaktor (c-kit-Ligand), Flk-2-Ligand, IL-11, IL-3, GM-CSF, Erythropoietin und Thrombopoietin. Die spezifischen Kulturbedingungen werden ausgewählt, um einen bestimmten Zweck zu erfüllen, d.h. Differenzierung in Erythroide in Megakaryozytenpopulationen, Erhalt der Vorläuferzellaktivität etc.
  • Zusätzlich zu oder anstelle von Wachstumsfaktoren können die jeweiligen Zellen in einer Co-Kultur mit stromalen oder Feederschicht-Zellen gezüchtet werden. Stromale Zellen, die zur Verwendung beim Wachstum hämatopoetischer Zellen geeignet sind, sind nach dem Stand der Technik bekannt. Diese umfassen Knochenmark-Stroms, wie in „Whitlock-Witte" verwendet (Whitlock et al., Annu. Rev. Immunol. 3, 213–235 [1985]), oder „Dexter"-Kulturbedingungen (Dexter et al., J. Exp. Med. 145, 1612–1616 [1977]); sowie heterologe thymische stromale Zellen (Small und Weissman, Scand. J. Immunol. 44, 115–121 [1996]).
  • Die jeweiligen gezüchteten Zellen können auf eine Vielzahl an Arten verwendet werden. Das Nährmedium, bei dem es sich um ein konditioniertes Medium handelt, kann in verschiedenen Stadien isoliert werden, und die Komponenten können analysiert werden. Die Trennung kann mit HPLC, Umkehrphasen-HPLC, Gelelektrophorese, isoelektrischer Fokussierung, Dialyse oder anderen, nicht zu einem Abbau führenden Verfahren erreicht werden, die eine Trennung nach Molekulargewicht, Molekularvolumen, Ladung, Kombinationen davon oder dergleichen ermöglichen. Eines oder mehrere dieser Verfahren können kombiniert werden, um zu einer weiteren Anreicherung von spezifischen Fraktionen zu führen.
  • Die Vorläuferzellen können zusammen mit dem Kultursystem in der Isolierung und Evaluierung von Faktoren verwendet werden, die mit der Differenzierung und Reifung von Lymphoidzellen assoziiert sind. Daher können die Vorläuferzellen in Tests zur Bestimmung der Aktivität von Medien, wie z. B. konditionierten Medien, zur Evaluierung von Flüssigkeiten hinsichtlich der Wachstumsfaktoraktivität, zur Involvierung mit dem Einsatz von Linien oder dergleichen verwendet werden.
  • Die jeweiligen CMP-, MEP- und/oder GMP-Populationen können zur Wiederherstellung der myeloischen Funktion in einem Rezipienten, z. B. Plättchen, Megakaryozyten, Neutrophilen, Monozyten, Makrophagen und Erythrozyten, verwendet werden. Die Erkrankung kann durch genetische oder durch die Umwelt hervorgerufene Umstände ausgelöst werden, z. B. durch Infektion mit einem Pathogen, wie z. B. HIV, durch Aussetzen gegenüber Strahlung etc. Autologe Zellen, insbesondere, wenn sie vor zytoreduktiver oder anderer Therapie entfernt werden, oder allogene Zellen können zur Isolation und zur darauf folgenden Transplantation von Vorläuferzellen verwendet werden.
  • Gene können in die myeloischen Vorläuferzellen für eine Reihe verschiedener Zwecke eingeführt werden, z. B. zum Vermeiden einer HIV-Infektion, als Ersatz für Gene mit einer Funktionsverlustmutation, zur Ermöglichung der Erkennung eines bestimmten Antigens, zur Unterdrückung der Aktivierung eines bestimmten Antigen-Rezeptors etc. Alternativ dazu werden Vektoren eingeführt, die Antisense-mRNA oder Ribozyme exprimieren, wodurch die Expression eines unerwünschten Gens blockiert wird. Andere Verfahren der Gentherapie bestehen in der Einführung von Arzneimittel-Resistenz-Genen, um normalen Vorläuferzellen einen Vorteil zu ermöglichen und selektivem Druck ausgesetzt zu sein, z. B. das multiple Arzneimittel-Resistenz-Gen (MDR), oder Anti-Apoptose-Genen, wie z. B. bcl-2. Verschiedene Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, können zur Transfektion der Target-Zellen verwendet werden, z. B. Elektroporation, calciumpräzipitierte DNA, Fu sinn, Transfektion, Lipofektion und dergleichen. Die spezifische Art und Weise, auf die die DNA eingeführt wird, ist für die Durchführung der Erfindung nicht entscheidend.
  • Es sind viele Vektoren, die für den Transfer exogener Gene in Target-Säugetierzellen nützlich sind, erhältlich. Die Vektoren können episomal sein, z. B. Plasmide, von Viren abstammende Vektoren, wie z. B. Cytomegalovirus, Adenovirus etc., oder sie können in das Targetzell-Genom durch homologe Rekombination oder Zufallsintegration integriert werden, z. B. von Retroviren abstammende Vektoren, wie z. B. MMLV, HIV-1, ALV etc. Von auf Retroviren basierenden Vektoren wurde gezeigt, dass sie besonders von Nutzen sind, wenn es sich bei den Target-Zellen um hämatopoetische Vorläuferzellen handelt. Siehe z. B. Schwarzenberger et al., Blood 87, 472–478 (1996); Nolta et al., P.N.A.S. 93, 2414–2419 (1996); sowie Maze et al., P.N.A.S. 93, 206–210 (1996).
