CN111542350B - 用于制备脂肪来源干细胞的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够制备脂肪移植物或收获细胞级分的装置。该装置包括一个用于接收和处理生物物质的第一离心管，该第一离心管包括上部圆柱部分和下部圆锥部分、无菌组织入口接头、至少一个无菌处理流体入口接头、无菌抽吸接头，以及至少一个连接至第一提取管的无菌提取端口。该第一离心管还包括内部空间，该内部空间包括位于其中的筛网以及位于其中的过滤器，该筛网被构造成能够将内部空间分成两部分，该过滤器位于筛网下方，在第一离心管的下部锥形部分中。该装置还可以包括第二离心管，该第二离心管被构造成能够从第一离心管接收并进一步处理生物物质。该第二离心管具有至少一个无菌接头，其中该第二离心管经由至少一个无菌接头以可释放方式连接到第一离心管的至少一个无菌提取端口中的一个上。

Description

用于制备脂肪来源干细胞的系统和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年4月2日提交的申请号为15/942,793的美国专利申请作为优先权，该美国专利申请公布号为2018/0221550。本申请还涉及2012年7月9日提交的申请号为13/544,909的美国申请，该申请现美国专利号为9,931,445，其要求2011年7月8日提交的发明名称为“用于制备脂肪来源干细胞的试剂盒”、申请号为61/505,936的美国临时专利申请作为优先权。这些申请中的全部公开内容据此以引用方式并入本文。

背景技术

1.发明领域

本发明整体公开了用于制备和使用来源于脂肪组织的干细胞的系统，用这种套件获得的脂肪来源干细胞，使用这种脂肪来源干细胞的方法，含有这种脂肪来源干细胞的组合物。

2.讨论当前发展状况

再生医学可以被定义为以临床靶向方式利用身体的再生机制，以不属于正常愈合机制的方式或通过人为放大正常机制来利用这些再生机制。在骨髓移植中发现了此过程的一个典型示例，在骨髓移植中，从供体收获造血干细胞和祖细胞，并将其植入受体内(受体内的正常造血再生机制已经消融，或者基本上耗尽或受损)，从而替代或再生受体的造血能力。该方法已扩展为用于多种治疗或预防目的的多种来源的非造血干细胞。特别是，已经证明脂肪组织可以容易地用作适于治疗或预防用途的多能间充质干细胞的来源。

间充质干细胞(“MSC”)是一种多能干细胞，可以很容易地分化成以下谱系，包括成骨细胞、肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞和β胰岛细胞(Pittenger,et al.,Science,Vol.284,pg.143(1999)；

Haynesworth,et al.,Bone,Vol.13,pg.69(1992)；Prockop,Science,Vol.276,pg.71(1997))。MSC在文献中也被称为骨髓干细胞、骨骼干细胞和多能间充质基质细胞，是从成年组织中分离的非造血祖细胞，其体外特征在于它们在未定型状态下具有广泛的增殖能力，同时保留响应适当刺激下沿间充质起源的各谱系分化的潜力，包括软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞谱系。体外研究证明了MSC有分化成肌肉(Wakitani,et al.,Muscle Nerve,Vol.18,pg.1417(1995)),神经元样前体(Woodbury,et al.,J.Neurosci.Res.,Vol.69,pg.908(2002)；

Sanchez-Ramos,et al.,Exp.Neurol.,Vol.171,pg.109(2001)),心肌细胞(Toma,et al.,Circulation,Vol.105,pg.93(2002)；Fakuda,Artif.Organs,Vol.25,pg.187(2001))以及其他可能细胞类型的能力。MSC存在于身体的多个组织中，来源于胚胎中胚层(例如，造血细胞和结缔组织)。因此，可以从这些组织来源中的任何一个分离出多能细胞，并且可以对其进行诱导以分化成这些细胞类型中的任意一种。

在现有技术中，对于脂肪组织的研究已经很成熟了，将其作为原料的话，源头多种，取材方便。如，最直接的可能就是因美容需要的脂肪物样品中进行简单的抽吸或处理，即可获得大量多能细胞。，而这些脂肪物样品多来自于人体，但从患者或供体中来获取脂肪物也存在一定的限制，如供体的获得受限，或抽取脂肪相对于对进行了一个小型手术。因此，对于作为原料的脂肪物而言，还可通过体外实验室培养以及适宜性处理来获得脂肪物，是完全可行的。当然，从患者体内抽取是最直接、安全、方便的途径。在实际应用中，可根据实际情况选择合适的脂肪物来源便可。

已经发现，脂肪组织是干细胞特别丰富的来源。此结果可能至少部分归因于脂肪组织的主要非干细胞组分，即脂肪细胞易于除去。然而，在现有技术的已知系统和方法中，处理脂肪组织以分离多能细胞并扩增和(可选地)分化所得的干细胞群通常需要昂贵的专用设备和同样昂贵的专门工艺。而且，这些设备或工艺大多是专门用于从脂肪组织(例如，通过从人类活体供体抽脂获得)中重复提取干细胞装置的费用让富干细胞培养基的使用仅限于出于治疗目的的大型医院和研究机构。因此，其对于很多应用而言具有高成本性和低实用性的特点，故这些昂贵的设备和方法不利于推广，更不利于大规模的应用，尤其是对于一些小医师或其他专业实习者而言，应用基于脂肪来源干细胞是不太可能的，其既不可能也不经济。而且，基于干细胞的美容增强技术的发展也受到了一定的约束或限制，其主要也是受到上述所提到的本领域目前设备和工艺不利于推广的影响，故目前用于提取和培养来源于脂肪组织的干细胞的系统和方法受到阻碍。

通过上述介绍可知，我们们目前比较迫切的需要一种适于以经济、安全的方式提取或处理脂肪来源干细胞的技术和系统，无论是纯净形式还是作为富干细胞培养基的一部分，尤其需要适于在小型专业实践中使用而无需对专业设施进行资本投资的技术和系统。本申请涉及一种用于从脂肪组织中分离MSC的系统，具体地，研究了一种组织加工装置、一种用于在封闭路径中加工组织以保持无菌的多装置集成系统以及一种用于制备脂肪移植物和/或重悬细胞混合物的方法。如本文所用，“脂肪组织”是指包含多种细胞类型(包括脂肪细胞和微血管细胞)的组织。脂肪组织包括干细胞和内皮前体细胞。因此，脂肪组织是指包括储存脂肪的结缔组织的脂肪。

发明内容

本发明人已经设想并实际应用了用于制备脂肪来源干细胞的系统和各种方法，解决了上述领域中的挑战和问题。来自人体的离体脂肪组织、其他生物体的离体脂肪组织或所体外培养的脂肪组织等的细胞群可以制备脂肪移植物和/或脂肪重悬细胞混合物等，最后可用做用作治疗和/或美容应用的细胞来源。此外，纯净形式(仅干细胞)或富集形式(相对于在体内于脂肪组织中产生的干细胞而言，干细胞级分增加的细胞培养物)的脂肪来源干细胞均可用于再生医学，诸如治疗通过使用再生细胞可以改善或治愈的疾病。如本文所述，可以向患者应用制备好的种群细胞，而不应用其他脂肪细胞或结缔组织，或者可以将这些细胞与脂肪组织混合在一起以浓缩量应用。本发明涉及一种用于从脂肪组织获得脂肪来源间充质干细胞的纯化级分并将该纯化级分施用回患者或动物体内的系统。本发明提供了一种用于提取脂肪组织(脂肪物)并对其进行处理以产生加工的脂肪物(PLA)的系统，PLA包含干细胞的比例至少为0.1％，并且更典型地为大于0.5％。根据本发明，在一些实施方案中，可以获得包含约2-12％干细胞的PLA，并且高达100％来自干细胞组成的细胞群的PLA是可能的。

本发明涉及一种在临床环境中用于大量获得脂肪来源间充质干细胞的纯化或富集级分的系统，并且还涉及使用来源于脂肪组织的干细胞的组合物、方法和系统，这些干细胞与此类添加剂一起被直接植入受体内，可能有利于促进、产生或支持治疗、结构或美容目的。本发明的实施方案提供了一种用于提取和处理脂肪组织以产生有效治疗量的脂肪来源干细胞以重新导入患者体内的多组分系统。有利的方面是，该系统制备方便、组合巧妙，成本低，应用方便，对应用环境要求低，使用效果佳，其也不需要完整的手术室环境或全面的脂肪抽吸，因此可以在医院或实验室环境之外进行操作。因此，该系统、方法、所得的脂肪移植物和/或脂肪重悬细胞混合物的应用等也适用于中小型医疗诊所、门诊外科中心和多学科专业化的医生办公室。

在一个实施例中，一种称为

的系统允许小医师以及手术中心采用经济适用的方法，从任何患者的脂肪组织中安全提取MSC或基质血管级分(SVF)用于治疗或冷冻保存(建库)。SVF是可以通过该系统产生的异质细胞级分。该级分由具有MSC特性的细胞富集。如果进一步培养细胞级分，则该系统可以由进一步培养的级分产生MSC。该系统包括形成安全、无菌和封闭过程的装置，可以提取少量脂肪样品(例如，通过吸脂)作为脂肪物的封闭过程；用于现场处理和纯化MSC或SVF级分的材料；以及用以协助评估所得加工脂肪物质量的可选购工具。该系统可由实验室技术人员经适当的培训后按照简单方法步骤进行操作。

在一个实施方案中，脂肪组织处理发生在维持封闭、无菌流体/组织途径的系统中。这是通过使用无菌容器和管路套件实现的，该套件允许在封闭路径内转移组织和流体成分。还提供了预包装的一系列用于导入无菌容器中的处理试剂(例如，盐水、酶等)，以便简单的控制试剂的添加、温度和处理时间，从而简化操作员手动管理的过程。在一个优选的实施方案中，从组织抽取到处理以及将组织植入受体内的整个过程实际上都将在相同的装置中操作，甚至可以在接受基于本发明程序的患者所在房间内进行。

