WO2020130068A1 - 胚型赤芽球を含む細胞集団及びその製造方法、細胞培養組成物並びに化合物試験法 - Google Patents
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Abstract
胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法であって、多能性幹細胞を浮遊培養して、細胞凝集体を形成させる工程(1)、及び前記工程(1)で得られた細胞凝集体から前記細胞集団を得る工程(2)を含み、前記工程(2)は、前記細胞凝集体を接着培養する工程(2a)を含む、製造方法を提供する。また、胚型赤芽球を含む細胞集団、及び該細胞集団を含む細胞培養組成物、並びに胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法を提供する。
Description
本発明は、胚型赤芽球を含む細胞集団及びその製造方法、並びに該細胞集団を含む細胞培養組成物に関するものである。さらに、本発明は、該細胞集団を用いた化合物試験法に関するものである。
化合物の発生毒性試験において、ヘモグロビン合成の阻害等の赤血球の機能を阻害する化合物は、胎児の成長を阻害し、催奇形性、胚致死作用を有することが知られている。また、赤血球の酸素運搬能に関わるグロビン遺伝子は、個体発生に伴い胚型、胎児型、成人型と遺伝子の発現が順次切り変わるスイッチングの現象が知られている。
よって、in vitroの試験系において化合物の有する赤血球機能の阻害による催奇形性を評価するためには、催奇形性の臨界期の血球である胚型赤芽球を用いて評価することが正確かつ有効であると考えられる。
非特許文献1(Fujita A. et al. Stem Cells. 2016 Jun;34(6):1541-52.)には、ヒトの胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞から、ε-グロビンを発現する赤芽球を経由し、β-グロビンを高発現する赤芽球を製造する方法が記載されている。
Fujita A. et al. Stem Cells. 2016 Jun;34(6):1541-52.
しかしながら、非特許文献1に記載の方法は熟練の技術が必要であり、ε-グロビンを発現する胚型赤芽球を含む細胞集団を製造する方法として、必ずしも再現性が十分とは言えなかった。本発明の目的は、多能性幹細胞から胚型赤芽球を含む細胞集団を再現性よく製造する方法及び該製造方法によって得ることができる細胞集団、並びに該細胞集団を含む細胞培養組成物を提供することである。また、本発明の目的は、該胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法を提供することである。
本発明は、以下に例示する胚型赤芽球を含む細胞集団及びその製造方法、細胞培養組成物並びに化合物試験法を提供する。
[1] 胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法であって、
多能性幹細胞を浮遊培養して、細胞凝集体を形成させる工程(1)、及び
前記工程(1)で得られた細胞凝集体から前記細胞集団を得る工程(2)を含み、
前記工程(2)は、前記細胞凝集体を接着培養する工程(2a)を含む、製造方法。
[2] 前記工程(2)は、前記細胞集団を回収する工程(2b)をさらに含む、[1]に記載の製造方法。
[3] 前記細胞集団を構成する細胞のうち、少なくとも70%の細胞は前記胚型赤芽球である、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4] 前記細胞集団において、細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、少なくとも50%がε-グロビン遺伝子である、[1]~[3]のいずれかに記載の製造方法。
[5] 前記工程(1)を、細胞非接着性の培養器材を用いて行う、[1]~[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6] 前記工程(2a)を、細胞接着性の培養器材を用いて行う、[1]~[5]のいずれかに記載の製造方法。
[7] 前記細胞接着性の培養器材は、基底膜標品でコートされている、[6]に記載の製造方法。
[8] 前記工程(1)の前に、多能性幹細胞を分散させる工程を含む、[1]~[7]のいずれかに記載の製造方法。
[9] 前記工程(1)は、前記多能性幹細胞を遠心する工程を含む、[1]~[8]のいずれかに記載の製造方法。
[10] 前記工程(1)の開始から前記工程(2a)の開始までの時間は、12時間以上96時間以内である、[1]~[9]のいずれかに記載の製造方法。
[11] 前記工程(2a)の培養時間は、2日以上18日以内である、[1]~[10]のいずれかに記載の製造方法。
[12] 前記工程(1)及び工程(2a)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程を、ROCK阻害剤の存在下で行う、[1]~[11]のいずれかに記載の製造方法。
[13] 前記工程(2a)を、エリスロポエチン、エリスロポエチン受容体作動薬及びエリスロポエチン受容体を介する情報伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で行う、[1]~[12]のいずれかに記載の製造方法。
[14] 前記工程(2a)を、フィーダー細胞の存在下で行う、[1]~[13]のいずれかに記載の製造方法。
[15] 前記フィーダー細胞は、骨髄間質細胞又は骨髄間質細胞由来細胞株である、[14]に記載の製造方法。
[16] 前記フィーダー細胞は、OP9細胞である、[15]に記載の製造方法。