  • Es können Kombinationen von Retroviren sowie eine geeignete Verpackungslinie verwendet werden, wobei die Capsid-Proteine für die Infektion der Target-Zellen funktional sind. Normalerweise werden die Zellen und das Virus für eine Zeitspanne von zumindest etwa 24 Stunden im Kulturmedium inkubiert. Den Zellen wird anschließend in manchen Anwendungen das Wachstum im Kulturmedium während kurzer Zeitspannen ermöglicht, z. B. 24–72 Stunden lang, oder für zumindest zwei Wochen, und es kann ihnen ermöglicht werden, vor der Analyse fünf Wochen lang oder mehr zu wachsen. Häufig verwendete retrovirale Vektoren sind „defekt", d.h. sie sind nicht in der Lage, virale Proteine zu produzieren, die zur produktiven Infektion erforderlich sind. Die Replikation des Vektors erfordert Wachstum in der Verpackungszelllinie.
  • Lentivirale Vektoren, wie z. B. jene, die auf HIV- oder FIV-gag-Sequenzen basieren, können zur Transfektion von sich nicht teilenden Zellen verwendet werden, wie z. B. der Ruhephase menschlicher hämatopoetischer Langzeit-Stammzellen (siehe Uchida et al., P.N.A.S. 95 (20), 11939–44 (1998)).
  • Die Wirtszellenspezifität des Retrovirus wird vom Hüllprotein env (p120) bestimmt. Das Hüllprotein wird von der Verpackungszelllinie bereitgestellt. Hüllproteine gehören zumindest drei verschiedenen Typen an: ökotrop, amphotrop und xenotrop. Retroviren, die mit ökotropem Hüllprotein verpackt sind, z. B. MMLV, sind in der Lage, die meisten murinen und Rattenzelltypen zu infizieren. Ökotrope Verpackungslinien umfassen BOSC23 (Pear et al., P.N.A.S. 90, 8392–8396 (1993)). Retroviren, die ein amphotropes Hüllprotein in sich tragen, z. B. 4070A (Danos et al., s.o.), sind in der Lage, die meisten Säugetier-Zelltypen, unter anderem von Menschen, Hunden und Mäusen, zu infizieren. Amphotrope Verpackungszelllinien umfassen PA12 (Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5, 431–437 (1985)); PA317 (Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6, 2895–2902 (1986), GRIP (Danos et al., PNAS 85, 6460–6464 (1988)). Retroviren, die mit xenotropem Hüllprotein verpackt sind, z. B. AKR env, sind in der Lage, die meisten Säugetier-Zelltypen zu infizieren, jedoch mit der Ausnahme muriner Zellen.
  • Die Sequenzen an den 5'- und 3'-Termini des Retrovirus sind lange terminale Wiederholungen (LTR). Eine Reihe von LTR-Sequenzen sind nach dem Stand der Technik bekannt und können verwendet werden, unter anderem die MMLV-LTR; HIV-LTR; AKR-LTR; FIV-LTR; ALV-LTR etc. Auf spezifische Sequenzen kann durch öffentliche Datenbanken zugegriffen werden. Es sind auch verschiedene Modifikationen der nativen LTR-Sequenzen bekannt. Die 5'-LTR agiert als ein starker Promotor, der die Transkription des eingeführten Gens nach der Integration in ein Targetzellen-Genom vorantreibt. Für manche Verwendungen ist es jedoch wünschenswert, einen regulierbaren Promotor zu haben, der die Expression steuert. Wo ein solcher Promotor inkludiert ist, wird die Promotorfunktion der LTR deaktiviert. Dies wird durch eine Deletion der U3-Region in der 3'-LTR erreicht, umfassend die Enhancer-Wiederholungen und den Promotor, die ausreicht, um die Promotorfunktion zu deaktivieren. Nach der Integration in ein Targetzellen-Genom kommt es zu einer Neuanordnung der 5'- und der 3'-LTR, was zu einem hinsichtlich der Transkription defekten Provirus führt, das als ein „selbstdeaktivierender Vektor" bezeichnet wird.
  • Die Vektoren können Gene umfassen, die später entfernt werden müssen, z. B. unter Verwendung eines Rekombinase-Systems, wie z. B. Cre/Lox, oder die Zellen, die diese exprimieren, müssen zerstört werden, z. B. durch das Inkludieren von Genen, die selektive Toxizität ermöglichen, wie z. B. Herpesvirus-TK, bcl-xs etc.
  • Geeignete induzierbare Promotoren werden in einem gewünschten Targetzelltyp aktiviert, entweder in der transfizierten Zelle oder den Nachkommen dieser. Mit Transkriptionsaktivierung ist gemeint, dass die Transkription in der Targetzelle über Grundniveau-Werte gesteigert wird, und zwar um zumindest etwa das 100fache, häufiger um zumindest etwa das 1000fache. Es sind verschiedene Promotoren bekannt, die in hämatopoetischen Zelltypen induziert sind.
  • Um den Besitz genetisch modifizierter Vorläuferzellen zu beweisen, können verschiedene Verfahren verwendet werden. Das Genom der Zellen kann eingeschränkt werden und mit oder ohne Amplifikation verwendet werden. Die Polymerase-Kettenreaktion; Gelelektrophorese; Restriktionsanalyse; Southern-, Northern- und Western-Blots; Sequenzierung und dergleichen können alle verwendet werden. Die Zellen können unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet werden, um sicherzustellen, dass die Zellen unter Erhalt der Fähigkeit, die eingeführte DNA zu exprimieren, zu einer Reifung zu allen der myeloischen Linien in der Lage sind. Es können in vitro und in vivo verschiedene Tests angewandt werden, um sicherzustellen, dass die pluripotente Fähigkeit der Zellen erhalten wurde.