根据本发明的一个方面，将少量原始脂肪组织从患者体内提取到套件的无菌容器中。在套件的一个或多个无菌容器内处理原始脂肪组织，以基本上去除成熟的脂肪细胞和结缔组织，从而获得适于植入受体体内的多种异质的脂肪组织来源细胞。处理脂肪组织所需的试剂作为套件的一部分提供，并根据预定时间表导入至一个或多个无菌容器中，以产生包含所需浓度的脂肪来源干细胞的加工脂肪物。然后，可以将脂肪来源干细胞或比体内富含更高干细胞级分的改良脂肪物与其他细胞、组织、组织碎片或其他细胞生长和/或分化的刺激剂组合，植入受体内。在一个优选的实施方案中，将具有任一上述添加剂的干细胞植入人体内，其中干细胞是在单次手术程序的情况下从人体内获得的，目的是使受体获得治疗、结构或美容效果。

在本发明的一个实施方案中，一种治疗患者的方法包括以下步骤：a)提供一个一次性组织提取系统作为套件的一个组件；b)使用一次性组织提取系统从患者体内提取脂肪组织，该脂肪组织具有一定浓度的干细胞；c)在套件的一个或多个无菌容器内处理至少一部分脂肪组织，以获得比处理前的脂肪组织中干细胞浓度更高的干细胞浓度；d)从套件的无菌容器中向患者应用干细胞。

在本发明的一个优选实施方案中，一种用于提取和处理脂肪组织以产生治疗有效量的脂肪来源干细胞的系统，其包括脂肪组织提取装置和改良的离心管，该离心管包括多个脂肪抽吸入口接头、多个处理流体入口接头和多个颗粒提取管。脂肪组织提取装置用于从人体提取一定量的脂肪组织，将脂肪物无菌转移到第一改良离心管中，执行多个处理步骤以清洁和分离脂肪物，并且使用改良离心管离心获得含有增加级分的干细胞团。将干细胞团重悬于液体中并向病人施用以用于治疗或美容目的。根据另一个实施方案，该系统还包括与第一改良离心管的设计基本类似的第二改良离心管，其中第二改良离心管用于进一步处理重悬浮细胞球团，以获得更高浓度的干细胞。

根据本发明的另一个优选实施方案，提供了一种用于制备脂肪干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(a)使用脂肪组织提取装置从人体提取脂肪组织；(b)将脂肪物无菌转移至改良的离心管中，该离心管包括多个脂肪物入口接头、多个处理流体入口接头和多个颗粒提取管；(c)通过多个处理流体接头添加一种或多种流体，处理改良离心管中的脂肪物，该处理包括清洁和分离脂肪物中的一种或多种；(d)离心含有加工脂肪物的改良离心管以浓缩包含富集干细胞级分的细胞团；(e)将细胞团重悬于流体中，以获得相对于原始脂肪物的干细胞浓度含有更多干细胞的细胞混合物；(f)向人体施用重悬的细胞混合物以用于治疗或美容目的。

根据本申请的另一方面，提供了一种组织处理装置。该装置包括被构造成能够接纳和处理生物物质的第一离心管，该第一离心管具有上部圆柱部分和下部圆锥部分、无菌组织入口接头、至少一个无菌处理流体入口接头、无菌抽吸接头，以及至少一个连接至第一提取管的无菌提取端口。该第一离心管还包括内部空间，其中放置有筛网以及过滤器，该筛网被构造成能够将内部空间分成两半和/或为在其中处理的生物物质提供支撑，该过滤器位于筛网下方，在第一离心管的下部锥形部分中。该装置还包括第二离心管，该第二离心管被构造成能够接纳并进一步处理来自第一离心管的生物物质，该第二离心管具有至少一个无菌接头。该第二离心管经由至少一个无菌接头以可释放方式连接到第一离心管的至少一个无菌提取端口中的一个上。

根据另一个实施方案，公开了一种用于在封闭环境中处理组织以保持无菌的系统。该系统包括第一离心管，该第一离心管具有基本圆柱形的主体，该主体具有顶部、倒锥形顶点和内部容积。第一离心管还包括至少两个无针密闭(swabable)阀；以可释放方式固定在至少两个无针密闭阀中的一个上的提取管，该提取管在内部容积内向顶点延伸一定距离；以及设置在主体内部容积内的筛网。该系统还包括第二离心管，该第二离心管包括基本圆柱形的主体，该主体具有顶部、倒锥形顶点和内部容积。第二离心管还包括至少一个无针密闭(swabable)阀，以及以可释放方式固定在至少一个无针密闭阀上的提取管，该提取管在内部容积内向顶点延伸一定距离。第二离心管经由至少一个无针密闭阀以可释放方式连接到第一离心管的至少两个无针密闭阀中的一个上。

在又一个实施方案中，公开了一种用于在封闭途径中处理组织以保持无菌的多装置集成系统。该系统包括离心管，该离心管具有基本圆柱形的主体，该主体具有顶部、倒锥形顶点和内部容积。该系统还包括至少两个无针密闭(swabable)阀；以可释放方式固定在至少两个无针密闭阀中的一个上的提取管，该提取管在内部容积内向顶点延伸一定距离；设置在主体的内部容积内的筛网；以及位于筛网下方，在离心管的倒锥形顶点处的过滤器。该系统还包括具有至少一个无针密闭阀的容器，该无针密闭阀可以可释放方式连接至离心管的至少两个无针密闭阀之一，以便无菌转移封闭系统中包含的材料。

在又一个实施方案中，提供了一种用于制备脂肪移植物的方法。该方法包括以下步骤：

(a)将脂肪物无菌转移至离心管中，该离心管包括上部圆柱部分和下部圆锥部分、无菌组织入口接头、至少一个无菌处理流体入口接头、无菌抽吸接头和至少一个连接至第一提取管的无菌提取端口，该离心管还包括位于其中的筛网和位于其中的过滤器，该过滤器位于筛网下方，在第一离心管的下部锥形部分中；

(b)通过至少一个流体入口接头添加一种或多种流体，洗涤离心管中的脂肪物；

(c)低速离心含有脂肪物的离心管，以分离污染物和致密脂肪部分，其中致密脂肪保留在筛网的顶部，液体收集在下部锥形部分；

(d)以更高的速度离心含有洗涤过的致密脂肪的离心管，以通过离心力迫使致密脂肪通过筛网的孔，并在筛网和过滤器之间的隔室中积聚破碎的脂肪颗粒，其中过滤器表面用作积聚脂肪颗粒的底部，并且破碎的脂肪和碎屑通过过滤器向下过滤到下部锥形部分中；

(e)通过注射器，并通过将注射器连接到至少一个入口，并且使相应的管线通向过滤器和筛网之间的部分来收集积聚的脂肪移植物；以及

(f)所制备的脂肪移植物可应用于患者，如可用于治疗或美容目的。

在又一个实施方案中，公开了一种用于制备脂肪来源细胞级分的方法。该方法包括以下步骤：

(a)将脂肪物无菌转移至权利要求1所述装置的第一离心管中；

(b)通过至少一个流体入口接头添加一种或多种流体，处理第一离心管中的脂肪物，该处理包括清洁和分离脂肪物操作中的一种或多种；

(c)离心含有加工脂肪物的第一离心管以浓缩包含富干细胞级分的细胞团；

(d)将包含富干细胞级分的浓缩细胞团无菌转移至权利要求1所述装置的第二离心管中；

(e)通过至少一个流体入口接头添加一种或多种流体，洗涤第二离心管中的细胞级分；

(f)离心含有细胞级分的第二离心管以浓缩包含富干细胞级分的细胞团；

(g)将细胞团重悬于流体中，以获得相对于原始脂肪物的干细胞浓度含有更多干细胞的细胞混合物；以及

(h)所制备的细胞混合物可应用于患者，如可用于治疗或美容目的。

通过下面的详细描述，本发明以上和其他目的、特征和优点将显而易见。

附图说明

附图展示了本发明的若干实施方案，并且可根据实施方案，与说明书一起用于解释本发明的原理。本领域技术人员应该认识到，附图中展示的特定实施方案仅仅是示例性的，并非意图限制本发明的范围。

图1是根据本发明的优选实施方案，用于从脂肪组织提取干细胞的改良离心管的图。

图2是根据本发明的优选实施方案，用于从脂肪组织提取干细胞的改良离心管的图，该离心管包括新型雾化装置。

图3是根据本发明的优选实施方案，用于从脂肪组织制备间充质干细胞或SVF以用于临床用途的系统图。

图4是根据本发明的实施方案，用于从脂肪组织制备间充质干细胞或SVF以用于临床用途的高级过程的方法图。

图5是根据本发明的优选实施方案，用于从脂肪组织制备间充质干细胞或SVF以用于临床用途的详细过程的方法图。

图6是根据本发明的另一个实施方案的离心管的图。

图7是图6所示离心管的分解图。

图8是根据本发明的另一个实施方案的离心管的图。

图9是图8所示离心管的分解图。

具体实施方式

本发明人已经设想并实际应用了用于制备脂肪来源干细胞的系统和各种方法，解决了上述领域中的挑战和问题。如附图所示，现在将参考其中的一些示例实施方案，详细说明各种技术。在以下说明中，列出了许多具体细节，以便提供对本文所述或所引用的一个或多个方面和/或特征的全面理解。然而，对于本领域的技术人员显而易见的是，可以在没有部分或所有这些具体细节的情况下实践本文所述或所引用的一个或多个方面和/或特征。在其他情况下，未详细描述众所周知的处理步骤和/或结构，以免使本文所述或所引用的一个或多个方面和/或特征模糊不清。

