JP2001508302A

JP2001508302A - 胚性幹細胞血清置換

Info

Publication number: JP2001508302A
Application number: JP53115898A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．プライス，ポール; ディー．ゴールズボロー，マインディー; リンティルキンス，メアリー
Original assignee: ライフテクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-01-10
Filing date: 1998-01-09
Publication date: 2001-06-26
Also published as: EP0986635A1; US20020076747A1; AU5734998A; CA2277278A1; EP0986635A4; WO1998030679A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、培養において胚性幹細胞の増殖を支持する、無血清補充物を提供する。本発明の無血清補充物を補充した基本培地を含む培地もまた提供される。本発明はまた、胚性幹細胞を培養および単離するための方法、トランスジェニック動物を産生するための方法、ならびに胚性幹細胞およびトランスジェニック動物において、組換えタンパク質を発現するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】胚性幹細胞血清置換発明の分野本発明は、胚性幹(ES)細胞およびハイブリドーマのような他の細胞型の単離および増殖に通常必要とされる血清補充の置換に関する。発明の背景 ES細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する株化細胞系である。未分化細胞は、多能性であり、そして生殖系列をふくむ全組織の形成に関与する。胚盤胞または桑実胚への注入後、あるいは桑実胚による凝集後(Wood、S.A.ら、Proc.Natl.Aca d.Sci．USA 90:4582-4585(1993))、ES細胞は、二つの異なるゲノムを有する子孫（すなわち、キメラ子孫）を生成する。ESが住む生殖細胞を有するキメラ動物を繁殖させることにより、ES細胞ゲノムと同型接合性である系のを株化を生じ得る。相同遺伝子組換え技術およびES細胞を使用し、研究者は、標的化様式において、部位特異的変異をゲノムに導入し得る。この技術は、得られたトランスジェニック動物での遺伝子機能および調節の研究を促進する(Capecchi、M.R.、Science 244:1288-1292(1989))。遺伝子ターゲティング実験に加えて、ES細胞は、ヒト疾病の動物モデルの作製(Smithies、O.ら、Proc.Natl.Acad.Scj.USA:5266-5272( 1995))および細胞分化過程の研究モデル(Doetschman、T.C.ら、J.Embryol.Exp.M orph．87:27-45(1985))のようなものを含む医学的研究のための多くのアプリケーションを有する。 ES細胞は、通常、一次胚繊維胚盤胞またはSTO細胞のいずれかの不活化支持細胞の予めプレートした層で継代培養される。支持細胞は、ES細胞付着のためのマトリックスを提供する。さらに、不明確な成長因子に寄与ことにより、支持細胞は、培養物中のES細胞分化を防止する上で重要な役割を果たす。 ES細胞を遺伝子ターゲティングまたは細胞前駆体のような用途に使用する場合、ES細胞の胚性多分化性（すなわち、非分化性）表現型を必ず保護しなければならない。支持細胞に加えて、多くの研究者は白血病阻害因子(LIF)または他の成長因子も使用し、培養ES細胞の分化を防止する(Smith、A.G.、Nature 336:688-690 (1988);Gearing、D.P.ら、米国特許第5,187,077号(1993))。研究者は、現在、インビトロでES細胞の多能性を維持するために、支持細胞層をLIFと組み合わせて使用する。しかし、支持細胞層を必要としない数種のES細胞系が開発された。その代わりとして、これらの支持細胞非依存性ES細胞は、ゼラチン化ペトリプレート上に播種される(Magin，T.M.、Nucl.Acids.Res．20:3795-3796(1992))。一般的に、支持細胞非依存性ES細胞系は、成長因子(例えば、LIF)を補充した培地中で培養される。しかも、ES細胞の分化の回避を補助するために、一般的に、ES細胞は、絶対的に必要とされる期間より長く培養中に維持されない。培養条件の評価を助けるため、細胞分化マーカーを使用するアッセイ方法が開発されている。アルカリホスファターゼを含む数種の細胞マーカーが使用されて、分化を受けている細胞から未分化細胞を識別し得る(Pease,S、ら、Devel.Biol .141:344-352(1990))。しかも、ES細胞は、代表的には、血清（例えば、ウシ胎仔血清(FBS)）を補充した培地中で培養されるため、ES細胞は分化する傾向がある。血清は、不明確な分化因子の主要な供給源であり、従って、ES細胞分化を促進する傾向にある。他にも血清に関連する問題がもある。ロット間変動が認められることが頻繁にあり、血清のいくつかのロットでは、細胞に有毒であることが見出されている(Rober tson、E.J.編、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical App roach、IRL Press、Oxford、UK(1987))。さらに、血清は、マイコプラズマ、バクテリオファージおよびウイルスのような感染性因子により汚染され得る。最後に、血清は、任意の培地でも不明確かつ変動性の成分であるため、血清を使用することは、培養細胞の栄養およびホルモン必要条件の正しい規定および解明を妨げる。 ES細胞の増殖での血清の使用に関連する多くの問題を考慮して、ES細胞に関する作業を行う研究所は、購入前の血清を予備スクリーニングすることに頼らなければならない。しかし、予備スクリーニングプロセスは時間がかかり、その上、解釈に供される。たとえ申し分のないロットが同定された後であっても、大量の予備スクリーニングを行った血清のロットを-20℃以下で貯蔵するのは、問題がある。従って、ES細胞の単離、培養物中のES細胞の培養、ES細胞の増殖、ES細胞の分化の制御およびES細胞の外移植のような、ES細胞に関する研究は、血清の必要性によって妨げられる。従って、無血清培地補充物および無血清培地について、培養物中でのES細胞分化を促進または誘導することなく、ES細胞の増殖および伸張を支持する必要性が残存する。発明の要旨本発明は、無血清真核生物細胞培養培地補充物を提供する。ここで、無血清補充物を補充した基本細胞培養培地は、無血清培養物中のES細胞の増殖を支持し得る。無血清真核生物細胞培養培地補充物は、アルブミンまたはアルブミン置換物、一種以上のアミノ酸、一種以上のビタミン、一種以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン置換物、一種以上の抗酸化剤、一種以上のインスリンまたはインスリン置換物、一種以上のコラーゲン前駆体および一種以上の微量元素から成る群から選択した一種以上の成分を含有するか、または一種以上の成分を組み合わせることにより得られる。好ましくは、本発明の補充物は、アルブミンまたはアルブミン置換物ならびに、一種以上のアミノ酸、一種以上のビタミン、一種以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン置換物、一種以上の抗酸化剤、一種以上のインスリンまたはインスリン置換物、一種以上のコラーゲン前駆体および一種以上の微量元素から成る群から選択した一種以上の成分を有する。本発明は、特に、無血清真核生物細胞培養培地補充物を提供し、この補充物は、 L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、チアミン、還元型グルタチオン、L-アスコルビン酸-2-リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリンおよび微量元素成分Ag⁺、Al³⁺、Ba²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Ge⁴⁺、Se⁴⁺、Br^-、I^-、Mn²⁺ 、F^-、Si⁴⁺、V⁵⁺、Mo⁶⁺、Ni²⁺、Rb⁺、Sn²⁺およびZr⁴⁺を含む成分から成る群から選択した一種以上の成分を有するか、または組み合わせて得る。本発明は、また、本発明の無血清細胞培養補充物を補充した基本細胞培養培地を含む真核生物細胞培養培地を提供する。また、本発明は、本発明の無血清補充物を有する基本細胞培養培地を組み合わせて得た、真核生物細胞培養培地も提供する。本発明は、また、無血清真核生物細胞培養培地の作製方法を提供し、この方法は、発明の補充物および基本培地を混合する工程を含む。また、本発明は、無血清真核生物細胞培養培地補充物の作製方法を提供する。また、本発明は、ES細胞および本発明の補充物を有する組成物を提供する。本発明は、また、ES細胞および無血清培地を有する組成物を提供し、ここで、無血清培地は、無血清培養中におけるES細胞の増殖を支持し得る。本発明は、また、ES細胞および本発明の補充物を含む容器手段を包含する製品を提供する。本発明は、ES細胞および本発明の無血清培地を含む容器手段を包含する製品もまた提供する。また、本発明は、一種以上の容器手段を包含する製品を提供し、ここで、第一容器手段は、本発明の補充物または本発明の無血清培地を含む。必要に応じて、第二容器手段は、基本培地を含む。必要に応じて、第三容器手段は、ES細胞を含む。また、本発明は、無血清培養中でES細胞を拡大させる方法を提供し、この方法は、無血清培養中でES細胞の増殖を支持し得る無血清培地をES細胞と接触させる工程、およびES細胞の拡大促進に適した無血清条件下でES細胞を培養する工程を包含する。本発明はまた、この方法で得られる拡大されたES細胞の集団を提供する。本発明は、トランスジェニック動物の生成方法も提供し、この方法は、ES細胞を無血清培養物中で培養する工程、核酸分子をES細胞に導入する工程、組換えES 細胞クローンを選択する工程、組換えES細胞クローンを拡大して集団を形成させる工程、組換えES細胞クローン性集団のアリコートを胚盤胞に注入する工程、注入した胚盤胞を宿主偽妊娠雌性動物に移入する工程、およびトランスジェニック子孫を選択する工程を包含する。本発明はまた、この方法によって得られるトランスジェニック動物も提供する。本発明は、トランスジェニック動物生成方法も提供する。この方法は、ES細胞を無血清培養物中で培養する工程、核酸分子をES細胞に導入する工程、組換えES 細胞クローンを選択する工程、組換えES細胞クローンを拡大して集団を形成させる工程、少数のES細胞を初期胚（例えば、８細胞桑実胚）と同時培養して胚凝集物を形成する工程、凝集した胚を宿主偽妊娠雌性動物に移入する工程、およびトランスジェニック子孫を選択する工程を包含する。本発明は、この方法によって得られるトランスジェニック動物も提供する。また、本発明は、トランスジェニック動物から組換えタンパク質を生成する方法を提供し、この方法は、ES細胞を無血清培養物中で培養する工程、目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む核酸構築物をES細胞に導入する工程、組換え ES細胞クローンを選択する工程、組換えES細胞クローンを拡大して集団を形成させる工程、組換えES細胞クローン集団を胚盤胞に注入する工程、注入した胚盤胞を宿主偽妊娠雌性動物に移入する工程、トランスジェニック子孫を選択する工程、動物の健康促進に適した条件下で、選択したトランスジェニック動物を育成する工程、およびトランスジェニック動物から組換えタンパク質を単離する工程を包含する。本発明はまた、この方法によって得られたタンパク質も提供する。また、本発明は、トランスジェニック動物から組換えタンパク質を生成する方法を提供する工程、この方法は、ES細胞を無血清培養物中で培養する工程、目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む核酸構築物をES細胞に導入する工程、組換えES細胞クローンを選択する工程、組換えES細胞クローンを拡大して集団を形成させる工程、少数のES細胞を初期胚（例えば、８細胞桑実胚）と同時培養して胚凝集物を形成する工程、凝集胚を宿主偽妊娠雌性動物に移入する工程、トランスジェニック子孫を選択する工程、動物の健康促進に適した条件下で、選択したトランスジェニック動物を育成する工程、およびトランスジェニック動物から組換えタンパク質を単離する工程を包含する。本発明はまた、この方法によって得られる組換えタンパク質も提供する。また、本発明は、無血清培養物中でのES細胞の分化を制御または防止する方法を提供する。この方法は、本発明の無血清培養培地とES細胞とを接触させる工程、およびES細胞分化を防止し、そして無血清培養物中でのES細胞拡大の促進に適した無血清条件下でES細胞を培養する工程を包含する。また、本発明は、ES細胞を無血清培養物中で特定型の細胞に分化させる方法を提供する。この方法は、ES細胞を無血清培養培地と接触させる工程、無血清培養物中でのES細胞拡大促進に適した無血清条件下でES細胞を培養する工程、および分化因子を加えるか、または培養条件を変えてES細胞の分化を誘発し、異なる型または特定型細胞を形成する工程を包含する。また、本発明は、分化ES細胞を哺乳類に提供する方法を提供する。この方法は、ES細胞を無血清培養培地と接触させる工程、無血清培養物中でのES細胞の拡大促進に適した無血清条件下でES細胞を培養する工程、分化因子を加えるか、または培養条件を変えてES細胞の分化を誘発し、異なる型または特定型の細胞を形成する工程、およびこの分化ES細胞を哺乳類に導入する工程を包含する。また、本発明は、無血清培養物中でES細胞を得る方法を提供する。