  • Die Vorläuferzellen können in einem beliebigen physiologisch annehmbaren Medium verabreicht werden, normalerweise intravaskulär, obwohl sie auch in Knochen oder andere passende Stellen eingeführt werden können, wo die Zellen eine geeignete Stelle zur Regeneration und Differenzierung finden können. Normalerweise werden zumindest 1 × 105 Zellen verabreicht, vorzugsweise 1 × 106 oder mehr. Die Zellen können mittels einer Injektion, eines Katheters oder dergleichen eingeführt werden. Die Zellen können bei Temperaturen von flüssigem Stickstoff eingefroren werden und für lange Zeitspannen gelagert werden, wobei sie nach dem Auftauen zur Verwendung geeignet sind. Falls gefroren, werden die Zellen normalerweise in einem Medium aus 10% DMSO, 50% FCS, 40% RPMI-1640-Medium gelagert. Einmal aufgetaut, können die Zellen durch die Verwendung von Wachstumsfaktoren und/oder stromalen Zellen vermehrt werden, die mit Vorläuferzellproliferation und -differenzierung assoziiert sind.
  • Die jeweiligen Zellen sind für In-vitro-Tests und Screeningverfahren zur Detektion von Faktoren von Nutzen, die auf myeloischen Vorläufern aktiv sind, insbesondere jener, die für myeloische, unter anderem megakaryozytische und Erythroid-, Linien spezifisch sind und nicht auf Lymphoidzellen wirken. Von besonderem Interesse sind Screeningtests für Mittel, die auf menschlichen Zellen aktiv sind. Zu diesem Zweck kann eine Vielzahl an Tests verwendet werden, unter anderem Immuntests für die Proteinbindung; die Bestimmung von Zellwachstum, -differenzierung und funktionaler Aktivität; die Produktion von Zytokinen, z. B. IL-1; und dergleichen.
  • Von besonderem Interesse ist die Untersuchung der Genexpression in den myeloischen Vorläufer-Untergruppen der Erfindung. Die exprimierte Gruppe an Genen kann unter den myeloischen Vorläufer-Untergruppen oder gegen andere hämatopoetische Untergruppen, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, verglichen werden. Um z. B. die Gene zu bestimmen, die während der Megakaryozyten-Entwicklung reguliert werden, könnte man die Gruppe an Genen, die in der MEP-Vorläufer-Gruppe exprimiert wird, mit den CMP- oder den GM-Vorläufern oder gegen Stammzellen oder Lymphoid-Vorläuferzellen vergleichen.
  • Es kann jedes geeignete qualitative oder quantitative Verfahren, das nach dem Stand der Technik zur Detektion spezifischer mRNAs bekannt ist, verwendet werden. mRNA kann z. B. durch Hybridisierung an eine Mikroanordnung, In-situ-Hybridisierung in Gewebesektionen, mittels PCR mit reverser Transkriptase oder in Northern-Blots, enthaltend Poly-A+-mRNA, detektiert werden. Ein Fachmann kann diese Verfahren leicht zur Bestimmung von Unterschieden in der Größe oder der Menge an mRNA-Transkripten zwischen zwei Proben verwenden. Die Menge besonderer mRNAs in MEP-Zellen wird z. B. mit der Expression der mRNAs in einer Verweisprobe, z. B. CMP-Zellen, verglichen.
  • Es kann jedes geeignete Verfahren zur Detektion und zum Vergleich von mRNA-Expressionsmengen in einer Probe zusammen mit den Verfahren der Erfindung verwendet werden. mRNA-Expressionsmengen in einer Probe können z. B. durch die Erzeugung einer Bibliothek exprimierter Sequenz-Markierungen (ESTs) aus einer Probe bestimmt werden. Die Aufzählung der relativen Darstellung von ESTs in der Bibliothek kann zur Annäherung an die relative Darstellung eines Gen-Transkripts innerhalb der Ausgangsprobe verwendet werden. Die Resultate der EST-Analyse einer Testprobe können anschließend mit der EST-Analyse einer Verweisprobe verglichen werden, um die relativen Expressionsmengen eines selektierten Polynucleotids zu bestimmen, insbesondere eines Polynucleotids, das einem oder mehreren der differenziell exprimierten Gene, die hierin beschrieben wurden, entspricht.
  • Alternativ dazu kann die Genexpression in einer Testprobe unter Verwendung des Verfahrens der seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) durchgeführt werden (Velculescu et al., Science 270, 484 (1995)). Kurz gesagt, umfasst SAGE die Isolation kurzer, einzigartiger Sequenzmarkierungen aus einer spezifischen Position innerhalb jedes Transkripts. Die Sequenzmarkierungen werden verkettet, kloniert und sequenziert. Die Häufigkeit bestimmter Transkripte innerhalb der Ausgangsprobe spiegelt sich in der Anzahl der Male wider, in der die assoziierte Sequenzmarkierung mit der Sequenzpopulation anzutreffen ist.
  • Die Genexpression in einer Testprobe kann auch unter Verwendung verschiedener Differenzialdisplay-(DD-)Verfahren analysiert werden. Bei DD-Verfahren werden Fragmente, die durch spezifische Sequenz-Begrenzungselemente (z. B. Restriktionsenzymstellen) definiert sind, als einzigartige Gen-Identifizierer verwendet, gekoppelt mit Informationen über Fragmentlänge oder Fragmentposition innerhalb des exprimierten Gens. Die relative Darstellung eines exprimierten Gens mit einer Probe kann anschließend basierend auf der relativen Darstellung des Fragments geschätzt werden, das mit diesem Gen innerhalb des Pools aller möglichen Fragmente assoziiert ist. Verfahren und Zusammensetzungen zur Durchführung des DD-Verfahrens sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt, siehe z. B. US-Patent Nr. 5.776.683 ; und US-Patent Nr. 5.807.680 .