[17] 前記工程(2a)を、幹細胞因子、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で行う、[1]~[16]のいずれかに記載の製造方法。
[18] 前記多能性幹細胞は霊長類多能性幹細胞又はげっ歯類多能性幹細胞である、[1]~[17]のいずれかに記載の製造方法。
[19] 前記多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞又はラット多能性幹細胞である、[1]~[17]のいずれかに記載の製造方法。
[1] 胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法であって、
多能性幹細胞を浮遊培養して、細胞凝集体を形成させる工程(1)、及び
前記工程(1)で得られた細胞凝集体から前記細胞集団を得る工程(2)を含み、
前記工程(2)は、前記細胞凝集体を接着培養する工程(2a)を含む、製造方法。
[2] 前記工程(2)は、前記細胞集団を回収する工程(2b)をさらに含む、[1]に記載の製造方法。
[3] 前記細胞集団を構成する細胞のうち、少なくとも70%の細胞は前記胚型赤芽球である、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4] 前記細胞集団において、細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、少なくとも50%がε-グロビン遺伝子である、[1]~[3]のいずれかに記載の製造方法。
[5] 前記工程(1)を、細胞非接着性の培養器材を用いて行う、[1]~[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6] 前記工程(2a)を、細胞接着性の培養器材を用いて行う、[1]~[5]のいずれかに記載の製造方法。
[7] 前記細胞接着性の培養器材は、基底膜標品でコートされている、[6]に記載の製造方法。
[8] 前記工程(1)の前に、多能性幹細胞を分散させる工程を含む、[1]~[7]のいずれかに記載の製造方法。
[9] 前記工程(1)は、前記多能性幹細胞を遠心する工程を含む、[1]~[8]のいずれかに記載の製造方法。
[10] 前記工程(1)の開始から前記工程(2a)の開始までの時間は、12時間以上96時間以内である、[1]~[9]のいずれかに記載の製造方法。
[11] 前記工程(2a)の培養時間は、2日以上18日以内である、[1]~[10]のいずれかに記載の製造方法。
[12] 前記工程(1)及び工程(2a)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程を、ROCK阻害剤の存在下で行う、[1]~[11]のいずれかに記載の製造方法。
[13] 前記工程(2a)を、エリスロポエチン、エリスロポエチン受容体作動薬及びエリスロポエチン受容体を介する情報伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で行う、[1]~[12]のいずれかに記載の製造方法。
[14] 前記工程(2a)を、フィーダー細胞の存在下で行う、[1]~[13]のいずれかに記載の製造方法。
[15] 前記フィーダー細胞は、骨髄間質細胞又は骨髄間質細胞由来細胞株である、[14]に記載の製造方法。
[16] 前記フィーダー細胞は、OP9細胞である、[15]に記載の製造方法。
[17] 前記工程(2a)を、幹細胞因子、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で行う、[1]~[16]のいずれかに記載の製造方法。
[18] 前記多能性幹細胞は霊長類多能性幹細胞又はげっ歯類多能性幹細胞である、[1]~[17]のいずれかに記載の製造方法。
[19] 前記多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞又はラット多能性幹細胞である、[1]~[17]のいずれかに記載の製造方法。
[20] 胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法であって、
多能性幹細胞を浮遊培養して、細胞凝集体を形成させる工程(A)、
前記工程(A)で得られた細胞凝集体から前記細胞集団を得る工程(B)、
前記細胞集団を試験化合物の存在下で培養する工程(C)、及び
前記工程(C)で培養した前記細胞集団の1)細胞数、2)細胞生存率、3)ヘム濃度、4)プロトポルフィリンIX濃度、及び5)グロビン発現量からなる群より選ばれる少なくとも1つの項目を測定する工程(D)を含み、
前記工程(B)は、前記細胞凝集体を接着培養する工程(Ba)を含む、化合物試験法。
[21] 前記工程(B)は、前記細胞集団を回収する工程(Bb)をさらに含む、[20]のいずれかに記載の化合物試験法。
[22] 前記細胞集団を構成する細胞のうち、少なくとも70%の細胞が前記胚型赤芽球である、[20]又は[21]に記載の化合物試験法。
[23] 前記細胞集団において、細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、少なくとも50%がε-グロビン遺伝子である、[20]~[22]のいずれかに記載の化合物試験法。
[24] 前記工程(C)を、フィーダー細胞の非存在下で行う、[20]~[23]のいずれかに記載の化合物試験法。
[25] 前記工程(C)を、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つの非存在下で行う、[20]~[24]のいずれかに記載の化合物試験法。
[26] 前記工程(C)の培養時間は2日以上である、[20]~[25]のいずれかに記載の化合物試験法。