この方法は、培養胚盤胞からES細胞を単離する工程、およびこの単離ES細胞を、ES細胞の拡大促進およびES細胞の分化防止に適した条件下で、無血清培養物中で培養する工程を包含する。本発明はまた、この方法によって得られたES細胞を提供する。また、本発明は、無血清培養物中で組換えタンパク質を生成する方法を提供する。この方法は、目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む核酸構築物を含む組換え真核生物細胞（例えば、ES細胞またはハイブリドーマ）を得る工程、この細胞を無血清培養物中で培養して細胞集団を形成させる工程、このタンパク質を上記の細胞または細胞を培養した培地から単離する工程を包含する。本発明はまた、この方法によって得られた組換えタンパク質も提供する。図面の簡単な説明写真は、すべてNikon Diaphot-TMD位相差顕微鏡により倍率100×で撮影した。図1Aは、L-グルタミン、可欠アミノ酸(NEAA)、2-メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン、LIF(10ng/mL)および15％FBSを補充したDMEM中で７日間増殖後のES細胞コロニーを示す。図1Bは、アルカリホスファターゼ活性を検出するため固定および染色した後の ESコロニーを示す。培養条件は、図1Aと同じであった。図2Aは、L-グルタミン、NEAA、2-メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン、LIF(10ng/mL)および15％濃度の本発明の無血清補充物を補充した DMEM中で７日間増殖後のES細胞コロニーを示す。図2Bは、アルカリホスファターゼ活性を検出するため固定および染色した後の ES細胞コロニーを示す。培養条件は、図2Aと同じであった。発明の詳細な説明次の説明において、細胞培養培地分野においておよび真核生物細胞の増殖について慣例的に使用される多数の用語が広範に使用される。明細書および請求の範囲、ならびにこのような用語に与えられる範囲の明確かつ一貫した理解を提供するため、次の定義を提供する。「アルブミン置換物」という用語は、本発明の補充物においてアルブミン（例ミンと実質的に類似した結果を与え得る化合物をいう。アルブミン置換物は、任意のタンパク質またはポリペプチド源であり得る。このようなタンパク質またはポリペプチドサンプルの例として、ウシ下垂体抽出物、植物加水分解産物（例えば、コメ加水分解産物）、ウシ胎仔アルブミン（フェチュイン）、卵アルブミン、ヒト血清アルブミン(HSA)、または別の動物由来アルブミン、雛抽出物、ウシ胚地において、細胞培養を促進するアルブミンまたはアルブミン置換物の濃度は、日常的な実験方法のみを使用して測定され得る。「トランスフェリン置換物」という用語は、本発明の補充物中でトランスフェリンを置き換え、トランスフェリンと実質的に類似した結果を与え得る任意の化合物をいう。トランスフェリン置換物の例として、任意の鉄キレート化合物が挙げられるが、これに限定されない。使用し得る鉄キレート化合物には、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、エチレングリコール-bis（β−アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-テトラ酢酸(EGTA)、デフェロキサミンメシレート、ジメルカプトプロパノール、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DPTA)、およびtrans-1、2 -ジアミノシクロヘキサン-N、N、N'、N'-テトラ酢酸(CDTA)の鉄キレート、ならびにクエン酸第二鉄キレートおよび硫酸第一鉄キレートが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、トランスフェリン置換物は、クエン酸第二鉄キレートおよび硫酸第一鉄キレートである。最も好ましくは、トランスフェリン置換物は、鉄キレート硫酸第一鉄-7水和物-EDTAである。本発明の補充物および培地において、細胞培養を促進するトランスフェリン置換物の濃度は、日常的な実験法のみを使用して測定され得る。「インスリン置換物」という用語は、本発明の補充物中でインスリンの代わりに使用し、インスリンと実質的に類似した結果を与え得る任意の亜鉛含有化合物をいう。インスリン置換物の例として、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛および硫酸亜鉛が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、インスリン置換物は、硫酸亜鉛-7水和物である。本発明の補充物および培地では、細胞培養を促進するインスリン置換物濃度は、日常的な実験法のみを使用して測定され得る。「拡大」という用語は、培養物中でのES細胞の分化ではなく、増殖および分裂をいう。「コラーゲン前駆体」という用語は、コラーゲンを合成するため、細胞により利用される任意の化合物をいう。本発明の補充物および培地で使用し得るコラーゲン前駆体として、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、およびこれらの多量体または誘導体、ならびにアスコルビン酸およびその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。一種以上のこのような化合物を、コラーゲンを形成するために使用し得る。「抗酸化剤」という用語は、酸素または過酸化物により促進される反応を阻害する分子をいう。本発明の補充物または培地に使用され得る抗酸化剤として、還元型グルタチオンおよびアスコルビン酸-2-リン酸塩またはその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。「成分」という用語は、細胞培養培地中で使用され、細胞の成長または増殖を維持または促進し得る化学的および生物的起源の任意の化合物をいう。「成分（ component）」、「栄養素」および「成分（ingredient）」という用語は、互換的に使用され得、これらはすべて、このような化合物をいう。細胞培養培地で使用される代表的な成分には、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などが挙げられる。エクスビボで細胞の増殖を促進または維持する他の成分は、特定の必要性に従って、当業者により選択され得る。「細胞培養物」とは、人工的なインビトロ環境で維持、培養または増殖される細胞または組織を意味する。「培養容器」とは、細胞を増殖させるための無菌環境を提供し得る様々なサイズのガラス容器、プラスチック容器または他の容器を意味する。例えば、フラスコ、単一または複合ウエルプレート、単一または複合ウエル皿、もしくは複合ウエルマイクロプレートが使用され得る。「細胞培養培地」、「培養培地」および「培地処方物」という用語は、細胞を培養または増殖させるための栄養性溶液をいう。「培養（cultivation）」および「培養（culturing）」という用語は、同義語である。「容器手段」という用語には、培養容器、ジャー、瓶、バイアル、ストロー、アンプルおよび凍結チューブなどが挙げられる。「栄養補給」または「流体交換」という用語は、細胞を培養する培地の取り替えをいう。「混合」という用語は、細胞培養培地処方物中の成分の混合（mixing）または混合（admixing）をいう。「接触」という用語は、一種以上の細胞と、一種以上の化合物、溶液、培地などとの混合、添加、接種、または撹拌をいう。「無血清」培地は、血清（例えば、ウシ胎仔血清(FBS)、ウマ血清、ヤギ血清など）を含まない培地である。「適合性成分」とは、溶液中で維持され、「安定な」組み合わせを形成し得るこれらの培地栄養素を意味する。「適合性成分」を含む溶液は、成分が毒性化合物に実質的に分解（degrade）または分解（decompose）しないか、または成分が細胞培養物により利用または異化代謝され得ない化合物に実質的に分解（degrad e）または分解（decompose）しない場合、「安定である」といわれる。また、分解が検出され得ないとき、または１×細胞培養培地処方物中の同じ成分の分解と比較して、分解が緩やかな速度で起こる場合、成分は「安定である」とみなされる。例えば、１×培地処方物のグルタミンが、ピロリドンカルボン酸およびアンモニアに分解することは公知である。２価カチオンと結合したグルタミンは、期間を通じて分解がほとんどまたは全く検出され得ないため、「適合性成分」とみなされる。米国特許第5,474,931号を参照のこと。細胞培養培地は、多くの成分からなり、そしてこれらの成分は、培地に応じて変わる。細胞培養培地に使用する各成分は、特有の物理学的特性および化学的特性を有する。成分の適合性および安定性は、溶液中における成分の「溶解度」により測定する。「溶解度」および「溶解性」という用語は、他の成分と溶液を形成するある成分の能力を指す。従って、成分が測定または検出し得る沈殿物を形成することなく溶液中に維持されるなら、成分は、適合性がある。従って、本明細書で使用する「適合性のある成分」という用語は、濃縮または１×製剤のいずれかとして溶液中で混合する場合、「安定」かつ「溶解性」の特定の培養培地成分の組み合わせを指す。「１×製剤」とは、細胞培養培地で認められるいくつかの成分または全成分を含有する水溶液を指すことを意味する。「１×処方物」は、例えば、細胞培養培地のための任意の亜群成分の細胞培養培地を指し得る。１×溶液中の成分濃度は、細胞の維持または増殖に使用する細胞培養処方物で認められる成分濃度とほぼ同じである。簡単に説明すると、細胞の増殖に使用する培養培地は、定義により、１×処方物である。多くの成分が存在する場合（適合性のある成分の亜群中として）、１×処方物中の各成分は、細胞培養培地中のこれらの成分とほぼ等しい濃度を有する。例えば、RPMI 1640培養培地は、特に、0.2g/L L-アルギニン、0. 05g/L L-アスパラギンおよび0.02g/L L-アスパラギン酸を含有する。本発明に従って適合性のある成分である、これらのアミノ酸の「１×処方物」は、溶液中でこれらの成分をほぼ同じ濃度含有する。従って、「１×処方物」をいう場合、溶液中の各成分は、上述の細胞培養培地中に認められる成分濃度と同じか、ほぼ同じとする。１×処方物中の培地成分濃度は、当業者にとって周知である。Method s For Preparation of Media，Supplements and Substrate For Serum-Free Ani mal Cell Culture，Allen R．Liss、N.Y.(1984)を参照のこと。これはその全体を、本明細書において参照文献として援用する。 10×処方物は、溶液中の各成分が細胞培養培地の同じ成分よりも約10倍濃縮された溶液を指す。例えば、RPMI 1640培地は、特に、0.3g/L L-グルタチオンを含有する。「10×処方物」は、１×培養培地で認められる濃度の約10倍濃度で、さらに多くの成分を含有し得る。明らかなように、「25×製剤」、「50×製剤」および「100×製剤」は、１×細胞培養培地と比較して、それぞれ約25、50または1 00倍濃度で成分を含有する溶液を示す。「微量元素」または「微量元素部分」という用語は、細胞培養培地中に微量しか存在しない部分を指す。本発明において、これらの用語は、Ag⁺、Al³⁺、Ba²⁺ 、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Ge⁴⁺、Se⁴⁺、Br^-、I^-、Mn²⁺、F^-、Si⁴⁺、V⁵⁺、Mo⁶⁺、Ni²⁺ 、Rb⁺、Sn²⁺およびZn⁴⁺ならびにそれらの塩を包含する。微量元素部分の適切な濃度は、当業者により決定され得る（表２を参照のこと）。所定の微量元素部分の塩を使用して本発明の補充物または培地を作製し得る。例えば、次の塩を使用し得る。AgNO₃、AlCl₃・6H₂O、Ba(C₂H₃O₂)₂、CdSO₄・8H₂O 、CoCl₂・6H₂O、Cr₂(SO₄)₃・1H₂O、GeO₂、Na₂SeO₃、H₂SeO₃、KBr、KI、MnCl₂・4 H₂O、NaF、Na₂SiO₃・9H₂O、NaVO₃、(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O、NiSO₄・6H₂O、RbCl、S nCl₂およびZrOCl₂・8H₂O。微量元素部分含有化合物の適切な濃度は、当業者により決定され得る（表３を参照のこと）。セレン、ケイ素、バナジウム、モリブデンおよびジルコニウムを含有する化合物の濃度例は、次の通りである。本発明の補充物の好ましい実施態様において、 SeO₃ ^2-濃度は、約0.02mg/L、SiO₃ ^2-濃度は、約0.3mg/L、VO₃ ^-濃度は、約0.005mg /L、Mo₇O₂₄ ^6-濃度は、約0.05mg/LそしてZrO²⁺濃度は、約0.005mg/Lである。本発明の１×培地では、SeO₃ ^2-の濃度範囲は、約0.00001〜0.007mg/L、SiO₃ ^2-の濃度範囲は、約0.0003〜0.3mg/L、VO₃ ^-の濃度範囲は、約0.000008〜0.008mg/L、Mo₇O₂₄ ^6- の濃度範囲は、約0.000009〜0.09mg/L、そしてZrO²⁺の濃度範囲は、約0.000 06〜0.006mg/Lである。１×培地の好ましい実施態様において、SeO₃ ^2-濃度は、約0.003mg/L、SiO₃ ^2-濃度は、約0.04ｍg/L、VO₃ ^-濃度は、約0.0007mg/L、MO₇O₂₄ ^6- 濃度は、約0.008mg/L、そしてZrO²⁺濃度は、約0.0008mg/Lである。「アミノ酸」という用語は、アミノ酸またはその誘導体（例えば、アミノ酸類似体）、ならびにそのD-およびL-形態を指す。このようなアミノ酸例には、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リジン、L- ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニン、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシンおよび L-バリンが挙げられる。