  • Eine Alternative dazu ist die Gen-Expression in einer Probe unter Verwendung der Hybridisierungsanalyse, die auf der Spezifität von Nucleotid-Wechselwirkungen basiert. Oligonucleotide oder cNDA können/kann verwendet werden, um DNA oder RNA mit spezifischer Sequenzzusammensetzung selektiv zu identifizieren oder einzufangen, und die Menge an RNA oder cDNA, die an eine bekannte Fangsequenz hybridisiert ist, kann qualitativ oder quantitativ bestimmt werden, um Informationen über die relative Darstellung einer bestimmten Nachricht innerhalb des Pools zellulärer Nachrichten in einer Probe bereitzustellen. Die Hybridisierungsanalyse kann kreiert werden, um ein gleichzeitiges Screening der relativen Expression hunderter bis tausender Gene zu ermöglichen, z. B. unter Verwendung von auf Anordnung basierenden Verfahren mit Formaten hoher Dichte, unter anderem Filter, Mikroskop-Objektträger oder Mikrochips, oder von auf Lösung basierenden Verfahren, die eine spektroskopische Analyse verwenden (z. B. Massenspektrometrie). Ein Beispiel für die Verwendung von Anordnungen in den diagnostischen Verfahren der Erfindung wird unten stehend ausführlicher beschrieben.
  • Die Hybridisierung an Anordnungen kann in Fällen durchgeführt werden, wo die Anordnungen entsprechend beliebigen geeigneten Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, produziert werden können. Verfahren zur Produktion großer Anordnungen von Oligonucleotiden werden z. B. in den US-Patenten Nr. 5.134.854 und 5.445.934 unter Verwendung lichtgerichteter Syntheseverfahren beschrieben. Unter Verwendung eines computergesteuerten Systems wird eine heterogene Anordnung an Monomeren durch gleichzeitige Kopplung an einer Reihe von Reaktionsstellen in eine heterogene Polymer-Anordnung konvertiert. Alternativ dazu werden Mikroanordnungen durch Abscheidung präsynthetisierter Oligonucleotide auf ein festes Substrat erzeugt, z. B. wie in der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO 95/35505 beschrieben.
  • Verfahren zur Sammlung von Daten aus der Hybridisierung von Proben mit Anordnungen sind nach dem Stand der Technik ebenfalls wohlbekannt. Die Polynucleotide der Zellproben können z. B. unter Verwendung einer detektierbaren fluoreszierenden Markierung und einer Hybridisierung der Polynucleotide in den Proben erzeugt wer den, die durch Scannen der Mikroanordnungen auf die Gegenwart der detektierbaren Markierung detektiert wird. Verfahren und Vorrichtungen zur Detektion von fluoreszenzmarkierten Targets auf Vorrichtungen sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Allgemein umfassen solche Detektionsvorrichtungen ein Mikroskop und eine Lichtquelle zum Richten von Licht auf ein Substrat. Ein Photonenzähler detektiert die Fluoreszenz des Substrats, während ein x-y-Translationsschritt die Position des Substrats variiert. Eine konfokale Detektionsvorrichtung, die in den jeweiligen Verfahren verwendet werden kann, wird im US-Patent Nr. 5.631.734 beschrieben. Ein Scanning-Laser-Mikroskop wird in Shalon et al., Genome Res. 6, 639 (1996), beschrieben. Unter Verwendung der geeigneten Anregungslinie wird ein Scan für jeden verwendeten Fluorophor durchgeführt. Die durch den Scan erzeugten digitalen Bilder werden anschließend zur darauf folgenden Analyse kombiniert. Für jedes spezifische Anordnungselement wird das Verhältnis des fluoreszierenden Signals aus einer Probe mit dem fluoreszierenden Signal aus einer anderen Probe verglichen, und es wird die relative Signalintensität bestimmt.
  • Verfahren zur Analyse der gesammelten Daten aus der Hybridisierung an Anordnungen sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Wo die Detektion der Hybridisierung z. B. eine fluoreszierende Markierung umfasst, kann die Datenanalyse die Schritte der Bestimmung der Fluoreszenzintensität als eine Funktion der Substratposition aus den gesammelten Daten, das Entfernen von herausfallenden Werten, d.h. Daten, die von einer im Vorhinein festgelegten statistischen Verteilung abreichen, sowie das Berechnen der relativen Bindungsaffinität der Targets aus den verbleibenden Daten umfassen. Die resultierenden Daten können als ein Bild dargestellt werden, wobei die Intensität in jeder Region entsprechend der Bindungsaffinität zwischen Targets und Sonden variiert.
  • Die Mustererkennung kann händisch oder unter Verwendung eines Computerprogramms durchgeführt werden. Verfahren zur Herstellung von Substratmatrizen (z. B. Anordnungen), das Design von Oligonucleotiden zur Verwendung für solche Matrizen, die Markierung von Sonden, Hybridisierungsbedingungen, das Scannen von hybridisierten Matrizen und die Analyse erzeugter Muster, umfassend die Vergleichsanalyse, werden z. B. im US-Patent Nr. 5.800.992 beschrieben.