[27] 前記多能性幹細胞は霊長類多能性幹細胞又はげっ歯類多能性幹細胞である、[20]~[26]のいずれかに記載の化合物試験法。
[28] 前記多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞又はラット多能性幹細胞である、[20]~[26]のいずれかに記載の化合物試験法。
[29] 複数の生物種由来の胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法であって、
前記工程(D)において、前記複数の生物種由来の多能性幹細胞から得られるそれぞれの前記細胞集団について前記測定を行う、[20]~[28]のいずれかに記載の化合物試験法。
[30] 前記複数の生物種は、霊長類及びげっ歯類からなる群に属する生物のうち少なくとも2種を含む、[29]に記載の化合物試験法。
[31] 前記複数の生物種は、ヒト及びラットを含む、[29]に記載の化合物試験法。
多能性幹細胞を浮遊培養して、細胞凝集体を形成させる工程(A)、
前記工程(A)で得られた細胞凝集体から前記細胞集団を得る工程(B)、
前記細胞集団を試験化合物の存在下で培養する工程(C)、及び
前記工程(C)で培養した前記細胞集団の1)細胞数、2)細胞生存率、3)ヘム濃度、4)プロトポルフィリンIX濃度、及び5)グロビン発現量からなる群より選ばれる少なくとも1つの項目を測定する工程(D)を含み、
前記工程(B)は、前記細胞凝集体を接着培養する工程(Ba)を含む、化合物試験法。
[21] 前記工程(B)は、前記細胞集団を回収する工程(Bb)をさらに含む、[20]のいずれかに記載の化合物試験法。
[22] 前記細胞集団を構成する細胞のうち、少なくとも70%の細胞が前記胚型赤芽球である、[20]又は[21]に記載の化合物試験法。
[23] 前記細胞集団において、細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、少なくとも50%がε-グロビン遺伝子である、[20]~[22]のいずれかに記載の化合物試験法。
[24] 前記工程(C)を、フィーダー細胞の非存在下で行う、[20]~[23]のいずれかに記載の化合物試験法。
[25] 前記工程(C)を、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つの非存在下で行う、[20]~[24]のいずれかに記載の化合物試験法。
[26] 前記工程(C)の培養時間は2日以上である、[20]~[25]のいずれかに記載の化合物試験法。
[27] 前記多能性幹細胞は霊長類多能性幹細胞又はげっ歯類多能性幹細胞である、[20]~[26]のいずれかに記載の化合物試験法。
[28] 前記多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞又はラット多能性幹細胞である、[20]~[26]のいずれかに記載の化合物試験法。
[29] 複数の生物種由来の胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法であって、
前記工程(D)において、前記複数の生物種由来の多能性幹細胞から得られるそれぞれの前記細胞集団について前記測定を行う、[20]~[28]のいずれかに記載の化合物試験法。
[30] 前記複数の生物種は、霊長類及びげっ歯類からなる群に属する生物のうち少なくとも2種を含む、[29]に記載の化合物試験法。
[31] 前記複数の生物種は、ヒト及びラットを含む、[29]に記載の化合物試験法。
[32] 胚型赤芽球を含む細胞集団であって、
前記細胞集団を構成する細胞のうち、少なくとも70%の細胞が前記胚型赤芽球である、細胞集団。
[33] 胚型赤芽球を含む細胞集団であって、
細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、少なくとも50%がε-グロビン遺伝子である、細胞集団。
[34] 化合物試験に用いられる、[1]~[19]のいずれかに記載の製造方法により得られる細胞集団又は[32]もしくは[33]に記載の細胞集団。
[35] ε-グロビンの発現が維持される状態で保存されている、[1]~[19]のいずれかに記載の製造方法により得られる細胞集団又は[32]~[34]のいずれかに記載の細胞集団。
前記細胞集団を構成する細胞のうち、少なくとも70%の細胞が前記胚型赤芽球である、細胞集団。
[33] 胚型赤芽球を含む細胞集団であって、
細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、少なくとも50%がε-グロビン遺伝子である、細胞集団。
[34] 化合物試験に用いられる、[1]~[19]のいずれかに記載の製造方法により得られる細胞集団又は[32]もしくは[33]に記載の細胞集団。
[35] ε-グロビンの発現が維持される状態で保存されている、[1]~[19]のいずれかに記載の製造方法により得られる細胞集団又は[32]~[34]のいずれかに記載の細胞集団。
[36] [1]~[19]のいずれかに記載の製造方法により得られる細胞集団又は[32]~[35]のいずれかに記載の細胞集団と、培地とを含む、細胞培養組成物。
[37] 前記培地は、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つを含まない、[36]に記載の細胞培養組成物。
[37] 前記培地は、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つを含まない、[36]に記載の細胞培養組成物。