「胚性幹細胞」および「多分化能性胚性幹細胞」という用語は、生殖系列細胞（精子および卵子）など、胚または成体で多くの分化細胞型を生じさせ得る細胞を指す。この細胞型はまた、本明細書において「ES」細胞も指す。 ES細胞の「集団」は、複数のES細胞を指す。同様に、胚盤胞の集団は、複数の胚盤胞を指す。「組換え胚性幹細胞」または「組換え胚性幹細胞クローン」という用語は、核酸分子が導入され、そして安定に維持されるようになったES細胞を指す。この核酸分子は、組換えES細胞の選択を助ける薬物耐性遺伝子を含有し得る。核酸分子の導入および薬物のクローン選択後、ESクローンをPCRまたはサザーンブロット法のいずれかにより分析し、正確な遺伝子ターゲティングを確認する。「核酸構築物」という用語は、目的のタンパク質をコードする核酸を含有する核酸分子を指す。好ましくは、核酸構築物は、発現制御配列(すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー、遺伝子調節タンパク質が結合し、そして遺伝子転写制御を実行する調節配列)に作動可能に連結された、目的のタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターである。使用され得る発現ベクターは、通常の当業者にとって周知である。「基本培地」という用語は、血清または本発明の無血清補充物のいずれかを補った場合、ES細胞または他の細胞の増殖を支持し得る任意の培地を指す。基本培地は、亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウムおよびカリウムなどの標準無機塩、ならびにビタミン、グルコース、緩衝系および必須アミノ酸を供給する。本発明に使用し得る基本培地には、Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)、Mini mal Essential Medium(MEM)、Basal Medium Eagle(BME)、RPMI 1640、F-10、F-1 2、αMinimal Essential Medium(αMEM)、Glasgow's Minimal Essential Medium (GM EM)およびIscove's Modified Dulbecco's Mediumなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、基本培地は、ピルビン酸のナトリウム塩添加を有するか有さないかのいずれかの高グルコースを有するDMEMである。ピリドキシンHClをピリドキサールの代わりに使用し得る。「無血清培養条件」および「無血清条件」という用語は、どのような型の血清も除外した細胞培養条件を指す。本発明は、ES細胞および他の細胞型を樹立および増殖させるための完全培地の血清成分置換物を提供する。無血清真核生物細胞培養培地補充物は、アルブミンまたはアルブミン置換物、一種以上のアミノ酸、一種以上のビタミン、一種以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン置換物、一種以上の抗酸化剤、一種以上のインシュリンまたはインシュリン置換物、一種以上のコラーゲン前駆体、および一種以上の微量元素からなる群から選択される一種以上の成分を有するか、または混合して得る。好ましくは、本発明の補充物は、アルブミンまたはアルブミン置換物、ならびに、一種以上のアミノ酸、一種以上のビタミン、一種以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン置換物、一種以上の抗酸化剤、一種以上のインシュリンまたはインシュリン置換物、一種以上のコラーゲン前駆体および一種以上の微量元素からなる群から選択される一種以上の成分を含有する。特に、本発明の補充物は、高脂質性ウシ血清アルブミンまたはアルブミン置換に、一種以上のアミノ酸、一種以上のビタミン、一種以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン置換物、一種以上の抗酸化剤（例えば、グルタチオンおよびL-アスコルビン酸-2-ホスフェート）、一種以上のインシュリンまたはインシュリン置換物、一種以上のコラーゲン前駆体、および一種以上の微量元素からなる群から選択される一種以上の成分からなる。L-プロリンおよびL-ヒドロキシプロリンとともにL-アスコルビン酸-2-ホスフェートは、コラーゲン前駆体としても重要である。本発明の補充物は、どんな基本培地にも添加し得る。高グルコース含有Dulbecco改変Eagle培地(DMEM)(Life Technologies、Gaithersburg、MDより入手可能)などの基本培地に添加する場合、本発明の補充物は、ES細胞またはハイブリドーマ増殖のいずれかについて認定されたウシ仔胎血清(FBS)と同等以上の程度に未分化ES細胞およびハイブリドーマ細胞の増殖を支持する。ほとんどの実験室では、ES細胞培養物の増殖および継代に使用される標準的な培地の組み合わせは、15％試験済みかつ熱非働化FBS、100μM 2-メルカプトエタノールおよび100μM非必須アミノ酸(NEAA)を補ったDMEM(高グルコース)である。 ES細胞培養物を樹立するため、時に、ヌクレオシドを培地に添加する(Robertson 、E.J.編、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach 、IRL Press、Oxford、UK(1987))。本発明の補充物は、血清（例えば、FBS）成分の代わりに、血清の場合と同じ最終パーセント、通常、ES細胞培養物中に約15 ％で基本培地に添加する。しかし、本発明の補充物の最終濃度は、約0.5〜約90 ％であり得る。好ましくは、補充物の最終濃度は、約５〜約50％である。より好ましくは、補充物の最終濃度は、約５〜約30％である。なおさらに好ましくは、補充物の最終濃度は、約５〜約20％である。最も好ましい補充物最終濃度は、約 15％である。この組成物は、規定され、そして再現性があるため、本発明の補充物は、適合性の予備試験を行う必要がない。しかも、補体因子が、本発明の補充物に存在しないことから、熱非働化する必要がない。 ES細胞は、そのゲノムに部位特異的改変を含有するトランスジェニック動物の作製において主要な有用性を有する。ES細胞の遺伝子構造を変更するために、遺伝的に変更した遺伝子のコピーを含有する核酸分子または構築物をES細胞に導入する。ES細胞への核酸の導入は、リン酸カルシウムでの沈降(Gossler、A.ら、Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA:9065-9069(1989))、レトロウイルス感染(Robertson．E. 、ら、Nature 323:445-448(1986))、エレクトロポレーション(Thompson、S．ら、Cell 56:313-321(1989))およびカチオン性脂質(Lamb、B.T.、ら、Nature Gene tics 5:22-29(1993))を含む、多くの方法で達成されてきた。核酸分子または構築物を取り込むES細胞画分では、導入核酸分子または構築物は、その遺伝子の天然のコピーとの相同組換えを受ける。適切な選択遺伝子（または複数の遺伝子）を核酸分子または構築物に組み込んで、培養培地への選択薬物の添加により組換えES細胞の薬物選択を可能にする。核酸分子または構築物の導入および薬物でのクローン選択後、ESクローンをPCRまたはサザーンブロット法のいずれかにより分析し、正確な遺伝子ターゲティングを確認する。次に、選択したESクローンを胚盤胞に注射する。これは、組換えES細胞を15回程注射して、胚盤胞の近隣内部細胞塊と混合し、そしてキメラ子孫を生成することを目標とする。注射した胚盤胞を宿主偽妊娠雌に移入し、妊娠させる。実験の経過を、出生時にマーカーを使用してモニターし得る。例えば、マウスにおいて、現在のところ、ほぼ全てのES細胞株が、129系統のマウス（アグーチ色毛を有する）から得られている。一般的に、宿主胚盤胞は、C57B1/6マウス（黒色毛を有する）から得られる。十分な割合でES細胞由来組織を有するキメラ動物は、通常、雄（ES細胞株は雄性）であり、主にアグーチ色毛を有する。雄性子孫の優性は、雄性ES細胞株により雌性胚が性転換を起こした結果である (Robertson、E.J．ら、J.Embryol.Exp.Morph．74:297-309(1983))。しかし、生殖系列に遺伝する雌性キメラが作製されることもよくある(Lamb、B.T.ら、Natur e Genetics 5:22-29(1993))。キメラ動物の生殖系列において標的化遺伝子の有するか否かを試験するため、キメラ動物をC57B1/6のつがいの片方と戻し交配する（アグーチ毛色が黒毛色より優性である場合）。アグーチ仔を産生するなら、 ES由来ゲノムの生殖系列遺伝が生じたとする。このような子孫は、ESゲノムに対して異型接合性である。所望であれば、異型接合性動物同士を交配し、標的化動物の同種接合性集団を樹立し得る。遺伝子ターゲティングプロセスでは、生殖系列コンピテントES細胞株の使用を必要とする。この株は、共同研究者、商業供給源（例えば、American Type Coll ection、Rockville、MD;Genome Systems．Inc.、St.Louis、MO;Lexicon Genetic s、Inc.、Woodlands、TX)から入手され得るか、または個々の研究者により作製され得る。本発明を使用し、次の方法でES系を単離し得る。ES細胞株は、内部細胞塊を不活化マウス胚線維芽細胞またはSTO細胞の支持細胞層頂部に置いた胚から増殖させることにより胚盤胞段階胚から樹立される。複数の胚盤胞は、ほんの数パーセントのイニシエート培養物が生殖系列コンピテントES細胞株を形成するので、どんな時でもイニシエートする。所望されない細胞分化、XY核型の非存在、ならびに不十分なES細胞およびコロニー形態は、潜在的なES培養物の大部分が有効なES細胞株として働かない主な理由としてある。全般的なES細胞培養物に関して、血清に存在する規定されない因子(例えば、FBS)は、ES細胞株の樹立に著しい負の影響を及ぼし得る。従って、本発明の補充物または培地は、ES細胞株樹立のための血清置換物として使用し得る。規定された組成物および特徴づけられていない分化因子が存在しないため、本発明の補充物および培地は、ES細胞株を樹立する確率を増加させる。しかも、本発明の補充物および培地は、マウスおよび非マウス種から真の生殖系列コンピテントES細胞を樹立する上で重要である。このようなES細胞株の樹立において、本発明の補充物または培地を単独あるいは、一般的または特定の成長因子と共に使用する。本発明に従って、ES細胞株は、どんな動物からも入手し得る。胚盤胞およびES 細胞が本発明の補充物および培地を使用して単離され得る動物例として、マウス (Evans、M.J.ら、Nature 292:154-156(1981))、ラット(Iannaccone、P.M.ら、De vel.Biol.163:288-292(1994))、ハムスター(Doetschman、T.ら、Devel.Biol.127 :224-227(1988))、ウサギ(Graves、K.H.ら、Molec.Reprod.Devel.36:424-433(19 93))、有尾猿（monkey)(Thomson、J.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844-78 48(1995))、ブタ(Baetscher，M.W.ら、国際特許出願第W095/28412(1995))、鳥類 (Shuman、R.M.、Experientia 47:897-905(1991))、魚類(Wakamatsu、Y.ら、Mol. Mar.Biol.Biotech．3:185-191(1994))、モルモット、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、爬虫類、両生類、ヒトおよびヒトニザルなどが挙げられる。始原細胞生殖細胞(PGC)由来ES細胞は、増殖特性および使用に関して、前述のE S細胞と類似している。ES細胞とは対照的に、PGC細胞は、胚盤胞の内部細胞塊からではなく、むしろ初期胚の生殖隆起の始原生殖細胞から樹立する(Matsui、Y. ら、Cell 70:841-847(1992))。PGC由来ES細胞株を樹立し、そして増殖させる細胞培養条件は、血清（例えば、FBS)および成長因子を必要とする。本発明の補充物および培地を用いて使用培地中の血清成分を置き換え、そしてPGC-由来ES細胞の樹立および増殖を行い得る。一旦ES細胞株を樹立すると、将来の使用のために、凍結保存しなければならない。また、後に、再構成するために、ESクローンを保存することは、遺伝子ターゲティング過程中では日常的である。凍結培地は、一般的に、5〜10％DMSO、10 〜90％FBS、および55〜85％DMEM培地からなる。本発明の補充物を、凍結保存および再構成のための血清置換物として使用し得る。本発明の補充物を有するような細胞の凍結保存用条件として、0.5〜95％補充物、1〜10％凍結保護物質（例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO))、および1〜90％基本培地が挙げられる。ES細胞は、このような条件下、約-80℃以下で凍結し得る。ES細胞は、約-135℃以下の温度で無期限にずっと凍結し得る。 ES細胞を増殖または拡大させる場合、不活化支持細胞は、通常、ES細胞の培養前に、少なくとも数時間10％FBSを含有するDMEM培地（ES認定されている必要はない）に支持細胞をプレーティングすることにより調製する。この時間枠は、支持細胞層をそれ自体に付着させ、そして培養皿上に拡散させる。ES細胞およびES 細胞培地を添加する前に、10％FBS含有培地を除去する。本発明の培地および補充物を、それぞれ培地含有血清および血清の置換物として使用して、胚盤胞支持細胞をプレーティングし得る。好ましくは、本発明の補充物または培地を使用してこのような支持細胞を増殖させる場合、接着因子を添加する。