  • In einem weiteren Screeningverfahren wird die Testprobe auf die Menge eines CMP-Sequenz-Polypeptids getestet. Die Diagnose kann unter Verwendung einer Reihe von Verfahren zur Bestimmung des Fehlens oder der Gegenwart oder veränderter Mengen eines differentiell exprimierten Polypeptids in einer Testprobe erreicht werden. Die Detektion kann z. B. die Färbung von Zellen oder histologischen Abschnitten (z. B. aus einer Biopsieprobe) mit markierten Antikörpern verwenden, die in Einklang mit herkömmlichen Verfahren durchgeführt wird. Zellen können permeabilisiert werden, um zytoplasmatische Moleküle zu färben. Allgemein werden Antikörper, die spezifisch an ein differentiell exprimiertes Polypeptid der Erfindung binden, zu einer Probe hinzugefügt und für eine Zeitspanne inkubiert, die ausreicht, um eine Bindung an das Epitop zu ermöglichen, normalerweise zumindest etwa 10 Minuten. Der Antikörper kann zur direkten Detektion detektierbar markiert werden (z. B. unter Verwendung von Radioisotopen, Enzymen, fluoreszierenden Elementen chemilumineszierenden Elementen und dergleichen) oder zusammen mit einem Antikörper oder Reagens der zweiten Stufeverwendet werden, um die Bindung zu detektieren (z. B. Biotin mit meerrettichperoxidasekonjugiertem Avidin, einem Sekundärantikörper, der an eine fluoreszierende Verbindung konjugiert ist, z. B. Fluorescein, Rhodamin, Texasrot etc.). Das Fehlen oder die Gegenwart von Antikörperbindung kann durch verschiedene Verfahren bestimmt werden, unter anderem durch Durchflusszytometrie dissoziierter Zellen, Mikroskopie, Radiographie, Szintillationszählung etc. Es kann jedes geeignete Alternativverfahren zur qualitativen oder quantitativen Detektion des Ausmaßes oder der Mengen von differentiell exprimiertem Polypeptid verwendet werden, z. B. ELISA, Western-Blot, Immunpräzipitation, Radioimmuntest etc.
  • VERSUCHE
  • Die folgenden Beispiele werden dargelegt, um dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung dessen bereitzustellen, wie die betreffende Erfindung herzustellen und zu verwenden ist, und sind nicht als Einschränkung des Umfangs dessen, was als die Erfindung angesehen wird, anzusehen. Es wurden Anstrengungen unternommen, hinsichtlich der verwendeten Zahlen Genauigkeit sicherzustellen (z. B. Mengen, Temperatur, Konzentrationen etc.), es sollten jedoch manche experimentelle Fehler und Abweichungen einbezogen werden. Falls nicht anders angegeben, sind Teile als Gewichtsteile angeführt, das Molekulargewicht ist das durchschnittliche Molekulargewicht, die Temperatur ist in°C angegeben; und der Luftdruck liegt bei oder nahe dem Atmosphärendruck.
  • Es ist davon auszugehen, dass diese Erfindung nicht auf das/die beschriebene(n) Verfahren, Arbeitsvorschriften, Zelllinien, Tier-Spezies oder -Arten und Reagenzien beschränkt ist, da diese variieren können. Es ist ebenfalls davon auszugehen, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich dem Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht dafür gedacht ist, den Umfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken, der nur durch die im Anhang befindlichen Ansprüche eingeschränkt wird.
  • Wie hierin verwendet, umfassen die Singularformen „einer/eine/ein" und „der/die/das" Referenten im Plural, es sei denn, aus dem Kontext geht klar etwas anderes hervor. Daher umfasst ein Verweis auf „eine Zelle" z. B. eine Vielzahl solcher Zellen, und ein Verweis auf „das Protein" umfasst einen Verweis auf ein oder mehrere Proteine und Äquivalente davon, die dem Fachmann bekannt sind, usw. Alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe besitzen, falls nicht anders angegeben, dieselbe Bedeutung, wie sie normalerweise von einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung, dem diese Erfindung angehört, verstanden wird.
  • Beispiel 1
  • Isolation eines häufig auftretenden myeloischen Vorläufers
  • 1A zeigt das Sca-1/c-Kit-Expressionsprofil der Linien-Fraktion (Lin-) IL-7Rα-. In vitro war die Aktivität der Myeloerythroid-Koloniebildenden Einheit (CFU) ausschließlich in der c-Kit+-Fraktion zu finden, jedoch nicht in der c-Kit--Fraktion. Die Lin--IL- 7Rα--c-Kit+-Zellen enthielten Sca-1+- und Sca-1--Zellen. Die Lin--IL-7Rα--Sca-1+-c-Kit+-Population ist hochgradig für HSC1-3 angereichert, und bei einer Mehrheit der HSC-Population handelte es sich um Fc-Rezeptor γ II/III-(FcγR)lo-CD34+. Andererseits wurden die Lin--IL-7Rα--Sca-1--c-Kit+-Zellen entsprechend dem Expressionsprofil von FcγR und CD34 in drei Subpopulationen unterteilt; FcγRlo-CD34+-, FcγRlo-CD34-- und FcγRhi-CD34+-Populationen (1B). Der CSF-1-Rezeptor (Makrophagen-CSF-Rezeptor {M-CSFR}) Granulozyten-CSF-Rezeptor (G-CSFR) und die gemeinsame β-Kette (βc) (die unentbehrliche Untereinheit der Rezeptoren für IL-3, IL-5 und granulozyten/makrophagenkoloniestimulierenden Faktor {GM-CSF}) würden in größtem Ausmaß in der FcγRhi-Population exprimiert, was darauf hindeutet, dass die FcγRhi-CD34+-Zellen an die Granulozyten/Makrophagen-Linien binden (1B).