可能在本申请中说明了一个或多个不同的发明。此外，对于在本文说明的一个或多个发明，可能说明了许多替代实施方案；要说明的是，这些仅出于说明目的提出。所说明的实施方案并非意图在任何意义上进行限制。从本发明公开可显而易见，一个或多个发明可以广泛适用于许多实施方案。一般而言，对实施方案进行足够详细的说明以使本领域技术人员能够实施一个或多个发明，要说明的是，可以利用其他实施方案，并且可以在不脱离特定发明范围的情况下，做出结构、逻辑、软件、电气和其他改变。因此，本领域技术人员将会认识到，可以对一个或多个发明实施各种修改和改变。可以参考形成本发明公开一部分的一个或多个特定实施方案或附图来说明一个或多个发明的特定特征，并且在附图中以示例的方式展示了一个或多个发明的特定实施方案。然而，要说明的是，此类特征不限于在参考对其进行描述的一个或多个具体实施方案或附图中的使用。本发明公开既不是对一个或多个发明的所有实施方案的文字说明，也不是必须在现有所有实施方案中一个或多个发明特征的列表。

本专利申请中提供的各部分的标题和本专利申请的名称仅仅是为了方便起见，不以任何方式被视为限制本发明公开。

具有若干彼此联系组件的实施方案的说明并非暗示需要所有此类组件。相反，可能说明了各种可选组件以说明一个或多个发明多种可能的实施方案，以便更充分地说明各发明的一个或多个方面。类似地，尽管处理步骤、方法步骤、算法等是按顺序说明的，但是除非特别明确指明，否则上述处理、方法和算法一般来说可以按不同的顺序操作。换句话说，本专利申请所述步骤的任何序列或顺序本身可能并不表示要求按该顺序操作。所述过程的步骤可以按任何实际顺序操作。此外，尽管被说明或暗示为非同时发生，但是一些步骤可以同时操作(例如，因为一个步骤在另一步骤之后被说明)。此外，通过其在附图中的说明来说明过程不意味着所述过程排除对其进行改动和修正，不意味着所述的过程或其任何步骤对于一个或多个发明是必需的，也不意味着所述过程是优选的。另外，各步骤通常每个实施方案说明一次，但这并不意味着这些步骤必须发生一次，或者它们只在每次进行或操作过程、方法或算法时发生一次。在某些实施方案中或某些情况下可以省略某些步骤，或者在给定实施方案中或某些情况下可以多次执行某些步骤。

当说明单个装置或物品时，显然是可以使用多个装置或物品代替单个装置或物品。相应的，在说明多个装置或物品时，显然是可以使用单个装置或物品代替多个装置或物品。

装置的功能或特征可以用一个或多个未被明确说明为具有此类功能或特征的其他装置来另外说明。因此，一个或多个发明的其他实施方案不需要包括装置本身。

为了清楚起见，本发明中所述或所引用的技术和机制有时将以单数形式描述。然而，应该注意的是，除非另外指出，否则特定实施方案包括技术的多次迭代或机制的多个实例。附图中的过程说明或方框应理解为代表代码的模块、片段或部分，其包括用于实施过程中的特定逻辑功能或步骤的一个或多个可执行指令。如本领域普通技术人员所理解的那样，替代实施方式包括在本发明实施方案的范围内，例如，可以根据所涉及的功能，不按照所示或所讨论的顺序执行功能，包括基本上同时执行或按相反的顺序执行。

如从上下文、本说明书和本领域普通技术人员的知识中显而易见，只要包括在任何此类组合中的特征不相互矛盾，那么在本文中描述的任何特征或特征的组合都包括在本发明的范围内。为了概括本发明，本文已经说明了本发明的某些方面、优点和新颖特征。当然，应当理解为，在本发明的任何特定实施方案中未必会体现所有这些方面、优点或特征。在下面的详细说明和权利要求中，本发明的其他优点和方面是显而易见的。

本文引用了许多公开文献和专利。所引用的公开文献和专利中的每一个据此均以引用的方式并入本文。本文引用的所有公开文献、专利和专利申请的全文均以引用的方式并入本文，其程度与每个单独公开文献、专利或专利申请被具体地和单独地指示为其全文以引用的方式并入本文的程度相同。

定义

如本发明所述，“脂肪组织的单位”是指离散的或可测量数量的脂肪组织。可以通过测定单位的重量和/或体积来测量一个单位的脂肪组织。基于以上确定的数据，从患者体内提取的一个单位的加工脂肪物具有细胞成分，其中至少0.1％的细胞成分为干细胞。参考相关公开文献，一个单位的脂肪组织可以指从患者体内提取的脂肪组织的总量，或者小于从患者体内提取的脂肪组织总量的量。因此，可以将一个单位的脂肪组织与另一个单位的脂肪组织组合，以形成重量或体积为各个单位之和的一个单位的脂肪组织。

如本发明所述，“部分”是指小于整体材料的量。一小部分是指小于50％的量，一大部分是指大于50％的量。因此，小于从患者体内取出的脂肪组织的总量的一个单位的脂肪组织是所取出的脂肪组织的一部分。

如本发明所述，“干细胞”是指具有分化为多种其他细胞类型潜能的多能细胞，分化成的细胞执行一种或多种特定功能并且具有自我更新的能力。本发明公开的一些干细胞可能是多能的。

如本发明所述，“加工脂肪物”(PLA)是指已经被加工以将活性细胞成分(例如，包含干细胞的成分)与成熟脂肪细胞和结缔组织分离开的脂肪组织。通常，PLA是指通过洗涤并将细胞与脂肪组织分离开而获得的细胞团。细胞团通常通过离心细胞悬浮液以使细胞聚集在离心容器底部而获得。

如本发明所述，术语“预防或治疗有效量”是指包含在药物组合物中的能够产生所需治疗效果的本发明细胞数量。本领域技术人员将会认识到，细胞数量(例如，剂量)将根据多种因素而变化，包括但不限于施用部位、疾病程度和应用方法。造血干细胞(用于再生受体血细胞形成能力的骨髓或脐带血来源干细胞)移植的经验表明，移植是细胞剂量依赖性的，具有阈效应。

因此，有可能将“越多越好”的一般原则应用在由其他变量设定的限制范围内，并且在可行的情况下，收获物将收集尽可能多的组织。根据患者的病症和反应，本发明所述的细胞剂量可以在几天、几周或几个月的时间间隔内重复，必要性由治疗医师或其他专业保健人员来确定。

术语“药学上可接受的媒介物”是指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或

欧洲药典或其他公认的药典中列出的用于动物(包括人体)的成分。术语“媒介物”是指与本发明的细胞一起应用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或载体，因此，媒介物必须与细胞相容。如果需要，本发明的药物成分还可以在必要时包含添加剂和/或辅助物质或药学上可接受的物质，诸如少量的pH缓冲剂、张力活性物质、助溶剂、防腐剂等，其中添加剂用以增强、控制或者以其他方式主导包含所述药物成分细胞的预期治疗效果。另外，为了使细胞悬液稳定，可以添加金属螯合剂。通过添加其他物质，例如氨基酸(诸如天冬氨酸、谷氨酸等)，可以改善本发明药物成分的液体介质中细胞的稳定性。一般来说，在本发明的药物成分中可以使用的药学上可接受的物质是本领域技术人员已知的，并且通常用于细胞成分的制备。合适的药物媒介物的示例描述于EW Martin的“Remington's PharmaceuticalSciences”中。用于应用本发明药物成分中包含的细胞的媒介物的说明性非限制示例包括，如无菌盐溶液(0.9％NaCl)、PBS等。

已经开发出许多用于从脂肪组织中收获和处理细胞的装置，但是这些装置可能会有一个或多个问题，从而阻碍了其广泛应用。这些问题包括使用困难以及成本。因此，需要能够快速和可靠地制备具有增加的产量、稠度和/或纯度的活性细胞群的替代方法，从而可以减少或消除细胞提取后操作的需要。理想的是，细胞群可以通过适于将其直接植入受体内的方式获得。

现在将详细参考本发明的当前优选实施方案。在附图和说明书中尽可能使用相同或相似的参考号来指代相同或相似的部件。应当注意的是，附图是简化的形式，不是精确的比例。参考本发明的公开内容，仅仅是为了方便和清楚起见，诸如顶部、底部、左边、右边、向上、向下、从……上方、在……上方、从……下方、在…下方、后面和前面这些方向性术语，为相对于附图使用。此类方向性术语不应以任何方式被解释为限制本发明的范围。

尽管本发明中的公开内容提到某些示出的实施方案，但应当理解为，这些实施方案是通过示例而非限制的方式提出的。尽管讨论了示例性的实施方案，但以下详细描述的意图将被解释为涵盖可能属于由所附权利要求书限定的本发明精神和范围内的实施方案的所有修改、替代方案和等同物。可以结合本领域中常规使用的各种细胞或组织分离技术来实施本发明，并且在本发明中所包括普遍实践的处理步骤仅为提供对本发明的理解所必需。

用于提取和处理脂肪组织的系统

本发明的各个实施方案涉及用于在临床环境中获得脂肪来源间充质干细胞或SVF级分的系统300，并且还涉及使用来源于脂肪组织的干细胞组合物、方法和系统，这些干细胞与添加剂一起被直接植入受体内，有助于促进、产生或支持治疗、结构或美容效果。在各种实施方案中，本发明提供了用于提取和处理脂肪组织以产生治疗有效量的脂肪来源干细胞以用于重新引入患者体内的系统300，其中该系统是易于操作、低成本的系统，适用于多学科专业的中小型医疗诊所。