上述のように、ES細胞を、ときにLIFなどの成長因子と共に、血清補充培地中で増殖させて、培養物中でのES細胞分化を防止する。本発明は、特定のES細胞株の特性に依存して、このような因子一種以上と共に、または無しで使用し得る。いくつかのES細胞株は、無支持細胞様式または培養中のいくつかの時点で支持細胞を除いて、単離されてきた。一般的に、これらの無支持細胞株は、LIFまたは他の成長因子を補った血清含有培地のゼラチン処理プレート上で増殖する。本発明の補充物を、常用される血清の直接置換物として使用し、無支持ES細胞株を増殖および維持し得る。あるいは、本発明の培地を使用して、無支持ES系を培養し得る。遺伝子ターゲティングに加えて、ES細胞株が有用である別の方法は、モデル系として細胞分化を研究することである。ここで、一つの適用として、別の方法では非常に入手が困難である幹細胞供給源（例えば、造血幹細胞）として分化した ES細胞を使用することがある(Keller、G.M.、Curr.Op.Cell.Biol．7:862-869(19 95))。分化研究において、血清補充培地（さらなる成長因子を含有または無含有の）を使用して、特定細胞型の発生を増強する。ES細胞分化制御は、本発明により容易にされ得る。規定されていない因子を含む血清補充培地ではなく、規定された因子を含有または無含有の規定増殖培地を使用することにより、研究者らは、培養中のES細胞の分化をより大きく制御し得る。分化因子を添加または培養条件を変えてES細胞を誘発することにより分化を惹起し、一種以上の特定細胞型を形成し得る。本発明の補充物または培地は、液体形態であり得るか、または乾燥形態で維持され得る。培地成分を液体担体に溶解または乾燥形態で維持し得る。成分を溶かして溶液にするのに使用する液体担体の型および方法は、様々で、そして日常の実験法だけで当業者により決定され得る。本発明の補充物または培地は、濃縮処方物(１×超〜1000×）または１×処方物として作製し得る。好ましくは、成分を有する溶液を１×培地処方物の同一成分の濃度よりも濃縮されている。例えば、成分を10倍濃縮（10×処方物）、25倍濃縮(25×処方物)、50倍濃縮(50×濃度)または100倍濃縮(100×処方物)し得る。特に、本発明の補充物または培地は、成分を適合性のある濃縮亜群に分けて作製し得る。米国特許第5,474,931号を参照のこと。補充物または培地の成分を個別の濃縮溶液として調製する場合、各濃縮物の適（十分）量を希釈剤と混合して、薄めた濃縮処方物または１×製剤を作製する。代表的には、亜群に使用する希釈剤は、水であるが、緩衝水溶液、生理食塩水溶液、または他の水溶液を含む他の溶液も本発明に従って使用し得る。代表的には、本発明の補充物または培地あるいは濃縮製剤（液体形態および乾燥形態の両方）を滅菌して、所望されない汚染を防止する。滅菌は、例えば、紫外線、加熱滅菌、放射線照射または濾過により達成し得る。微量元素部分を含む化合物を調製して溶液にし得る。好ましくは、微量元素部分を含む化合物を濃縮溶液に分類してそして貯蔵する。例えば、1000〜10,000× 化学貯蔵溶液の作製が可能で、後の使用のために、液体として貯蔵し得るか、または適切なアリコートサイズで凍結し得る。培養中のESおよび他の細胞の増殖を維持すると考えられる成分の濃度範囲を表１〜３に列挙する。これらの成分は本発明の細胞培養培地補充物を形成させるために組み合わされ得る。当業者に容易に明らかなように、所定の成分の濃度は、開示された範囲を超えて増加または減少させ得、そして濃度の増加または減少の効果は、日常的な実験のみを使用することにより決定し得る。本発明の補充物の成分濃度および本発明の培地濃度は、表１〜３に列挙される濃度である。表１には、非微量元素部分含有成分の濃度を提供する。表１の２番目の欄には、無血清補充物中の成分濃度を提供する。表１の３番目の欄には、１ ×培地中に存在し得る成分の最終的な濃度範囲を提供する。表１の４番目の欄には、１×培地の好適な実施態様中の各成分についての最終濃度を提供する。表２に微量元素部分の成分の濃度を提供する。表２の２番目の欄には、無血清補充物中の成分濃度を提供する。表２の３番目の欄には、１×培地中に存在し得る成分の最終的な濃度範囲を提供する。表２の４番目の欄には１×培地の好適な実施態様中の各成分についての最終濃度を提供する。表３には本発明の無血清補充物および培地を作製するために組み合わせ得る微量元素部分含有化合物の濃度を提供する。表３の２番目の欄には、無血清補充物中の成分濃度を提供する。表３の３番目の欄には、１×培地中に存在し得る成分の最終的な濃度範囲を提供する。表３の４番目の欄には、１×培地の好適な実施態様中の各成分についての最終濃度を提供する。当業者に明らかなように、微量元素部分は、溶液中で成分と反応し得る。従って、本発明は、表１〜３に開示した処方物、ならびに表１〜３の成分を組み合わせた後に形成される任意の反応混合物を包含する。本発明の無血清補充物を作製するために、アミノ酸は、３×濃縮物として細胞培養グレードの水に希釈される。完全な可溶化を可能にし、そして２〜８℃での保存中の安定性を保証するために、pHを0.8〜1.0に調整する。この濃縮されたサブグループには、還元グルタチオンおよびL-アスコルビン酸-２-リン酸の塩（例えばマグネシウム塩）が含まれる。米国特許第5,474,931号を参照されたい。アスコルビン酸は溶液中で比較的短い半減期を有するため、リン酸塩はアスコルビドの水中で3X濃縮物として調製され、そして溶解される。溶液が保存される場合、溶液は濾過滅菌されるべきである。本発明はまた、ウシ、ヒト、または他の供給源から得られた他のアルブミン（無脂質、貧脂質もしくは脂質リッチ）、おアミノ酸溶液のpHを約7.0〜7.4まで上げ、アルブミン溶液およびトランスフェリンを添加する。インスリンは0.03N HCl中に前もって可溶化し、そしてpHを0.5 N Na0Hで10.0にする。インスリンもまた10を超えるpHで可溶化し、次いで添加し得る。インスリンは、組換え体および動物（ヒトを含む）供給源の両方から入手可能である。好適な実施態様の一つでは、ウシ亜鉛インスリンを使用する。微量元素部分は、細胞培養グレードの水で作製される0.01N HCl中に濃縮保存溶液（例えば、1000×）として作製される。可溶化後、微量元素部分溶液は、アミノ酸溶液に直ぐに添加され得るか、または濾過されてから窒素ガス下で-70℃ にて保存し得る。トランスフェリンは貧鉄または鉄飽和であり得、そして異なる供給源（ウシ、ヒト等）に由来し得る。好適な実施態様では、鉄飽和ヒトトランスフェリンを使用する。アルブミン-アミノ酸-トランスフェリン混合物のpHを５N Na0HでpH7.7〜7.9に調整し、そしてインスリンおよび微量元素を添加する。所望の容量になるように細胞培養グレードの水を添加し、そしてこの水溶液を濾過滅菌する。それから、この補充物は、培養中のES細胞および他の細胞の増殖用に、血清の代わりに、そして血清と同じ濃度で使用され得る。本発明の補充物は、好ましくは約４℃で、最も好ましくは約−20℃で保存されるが、この補充物は、もっと低い温度（例えば、約−80℃）で保存され得る。好ましくは、本発明の培地は、約４℃で保存される。種々の置換物（例えば、トランスフェリン置換物、インスリン置換物、アルブミン置換代替物など）は、本発明の補充物または培地を調製するために使用され得る。このような置換物を用いて本発明の補充物または培地を作製するための濃度および手順は、過度の実験を伴うことなく当業者により決定され得る。本発明はまた、基本培地を本発明の無血清補充物と組み合わせることにより調製した真核生物細胞培養培地を提供する。この組み合わせは、基本培地を無血清補充物と混合または混和することにより達成され得る。好適な基本培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、最少必須培地（MEM）、イーグル基本培地（B ME）、RPMI1640、F-10、F-12、α最少必須培地（αMEM）、グラスゴー最少必須培地（G-MEM）、およびイスコフ（Iscove）改変ダルベッコ培地を含むが、これらに限定されない。好ましくは、１×培地の容量オスモル濃度は、約280〜310mOsmolである。しかし、１×培地の容量オスモル濃度は、約260mOsmol程度に低くてもよく、約350mO smol程度に高くてもよい。好ましくは、基本培地には、約2.2g/Lの重炭酸ナトリウムが補充される。しかし、約3.7g/Lまでの重炭酸ナトリウムが使用され得る。この培地には、L-グルタミン（１×培地中の最終濃度は約2mM）、１種以上の抗生物質、NEAA（１×培地中の最終濃度は約100μM）、２-メルカプトエタノール（１×培地中の最終濃度は約100μM）が、そしてES細胞についてはLIF（１×培地中の最終濃度は約10ng/mL）がさらに補充され得る。本発明の無血清補充物および培地は、多くの動物（ヒト、有尾猿（monkey）、無尾猿（ape）、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類を含む）由来のES細胞の培養に使用され得る。本発明の無血清補充物および培地はまた、ES細胞以外の他の種類の細胞の培養にも使用し得る。例えば、BHK21、VERO、HeLa、Hep2、マウスＴ細胞株（例えば、CDC-25）、形質転換されたリンパ球細胞株（例えば、HL6）、LLCMK2、PC-12、ハイブリドーマ細胞、繊維芽細胞、または他の細胞株は、本発明の無血清補充物を補充した基本培地中で培養され得る。好ましくは、本発明の補充物および培地は、ES細胞またはハイブリドーマ細胞のいずれの培養にも使用される。最も好ましくは、本発明の補充物および培地は、ES細胞の培養に使用される。 ES細胞を継代するには、先ずこの培養物を、Ca²⁺、Mg²⁺を含まないダルベッコ -リン酸緩衝化生理食塩水（DPBS）で１回または２回リンスする。十分量のトリプシン-EDTA（0.25％トリプシン、１mM EDTA）を細胞層を丁度覆うように添加し、そして培養容器をインキュベーターに戻す。数分後、ES細胞のコロニーおよび支持細胞をプラスチック容器から剥離し、ピペッティングによりさらに分離し得る。トリプシン活性を消失させるために増殖培地を添加し、そして細胞は通常の場合遠心分離によりペレット化する。上澄みを取り除き、そして細胞を新しい増殖培地に再懸濁する。新しい支持層を含む新たな培養容器に細胞を移す。ES細胞は、古い支持細胞から分離されない。古い支持細胞は、新しい培養では効率的に付着しない。当業者は、ES細胞および支持細胞を培養する方法に精通している。ES細胞培養のガイドラインは、Hogan，Gら編、マウス胚の操作：A Laboratory Manual，Col d Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY(1994)；およびRobertson,E .J.編、奇形ガンおよび胚性幹細胞：A Practical Approach，IRL Press Oxford ，UK(1987))により概説されている。初代マウス胚線維芽細胞またはSTO細胞は、代表的に支持細胞として使用されるが、他の種類の繊維芽細胞を使用しても良い。初代マウス胚線維芽細胞は、細かく刻まれた約13日齢の胚を培養し、そして数回の継代にわたって線維芽細胞集団を増殖させることにより作製される。対照的に、STO細胞は、胚系統の永続的な細胞株であり、初代細胞よりも長期に培養され得る。いずれの型の支持細胞も、使用前にマイトマイシンCまたはγ線照射での処理により不活化される。支持細胞は、このような処理後も代謝的に活性なままであるのに対し、この処理により支持細胞の有糸分裂は不活化される。ES細胞を継代するたびに、ES細胞は、支持細胞の新しい層の上に配置される。本発明はまた、無血清培地中にES細胞を含む組成物を提供する。ここで、本発明の無血清補充物が添加される無血清培地は、無血清培地中のES細胞の増殖を支持し得る。この組成物のアリコートは、約-80℃以下で凍結し得る。この組成物のアリコートを、約-135℃以下で無期限に凍結し得る。この組成物のアリコートを融解しそして開けた後に、滅菌細胞培養技術を用いて、ES細胞を無血清培地中で培養し得る。ES細胞を入手し得る動物は、ヒト、有尾猿（monkey）、無尾猿（ ape）、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類を含む。本発明はまた、ES細胞のアリコートおよび本発明の補充物を含む容器手段を含む製造製品を提供する。本発明はまた、本発明の無血清培地中のES細胞の組成物のアリコートおよび無血清培地を含む容器手段である製造製品を提供する。本発明はまた、一個以上の容器手段を含む製造製品を提供する。ここで、第一の容器手段には、本発明の補充物または本発明の無血清培地が含まれる。必要に応じて、第二の容器手段には、基本培地が含まれる。必要に応じて、第三の容器手段には、ES細胞が含まれる。本発明の補充物を含む製造製品は、好ましくは約４℃で、そして好ましくは約-20℃で保存される。本発明の培地を含む製造製品は、好ましくは約４℃で保存される。本発明はまた、無血清培養でES細胞を拡大する方法を提供する。この方法では、ES細胞は、本発明の無血清培地を用いて無血清培養で培養される。この無血清培地には、本発明の無血清補充物が含まれる。本発明はまた、無血清培養でのES細胞の分化を制御または防止する方法を提供する。本発明の補充物は無血清であるので、培養中のES細胞を未分化かつ多分化能状態に維持することを容易にする。所望の場合、細胞培養培地には、白血病阻害因子(LIF)(Life Technologies，Inc.)が補充され得る。ES細胞の分化を阻害する他の因子としては、S1因子（Matsui，Y.ら、Cell 70:841-847（1992）；および毛様体神経栄養因子（CNTF）（Conover，J.C.ら，Development 119:559-565(1 993)））およびオンコスタチンM（Conover，J.C.ら，Development 119:559-565( 1993)）が挙げられるが、これらに限定されない。 ES細胞の分化は、アルカリホスファターゼの組織化学的アッセイにより評価され得る（Pease，S.