  • Die Methylzellulose-CFU-Aktivität für jede der oben genannten Populationen wird in den 2 und 3 dargestellt. In Gegenwart von Steelfaktor (SLF), flt-3-Ligand (FL), Interleukin- (IL-) 3, IL-11, GM-CSF, Thrombopoietin (Tpo) und Erythropoietin (Epo) führten > 90% einzelsortierter FcγRlo-CD34+-Zellen zu verschiedenen Typen von Myeloerythroid-Kolonien, unter anderem CFU-GEMMeg, Burst-Forming-Unit-Erythroid (BFU-E), CFU-Megakaryozyten (CFU-Meg), CFU-Granulozyten/Makrophagen (CFU-GM), CFU-Granulozyten (CFU-G) und CFU-Makrophagen (CFU-M). Auffälligerweise erzeugte die FcγRhiCD34+-Population nur CFU-M-, CFU-G- oder CFU-GM-Kolonien, die Makrophagen und/oder Granulozyten enthielten, als Antwort auf beliebige der Wachstumsfaktorkombinationen. Im Gegensatz dazu führten FcγRloCD34--Zellen ausschließlich zu CFU-Meg-, BFU-E- oder CFU-MEP-Kolonien, die nur Megakaryozyten und/oder Erythrozyten enthielten, als Antwort auf IL-3, GM-CSF, Tpo und Epo, bildeten jedoch bei Abwesenheit von Tpo und Epo keine Kolonien. Alle drei myeloischen Vorläufer-Populationen erfordern keine „frühzeitig agierenden Zytokine", wie z. B. SLF, FL und IL-11, um die Koloniebildung zu initiieren, wohingegen HSC großteils von diesen Zytokinen abhängig sind, wie zuvor beschrieben wurde.
  • Alle dieser Vorläufer zeigten in vivo eine schnelle Differenzierungsaktivität (4). Sechs Tage nach der Injektion von 10.000 FcγRloCD34+-Zellen in tödlich bestrahlte Rezipientenmäuse waren sowohl myelomonozytische Gr-1+/Mac-1+-Zellen als auch TER119+-Erythroidzellen in Milz und Knochenmark detektierbar. Im Gegensatz dazu führten 10.000 FcγRhiCD34+-Zellen vorübergehend lediglich zu Gr-1+/Mac-1+-Zellen, wohingegen die FcγRloCD34--Population nur TER119+-Zellen produzierte. Dementsprechend lag die Mehrheit der Aktivität der milzkoloniebildenden Tag-8-Einheit (CFU-S) – großteils umfassend Erythroidzellen – in der FcγRloCD34--Population (Tabelle 1). FcγRloCD34+-Zellen ergaben über vier Mal weniger Tag-8-Kolonien, während FcγRhiCD34+-Zellen keine detektierbare Aktivität aufwiesen. Manche Tag-12-CFU-S – bestehend aus multipotenten Zellen – stammten auch von FcγRloCD34--Zellen und FcγRloCD34+-Zellen. Dabei kann es sich, wie zuvor beschrieben, um die Reste von Tag-8-Kolonien handeln.
    Tabelle 1: CFU-S-Häufigkeit hämatopoetischer Vorläufer-Populationen
    LT-HSC ST-HSC CMP MEP-P G/M-P
    Tag 12 1/61* 1/14* 1/200 1/53 < 1/500
    Tag 8 < 1/100* < 1/100* 1/67 1/15 < 1/500
    * Diese Daten stammen von Morrison und Weissman und sind zu Vergleichszwecken dargestellt.
  • Um die Selbsterneuerungs- und Proliferationsfähigkeit zu evaluieren, co-injizierten die Erfinder 200 HSC (CD45.2-C57B6) mit 5.000 Zellen eines jeden myeloischen Vorläufers (CD45.1-C57B6) in tödlich bestrahlte CD45.2-C57B6-Wirte. In diesem kompetitiven Rekonstitutionstest waren die Nachkommen von entweder FcγRloCD34-- oder FcγRhiCD34+-Zellen nach zwei Wochen nicht detektierbar. Die myeloischen Nachkommen von FcγRloCD34+-Zellen waren zwei Wochen nach der Injektion detektierbar, verschwanden jedoch drei Wochen nach der Injektion. Dies legt nahe, dass diese Populationen keine oder eingeschränkte Selbsterneuerungsaktivität besitzen. Diese Resultate stehen in Einklang mit den vorhergehenden Resultaten der Erfinder, dass HSC, enthalten in Knochenmarktransplantaten, für die Mehrheit der zwei Wochen nach der Transplantation produzierten weißen Blutkörperchen, Plättchen und roten Blutkörperchen verantwortlich sind. Die Erfinder konnten keine B-Zellen- oder T-Zellen-Differenzierung weder von der FcγRloCD34-- noch der FcγRhiCD34+-Population in kompetitiven Rekonstitutions- oder intrathymischen Injektionstests detektieren. Die FcγRloD34+-Population konnte keine T-Zellen erzeugen, jedoch 1 unter 2.800 Zellen in der FcγRloCD34+-Fraktion differenzierte sich durch das zuvor beschriebene Verfahren in vitro in B-Zellen. Die B-Zellen-Ablese von CLP in diesem Test liegt bei 1 von 6 Zellen. Daher spiegelt die geringe Häufigkeit der B-Zellen-Ablese aus der FcγRloCD34+-Population wahrscheinlich eine geringe Kontaminierung eines B-Zellen-bindenden Vorläufers mit einem ähnlichen Zelloberflächen-Phänotyp wider, der nur sichtbar wird, wenn große Anzahlen von Zellen sortiert werden.