在本发明的一个优选实施方案中，如图1所示，与本领域已知的各种附件结合使用的改良离心管100包含在系统或套件中，该系统或套件允许小医师以及手术中心采用经济适用的方法操作，从任何患者或供体或体外培养的体外组织脂肪中安全提取间充质干细胞(MSC)或SVF，以直接用于治疗或用于冷冻保存(建库)。该套件包括离心管100和各种其他组件，可用于执行安全、无菌和封闭的过程以抽吸少量脂肪组织样品，还包括用于现场处理和纯化MSC级分或SVF的组件，以及用于质量评估的组件。按照以下详细说明或者通过一定培训的简单方法步骤，实验室技术人员或具有类似资质的人员可以基本操作包括离心管100在内的组件。

离心管100保持封闭的无菌流体/组织路径，接纳脂肪组织样品，并根据需要提供作为输出的更多或更少的间充质干细胞或SVF富集样品。这是通过使用无菌容器和管路套件实现的，该套件允许在封闭路径内转移组织和流体成分。也可以以预包装的形式提供一系列处理试剂(例如，盐水、酶等)，以引入离心管100中，从而能够简单控制试剂的添加以及处理的温度和时间，从而简化操作员的过程管理。在一个优选的实施方案中，从组织提取到处理以及将组织植入受体内的整个过程都在同一设备中进行(实际上，甚至在同一房间内，例如最好在接受使用通过本发明获得的MSC治疗程序的患者房间内)。

管100包括常规设计的主体，并且包括内部容积160，内部容积一般提供从大约10mL至多达500mL的各种尺寸，并且适用于配备标准离心机以使用图1所示的常规几何形状的管(尽管根据本发明，可以使用本领域中已知的并且与本领域中可用的离心机兼容的任何合适几何形状的离心管)。

在一个实施方案中，套件或系统包括三个主要组件：(1)一套永久性的设备，这些设备在本领域中都是已知的：抽吸泵、振动器、离心机和小型培养箱；(2)多个一次性使用的一次性设备物品：抽吸针/套管、收集袋、注射器、过滤器、烧瓶和离心管100；(3)各种处理溶液/试剂。这些组件更适于彼此配合，以便于脂肪组织的提取和处理以获得MSC，同时保持无菌并简化过程。管100设置有盖150，该盖被多个开口115、120、121和122穿透，以及单独的接头110，其通常安装在管100的顶部上靠近盖150(实际上，应当理解为，本领域普通技术人员可以将各种接头(虽然全部固定在管100的上部)通过各种方式进行布置，其中一些、全部或没有接头穿过盖150，实际上，可以任选地省略盖150以利于一体化结构的管100，该管可以在使用后丢弃)。接头120被安装有无菌接头125(诸如鲁尔锁)的管129穿透，以允许经由管129引入各种试剂或其他流体，而不会破坏管100内的无菌环境。

通常，使用无菌注射器经由管129向管100添加流体。管130和131分别穿透接头121和122处的盖150，并设置有无菌接头126和127，以使细胞或其他材料在离心后保留在底部(构成管100下部的倒锥的点)处的细胞团中(在离心过程中产生具有相对较高比重物质的细胞团是本领域熟知的)。接头126和127可以是本领域已知的任何类型，如鲁尔锁，并且适合于在管130、131与能够施加吸力以从管100的底部处的细胞团中取出细胞的注射器或其他装置之间建立无菌连接。接头115被管116穿透，该管在其端部处安装有无菌接头117，并且可用于从管100的上部施加吸力，以在管100内形成真空(例如，以利于通过接头110将脂肪物快速引入到管100中)。接头110经由短管连接到接头111，该接头(像进入管100的所有其他接头一样)适合于一直保持管100内的无菌状态。接头110通常用于将脂肪物注入管100中，作为从脂肪物中提取MSC并潜在地将其纯化或浓缩成细胞团的过程的第一步，该细胞团可以经由管130和131中的任何一个抽出。在一个优选的实施方案中，提供了两个管131，131以确保即使其中一个管被堵塞，也可以提取细胞团。

图2是根据本发明的实施方案，用于从脂肪组织提取干细胞的改良离心管200的图，该离心管包括新型雾化装置。本领域普通技术人员可以发现，管200与管100非常相似，但提供了关于接头125-127的更多说明性细节。管116也以安全的方式连接到真空泵220(管116与泵220之间的无菌连接的细节未示出，但这在本领域中是熟知的)。可以设置已经无菌连接到管116的真空泵，作为用于从脂肪物分离MSC的便携式套件的组件，或者更普遍地，可以在执行从脂肪物提取MSC的过程中根据需要将其连接到管116。一般来说，本发明的目的是促进脂肪物在进入管100时快速分解成小液滴，使得可以不借助特殊设备即可有效地进行脂肪组织的分解和细胞的洗涤(而不损坏细胞)。因此，在一些实施方案中，可以设置涡轮或筛网210，其包括多个孔211，当脂肪物通过接头110进入管100时必须穿过这些孔；孔211的存在有助于分解脂肪组织团块，脂肪组织团块构成了进入的脂肪物的至少一部分。应当注意的是，可以使用由泵220提供的真空或另一种通过管116抽吸的装置，或者通过接头110直接注入脂肪物(诸如用柱塞型注射器)来将脂肪物抽吸到管100中。无论哪种方式，当迫使脂肪物通过接头110，然后穿过孔211时，脂肪物都会破碎成小液滴或小块细胞和组织碎片，它们更容易洗涤，并根据本发明其他地方说明的方法进行加工(例如，参考图4)。

图3是根据本发明的实施方案，用于从脂肪组织制备间充质干细胞或SVF以用于临床用途的系统300的图。

根据该实施方案，如上所述，提供了一种包括各种组件的套件，以用于从患者301提取脂肪组织(但根据该实施方案，非患者供体也可以使用系统300来提取脂肪组织)。如上所述，可以以本领域已知的多种方式获得脂肪组织。根据一个示例性实施方案，如图3所示，系统300包括注射器302和无菌密封袋303，用于从患者301获得脂肪组织。注射器302可以是本领域已知的任何常规类型，其适用于通过手动抽吸来抽取不同量的脂肪组织，通常从1毫升至几百毫升。根据系统300的不同套件可以提供一种或多种用于离解脂肪组织的装置，例如超声室305。如图所示，当脂肪组织仍在无菌袋303中时可以被放置于超声室305中，或者可以经由无菌管通过超声室305。系统300通常包括至少一个中等尺寸(约100毫升)的改良离心管310(如上所述图1和2说明的那样)。通过向管310的内部区域340-341施加真空350，或者通过直接由注射器注入或经由无菌管从注射器注入，可以将脂肪组织抽吸到管310中。脂肪物通常通过涡轮或筛网210进入，该涡轮机或筛网穿孔有多个孔211，如上所述，这有助于将进入的脂肪组织样品分解成更适合于试管310内有效处理的小液滴。将抽脂剂样品放入试管310内后，可以通过一个或多个无菌配件(例如图1和2中所示的配件125)从作为系统300套件的一部分提供的无菌容器中注入多种清洗剂320或试剂321(例如，有助于组织解离的试剂)。

如上所述，管310适于在离心机内简易使用(该离心机可以作为系统300套件的一部分提供，或者也可以在标准台式或其他离心机相应位置中使用系统300；离心机在本领域是熟知的，并且一般来说很容易在大范围的医疗设施中获得)，因此可以容易地使管310中的脂肪物离心，例如将干细胞与其他细胞或组织级分分离开。管310通常设置有一个或多个接头330、331，用于取出管310的圆锥形部分340的顶点处的细胞团中包含的分离干细胞或其他细胞或材料。此类接头330、331的示例在图1和2中示出(即接头126和127，它们分别从管130和131中抽吸球团状材料)。在一些实施方案中，将在管310中处理过的脂肪物(通过洗涤、离解和离心中的任何一种)直接施用于患者301；在其他实施方案中，系统300可以包括一般来说较小的第二管360，在将其从管310中取出后，可用于进一步加工脂肪物。例如，可以将部分富集的脂肪物(即具有比在最初从患者或供体301提取脂肪物时存在的干细胞级分更高的干细胞级分的加工脂肪物)注入(或通过真空350抽吸)到管360中，例如可以是10至20毫升的体积(但可以是其他体积，包括与管310的体积相同或更大的体积；所示和所述的相对尺寸仅仅是示例性的，不应被视为限制，特别是在各种治疗方案可能需要不同的特定管子尺寸时)。因此，图3中所示的系统300是示例性的，并且展示了可以连同无菌容器中用于按需使用的各种试剂和洗涤剂一起包括在套件中(该套件适合用于从患者301抽吸脂肪物的单次治疗)，在便携式连续无菌环境中进行加工(该环境包括作为套件交付的系统300的元件)，并且无需干细胞培养或分化即可向同一个或另一个患者301应用。应当理解为，在一些实施方案中，可能期望使用本领域已知的技术来分化用系统300获得的干细胞级分，例如获得从根据本发明获得的间充质干细胞或SVF分化而来的前体骨细胞或其他前体细胞类型并对其进行培养。

提取和加工脂肪组织的方法

在实施本发明公开的方法时，可以从脂肪组织获得旨在应用于患者301的细胞(诸如间充质干细胞或SVF)。脂肪组织可通过本领域普通技术人员已知的各种方法获得。例如，可通过负压吸脂术、超声吸脂术和脂肪切除术从患者体内取出脂肪组织。此外，还可包括这些手术的组合，诸如脂肪切除术和负压吸脂术的组合。由于组织或组织的某些级分会用于重新植入患者体内，因此应该以保护细胞成分的活力并最大程度减少组织被潜在感染性生物体(诸如细菌和/或病毒)污染的可能性的方式收集脂肪组织。因此，组织提取更适宜以无菌的方式进行，以最大程度减少污染。