ら，Devel．Biol.141:344-352(1990)）。例えば、実施例１に示したように、Sigmaの診断キット86-R（Sigma Chemical、St．Louis，MO）が使用され得る。他のマーカーは、ES細胞の分化の程度を評価するために使用され得る。例えば、ECMA-7またはTROMA-1モノクローナル抗体が使用され得る（Brulet ，P.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA:77:4113-4117(1980)）。従って、当業者は、無血清補充物を用いた無血清培養でES細胞を培養することにより、ES細胞を拡大し、そして培養中に分化するのを防止し得る。本発明の無血清補充物はまた、ES細胞を目的の細胞型に分化させるためにも使用され得る。当業者は、インビトロでES細胞を分化させるための技術に精通している。例えば、Dinsmore，J.ら，Cell Transplantation 5:131-143（1996）；Ra y，W.J.ら，J.Cell．Physiol．168:264-275(1996)；Palacios，R．ら，Proc.Nat l．Acad．Sci．USA 92:7530-7534(1995)；Setlow，J.K.，Genelic Engineering: Principles and Methods 16:17-31，Plenum Press(1994)；Pedersen，R.A.，Rep rod．Fertil．Dev．6:5543-552(1994)；Doetschman，T.ら，Hypertension 22:61 8-6629(1993)；Snodgrass，H.R．ら，J.Cell．Biochem．49:225-230(1992)；およびHollands，P.，Human Reprod．6:79-84(1991)を参照のこと。本実施態様では、本発明の無血清補充物が補充された基本培地を含む無血清培地中でES細胞は拡大する。拡大中は、分化は阻害される。未分化のES細胞コロニーは培養容器から取り出され、新しい培養容器に移され、そして分化した細胞型の集団を形成させる特定の方法において本発明の無血清培地中で培養される。あるいは、ES細胞は、ES細胞を目的の細胞型に分化させる１個以上の増殖因子で処理される。分化を促進するために、培養されたES細胞は、１個以上の核酸構築物で処理され得る。ここで、各構築物は、目的のタンパク質をコードする核酸分子を含有し、その発現は、目的の細胞型へのES細胞の分化に寄与する。 ES細胞が分化させられ得る細胞型には、ニューロン、心筋心房細胞、心筋心室細胞、骨格筋、グリア細胞、内皮細胞、上皮細胞、腎細胞、肝細胞、および造血細胞（造血幹細胞、造血始原細胞、および造血前駆細胞、白血球、マクロファージ、好酸球、好中球、赤血球、網状赤血球、Ｂ細胞、ならびにＴ細胞を含む）が含まれるが、これらに限定されない。 ES細胞は、特定の細胞型へのES細胞の分化を誘導するために、特定の因子とともにインキュベートされ得る。このような因子は、当業者に周知である。例えば、このような因子には、インターロイキン、サイトカイン、コロニー刺激因子、増殖因子、およびインターフェロンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の無血清補充物はまた、哺乳動物への外植用の目的の細胞型を調製するために使用され得る。本実施態様では、分化が生じた（上記の）細胞は、哺乳動物に導入される。例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、または造血始原細胞への分化が生じたES細胞は、哺乳動物の骨髄または血流に導入され得る。任意の分化した細胞型は、哺乳動物の血流または骨髄に導入され得る。あるいは、目的の分化した細胞型は、皮膚、脳、骨格筋、心臓、肺、腎臓、膀胱、乳房、胃、食道、小腸、大腸、精巣、前立腺、子宮、卵巣、リンパ腺、肝臓、牌臓、胸腺、および甲状腺のような組織に導入され得る。分化した細胞が外植され得る哺乳動物としては、ヒト、有尾猿、無尾猿、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、およびヒツジが挙げられる。本発明の無血清補充物はまた、無血清培養で培養したES細胞（または他の細胞型）において組換えタンパク質を発現するために使用され得る。一般的に、培養した胚盤胞からES細胞を単離し、そして単離されたES細胞を、ES細胞の拡大の促進およびES細胞の分化の阻害に適した条件下で無血清培養で培養することにより、組換えタンパク質は得られる。より詳細には、組換えタンパク質は、目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む核酸構築物（すなわち、DNA）をES細胞に（例えば、当業者に公知のエレクトロポレーション法またはトランスフェクション法により）導入することにより得られる。核酸構築物の導入後、組換えES細胞は選択され、そして本発明の無血清補充物を補充した基本培地を含む無血清培養で培養される。組換えタンパク質は、当業者に周知の方法により、ES細胞から単離され得る。例えば、Ausubel，F.M.ら編、Current Protocols in Molecular Bi ology，John Wiley & Sons(1994)を参照のこと。ES細胞を支持細胞と同時培養する場合、組換えタンパク質は、ES細胞および支持細胞の混合物から単離され得る。組換えタンパク質がES細胞から分泌される場合、組換えタンパク質は、ES細胞を培養した無血清培地から採集され得る。本発明の無血清補充物はまた、トランスジェニック動物を作製するためにも使用され得る。これは、無血清培養でES細胞を培養する工程、ES細胞に核酸分子を導入する工程、組換えES細胞クローンを選択する工程、組換えES細胞クローンを拡大させて集団を形成させる工程、組換えES細胞クローン集団のアリコートを胚盤胞に注入する工程、注入された胚盤胞を宿主偽妊娠雌性動物に移す工程、およびトランスジェニック子孫を選択する工程により達成される。本発明はまた、この方法により得られたトランスジェニック動物も提供する。トランスジェニック動物はまた、無血清培養でES細胞を培養する工程、ES細胞に核酸分子を導入する工程、組換えES細胞クローンを選択する工程、組換えES細胞クローンを拡大させて集団を形成させる工程、少数のES細胞を初期胚（例えば、８細胞桑実胚）とともに同時培養して凝集物を形成させる工程、凝集した胚を宿主偽妊娠雌性動物に移す工程、およびトランスジェニック子孫を選択する工程によっても作製され得る。本発明はまた、この方法により得られたトランスジェニック動物も提供する。トランスジェニック動物を作製するために使用され得る動物としては、ヒト、有尾猿、無尾猿、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類が挙げられる。達成されるトランスジェニック操作は、優性の正の増強または標的化された修正（Merlino，G.T.，FASEB J．5:2996-3001(1991)）を含む機能獲得変化；および優性の負の妨害、標的化されたノックアウト、または条件的ノックアウト（Merlino，G.T.，FASEB J．5:2996-3001(1991)；Barinaga，M.，Science 265:26-28（1994）；Gu，H.らScience 265：103-106(1994)）を含む機能喪失変化を含むがこれらに限定されない任意のトランジェニック操作であり得る。この方法は、当業者により日常的に実施され得る。トランスジェニック動物から組換えタンパク質を生産するために、無血清補充物あるいは本発明の培地を使用し得る。この実施態様では、トランスジェニック動物を生産するために使用するES細胞を、本発明の無血清補充物で補充した基本培地を含む無血清培地中で培養する。この実施態様では、トランスジーンを、組織特異的プロモーターに操作連結し得る。米国特許第5,322,775号を参照すること。トランスジェニック動物の血液あるいは乳汁から、組換えタンパク質を単離する。この実施態様を実施するために使用され得る動物には、ウシ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギなどが含まれる。本発明の無血清補充物をまた、動物からES細胞を単離するために使用し得る。新しい、有用なES細胞株を樹立するために、このような単離ES細胞を使用し得る。この実施態様では、単離されたES細胞を、本発明の無血清補充物を補充した基本培地を含む無血清培地中で培養する。ES細胞が、本発明の補充物および培地を使用して得られ得る動物には、ヒト、有尾猿、無尾猿、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類を包含する。現在本発明を完全に記述している同様なものは、例示の目的のみで本明細書中に含まれる特定の実施例を参照することによってより明白に理解されるが、本発明を限定する意図はない。以下の実施例において、他に特定しなければ、すべての培地、培地補充物、増殖因子および細胞培養試薬は、Life Technologies，Inc．(Gaithersburg,MD)から生産された。支持細胞培地は、以下のような最終成分濃度のDMEM(カタログ番号11965)から構成された：10％のFBS、2mMのL-グルタミン、50U/ｍＬのペニシリンおよび50μg/mLのストレプトマイシン。以下の実施例において、ES細胞血清補充培地は、15％のES適格FBS、2mMのL-グルタミン、100μMのNEAA、50U/ｍＬのペニシリン、50μg/mLのストレプトマイシンおよび100μMの2-メルカプトエタノール(Sigma)の最終濃度を有するDMEMから構成された。ES細胞培地にLIFを使用した場合、1000U/mL（10ng/mL）の最終濃度を得るために、ESGRO^TM（マウス組換えLIF）を添加した。実施例１基本処方物の確立 ES D3 ES細胞（Doetschman,T.C.ら,J.Embryol．Exp.Morph.87:27-45(1985)）を使用した。他に特定しなければ、15継代のD3細胞を使用した。細胞層をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）でリンスした後、プレートから細胞を除去するため、トリプシン−EDTA(0.25％、1mM)を使用した。加湿37℃、10％CO₂インキュベーター（恒温器）で細胞を培養した。培地処方物評価アッセイのプロトコルは以下のとおりであった。実験のための ES細胞の供給源は、LIFとともにES細胞培地の支持細胞層上で維持された、ES細胞のサブコンフルエント皿であった。実験条件のための支持細胞層を、3〜5×10⁴ 支持細胞/cm²を播種し、そして細胞を付着させることにより、６ウェルプレート（NUNC）中で確立した。ES細胞をトリプシン処理し、細胞懸濁物を形成した。トリプシン活性を血清補充培地でクエンチングし、そして細胞を、500×ｇの遠心分離によりペレット化した。培地を除去し、ES細胞を、2ｍＭのL-グルタミン、50U/ｍＬのペニシリン、50μg/mLのストレプトマイシン、100μMのNEAAおよび 100μMの2-メルカプトエタノール（最終濃度）を含有するDMEMに再懸濁した。次いで、ES細胞を、90細胞/mLの濃度で、各試験培地（以下に記述する）と混合した。次いで、支持細胞培地を支持細胞プレートから除去し、そして支持細胞層を、2mLのDMEM（血清あるいは他のいかなる添加剤を補充しなかった）で１回洗浄した。2.5ｍＬの試験培地およびＥＳ細胞（225／ウェル）を、各ウェルの支持細胞に添加した。試験条件を3重（３ウェル／試験条件）にアッセイした。ＥＳ細胞増殖パラメータに関して観察を行う間、細胞を７日間インキュベートした。インキュベーション条件は、37℃、空気中10％ CO₂および加湿雰囲気であった。７日間の培養期間の終了時に観察を行ない、次いでＥＳ細胞を収集、固定し、組織化学的アッセイ（Sigma診断キット86-R,Sigma,St.Louis,MO）を使用して、アルカリホスファターゼの存在をアッセイした。製造業者の指示に従って、細胞を固定し、アッセイした。このアッセイでは、アルカリホスファターゼを発現する細胞は、暗紅色あるいは赤色に染色される。ＥＳ細胞コロニーを、以下のようなパラメータに従って、アルカリホスファターゼ染色の形態および強度の点から評価した。クラスＩコロニーは円形で、暗紅色に染色され、輪郭のはっきりとしたコロニー辺縁を特徴とする、所望の未分化コロニー形態をもつ。クラスIIコロニーは分化し始めており、少なくとも60％紅色に染色され、はっきりとしない辺縁を有する、より平たくなった外観をもつ。クラスIIIコロニーは、明らかなコロニー分化の徴候を示し、ごくわずかな紅染色から紅染色ではない染色を有し、はっきりとした辺縁を有さない、平たくなった外観をもつ。ES細胞（225／ウェル）の入力数から得られたコロニーの全数を除することにより、プレーティング効率を決定した。未分化ＥＳ細胞の増殖および維持を促進する能力について、上述のように、無血清培地補充物を評価アッセイで試験した。この補充物の基本処方物は、表１および3（各表の最右欄）に記述するとおりであったが、L-アスコルビン酸−2-ホスフェートを欠いていた。この処方物を、他の細胞型で有益であると知られている成分を含有する、別の無血清処方物と組合わせて試験した。これらの他の成分である、15μg/Lのクエン酸鉄、0.3μg/Lのグリシル-ヒスチジル-リジンおよび3 00μg/Lのエタノールアミンを、a＋/−様式での全ての組合せで試験した。処方物をDMEMに添加して、15％の最終濃度とした。すべての場合において、一般的なプレーティング効率、および観察された未分化ESコロニーの数は、これらの成分の有無に関わらず変化しなかった。従って、クエン酸鉄、グリクロ（glycl）− ヒスチジル−リジンおよびエタノールアミンは、至適ES細胞の増殖に必要でないと結論した。実施例２基本処方物の改良次いで、実施例１で最良に機能した処方物を、その機能を高めるために改良され得るかどうかをみるために、さらに評価した。