本発明によれば、多能性幹細胞から胚型赤芽球を含む細胞集団を再現性よく製造する方法及び該製造方法によって得ることができる細胞集団、並びに該細胞集団を含む細胞培養組成物を提供することができる。また、本発明によれば、該胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法を提供することができる。
[1.定義]
本明細書において、下記用語の定義は、下記のとおりである。「幹細胞」とは、分化能及び分化能を維持した増殖能(特に自己複製能)を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複能性幹細胞(multipotent stem cell)、単能性幹細胞(unipotent stem cell)等の亜集団が含まれる。「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成するすべての細胞(三胚葉(外胚葉、中胚葉、内胚葉)由来の組織)に分化しうる能力(分化多能性(pluripotency))を有する幹細胞をいう。「複能性幹細胞」とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。「単能性幹細胞」とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
本明細書において、下記用語の定義は、下記のとおりである。「幹細胞」とは、分化能及び分化能を維持した増殖能(特に自己複製能)を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複能性幹細胞(multipotent stem cell)、単能性幹細胞(unipotent stem cell)等の亜集団が含まれる。「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成するすべての細胞(三胚葉(外胚葉、中胚葉、内胚葉)由来の組織)に分化しうる能力(分化多能性(pluripotency))を有する幹細胞をいう。「複能性幹細胞」とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。「単能性幹細胞」とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞(ES細胞:Embryonic stem cell)、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多能性幹細胞(iPS細胞:induced pluripotent stem cell)等を挙げることができる。間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell;MSC)から得られるMuse細胞(Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell)や、生殖細胞(例えば精巣)から作製されたGS細胞も多能性幹細胞に包含される。
胚性幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。ES細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はleukemia inhibitory factor(LIF)を含む培地中で培養することにより製造することができる。ES細胞の製造方法は、例えば国際公開第96/22362号、国際公開第02/101057号、米国特許第5843780号明細書、米国特許第6200806号明細書、米国特許第6280718号明細書等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えばヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、EB5細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、D3株はAmerican Type Culture Collection(ATCC)より、入手可能である。ES細胞の一つである核移植ES細胞(ntES細胞)は、細胞株を取り除いた卵子に体細胞の細胞核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
EG細胞は、始原生殖細胞をマウス幹細胞因子(mSCF)、LIF及び塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む培地中で培養することにより製造することができる(Cell,70:841-847,1992)。
人工多能性幹細胞とは、体細胞を、公知の方法等により初期化(reprogramming)することにより、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組み合わせのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。2006年、山中らによりマウス細胞で人工多能性幹細胞が樹立された(Cell,2006,126(4)pp.663-676)。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する(Cell,2007,131(5)pp.861-872;Science,2007,318(5858)pp.1917-1920;Nat.Biotechnol.,2008,26(1)pp.101-106)。人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる(Science,2013,341pp.651-654)。