图4是根据本发明的实施方案，用于从脂肪组织制备间充质干细胞或SVF以用于临床用途的高级过程400的方法图。

根据该实施方案，在步骤401中，提供一次性组织提取系统作为无菌套件的组件，该无菌套件旨在获得经过加工的富含干细胞的唇吸物(例如，注射器302)。然后，在步骤402中，技术人员、医师或其他专业人员从患者(或供体)体内提取脂肪组织(或体外培养的脂肪组织)，该脂肪组织具有初始浓度的干细胞(特别是MSC)。对于负压吸脂手术，可通过将套管插入患者301体内存在的脂肪组织沉积物中或附近来收集脂肪组织，然后将脂肪组织抽吸到抽吸装置中。在一个实施方案中，可将小套管连接至注射器302，并且可以使用手动力抽吸脂肪组织。注射器302或其他类似装置可以被用于收获相对较小至中等量的脂肪组织(例如从0.1到几百毫升的脂肪组织)。

负压吸脂手术可以用来从患者301体内取出脂肪组织，因为它提供了一种收集组织的微创方法，该方法损伤干细胞的可能性相对最小。此外，吸脂手术在本领域的广泛使用已经推动开发了成熟且安全的从供体或患者体内取出大量脂肪组织的技术。在一个优选的实施方案中，该系统包括一次性使用后可弃抽吸系统，其可以将脂肪组织提取到无菌密封袋中以进行进一步加工。该系统更适宜采用相对较小的装置，诸如小型注射器302，其相应的优点是，脂肪抽吸可以仅在局部(或者甚至没有)麻醉的情况下进行，而非全身麻醉。

从患者体内取出的脂肪组织可以被收集到无菌容器(诸如无菌密封容器303)中以进行进一步加工。如本发明所述，在一个实施方案中，设计了一种装置专用于收集组织以制造加工脂肪组织细胞群，该细胞群包括干细胞和/或内皮前体细胞。在一个优选的实施方案中，该装置是一次性使用后可弃抽吸系统，其将来自患者的脂肪组织提取到无菌密封袋303中。在替代实施方案中，该装置可以是执行提取手术的医师一般用来收集组织的任何常用装置。

因为通常仅需要少量的脂肪组织，所以本发明的用途并非局限于具有大量脂肪组织的个体。要收集的组织的量将取决于许多变量，包括但不限于供体体重指数、适宜收获脂肪组织部位的可用性、伴行和既有的药物和病症(诸如抗凝治疗)，以及收集脂肪组织的临床目的。此外，存在于脂肪物中的干细胞浓度因个体不同而有很大的差别，因此，当需要特定量的干细胞时，可能需要更多或更少体积的脂肪组织以获得所需的特定量。例如，从瘦的个体中提取的组织中的干细胞的浓度通常将会大于从肥胖的供体中提取的干细胞的浓度(这反映了肥胖个体的脂肪组织中脂肪含量增加的典型稀释效应)。

获得人体人体或供体脂肪组织的优选方法是通过本领域熟知的切除或吸脂手术。无论获得脂肪组织的方法是什么，本发明的多能细胞都存在于最初切除或提取的脂肪组织中。然后可以加工脂肪组织以利于干细胞的分离/浓缩。例如，多能细胞可以通过用生理相容性溶液诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤收集到的脂肪组织来获得。通常，洗涤步骤包括用PBS或乳酸林格氏液冲洗脂肪组织样品、搅拌或离心样品，并使样品中的组织与流体分离开。除洗涤之外，还可离解脂肪组织。离解可通过酶降解(例如，胶原酶、胰蛋白酶处理)发生。可以使用其他离解方法，诸如机械搅拌、声能或超声能或热能方法作为这种酶处理的替代或结合。然后可以将细胞离心，并且可以将所得的细胞团(包含多能细胞)重悬于适当的溶液(例如，PBS)中之后进行进一步加工。

在步骤403中，对步骤402中获得的脂肪组织的一部分进行加工(例如如上所述)以获得更高浓度的干细胞，并且在步骤404中，将加工的干细胞从无菌容器中应用于患者301，该无菌容器可设置在系统300的套件中，或者可以在医疗机构中获得。可以通过以下方法将重悬细胞团中的多能细胞与重悬细胞团中的其他细胞分离开，包括但不限于细胞分选、大小分级、粒度、密度、分子、形态和免疫组织学方法(例如，通过使用磁珠、荧光激活细胞分选/FACS、磁激活细胞分选/MACS或亲和色谱进行淘选)。在一些基于免疫学的细胞分离方法中，可以通过使用与细胞表面上的表位结合的抗体或其他特异性结合蛋白，通过阳性筛选来获得多能细胞。在此类方法中，如本领域技术人员已知的，可以通过用合适的缓冲液进行一次或多次洗涤，来从抗体粘附物中回收细胞。或者，可以通过阴性筛选分离多能细胞。根据本发明的各种实施方案，干细胞收集套件可包括无菌容器和/或试剂，以利于脂肪抽吸样品中干细胞的分离或浓缩。对多能细胞的存在更适宜在对其再引入之前使用例如本领域已知的特定细胞表面标记和/或计数技术来进行评估。

使用本发明的系统300获得的多能细胞通常将被引入(或再引入)到患者体内而无需扩增或分化。然而，在一些实施方案中，多能细胞可以在体外扩增和/或分化。即，分离之后，可以维持多能细胞活性并使其在培养基中增殖。使用本领域已知的技术，可以诱导多能细胞分化(或表型改变)成所需的细胞类型。根据所用细胞的需要修改或调整培养基和/或培养基补充剂的浓度是本领域技术人员技能范围之内的。在另一个实施方案中，本发明的多能细胞可在确定组成的培养基中扩增，其中用血清白蛋白、血清转铁蛋白、硒和重组蛋白的组合代替血清，如本领域已知，重组蛋白包括但不限于：胰岛素、血小板源生长因子(PDGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。本发明的多能细胞群的维持条件还可以包含一种或多种细胞因子，其允许细胞保持未分化的形式。

如果需要分化多能细胞，可以将一种或多种其他物质添加到培养物中以诱导所需的特定表型改变。此类物质可包含一种或多种细胞内信号通路的激活剂(例如，促分裂原活化的蛋白激酶和SMAD)、转录因子的激活剂(例如，sox9、L-sox5和L-sox6)、产生细胞外基质蛋白(例如，胶原蛋白II、聚集蛋白聚糖和软骨寡聚基质蛋白)并与其相互作用的激活剂、生长因子、细胞因子、趋化因子、激素和环境因子(例如，氧张力)。

图5是根据本发明的优选实施方案，用于从脂肪组织制备间充质干细胞或SVF以用于临床用途的详细过程500的方法图。根据该实施方案，在步骤501中，从供体或患者体内301提取脂肪组织。在步骤502中，将脂肪物通过真空350注入或抽吸到改良离心管310中。或者，在步骤503中，可以使用本领域已知的洗涤剂诸如PBS来洗涤提取的脂肪物。在步骤504中，可选择将脂肪物离解以分解脂肪组织和细胞团块，以利于随后的加工。在步骤505中，可以离心细胞或脂肪物以分离具有不同比重的细胞和组织级分。例如，在适当制备的脂肪物中，MSC可以在管310的锥形容积340的顶点处形成细胞团，并因此在相当大的程度上与较轻的细胞或组织碎片分离。在许多情况下，作为步骤505的结果产生的细胞团可能具有稍微富集的干细胞浓度(相对于在步骤501中从供体或患者体内提取的脂肪物中存在的干细胞浓度)，并且可期望进一步的富集。在步骤506中，可以将富含干细胞的细胞团重悬于适当的溶液中进行进一步加工(包括可能重复步骤502至505)。在步骤507中，可选择性使用本领域已知的技术将干细胞与其他细胞级分进一步分离。可以通过以下方法将重悬细胞团中的多能细胞与重悬细胞团中的其他细胞分离开，包括但不限于细胞分选、大小分级、粒度、密度、分子、形态和免疫组织学方法(例如，通过使用磁珠、荧光激活细胞分选/FACS、磁激活细胞分选/MACS或亲和色谱进行淘选)。在一些基于免疫学的细胞分离方法中，可以使用与细胞表面上的表位结合的抗体或其他特异性结合蛋白，通过阳性筛选来获得多能细胞。在此类方法中，如本领域技术人员已知的，可以通过用合适的缓冲液进行一次或多次洗涤，来从抗体粘附物中回收细胞。或者，可以通过阴性筛选分离多能细胞。在步骤508中，可以使用本领域已知的各种方式中的任何一种来确定加工脂肪物样品中干细胞的浓度。对多能细胞的存在更适宜在对其再引入之前使用例如本领域已知的特定细胞表面标记和/或计数技术来进行评估。在步骤509中，可以至少部分地基于在步骤508中确定的浓度来确定是否需要进一步加工脂肪物以进一步浓缩(即，使干细胞的浓度更高)，如果需要，则可以通过重复步骤502至508中的一个或多个来进行这种进一步的加工。在步骤510中，可以选择性使用本领域明确的技术，培养干细胞以获得更大量的干细胞。

类似地，在步骤511(其可以在步骤510之前或之后，或者实际上与步骤510同时执行)中，可以使用本领域已知的技术将多能干细胞分化成一种或多种类型的前体细胞。最后，在步骤512中，可以将如上文参考步骤501至511所述提取和加工的干细胞或前体细胞施用于一个或多个患者301，或者建库以供稍后用于治疗、美容或其他应用。