  • Um die Linien-Beziehungen unter diesen drei myeloischen Vorläufer-Populationen zu testen, züchteten die Erfinder jede Population auf stromalen S17-Schichten für eine Zeitspanne von 60 Stunden und analysierten ihre phänotypischen Veränderungen mittels Durchflusszytometrie. Die FcγRloCD34+-Zellen führten zu FcγRloCD34--Zellen und FcγRhiCD34+-Zellen (5A). Erneut sortierte FcγRloCD34--Zellen und FcγRhiCD34+-Zellen, die von FcγRloCD34+-Zellen stammten, bildeten MEP- bzw. G/M-Kolonien in Methylzellulose. Im Gegensatz dazu führten weder FcγRloCD34--Zellen noch FcγRhiCD34+-Zellen zu den anderen zwei Vorläufer-Subtypen; Nachkommen von beiden Populationen führten zu einer schnellen Hinabregulierung der c-Kit-Expression und differenzierten in reife Zelltypen. Daher befindet sich die FcγRloCD34+-CMP stromauf von sowohl FcγRloCD34-- als auch FcγRhiCD34+-Zellen, die an die MEP- bzw. G/M-Linien binden.
  • Unter verschiedenen Transkriptionsfaktoren wurde von GATA-1 gezeigt, dass es durch die Aktivierung des Epo-Rezeptor-(Epo-R-)Promotors eine entscheidende Rolle in der Bindung multipotenter Vorläufer an die Erythroid- und megakaryozytischen Linien spielte. Die Expression von GATA-1 war in der FcγRloCD34+-CMP detektierbar und war in den FcγRloCD34--MEP-Vorläufern hochgradig ausgeprägt (5B). Im Gegensatz dazu exprimierten weder FcγRhiCD34+-G/M-Vorläufer noch HSC detektierbare Mengen an GATA-1. Die Expressionsmuster des Epo-R korrelierte mit jenem von GATA-1.
  • Subklonierungsstudien unter Verwendung multipotenter koloniebildender Zellen zeigen, dass die myeloische Bindung ein asymmetrisches Vorkommnis ist und dass die Linienbindung in vitro nicht notwendigerweise einem spezifischen Muster folgt. Die Identifikation eines gemeinsamen myeloischen Vorläufers zusätzlich zu dem gemeinsamen Lymphoidvorläufer, über den zuvor berichtet wurde, zeigt, dass die Bindung an die myeloischen oder Lymphoid-Stammbäume nach der HSC-Differenzierung relativ früh auftritt. Die eingeschränkte Differenzierungskapazität, sowohl in vitro als auch in vivo, an entweder die myeloischen oder Lymphoid-Stammbäume eines jeden Vorläufers zeigt auch, dass signifikanter Cross-Talk oder Plastizität unter diesen Linien rar ist, wenn HSC sich einmal zu diesem Punkt differenzierte. Ebenso zeigt die eingeschränkte Differenzierungskapazität der CMP zu entweder den Erythroid-/megakaryozytischen oder myelomonozytischen Stammbäumen, dass diese Entwicklungsauswahl spezifisch reguliert wird und die differentielle Expression von Genen involvieren kann, welche die Transkription kontrollieren, wie z. B. GATA-1. Die Entdeckung der CMP sowie ihrer linieneingeschränkten Nachkommen sollte das Mittel zur Untersuchung der der Linien-Bestimmung zugrunde liegenden molekularen Vorkommnisse bereitstellen, testen, ob die Linien-Bindung stochastisch oder instruktiv ist, und kann das Verständnis der Erfinder über die Beeinflussung spezifischer Linien in nichtlymphoiden Leukämie-Arten verbessern.
  • Verfahren
  • Mausstämme
  • Wie beschrieben, wurden die kongenen Mausstämme C57BL/Ka-Thy1.1 (CD45.2) und C57BL/Ka-Thy1.1 (CD45.1) verwendet. C57BL/6 RAG-2-/-(CD45.2)-Mäuse wurden durch Kreuzung von C57BL/6 RAG-2-/-(CD45.1)-Mäusen mit C57BL/6 CD45.2-Mäusen erzeugt. Die C57BL/6 RAG-2-/-(CD45.2)-Mäuse wurden als Rezipienten verwendet.
  • Zellfärbung und -sortierung
  • Knochenmarkzellen wurden mit für Linien-(Lin-)Marker spezifischen biotinylierten Antikörpern (CD3: KT31.1, CD4: GK1.5, CD8: 53-6.7, B220: 6B2, Gr-1: 8C5, TER119 und CD19: 1D3, IgM: R6-60.2 (Pharmingen)) und IL-7Rα (A7R34) gefärbt. Lin+-Zellen wurden partiell mit Schaf-Anti-Ratten-IgG-konjugierten immunmagnetischen Perlen entfernt (Dynabeads M-450, Dynal A.S., Oslo, Norwegen), und die verbleibenden Zellen wurden mit Avidin-Cy5-PE (Tricolor) (Caltag, Burlingame, CA) gefärbt. Zellen wurden mit monoklonalen PE-konjugierten Anti-FcγR-(2.4G2-), FITC-konjugierten CD34-(RAM34-)(Pharmingen), Texasrot-konjugierten Anti-Sca-1-(E13-161-7-) und APC-konjugierten Anti-c-Kit-(2B8-)Antikörpern gefärbt. FITC-konjugierte, Anti-gemeine-β-Ketten-(9D3-)Antikörper und Kaninchen-Anti-M-CSFR-Antikörper wurden ebenfalls verwendet. Zellen wurden wie zuvor beschrieben sortiert oder analysiert (Kondo et al., s.o. (1997)).
  • In-vivo- und In-vitro-Tests zur Bestimmung des Differenzierungspotentials von Vorläufern.