アスコルビン酸ホスフェートが存在しないことを除いて、この処方物は、表１および３の各々の最右欄の処方物と同じであった。最適下限（sub-optimal）であった補充物の一つの局面は、３日より多い日数、同じ培養容器で維持されたES細胞培養物における支持細胞層の形態と関連した。一般に、ES細胞を２日置きまたは３日置きに継代する。代表的には、抗生物質耐性ES細胞の選択の間、10日以上、継代することなく、培養物を維持する。しかし、本発明の補充物（アスコルビン酸-2-ホスフェートなし）を補充した培地中でのこれらの延長された培養期間の間、個々の支持細胞の剥離のために、支持細胞層は希薄およびまだらになることに留意された。剥離細胞は、増殖培地中で浮遊することが観察された。さらに、付着して残存する支持細胞は、FBSを補充した培地中で増殖したコントロール細胞と比較して、所望でない形態学（すなわち、紡錘形態、凸凹輪郭）を示した。さらに、これらの紡錘状、凸凹様の支持細胞において増殖するES細胞コロニーは、FBSを充填した培地で増殖したES細胞コロニーと比較して、全体のサイズで著しく減少した。処方物を改良するため、処方物へのL-アスコルビン酸-2-ホスフェートの添加を評価した。評価アッセイ（実施例１のように）では、培地に無血清補充物（15％の最終濃度まで）を、L-アスコルビン酸-2-ホスフェート（50mg/Lの最終濃度）有りまたは無しのいずれかで補充し、および10mg/mL（最終濃度）のLIFを補充した。３つのウェルの平均結果を表４に示す。表４では、括弧外の数字は、示された程度の分化を示したES細胞コロニー数である。括弧内の数字は、示された程度の分化を伴うコロニーを表す全ES細胞コロニーが何パーセントかを示す。表４では、「良好な」支持細胞形態は、紡錘状、凸凹様特性ではなく、むしろより線維芽細胞様の特性および滑らかな辺縁を反映する。表４の結果は、L-アスコルビン酸-2-ホスフェートが、増殖培地のLIFの通常の有益な作用とは独立して、支持細胞層の外観を直接的に改善することを示唆する。増殖培地中のLIFとともに、L-アスコルビン酸-2-ホスフェートは事実上、得られた形態学的クラスのコロニーに影響を及ぼさなかった。しかし、L-アスコルビン酸-2-ホスフェートは、平均コロニーサイズ（増殖速度の指標）を幾分か増大させた。これはおそらく支持細胞層の改善によるものであった。培地中LIFなしでは、この効果はより劇的であった。LIFの非存在下、そしてL- アスコルビン酸-2-ホスフェートの存在下において、クラスＩコロニーのパーセントは増加し、クラスIIコロニーのパーセントは減少し、コロニーサイズは非常に改善された。この実験では、LIF単独はプレーティング効率に正の効果有したが、L-アスコルビン酸-2-ホスフェート単独はプレーティング効率にほとんど影響を及ぼさなかった。L-アスコルビン酸-2-ホスフェートは有意な負の効果を引き起こさず、そしてコロニーサイズおよび支持細胞層形態を明らかに改善したので、L-アスコルビン酸-2-ホスフェートを、本発明の処方物に添加した。実施例３本発明のES細胞の日常的な増殖および維持 LIF（10ng/mLの最終濃度）、および本発明の補充物（15％の最終濃度で）またはES適格FBS(15％の最終濃度で)のいずれかを補充したDMEMで、当業者に公知の標準ES培養実務（上記）に従ってES細胞を増殖および継代した。培養物を４継代について維持した。細胞数および細胞形態を、各継代で評価した。ES細胞形態は、本発明の無血清補充物を補充した培地での増殖を、2日以内に改善した。経時的に、無血清補充物を補充した培地に培養したES細胞の形態は、FBS補充培地中で増殖したES細胞の形態よりも常にすぐれていた。本発明の無血清補充物を補充した培地で増殖した細胞について、細胞数は、FBS補充培地で増殖した細胞よりも高くはないとしても、少なくとも、等しかった。観察された細胞数の増加は、無血清補充物を補充した培地で培養した細胞にみられたプレーティング効率の増加によるもののようであった。４継代後に、FBS補充培地中で増殖した細胞、および本発明の無血清補充物を補充した培地で増殖した細胞で、Mouse Y・ES^TMシステム（Life Technologies,In c.）を使用して、染色体分析を行なった。２つのセットの細胞間に有意な差異を観察しなかった。分析した（各セットの細胞に対して25）すべての拡散は、＞9 0％の止常な二倍体数を示した。ES細胞の正常な倍数性の維持および未分化特性により、培養条件がES細胞に対して適切であることが示唆される。実施例４無血清培地を補充した培地での他のES細胞株の培養本発明の補充物がD3株以外の他のES細胞株に有用であるかどうかを決定するために、３種類の追加のES株を、本発明の無血清補充物を補充した培地中で培養した。2匹のマウス系129ES株であるE14（Hooper,M.,Nature 326:292-295(1987)およびR1（Nagy,A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8424-8428(1993)）を評価した。加えて、非129ES株であるTT2（C57B1/6 X CBAF₁）（Yagi,T.ら、Analyt．Bioc h．214:70-76(1993)を評価した。すべての３つのES細胞株について、無血清補充物を補充した培地中で増殖した細胞は、一般的に改善した細胞形態（すなわち、滑らかな細胞辺縁のある円形細胞）を示し、FBS補充培地中で増殖した細胞と比較して、あまり分化していなかった。従って、無血清条件下で、いずれかのES細胞株を培養するのに、本発明の無血清補充物を使用し得る。実施例５ ES適格FBSおよび他の市販ウシ胎仔血清と無血清補充物との比較実施例１のように、評価アッセイを実施した。ここで、８つの異なる試験条件下でD3 ES細胞を培養した。a)本発明の無血清補充物の2つの異なる製造ロット、 b)ES適格FBSのロットおよびc〜g)5つの異なるロットの市販血清（Hyclone，Loga n，Utah）を補充した培地；を別々に補充した培地で細胞を培養した。すべての試験条件において、培地は10ng/mL（最終濃度）のLIFを含有した。結果（3ウェルの平均）を表５に示す。表５では、括弧外の数宇は、示される程度の分化を表すES細胞コロニー数である。括弧内の数字は必要とする程度に分化したコロニーである総ES細胞コロニーのパーセントを示す。本発明の無血清補充物の２つのロットは全く同じように機能した。すなわち、 ES細胞は高いプレーティング効率を示し、ほとんど分化せず、すぐれた細胞およびコロニー形態を示した。2つのロットの同等の機能により、その明確で、再現し得る組成物により、ES細胞培養に使用する、一定のロットの無血清補充物を予備試験する必要がないという事実が支持される。無血清補充物はES適格FBS（表５）よりも明らかにすぐれている。無血清補充物はプレーティング効率の増加を助長し、未分化ES細胞コロニー数を＞50％増加させた。無血清補充培地で増殖したES細胞でみいだしたアルカリホスファターゼのすぐれた形態および濃染色の例は図１および２に示されている。市販されているFBSの5つのロットと比較して、無血清補充物を使用して、さらにより劇的な結果が得られた（表５）。市販FBSを使用して得られた結果は、ロット毎に非常に異なった。これらの結果は、FBSを、ES細胞培養で使用する前に予めスクリーニングしなければならないこと明らかに示す。予備スクリーニングの血清に必要なものは、本発明の無血清補充物により得られる。実施例６ ES細胞の分化血清補充培地で培養する場合、ES細胞はin vitroで分化し、そして他の細胞型の形態および特徴を獲得する。特定のプロトコルに従うことにより、分化アッセイを使用して、特定の型の分化した細胞を再現性よく得ることができる（Doetsc hman、T.C.ら、J.Embryol.Exp.Morph.87:27-45(1985)。簡単には、ES細胞のプレートをトリプシン処理し、そして支持細胞の非存在下およびLIFの非存在下で、静電気的に荷電していないプラスチック上に再プレート化した。これにより、ES細胞は培地において浮遊するボールへと凝集した。これらの細胞ボール（胚様体と呼ばれる）は、分化し始めた。胚様体は、懸濁培養液中で増殖し続けるか、または静電的に荷電したプラスチック（支持細胞なし）に付着するかのいずれかであった。プラスチックに付着した胚様体から、細胞は、分化した集団（mass）から増殖した。in vitroで拍動する心臓細胞を含む多数の種々の細胞型が、胚様体から増殖した。本発明の無血清補充培地で培養したES細胞について、分化アッセイを実施した場合、FBS補充培地で培養した細胞に対して、形成された胚様体数は減少した。延長した培養期間（約３週間）の後、無血清補充物を補充した培地に形成された胚様体は、非常により顕著な円形状となった。静電的に荷電したプラスチックにプレートし、付着させると、胚様体は、不確定の付着因子を供給するための１％のFBS添加なしには付着しなかった。いったん付着すると、胚様体から増殖した分化細胞はFBS補充培地でみられたものとはかなり異なっていた。分化し、付着した胚様体から増殖した細胞は、大きな細管構造および嚢を形成したものを含んでいた。対照的に、血清を補充した培地（１％最終濃度FBS）で培養したES細胞は生存しないか、または胚様体を形成しなかった。精製した付着因子は、このような因子を供給するのに使用した１％血清を置換し得ることが期待される。特定の因子を添加し得る無血清増殖物質を使用することは、ES細胞が種々の前駆体または他の分化した細胞型に分化するのが望ましい培養系では、より顕著な実験的な制御および柔軟性を可能にする。実施例７ G418耐性ES細胞の選択本発明の無血清補充物は、薬物耐性ES細胞の選択を容易にする。ES細胞を、FB S補充培地、または本発明の無血清補充物を補充した培地のいずれかにおいて増殖させた。細胞の各セットについて、3.4×10⁶細胞を、neo遺伝子（これは、抗生物質G418に対する耐性を付与する）を含むDNAベクターとのエレクトロポレーション（リン酸緩衝化生理食塩水において）に供した。エレクトロポレーションの後、細胞を、FBS補充培地、または本発明の無血清補充物を補充した培地のいずれかにおいて、neo耐性支持細胞に再プレートした。細胞の両セットを、それぞれ補充培地およびG418の添加の前に、24時間培養した。薬物選択を、３連のプレートにおいて、０、150、250、350、および450μg/ mL G したES細胞は、２日間で、コンフルエントおよび過剰増殖であった。薬物を含まないES細胞の培養を、この時点で終結させた。 G418耐性細胞のコロニーを、FBS補充培地において培養した細胞から得られた耐性コロニー（すなわち、６日）と比較して、本発明の無血清補充物を補充した培地において培養した細胞からより迅速に（すなわち、４日後）得た。さらに、さらなる数のより耐性なコロニーを、本発明の無血清補充物を補充した培地において培養した細胞から得た。無血清補充物は、試験したG418濃度の全ての範囲（150μg/mL〜450μg/mL）にわたって、G418耐性コロニーのよりよい選択を促進した。例えば、250μg/mL G4 18で、全72の耐性コロニーを、FBS補充培地において得た（エレクトロポレーションした3.4×10⁶細胞のうち）。対照的に、無血清培地を補充した培地において培養した細胞において、1104の耐性細胞を単離した（エレクトロポレーションした3.4×10⁶細胞のうち）。さらに、これらの耐性コロニーは、FBS補充培地において選択した薬物耐性コロニーと比較して、改良された形態（すなわち、丸くなった細胞、平滑な輪郭、少ない分化）を示した。増加した選択効率が、無血清補充物を補充した培地において培養したES細胞の形質転換の実際の効率における増加に起因することは可能である。あるいは、無血清補充物によって付与された細胞生存度のレベルにおける増加が、耐性コロニーの数における全体の増加に寄与することは可能である。実施例８無血清補充培地において培養したES細胞の生殖系列コンピテンスの実証継代16でのR1 ES細胞（Nagy,A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8424-8428(19 93)）を、FBS補充培地（最終濃度17.5％）または本発明の無血清補充物を補充した培地のいずれかにおいて、12〜14日間（４〜５継代）培養した。この実験の経過の間、無血清補充物を補充した培地で増殖させたES細胞コロニーは、血清補充培地において増殖したES細胞コロニーより、より丸くかつより清澄な様子（すなわち、平滑な細胞輪郭を示した）であることを観察した。 12または13日目（継代20）および14日目（継代21）で、無血清補充物を補充した培地において培養したES細胞を、胚盤胞に注入した。FBS補充培地において培養したES細胞を、12日目（継代20）および14日目（継代21）で注入した。C57B1/ 6胚盤胞を、５％無血清補充物または５％FBSのいずれかで補充した培地に注入した。全ての注入した胚盤胞を、宿主雌に移した。表６は、出産データを示す：生まれたマウスの全数、生まれたキメラの数、およびキメラの性別。表６において、括弧の外側の数は、示した培地を用いて得られる仔の数である。かっこ内の数は、動物の示されたカテゴリーが、全動物の何％を表すかを示す。同腹仔は70％雄であり、これはおそらく、雄ES細胞株による雌胎仔の性変換を反映する。２つの試験条件において、全ての生まれた仔の％またはキメラ仔の％における有意な差異は観察されなかった。キメラ仔の性別における可能な差異は、分析に利用可能なコントロール仔の数が少ないことに起因して、適切に判定し得なかった。全体として、優れた生殖系列の伝達を得た。ES細胞成分の伝達は、雄および雌動物の両方からの７のキメラ（78％）において、5 〜100％の範囲の毛皮色への寄与を伴って観察された（表７）。全ての子孫が、健常なようであった。本発明の１つの特徴が、ES細胞（無血清補充物を補充した培地を用いて培養した）を胚盤胞に注入する間に明らかになった。ES細胞の胚盤胞への注入のプロセスは、正確な技術およびハイレベルの技術トレーニングを必要とする。注入培地処方物は、研究所毎にわずかに異なるが、一般的には、ES細胞が注入プロセスの間に健常なままであることを確実にするために、少なくとも５％FBSを含む。