图6和7展示出离心管600的另一个实施方案，该离心管可用作如上所述的可注射脂肪移植物制备工具或用作细胞级分收集工具。离心管600包括具有内部容积604的主体602。主体602包括大致圆柱形的部分601和大致圆锥形的部分603。离心管600还包括盖606，该盖通过紧固装置609由盖环608固定到管上。尽管在图6中展示出螺纹作为紧固装置，但应当理解为，可以使用任何合适的紧固装置来将盖环固定至管600。

盖606包括多个开口607(见图7)。每个开口可包括接头，该接头可以是与其连接的无针密闭阀610。无针密闭阀610类似于上述接头125-127，并且允许从主体602无菌提取样品。例如，无针密闭阀610可包括至少一个无菌组织入口接头、至少一个无菌加工流体入口接头、至少一个无菌抽吸接头和至少一个无菌提取端口。阀610还允许将试剂提取并引入到主体602中或者从主体中提取和引入试剂。在其他实施方案中，可能存在更多或更少的无针密闭阀610。

离心管600还包括多个管612，类似于如上所述的管130、131，并提供用于将样品从主体602中取出的通道。

离心管600还包括位于内部容积内的混合环614，在离心之前促进脂肪的均匀化，并且还在酶消化期间捕集结缔组织的细丝。混合环防止这些残留物堵塞筛网616和过滤器618(如下所述)。

筛网616位于混合环614的下方。在一个实施方案中，筛网616被构造成能够将主体602的内部容积604分成两部分(例如，基本上为两半)，并且能够为引入容器600中的粘性组织提供支撑。在替代实施方案中，筛网616被构造成能够对引入到容器600中的粘性组织提供支撑并且能够将主体602的内部容积604按比例划分而不是分成两等分(例如，在筛网上方是内部容积604的60％和在筛网下方是内部容积604的40％；在筛网上方是内部容积604的70％和在筛网下方是内部容积604的30％；在筛网上方是内部容积604的80％和在筛网下方是内部容积604的20％；在筛网上方是内部容积604的40％和在筛网下方是内部容积604的60％；在筛网上方是内部容积604的30％和在筛网下方是内部容积604的70％；在筛网上方是内部容积604的20％和在筛网下方是内部容积604的80％)。在一些实施方案中，筛网616具有多个尺寸为约1mm的孔617，从而允许将液体冲洗掉，而致密级分(例如，脂肪移植物)保留在顶部。筛网616还用于将组织分解成小于1mm的小颗粒，诸如当在离心过程中施加离心力时。

因此，在一种实施方式中，将多个孔617的尺寸设定为具有约1mm的直径。在特定的实施方式中，孔617的尺寸被设定为具有不大于1.2mm的直径(例如，在1mm至1.2mm的范围内)。另外，孔的尺寸被设定为具有小于1mm的直径(例如，0.9mm至1mm；0.8mm至1mm；0.7mm至1mm；0.6mm至1mm；0.5mm至1mm；0.5mm至0.6mm；0.6mm至0.7mm；0.7mm至0.8mm；0.8mm至0.9mm)。在另一种实施方式中，孔617的尺寸被设定为具有小于500微米的直径。特别地，孔617的尺寸被设定为350微米至450微米。

另外，可以根据应用来配置孔的分布和/或密度。在一种实施方式中，孔均匀分布在筛网616的表面上。此外，在一种实施方式中，超过筛网616表面积的50％为孔617。因此，在该实施方式中，筛网616的表面积的一半以上是孔。在第一个特定实施方式中，筛网616具有大于或等于其表面积60％的孔617(例如，表面积的60％至70％为孔617)。在第二个特定实施方式中，筛网616具有大于或等于其表面积70％的孔617(例如，筛网616表面积的70％至80％为孔617的表面积)。在第三个特定实施方式中，筛网616具有大于或等于其表面积80％的孔617(例如，筛网616表面积的80％至90％为孔617的表面积)。在第四个特定实施方式中，筛网616具有大于或等于其表面积90％的孔617(例如，筛网616表面积的90％至95％为孔617的表面积)。

如上所述，筛网616可以被构造成能够：为组织的液体/非液体级分提供支撑；并且当施加力(诸如离心力)时，制备具有某些特性的脂肪移植物。例如，对于具有一定孔径的孔617和表面积的筛网，在离心时，该筛网可制备能注射并且足够固结以便局部应用的脂肪移植物。特别地，所制备的脂肪移植物具有一定的粘度，诸如当前应用所选的一定厘泊(cP)或一定的帕斯卡秒(Pa.s)。另外，脂肪移植物可通过粘弹性来表征，粘弹性包括粘度(例如，流体特性和对流动阻力的度量)和弹性(固体材料特性)。因此，孔617的孔径和筛网616表面积上孔617的总面积百分占比中的一个或两个都可能影响通过离心制备的材料的特性。作为一个示例，减小孔617的尺寸(例如，使得孔617具有介于350与450微米之间的直径)并且增大筛网616上孔的总表面积(例如，使得孔617的表面积为80％到90％)，可通过离心产生液化程度更高的脂肪移植物，该脂肪移植物足够粘稠，并且其干细胞仍然得以保留，这样液化的脂肪移植物可以作为生物墨水进行打印。

因此，由于筛网616具有的各种特性，通过离心产生的后续组织可用于不同情况。作为一个示例，筛网616的孔617的孔径大约为1mm(如1.2mm)，离心可以引起组织破碎裂成小于1.2mm的尺寸。这种破碎组织，如筛网616的孔617孔径那样大约1mm，可以将干细胞保存在其中，因此破碎组织可应用于临床。例如，对于这种尺寸的组织，破碎的组织可用于多种情况，诸如通过特定尺寸的针头注射和/或用于局部应用进行伤口愈合。

在一种应用中，可以用3D生物打印机将经由离心产生的脂肪移植物进行3D生物打印。3D生物打印利用专用材料将经由离心产生的脂肪移植物用于创建三维组织和器官。这些专用材料可以被称为生物墨水。在特定实施方式中，生物墨水可以是基于水凝胶的，能够在打印后保持细胞。在一种实施方式中，生物打印包括通过与自动化计算机辅助的三维原型设备(例如，生物打印机)兼容的方法，对细胞利用三维精确沉积。本发明设想了各种3D生物打印程序。一种示例生物打印程序包括微挤出，其利用施加的力通过打印头将生物墨水挤出。

特别地，孔617的孔径在350微米至450微米的范围内可制备微粒化脂肪，其可以与3D生物打印兼容使用，诸如与3D打印机的喷头直径(其可以大约为450微米或小于450微米)兼容使用，以与水凝胶一起3D打印出3D组织结构。这种脂肪移植物含有丰富的内皮祖细胞的级分，可以支持并维持缺血组织、器官和伤口中的新血管形成。因此，具有一定孔径(例如，350微米至450微米)的孔617的离心管600可产生可用于微挤出的材料。

就这一点而言，可根据应用调节孔617的尺寸、孔617的分布或孔617的密度(例如，筛网616表面上孔617的总表面积)中的任何一个、任何组合或全部。特别地，可以调节孔的尺寸、孔的分布或孔的密度中的任何一个、任何组合或全部，以制备具有不同物理特性(例如，包括不同粘度和/或流动性)的不同类型的脂肪移植物。

离心管600还包括位于内部容积604下部圆锥部分中、在筛网616下方的过滤器618。过滤器618是组织物质的收集平台，这些组织物质冲破筛网616。过滤器618还可包括从其延伸的管619，这些管被构造成连接至主体602内的管612。如图6和7所示，有两个管619。或者，离心管600仅包括单个管619。

在一些实施方案中，过滤器618包括约100微米的孔。因此，离心时，组织被挤压通过筛网并收集于过滤器表面的顶部，而液体级分向下移动到管600的底部。因此，该“微粒化”组织(通常是脂肪)可以通过602中间部分、介于筛网616与过滤器618之间的隔室进行收集。将正确的管线连接至顶盖入口。这样，该装置便用作可注射脂肪移植物的制备工具。

如果将消化酶应用于脂肪组织，则基质细胞级分将被分离开。尺寸在100微米以下的细胞可以离心后通过过滤器618收集到圆锥形部分603的底部处。因此，过滤器618允许从已消化的组织中分离和纯化特定细胞级分。

然后，可以进一步洗涤通过离心管600收集的脂肪移植物和细胞级分，并在第二个较小的离心管700中进行浓缩，如图8-9所示。在一些实施方案中，离心管700可以类似于上文所述的离心管360。离心管700可包括例如具有约50mL内部容积的主体702。管700还可以包括具有多个开口706的盖704，其可以是如上文所述的无针密闭阀或接头。离心管700还包括一个或多个管708，其类似于上文所述的管130、131、612，并提供用于将样品从主体702中取出的通道。

在一个实施方案中，第二管700可以通过由泵或注射器施加负压而持续地连接至管600。或者，可以将第一管600收集的材料转移至第二管700，方法是直接从第一管600收集到注射器中，然后将其释放到第二管700中，在第二管中洗涤材料并通过离心进行浓缩。最终产品通过安装在第二离心管700顶部相应的入口收集，这类似于管600中的入口。在一些实施方案中，第二离心管700不用于脂肪移植物制备。

在一些实施方案中，公开了一种用于制备脂肪移植物的方法。该方法包括将脂肪物无菌转移至第一离心管600。接下来，通过至少一个流体入口接头或无针密闭阀610添加一种或多种流体，在第一离心管600中洗涤脂肪物。然后，将包含脂肪物的第一离心管600低速离心以分离污染物和致密脂肪级分。致密脂肪保留在筛网616的顶部，而液体收集在下部圆锥部分603中。然后，将含有洗涤过的致密脂肪的第一离心管600以更高的速度离心，通过离心力使致密脂肪通过筛网616的孔，并且在筛网616与过滤器618之间的隔室中积聚破碎脂肪颗粒(脂肪移植物)。因此，在筛网616具有约1mm孔的一种实施方式中，首先低速离心第一离心管600，然后以更高的速度(例如，400g)离心。过滤器表面用作底部以积聚脂肪颗粒，破碎的脂肪(油)和碎屑通过过滤器618向下过滤到下部圆锥部分603。然后，可以通过将注射器附接到入口或无针密闭阀610中的至少一个，并使相应的管线通向过滤器618与筛网616之间的中间隔室，通过注射器收集积聚的脂肪移植物。而所得到的脂肪移植物便可应用于患者以用于治疗或美容目的等。