  • Für Rekonstitutionstests wurden gereinigte Vorläufer in den retro-orbitalen venösen Sinus von tödlich bestrahlten (920 RAD), kongenen Mäusen injiziert, die sich nur durch das CD45-Allel unterschieden, und zwar zusammen mit 200 Wirtstyp-HSC. RAG-2(-/-)-Rezipienten erhielten 400 RAD. Intrathymische Injektionen wurden wie beschrieben durchgeführt (Kondo et al., s.o. (1997)). CFU-S-Tests wurden mit 100–500 doppelt sortierten Vorläufern/Maus durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Traver et al., s.o. (1998)).
  • Die Evaluierung von myeloischer Koloniebildung wurde durch einen zuvor beschriebenen Methylzellulose-Test durchgeführt (Morrison et al., s.o. (1996)). Zytokine, wie z. B. Maus-SLF (20 ng/ml), Maus-IL-3 (30 ng/ml), Maus-IL-11 (10 ng/ml), Maus-GM-CSF (10 ng/ml), Maus-Tpo (10 ng/ml) und menschliches Epo (1 U/ml), wurden von R&D Systems (Minneapolis, MN) zugekauft. Vorläufer wurden auch auf bestrahlten (3.000 rad) stromalen S17-Zellschichten in 24-Well-Platten mit RPMI-1640-Medium gezüchtet, das 10% FBS (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) und Maus-IL-7 (10 ng/ml) enthielt. Alle Kulturen wurden bei 37°C in einer befeuchteten Kammer bei 7% CO2 inkubiert.
  • Evaluierung der GATA-1- und Epo-R-Expression
  • mRNA wurde aus 10.000 Zellen aus jeder Population gereinigt und wurde, wie zuvor beschrieben, mittels RT-PCR amplifiziert. Verwendete Primersequenzen für (Seq.-ID Nr. 1) GATA-1: 5'-GGAATTCGGGCCCCTTGTGAGGCCAGAGAG-3 und (Seq.-ID Nr. 2) 5'-CGGGGTACCTCACGCTCCAGCCAGATTCGACCC-3', für EpoR: (Seq.-ID Nr. 3) 5'-ATGCCTGTAATCCCAGCACT-3' und (Seq.-ID Nr. 4) 5'-TCATGGTGGTAGCTGGTAGC-3' und für HPRT: (Seq.-ID Nr. 5) 5'-GTTCTTTGCTGACCTGCTGG-3' und (Seq.-ID Nr. 6) 5'-TGGGGCTGTACTGCTTAACC-3'. Die erwartete Länge der Produkte liegt bei 375 bp, 581 bp bzw. 400 bp. Die Proben wurden denaturiert (94°C, 30 Sekunden), einem Annealingschritt unterzogen (55°C, 2 Minuten) und 40 Zyklen lang verlängert (72°C, 3 Minuten).
  • Die oben stehend und im ganzen Text beschriebenen Publikationen werden ausschließlich für ihre Offenbarung vor dem Anmeldedatum der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Nichts hierin ist als ein Eingeständnis auszulegen, dass die Erfinder nicht berechtigt sind, solch eine Offenbarung aufgrund einer früheren Erfindung vorwegzunehmen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00310001
  • Figure 00320001

Claims (13)

  1. Im Wesentlichen reine Zusammensetzung myeloischer Säugetier-Vorläuferzellen, worin zumindest 95% der Zellen in der Zusammensetzung als c-kithi, IL-7Rα-, lin- gekennzeichnet sind.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die myeloischen Vorläuferzellen weiters als FcγRloCD34+ gekennzeichnet sind.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die myeloischen Vorläuferzellen weiters als FcγRloCD34- gekennzeichnet sind.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die myeloischen Vorläuferzellen weiters als FcγRhiCD34+ gekennzeichnet sind.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zellen gentechnisch modifiziert wurden, um einen exogenen DNA-Vektor zu umfassen.
  6. Verfahren zur Anreicherung einer Zusammensetzung myeloischer Säugetier-Vorläuferzellen, die als c-kithi, IL-7Rα-, lin- gekennzeichnet sind, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Kombinieren von Reagenzien, die c-kit-, IL-7Rα- und lin-Marker spezifisch erkennen, mit einer Probe hämatopoetischer Zellen; sowie das Selektieren auf jene Zellen, die c-kithi, IL-7Rα-, lin- sind, um eine angereicherte Population an Zellen mit Vorläuferaktivität myeloischer Abstammung bereitzustellen.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin es sich bei der Probe hämatopoetischer Zellen um Knochenmark handelt.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin es sich bei der Probe hämatopoetischer Zellen um mobilisiertes peripheres Blut handelt.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, worin es sich bei den Zellen um Maus-Zellen handelt, weiters umfassend folgende Schritte: das Kombinieren von Reagenzien, die Sca-1 spezifisch erkennen, mit der Probe hämatopoetischer Zellen; sowie das Selektieren auf jene Zellen, die Sca-1- sind.
  10. Verfahren zum Screenen auf genetische Sequenzen, die spezifisch in Zellen exprimiert werden, die an den myeloischen Stammbaum gebunden sind, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Isolieren von RNA aus einer Zellpopulation nach Anspruch 1, das Erzeugen einer Sonde aus der RNA, das Screenen einer Population an Nucleinsäuren auf die Hybridisierung an die Sonde.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, weiters umfassend das Unterteilen der Population an Zellen gemäß der Expression von CD34 und dem FcγR.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, weiters umfassend einen Vergleich der Hybridisierung, die zwischen der Subpopulation an Zellen erhalten wurde.
  13. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Population an Nucleinsäuren in einer Anordnung dargestellt ist.
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