注入プロセスは、FBS補充培地において培養したES細胞の固有の粘着性によって妨害される。注入ピペットは容易に詰まり、そして頻繁な交換を必要とする。対照的に、本発明の無血清補充物で調製した注入培地は、FBS補充培地を用いて得られるES細胞懸濁物より非常に少ない粘着性のES細胞懸濁物の形成を容易にした。従って、代表的な技術的に困難な注入プロセスは、より容易でかつより時間のかからないものになった。実施例９ハイブリドーマ細胞培養本発明の無血清補充物を使用して、ハイブリドーマ細胞もまた増殖し得る。表８および９は、SP2/0（表８）およびAE-1（表９）ハイブリドーマ細胞の培養の結果を示す。表８および９の両方において、結果を、３〜４日間隔の４継代培養にわたって、25cm²プラスチックフラスコ（細胞培養グレード）あたりの細胞の数（×10⁶）として示す。付着因子は必要ではなかった。プラスチック増殖表面の処理も必要ではなかった。細胞を、標準的な細胞培養技術を用いてフラスコから除去した。培養物の表面を、冷Dulbeccoリン酸緩衝化生理食塩水（DPBS）で洗浄した。この洗浄の後に、1.0mLの冷トリプシン-EDTA（0.25％トリプシン、１mM EDTA）（Llfe Technolo gies，Inc.）で処理した。トリプシンEDTAを、３〜５分間細胞表面に定着させ、次いで、細胞を、フラスコの表面から、手のひらに対して強く振り動かすことによって脱着させた。トリプシン活性を、DPBS中の1.5mLの大豆トリプシンインヒビター（0.1mg/mL）（Sigma,カタログ番号T9218）の添加によってクエンチした。細胞を、トリパンブルー排除法を用いて計数した。新たな培養を、25cm²プラスチックフラスコあたり2.5×10⁵でプレートした。プレートした細胞を、37℃にて５％CO₂雰囲気において培養した。表８および９の両方に示された結果を、２mM L-グルタミン（Life technologies，Inc.）を補充したRPMI 1640培地を用いる実験において得た。表８および９における結果は、ハイブリドーマ細胞を、本発明の無血清補充物を補充した基本培地において培養し得ることを示す。 ^*×10⁶細胞／25cm²フラスコ ^*×10⁶細胞／25cm²フラスコ本発明の補充物および培地を使用して、任意のハイブリドーマ株を培養し得る。当業者は、SP2/0およびAE-1以外の他のハイブリドーマ株に精通している。例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション細胞株およびハイブリドーマカタログを参照のこと。個々の刊行物、特許出願、または特許が参考として援用されることが、特別におよび個別に示されているかと同じ程度まで、全ての刊行物、特許出願、および特許を、本明細書中で参考として援用する。前述の発明は、理解を明確にする目的のために、説明および実施例によって、いくらか詳細に記載されているが、特定の変更および改変が、添付の請求の範囲内で実施され得ることが明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ゴールズボロー，マインディーディー. アメリカ合衆国メリーランド 20879, ゲイザーズバーグ，ジャイアントステッププレイス 8304 (72)発明者ティルキンス，メアリーリンアメリカ合衆国ニューヨーク 14304, ナイアガラフォールズ，リンドバーアベニュー 6716

Claims

【特許請求の範囲】１．アルブミンまたはアルブミン置換物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン置換物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン置換物、１つ以上のコラーゲン前駆体、および１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分を含む無血清真核生物細胞培養培地補充物であって、ここで該補充物で補充された基本細胞培養培地が、胚性幹細胞の無血清培養中での増殖を支持し得る、無血清真核生物細胞培養培地補充物。２．アルブミンまたはアルブミン置換物、ならびに１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン置換物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン置換物、１つ以上のコラーゲン前駆体、および１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分を含む無血清真核生物細胞培養培地補充物であって、ここで該補充物で補充された基本細胞培養培地が、胚性幹細胞の無血清培養中での増殖を支持し得る、無血清真核生物細胞培養培地補充物。３．前記抗酸化剤が、還元グルタチオンおよびアスコルビン酸アスコルビン酸-2 −ホスフェートからなる群から選択される、請求項１に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。４．前記コラーゲン前駆体が、L-プロリンおよびその多量体または誘導体、L-ヒドロキシプロリン多量体またはその誘導体、ならびにアスコルビン酸およびその多量体からなる群から選択される、請求項１に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。５．前記トランスフェリン置換物が、クエン酸第二鉄キレートおよび硫酸第一鉄キレートからなる群から選択される鉄キレートである、請求項１に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。６．前記トランスフェリン置換物が、硫酸第一鉄七水和物EDTAである、請求項５に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。７．前記インスリン置換物が、塩化亜鉛、臭化亜鉛、および硫化亜鉛七水和物からなる群から選択される、請求項１に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。８．前記インスリン置換物が、硫化亜鉛七水和物である、請求項７に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。９．前記アミノ酸成分が、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、L-リジン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニン、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を含む、請求項１に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。１０．前記アルブミン置換物が、ウシ下垂体抽出物、植物加水分解物、ウシ胎仔アルブミン（フェチュイン）、卵アルブミン、ヒト血清アルブミン（HSA）、ニ選択される、請求項１に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。核生物細胞培養培地補充物。１２．前記微量元素成分が、Ag⁺、Al³⁺、Ba²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Ge⁴⁺、Se⁴⁺ 、Br^-、I^-、Mn²⁺、F^-、Si⁴⁺、V⁵⁺、Mo⁶⁺、Ni²⁺、Rb⁺、Sn²⁺、およびZr⁴⁺からなる群から選択される１つ以上の微量元素部分を含む、請求項１に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。１３．前記補充物が濃縮される、請求項１に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。１４．前記補充物が、約２倍〜約10倍濃縮される、請求項１に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。１５．前記補充物が、約0.5％〜約90％の最終濃度まで基本培地に添加される、請求項１に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。１６．前記補充物が、約５％〜約50％の最終濃度まで基本培地に添加される、請求項１５に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。１７．前記補充物が、約５％〜約30％の最終濃度まで基本培地に添加される、請求項１６に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。１８．前記補充物が、約５％〜約20％の最終濃度まで基本培地に添加される、請求項１７に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。１９．前記補充物が、約15％の最終濃度まで基本培地に添加される、請求項１８に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。２０．アルブミンまたはアルブミン置換物と、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン置換物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン置換物、１つ以上のコラーゲン前駆体、および１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分とを組み合わせることによって得られる無血清真核生物細胞培養培地補充物であって、ここで該補充物で補充された基本細胞培養培地が、無血清培養において胚性幹細胞の増殖を支持し得る、無血清真核生物細胞培養培地補充物。 -フェニルアラニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、チアミン、還元グルタチオン、L-アスコルビン酸-2−ホスフェート、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、Ag⁺、Al³⁺、Ba²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Ge⁴⁺、Se⁴⁺、Br^- 、I^-、Mn²⁺、F^-、Si⁴⁺、V⁵⁺、Mo⁶⁺、Ni²⁺、Rb⁺、Sn²⁺、およびZr⁴⁺を含む無血清真核生物細胞培養培地補充物であって、ここで該補充物で補充された基本細胞培養培地が、無血清培養において胚性幹細胞の増殖を支持し得る、無血清真核生物細胞培養培地補充物。メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、チアミン、還元グルタチオン、L-アスコルビン酸-2−ホスフェート、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、Ag⁺塩、Al³⁺塩、Ba²⁺塩、Cd²⁺塩、Co²⁺塩、Cr³⁺塩、Ge⁴⁺塩、Se⁴⁺塩、Br^-塩、I^-塩、Mn²⁺塩、F^-塩、Si⁴⁺塩、V⁵⁺塩、Mo⁶⁺ 塩、Ni²⁺塩、Rb⁺塩、Sn²⁺塩、およびZr⁴⁺塩を組み合わせることによって得られる無血清真核生物細胞培養培地補充物であって、ここで各成分が、基本培地に添加された場合に、無血清培養において胚性幹細胞の増殖を支持する量で存在する、無血清真核生物細胞培養培地補充物。２３．前記Ag⁺塩がAgNO₃であり、前記Al³⁺塩がAlCl₃六水和物であり、前記Ba²⁺ 塩がBa(C₂H₃O₂)₂であり、前記Cd²⁺塩がCdSO₄八水和物であり、前記Co²⁺塩がCoCl₂ 六水和物であり、前記Cr³⁺塩がCr₂(SO₄)₃一水和物であり、前記Ge⁴⁺塩がGeO₂であり、前記Se⁴⁺塩がNa₂SeO₃およびH₂SeO₃であり、前記Br^-塩がKBrであり、前記I^- 塩がKIであり、前記Mn²⁺塩がMnCl₂四水和物であり、前記F^-塩がNaFであり、前記Si⁴⁺塩がNa₂SiO₃ 九水和物、前記V⁵⁺塩がNaVO₃であり、前記Mo⁶⁺塩が(NH₄)₆MO₇O₂₄四水和物であり、前記Ni²⁺塩がNiSO₄六水和物であり、前記Rb⁺塩がRbClであり、前記Sn²⁺塩が SnCl₂であり、そして前記Zr⁴⁺塩がZrOCl₂八水和物である、請求項２２に記載の無血清真核生物細胞培養培地補充物。２４．無血清真核生物細胞培養培地補充物を作製する方法であって、該方法は、フェニルアラニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-七リン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、チアミン、還元グルタチオン、 L-アスコルビン酸-2−ホスフェート、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、Ag⁺塩、Al³⁺塩、Ba²⁺塩、Cd²⁺塩、Co²⁺塩、Cr³⁺塩、Ge⁴⁺ 塩、Se⁴⁺塩、Br^-塩、I^-塩、Mn²⁺塩、F^-塩、Si⁴⁺塩、V⁵⁺塩、Mo⁶⁺塩、Ni²⁺塩、Rb⁺ 塩、Sn²⁺塩、およびZr⁴⁺塩を混合する工程を包含し、ここで各成分が、基本培地に添加された場合に、無血清培養において胚性幹細胞の増殖を支持する量で存在する、方法２５．前記Ag⁺塩がAgNO³であり、前記Al³⁺塩がAlCl₃六水和物であり、前記Ba²⁺ 塩がBa(C₂H₃O₂)₂であり、前記Cd²⁺塩がCdSO₄八水和物であり、前記Co²⁺塩がCoCl₂ 六水和物であり、前記Cr³⁺塩がCr₂(SO₄)₃一水和物であり、前記Ge⁴⁺塩がGeO₂であり、前記Se⁴⁺塩がNa₂SeO₃およびH₂SeO₃であり、前記Br^-塩がKBrであり、前記I^- 塩がKIであり、前記Mn²⁺塩がMnCl₂四水和物であり、前記F^-塩がNaFであり、前記Si⁴⁺塩がNa₂SiO₃九水和物、前記V⁵⁺塩がNaVO₃であり、前記Mo⁶⁺塩が(NH₄)₆Mo₇ O₂₄四水和物であり、前記Ni²⁺塩がNiSO₄六水和物であり、前記Rb⁺塩がRbClであり、前記Sn²⁺塩がSnCl₂であり、そして前記Zr⁴⁺塩がZrOCl₂八水和物である、請求項２３に記載の方法。