此外，可以对具有不同孔径筛网616的第一离心管600进行离心。作为一个示例，在筛网616的孔径大约为1mm的情况下，可以首先以较低的速度旋转第一离心管600，然后以较高的速度(例如，400g)旋转。或者，在筛网616的孔径大约为1mm或更小(例如，350微米至450微米)的情况下，可以首先以较低的速度旋转第一离心管600，然后以小于400g(例如，200g)的较高速度旋转。可以根据所需的流变性(例如，流动性)来选择较高(或第二)速度。特别地，更高的速度(如400g)，可以提供更高密度和更高干重的最终移植物。相反，较低的速度(如200g)，可以提供更低密度和更低干重的最终移植物。这样，取决于生物墨水(例如，载体)的应用和交联参数，系统可选择筛网616的特性(例如，孔的孔径调节加工参数)以获得所需的流变性，以便形成适于各种应用的具有可打印特性的脂肪(例如，可以在包括多个离散的较高(或第二)速度设置的机器上进行离心，在其中为相应的脂肪移植物所需流变性选择较高的速度)。

因此，图6和7的系统具有双重功能，既允许脂肪移植物制备，也允许细胞级分收获。类似于上文公开的系统，该流程以完全封闭和无菌的方式进行，同时对用户透明且灵活。在一些实施方案中，图6和7的系统可与图8-9所示的管700一起使用。

因此，在一种实施方式中，如图6和7所示的离心管600，离心管被构造成能够制备脂肪移植物和/或制备细胞级分提取物。特别地，离心管被构造成用于加工脂肪移植物制剂以及用于加工细胞级分收获物，从而实现如本发明所述的更大的灵活性。就这一点而言，离心管提供了制备富含细胞的脂肪移植物的能力。具体地，可以通过将提取出的细胞级分返回/混合到脂肪移植物(例如，先前通过离心管制备的脂肪移植物)中来制备富含细胞的脂肪移植物。实际上，这可通过将原始脂肪物分成至少两个部分来完成，第一部分用于制备脂肪移植物，第二部分用于酶消化以便制备细胞级分提取物。

在一种实施方式中，可使用同一离心管制备脂肪移植物，并将其作为细胞级分提取流程的至少一部分，以制备富含细胞的脂肪移植物。因此，在一种具体实施方式中，可以按顺序使用相同的离心管，诸如通过按顺序应用脂肪移植方案和细胞提取方案来执行制备脂肪移植物的步骤和制备细胞级分提取物的步骤中至少一个(例如，应用脂肪移植方案在离心管中制备脂肪移植物，从离心管中取出制备的脂肪移植物，然后使用相同的离心管应用细胞提取方案以制备细胞级分提取物，然后将提取出的细胞级分返回/混合到脂肪移植物中)。如上所述，在一种实施方式中，可使用两个离心管制备细胞级分提取物，包括：首先在第一离心管中加工生物物质；在第一离心管中加工之后，将加工的生物物质从第一离心管中取出，然后插入第二离心管中进行进一步加工。就这一点而言，在患者细胞级分提取流程中使用的离心管中的至少一根同样可用于为同一患者制备脂肪移植物。

在替代的实施方式中，可以使用不同的离心管来制备脂肪移植物(例如，使用图6和7中所展示类型的第一离心管制备的脂肪移植物)并制备细胞级分提取物(例如，在图6和7说明的那些)。之后，可以将细胞级分提取物混合到脂肪移植物中。这样，可以使用离心管(无论使用如图6和7中公开的常用离心管(例如，执行脂肪移植方案和细胞级分提取方案的步骤所共有的)还是使用如图6和7中公开的相同类型的多个离心管)将细胞混合到脂肪移植物中，从而为脂肪移植物的再生特性提供额外的实施。

如上所述，一个应用包括3D打印，这可能涉及脂肪和细胞的顺序打印。例如，3D打印可包括多层制造，以实现植入物的目标几何形状，并且在由生物墨水和脂肪组成的整体多孔结构中具有所需浓度的细胞。实际上，3D打印机可包括多个喷头，诸如第一喷头和第二喷头。例如，可以通过第一喷头输送具有所需流变特性的脂肪移植物与另一种材料(例如，用作载体并提供3D打印结构能力的聚合物材料)的组合。3D打印机可将第一喷头与第二喷头一起操作，其中第二喷头输送封装在载体(诸如可打印的聚合物载体)中的提取出的细胞级分。例如，3D打印机可将第二喷头与第一喷头并联操作。或者，3D打印机可将第二喷头与第一喷头串联操作。在另一个实施方式中，3D打印机可将第二喷头与第一喷头至少部分地串联和至少部分地并联操作。示例载体包括但不限于聚合物，包括胶原蛋白、明胶、藻酸盐和透明质酸(HA)，以及合成聚合物，诸如PVA和聚乙二醇(PEG)，且通过UV或化学方式交联构造。

作为一个示例，3D打印机的任务是打印由脂肪移植物组成的3D形状(使用生物墨水实现结构刚度)以及3D形状内的一个或多个结构(诸如所打印脂肪内部的一个或多个血管)。3D打印机可以特定模式打印细胞和脂肪，从而在3D打印结构中创建细胞更加集中的位置(例如，在血管示例中，3D打印结构中血管的位置)。

同样，图6和7中展示的离心管600特别适合与3D打印结合使用，因为离心管600(使用单个离心管600或多个离心管600)可产生脂肪移植物和细胞级分提取物，当其分别与生物墨水和载体组合时，可以有效成本的方式与3D打印机的喷头配合使用。

重新引入脂肪来源干细胞的方式

根据本发明的系统300的套件可用于生产药物组合物，该药物组合物包含发明所述预防或治疗有效量的间充质干细胞或SVF，最好是完全纯化的形式，同时包含适当量的合适载体，以便提供适合于向患者安全有效施用形式的干细胞。

与采用脂肪组织或来源于脂肪组织的干细胞的其他治疗相比，根据本发明的各个实施方案接受治疗的患者可能会接收不同浓度的干细胞。因此，可以将从患者身上取出的脂肪组织进行加工，以改变向患者施用的干细胞浓度。在本发明的一个优选实施方案中，患者接收的干细胞浓度高于通常在脂肪组织移植和其他类似的基于干细胞的疗法中存在的干细胞浓度。浓缩干细胞可以包含基本上不含成熟脂肪细胞和结缔组织的脂肪来源干细胞和/或内皮前体细胞的组合物的形式施用，或者，作为另一个示例，浓缩干细胞可以包含一个单位的脂肪组织(其中干细胞数量增加)的组合物的形式施用。

本发明的药物组分可根据具体选择的施用形式进行配制。例如，可以将药物组分制成液体剂型(例如作为混悬剂)注入需要治疗的受试者体内。说明性(非限制性)示例包括用无菌悬浮液配制本发明的药物组分和药学上可接受的载体(诸如盐溶液、磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)或任何其他合适的药学上可接受的载体)，以优选地通过静脉内、腹膜内、皮下等施用于受试者(例如，人体)，但其他施用途径也是可以的。

根据本发明，可以通过常规方式将药物组分施用至有需要的受试者。在一个特定实施方案中，可通过使用诸如注射器、导管、套管针、套管等装置，通过静脉内施用将药物组分施用至有需要的受试者。在任何情况下，可以使用本领域普通技术人员已知的任何适当的设备、器具和装置来施用本发明的药物组分。在优选的实施方案中，用于施用药物组分的装置作为上述套件的一部分提供，或适于与上述套件一起使用，以利于将药物组分转移至受试者而不产生污染。

在本发明中，可用脂肪物，即离体的脂肪组织(即取自与人体、供体的脂肪组织/脂肪抽吸物)或体外培养的脂肪来制备脂肪移植物或重悬细胞混合物等，制备完成便可将其进行应用，如可将其应用于患者来达到治疗患者或美容的目的。

为了说明和描述的目的，已经提供了本发明的优选实施方案的上述说明。这些实施方案并非意图为详尽的或将本发明限制为所公开的精确形式。本发明选择和说明了许多实施方案，以便最好地解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够理解本发明的各种实施方案，以及适合于所设想的特定用途的各种修改。本发明的范围旨在由权利要求书及其等同物限定。

技术人员将意识到上述各种实施方案的可能修改范围。因此，本发明由权利要求书及其等同物限定。

Claims (35)

1.一种组织加工装置，所述组织加工装置包括：

第一离心管，所述第一离心管被构造成能够接纳和加工生物物质，所述第一离心管包括上部圆柱部分和下部圆锥部分、无菌组织入口接头、至少一个无菌加工流体入口接头、无菌抽吸接头，以及至少一个连接至第一提取管的无菌提取端口；

其中，所述第一离心管还包括内部空间，所述内部空间包括位于其中的筛网以及位于其中的过滤器，所述筛网被构造成能够为生物物质提供支撑，所述过滤器位于所述筛网下方，在所述第一离心管的下部锥形部分中；以及

第二离心管，所述第二离心管被构造成能够接纳并进一步加工来自所述第一离心管的生物物质，所述第二离心管具有至少一个无菌接头，其中所述第二离心管经由所述至少一个无菌接头以可释放方式连接到所述第一离心管的所述至少一个无菌提取端口中的一个上。