２６．請求項１に記載の無血清細胞培養補充物を補充した基本細胞培養培地を含む無血清真核生物細胞培養培地であって、ここで該補充された培養培地が、無血清培養において胚性幹細胞の増殖を支持し得る、無血清真核生物細胞培養培地。２７．前記培地が、１×培地処方物である、請求項２６に記載の無血清真核生物細胞培養培地。２８．前記培地が濃縮された培地処方物である、請求項２６に記載の無血清真核生物細胞培養培地。２９．前記補充物の最終濃度が、約0.5％〜約90％である、請求項２６に記載の無血清真核生物細胞培養培地。３０．前記補充物の最終濃度が、約５％〜約50％である、請求項２９に記載の無血清真核生物細胞培養培地。３１．前記補充物の最終濃度が、約５％〜約30％である、請求項３０に記載の無血清真核生物細胞培養培地。３２．前記補充物の最終濃度が、約５％〜約20％である、請求項３１に記載の無血清真核生物細胞培養培地。３３．前記補充物の最終濃度が、約15％である、請求項３０に記載の無血清真核生物細胞培養培地。３４．基本細胞培養培地と、請求項１に記載の無血清補充物とを組み合わせることによって得られる無血清真核生物細胞培養培地であって、ここで該培地が、無血清培養において胚性幹細胞の増殖を支持し得る、無血清真核生物細胞培養培地。３５．無血清真核生物細胞培養培地を作製する方法であって、該方法は、基本細胞培養培地と、請求項１に記載の補充物とを混合する工程を包含し、ここで該培地が、無血清培養において胚性幹細胞の増殖を支持し得る、方法。３６．前記培地が１×処方物である、請求項３５に記載の方法。３７．前記培地が濃縮された処方物である、請求項３５に記載の方法。３８．前記補充物の最終濃度が、約0.5％〜約90％である、請求項３５に記載の方法による無血清真核生物細胞培養培地。３９．前記補充物の最終濃度が、約５％〜約50％である、請求項３８に記載の方法による無血清真核生物細胞培養培地。４０．前記補充物の最終濃度が、約５％〜約30％である、請求項３９に記載の方法による無血清真核生物細胞培養培地。４１．前記補充物の最終濃度が、約５％〜約20％である、請求項４０に記載の方法による無血清真核生物細胞培養培地。４２．前記補充物の最終濃度が、約15％である、請求項４１に記載の方法による無血清真核生物細胞培養培地。４３．無血清培地において胚性幹細胞を含む組成物であって、該無血清培地が、無血清培地において胚性幹細胞の増殖を支持し得る、組成物。４４．前記培地が、請求項２６または３４に記載の培地である、請求項４３に記載の組成物。４５．前記組成物が、約-135℃以下で無期限に保存され得る、請求項４４に記載の組成物。４６．前記胚性幹細胞が、ヒト、有尾猿、無尾猿、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、鳥類、爬虫類、魚、および両生類からなる群から選択される動物から得られる、請求項４５に記載の組成物。４７．前記胚性幹細胞が、マウス、ウシ、ヤギ、およびヒツジからなる群から選択される動物から得られる、請求項４６に記載の組成物。４８．前記胚性幹細胞が、マウスから得られる、請求項４７に記載の組成物。４９．胚性幹細胞および請求項１に記載の補充物を含む容器手段を含む、製造産物。５０．請求項２６または３４に記載の培地中に胚性幹細胞を含む容器手段を含む、製造産物。５１．１つ以上の容器手段を含む製造産物であって、ここで、第１容器手段が請求項１に記載の補充物を含み、ここで必要に応じて、第２容器手段が基本培地を含み、ここで必要に応じて、第３容器手段が胚性幹細胞を含む、製造産物。５２．１つ以上の容器手段を含む製造産物であって、ここで、第１容器手段が請求項２６または３４に記載の培地を含み、ここで必要に応じて第２容器手段が胚性幹細胞を含む、製造産物。５３．前記製造産物が凍結状態である、請求項４９〜５２のいずれか１つに記載の製造産物。５４．無血清培養において胚性幹細胞を拡大する方法であって、 (a)該胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地と接触させる工程；および (b)該胚性幹細胞を、該胚性幹細胞の拡大を容易にするのに適した無血清条件下で培養する工程、を包含する、方法。５５．前記胚性幹細胞を、支持細胞の層上に播種する工程をさらに包含する、請求項５４に記載の方法。５６．トランスジェニック動物を産生する方法であって、 (a)胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地において培養する工程； (b)核酸分子を、該胚性幹細胞に導入する工程； (c)組換え胚性幹細胞クローンを選択する工程； (d)該組換え胚性幹細胞クローンを拡大して、集団を形成する工程； (e)該組換え胚性幹細胞クローン集団のアリコートを、胚盤胞に注入する工程； (f)該注入した胚盤胞を、宿主偽妊娠雌性動物に移す工程；および (g)トランスジェニック子孫を選択する工程、を包含する、方法。５７．前記培養工程が、 (a1)前記胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地と接触させる工程；および (a2)該胚性幹細胞を、該胚性幹細胞の拡大を容易にするのに適した無血清条件下で、無血清培地において培養する工程、をさらに包含する、請求項５６に記載の方法。５８．前記胚性幹細胞を、支持細胞の層上に播種する工程を包含する、請求項５７に記載の方法。５９．トランスジェニック動物を産生する方法であって、 (a)胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地において培養する工程； (b)核酸分子を、該胚性幹細胞に導入する工程； (c)組換え胚性幹細胞クローンを選択する工程； (d)該組換え胚性細胞クローンを拡大して、集団を形成する工程； (e)少数の該胚性幹細胞を、初期胚と同時培養して、胚の凝集を形成する工程； (f)該凝集した胚を、宿主偽妊娠雌性動物に移入する工程；および (g)トランスジェニック子孫を選択する工程、を包含する、方法。６０．前記培養工程が、 (a1)前記胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地と接触させる工程；および (a2)該胚性幹細胞を、無血清培養において該胚性幹細胞の拡大を促進するのに適した無血清条件下で培養する工程、をさらに包含する、請求項５９に記載の方法。６１．前記胚性幹細胞を、支持細胞の層上に播種する工程を包含する、請求項６０に記載の方法。６２．組換えタンパク質をトランスジェニック動物から産生する方法であって、 (a)胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地において培養する工程； (b)該タンパク質をコードする目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む核酸構築物を、該胚性幹細胞に導入する工程； (c)組換え胚性幹細胞クローンを選択する工程； (d)該組換え胚性幹細胞クローンを拡大して、組換え胚性幹細胞の集団を形成する工程； (e)該組換え胚性幹細胞クローン集団を、胚盤胞に注入する工程； (f)該注入された胚盤胞を、宿主偽妊娠雌性動物に移入する工程； (g)トランスジェニック子孫を選択する工程； (h)該選択されたトランスジェニック動物を、該トランスジェニック動物の健康を促進するのに適した条件下で成育させる工程；および (i)該組換えタンパク質を、該トランスジェニック動物から単離する工程、を包含する、方法。６３．前記培養工程が、 (a1)前記胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地と接触させる工程；および (a2)前記胚性幹細胞を、無血清培養において前記胚性幹細胞の拡大を促進するのに適した無血清条件下で培養する工程、をさらに包含する、請求項６２に記載の方法。６４．前記胚性幹細胞を、支持細胞の層上に播種する工程をさらに包含する、請求項６３に記載の方法。６５．組換えタンパク質を、トランスジェニック動物から産生する方法であって、 (a)胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地において培養する工程； (b)該タンパク質をコードする目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む核酸構築物を、該胚性幹細胞に導入する工程； (c)組換え胚性幹細胞クローンを選択する工程； (d)該組換え胚性幹細胞クローンを拡大して、組換え胚性幹細胞の集団を形成する工程； (e)少数の胚性幹細胞を、初期胚と同時培養して、胚の凝集を形成する工程； (f)該注入された胚盤胞を、宿主偽妊娠雌性動物に移入する工程； (g)トランスジェニック子孫を選択する工程； (h)該選択されたトランスジェニック動物を、該トランスジェニック動物の健康を促進するのに適した条件下で成育させる工程；および (i)該組換えタンパク質を、該トランスジェニック動物から単離する工程、を包含する、方法。６６．前記方法が、 (a1)前記胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地と接触させる工程；および (a2)前記胚性幹細胞を、無血清培養において前記胚性幹細胞の拡大を促進するのに適した条件下で培養する工程、をさらに包含する、請求項６７に記載の方法。６７．前記胚性幹細胞を、支持細胞の層上に播種する工程をさらに包含する、請求項６６に記載の方法。６８．無血清培養において、胚性幹細胞の分化を制御または予防するための方法であって、 (a)該胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地と接触させる工程；および (b)胚性幹細胞の分化を制御または予防し、そして無血清培養において該胚性幹細胞の拡大を促進するのに適した無血清条件下で、該胚性幹細胞を培養する、工程、を包含する、方法。６９．前記胚性幹細胞を、支持細胞の層上に播種する工程をさらに包含する、請求項６８に記載の方法。７０．前記培養工程が、前記胚性幹細胞の分化を制御または予防する１つ以上の因子を前記培地に補充することをさらに包含する、請求項６９に記載の方法。７１．前記因子が、白血病抑制因子、幹細胞刺激因子(steel factor)、毛様体神経栄養因子、およびオンコスタチンＭからなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。７２．前記因子が白血病抑制因子である、請求項７１に記載の方法。７３．前記因子が幹細胞刺激因子である、請求項７１に記載の方法。７４．前記因子が毛様体神経栄養因子である、請求項７１に記載の方法。７５．前記因子がオンコスタチンＭである、請求項７１に記載の方法。７６．胚性幹細胞の無血清培地中での特定の型の細胞への分化を引き起こす方法であって、 (a)胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地に接触させる工程； (b)胚性幹細胞を、無血清培養において該胚性幹細胞の拡大を促進するのに適した条件下で培養する工程；および (c)分化因子を添加するか、または培養条件を変更して、胚性幹細胞の分化を誘導して、異なる型の細胞を形成する工程、を包含する、方法。７７．前記胚性幹細胞を、支持細胞の層上に播種する工程をさらに包含する、請求項７６に記載の方法。７８．前記細胞の分化を予防し、そして前記細胞の拡大を促進するのに適した条件下で、前記胚性幹細胞を培養する工程が、前記胚性幹細胞の分化を予防する１つ以上の増殖因子を前記培養培地に補充することをさらに包含する、請求項７６に記載の方法。７９．前記拡大された胚性幹細胞を培養する工程が、前記胚性幹細胞の分化を促進する１つ以上の増殖因子を前記培養培地に補充する工程をさらに包含する、請求項７６に記載の方法。８０．無血清培養において、分化した胚性幹細胞を哺乳動物に提供する方法であって、 (a)胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地に接触させる工程； (b)胚性幹細胞を、無血清培養において該胚性幹細胞の拡大を促進するのに適した条件下で培養する工程； (c)分化因子を添加するか、または培養条件を変更して、胚性幹細胞の分化を誘導して、異なる型の細胞を形成する工程；および (d)該分化した細胞を、哺乳動物に導入する工程、を包含する、方法。８１．前記胚性幹細胞を、支持細胞の層上に播種する工程をさらに包含する、請求項８０に記載の方法。８２．前記胚性幹細胞を、該細胞の分化を予防するのに適した無血清条件下で培養する工程が、１つ以上の因子を前記培養培地に補充することをさらに包含する、請求項８０に記載の方法。８３．前記因子が白血病抑制因子である、請求項８２に記載の方法。８４．前記細胞の分化を誘導するのに適した条件下で、前記拡大した胚性幹細胞を培養する工程が、１つ以上の増殖因子を前記培養培地に補充することをさらに包含する、請求項８０に記載の方法。８５．無血清培養において胚性幹細胞を得る方法であって、 (a)胚性幹細胞を、胚盤胞から単離する工程；および (b)該単離された胚性幹細胞を、請求項２６または３４に記載の培地において培養する工程、を包含する、方法。８６．無血清培養において、組換えタンパク質胚性幹細胞を産生する方法であって、 (a)目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む組換え胚性幹細胞を得る工程； (b)無血清培養において、該胚性幹細胞を培養して、組換え胚性幹細胞の集団を形成する工程；および (c)該タンパク質を、該胚性幹細胞、または該細胞が培養される培地から単離する工程、を包含する、方法。８７．前記単離工程が、 (c1)前記タンパク質を、前記胚性幹細胞から単離すること、をさらに包含する、請求項８７に記載の方法。８８．前記単離工程が、 (c1)前記タンパク質を、前記採取した培地から単離すること、をさらに包含する、請求項８６に記載の方法。