2.根据权利要求1所述的组织加工装置，其中所述筛网将所述内部空间分成两半；并且

其中所述第一离心管具有顶部和顶点，其中所述无菌组织入口接头、所述至少一个无菌加工流体入口接头、所述无菌抽吸接头和所述至少一个无菌提取端口位于所述第一离心管的所述顶部附近。

3.根据权利要求2所述的组织加工装置，其中所述第一提取管在所述第一离心管内从所述提取端口向所述顶点延伸一定距离。

4.根据权利要求2所述的组织加工装置，其中所述至少一个无菌加工流体入口接头、所述无菌抽吸接头和所述至少一个无菌提取端口设置在固定于所述第一离心管顶部的盖内。

5.根据权利要求1所述的组织加工装置，还包括固定在所述无菌抽吸接头上的真空装置。

6.根据权利要求1所述的组织加工装置，还包括位于所述第一离心管上部圆柱部内的混合环。

7.根据权利要求1所述的组织加工装置，其中所述过滤器包括约100微米的孔。

8.根据权利要求1所述的组织加工装置，其中所述装置被构造用于加工脂肪移植物制剂和用于加工细胞级分收获物。

9.根据权利要求1所述的组织加工装置，其中所述筛网包括直径约1mm的孔。

10.根据权利要求1所述的组织加工装置，其中所述筛网包括直径小于1.2mm的孔。

11.根据权利要求1所述的组织加工装置，其中所述筛网包括直径在350微米至450微米范围内的孔。

12.根据权利要求11所述的组织加工装置，其中所述孔的表面积为所述筛网总表面积的至少60％。

13.根据权利要求11所述的组织加工装置，其中所述孔的表面积为所述筛网总表面积的至少80％。

14.一种用于在封闭路径中加工组织以保持无菌的多装置集成系统，所述多装置集成系统包括：

离心管，所述离心管具有基本上圆柱形的主体，所述主体具有顶部、倒锥形顶点和内部容积，并且还包括：

至少两个无针密闭阀；

以可释放方式固定在所述至少两个无针密闭阀中的每一个上的提取管，所述提取管在所述内部容积内向所述顶点延伸一定距离；

设置在所述主体内部空间内的筛网；以及

位于所述筛网下方，在所述离心管的倒锥形顶点处的过滤器；以及

具有至少一个无针密闭阀的容器，

其中所述无针密闭阀可以可释放方式连接至所述离心管的所述至少两个无针密闭阀中的一个上，以便无菌转移封闭系统中容纳的材料。

15.根据权利要求14所述的系统，还包括真空装置，所述真空装置连接到所述至少两个无针密闭阀中的一个上，以将组织抽吸到所述内部容积中。

16.根据权利要求14所述的系统，其中所述筛网被构造成能够将所述内部容积分成两半。

17.一种用于制备脂肪移植物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将脂肪物无菌转移至离心管中，所述离心管包括上部圆柱部分和下部圆锥部分、无菌组织入口接头、至少一个无菌加工流体入口接头、无菌抽吸接头和至少一个连接至第一提取管的无菌提取端口，所述离心管还包括位于其中的筛网和位于其中的过滤器，所述过滤器位于筛网下方、所述离心管的下部锥形部分中；

(b)通过至少一个无菌加工流体入口接头添加一种或多种流体，洗涤离心管中的所述脂肪物；

(c)低速离心含有所述脂肪物的所述离心管，以分离污染物和致密脂肪部分，其中所述致密脂肪保留在所述筛网的顶部，液体收集在所述下部锥形部分；

(d)以更高的速度离心含有洗涤过的致密脂肪的所述离心管，以通过离心力迫使所述致密脂肪通过所述筛网的孔，并在所述筛网和所述过滤器之间的隔室中积聚破碎的脂肪颗粒，其中所述过滤器的表面用作积聚脂肪颗粒的底部，并且其中破碎的脂肪和碎屑通过所述过滤器向下过滤到所述下部锥形部分中；

(e)使用注射器收集积聚的脂肪移植物，并将注射器连接到至少一个入口，使相应的管线通向过滤器和筛网之间的隔室，即制备得到脂肪移植物。

18.根据权利要求17所述的方法，还包括将所述取出的脂肪物分成第一部分和第二部分；

其中在(a)中被转移至所述离心管的所述脂肪物包括所取出的脂肪物的所述第一部分；并且

还包括：

将所述脂肪物的所述第二部分无菌转移至所述离心管；

通过所述至少一个无菌加工流体入口接头添加一种或多种流体，加工所述离心管中的所述脂肪物的所述第二部分，所述加工包括清洁和离解所述脂肪物中的一种或多种；

离心含有所述脂肪物的所加工的第二部分的所述离心管，以浓缩包含富集干细胞级分的细胞团；

将所述细胞团重悬于流体中，以获得相对于所述脂肪物原始第二部分的干细胞浓度而言，富含更多量干细胞的细胞混合物，即为重悬细胞混合物。

19.根据权利要求18所述的方法，进一步包括，在离心管中处理抽脂剂的第二部分之后，将处理过的脂肪物的第二部分转移到第二离心管中，以便进一步处理脂肪物的第二部分，第二离心机包括至少一个无菌配件的离心管，其中第二离心管通过至少一个无菌配件以可释放方式连接到第一离心管的至少一个无菌提取口中的一个。

20.根据权利要求18所述的方法，其中在将所述脂肪物的所述第二部分无菌转移至所述离心管之前，将所述脂肪移植物从所述离心管中取出。

21.根据权利要求20所述的方法，其中能够将所述重悬细胞混合物和所述脂肪移植物作为组合物来应用。

22.根据权利要求21所述的方法，其中应用所述重悬细胞混合物和所述脂肪移植物包括使用所述重悬细胞混合物和所述脂肪移植物进行3D打印。

23.根据权利要求22所述的方法，其中3D打印包括使用3D打印机中的第一喷头分配悬浮在生物墨水中的所述脂肪移植物，以及在3D打印机的第二喷头中分配所述重悬细胞混合物。

24.根据权利要求17所述的方法，其中所述离心管包括第一离心管；

还包括将所述提取的脂肪物分成第一部分和第二部分；

其中在(a)中被转移至所述第一离心管的所述脂肪物包括所提取的脂肪物的所述第一部分；还包括：

执行将所述脂肪物的所述第二部分无菌转移至第二离心管，所述第二离心管构成与所述第一离心管类型相同，包括所述上部圆柱部分和所述下部圆锥部分、所述无菌组织入口接头、所述至少一个无菌加工流体入口接头、所述无菌抽吸接头和所述至少一个连接至所述第一提取管的所述无菌提取端口，所述第二离心管还包括位于其中的所述筛网和位于其中的所述过滤器，所述过滤器位于所述筛网下方、所述第二离心管的所述下部锥形部分中；

通过所述至少一个无菌加工流体入口接头添加一种或多种流体，加工所述第二离心管中的所述脂肪物的所述第二部分，所述加工包括清洁和离解所述脂肪物中的一种或多种；

离心含有所述脂肪物的所加工的第二部分的所述第二离心管，以浓缩包含富集干细胞级分的细胞团；

将所述细胞团重悬于流体中，以获得相对所述脂肪物的原始第二部分的干细胞浓度富含更多干细胞的细胞混合物，即为重悬细胞混合物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中将由所述第一离心管产生的所述脂肪移植物和由所述第二离心管产生的所述重悬细胞混合物能够作为组合物应用。

26.根据权利要求25所述的方法，其中应用所述重悬细胞混合物和所述脂肪移植物包括使用所述重悬细胞混合物和所述脂肪移植物进行3D打印。

27.根据权利要求26所述的方法，其中3D打印包括使用3D打印机中的第一喷头分配悬浮在生物墨水中的所述脂肪移植物，以及在3D打印机的第二喷头中分配所述重悬细胞混合物。

28.根据权利要求17所述的方法，还包括在步骤(e)之后，转移所述脂肪移植物以进一步洗涤和浓缩到第二离心管中，并通过穿过所述第二离心管中的阀的针来收集所述脂肪移植物。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述更高的 速度在200g至400g的范围内。

30.根据权利要求29所述的方法，其中离心在机器上进行，所述机器包括多个第二速度设置，在所述第二速度设置中，为所述脂肪移植物的相应流变性选择较高的速度。

31.根据权利要求17所述的方法，其中所述筛网被构造成能够制备与3D打印机的喷头兼容的微粒化脂肪，以便利用所述脂肪移植物进行生物打印。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述筛网包括直径在350微米至450微米范围内的孔。

33.一种用于制备脂肪来源细胞级分的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将脂肪物无菌转移至权利要求1所述装置的第一离心管中；

(b)通过所述至少一个无菌加工流体入口接头添加一种或多种流体，加工所述第一离心管中的所述脂肪物，所述加工包括清洁和离解所述脂肪物中的一种或多种；

(c)将含有加工脂肪物的第一离心管离心以浓缩包含富干细胞级分的细胞团；

(d)将包含富干细胞级分的浓缩细胞团无菌转移至权利要求1所述装置的第二离心管中；

(e)通过所述至少一个无菌加工流体入口接头添加一种或多种流体，洗涤所述第二离心管中的所述细胞级分；

(f)将含有细胞级分的第二离心管离心以浓缩包含富干细胞级分的细胞团；

(g)将细胞团重悬于流体中，以获得相对于原始脂肪物的干细胞浓度而言富含更多干细胞的细胞混合物。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述第一离心管的所述筛网被构造成能够制备与3D打印机的喷头兼容的微粒化脂肪，以便利用所述重悬细胞混合物进行生物打印。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述筛网包括直径在350微米至450微米范围内的孔。

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