人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞(例えば末梢血単核球やT細胞)、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子(例えばOct3/4、Sox2、Klf4、及びMycの4因子)の発現により初期化する場合、遺伝子を発現させるための手段は特に限定されない。遺伝子を発現させるための手段としては、例えばウイルスベクター(例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター)を用いた感染法、プラスミドベクター(例えばプラスミドベクター、エピソーマルベクター)を用いた遺伝子導入法(例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法)、RNAベクターを用いた遺伝子導入法(例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法)、タンパク質の直接注入法等が挙げられる。
多能性幹細胞には、遺伝子改変された多能性幹細胞も含まれる。遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などが挙げられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲッティング、ES細胞を用いた変異マウスの作製、羊土社(1995)等に記載の方法を用いて行うことができる。
具体的には、例えば改変する標的遺伝子(例えば細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子等)のゲノム遺伝子を単離し、単離されたゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)やCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987-1997)等に記載された公知の方法が挙げられる。ゲノムDNAライブラリースクリーニングシステム(Genome Systems製)やUniversal GenomeWalker Kits(Clontech製)などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することもできる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲッティング、ES細胞を用いた変異マウスの作製、羊土社(1995)等に記載の方法に従って行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択又はポリA選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法やPCR法等が挙げられる。
「哺乳動物」には、げっ歯類、有蹄類、ネコ目、ウサギ目、霊長類等が包含される。げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が包含される。有蹄類には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が包含される。ネコ目には、イヌ、ネコ等が包含される。ウサギ目には、ウサギ等が含包される。「霊長類」とは、霊長目に属するほ乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザル、ロリス、ツバイ等の原猿亜目、及びサル、類人猿、ヒト等の真猿亜目が挙げられる。
「細胞接着(Cell adhesion)」には、細胞と細胞との接着(細胞-細胞接着)及び細胞と細胞外マトリックス(基質)との接着(細胞-基質接着)が含まれる。インビトロの人工培養環境下で生じる、細胞の培養器材等への接着も細胞接着に含有される。細胞-細胞接着において形成される結合が、細胞-細胞結合(cell-cell junction)であり、細胞-基質接着において形成される結合が細胞―基質結合(cell-substratum junction)である。細胞接着の種類として、例えば固定結合(anchoring junction)、連絡結合(communicating junction)、閉鎖結合(occluding junction)が挙げられる。
細胞-細胞結合として、「密着結合(Tight junction)」、「接着結合(adherence junction)」が挙げられる。密着結合は比較的強い細胞-細胞結合であり、上皮細胞などの特定の細胞同士で生じうる。細胞間に密着結合が存在しているかどうかは、例えば密着接合の構成成分に対する抗体(抗クローディン抗体、抗ZO-1抗体等)を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。接着結合は、細胞凝集体中で生じる頻度は比較的高い。
「浮遊培養」とは、細胞が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養することをいう。すなわち浮遊培養は、細胞を培養器材及び培養器材上のフィーダー細胞等(以下、「培養器材等」と記す。)に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件で行われる培養(接着培養)は、浮遊培養とは区別される。より詳細には、浮遊培養とは、細胞と培養器材等との間に、強固な細胞-基質結合を作らせない条件での培養をいう。培養している細胞が浮遊培養状態であるか接着培養であるかの判別は、例えば顕微鏡観察時の培養器材の揺動等によって当業者であれば容易に可能である。
「接着培養」とは、細胞が培養器材等に接着して存在する状態を維持しつつ培養することをいう。ここで、細胞が培養器材等に接着するとは、細胞と培養器材等との間に細胞接着の一種である強固な細胞-基質間結合ができることをいう。
浮遊培養中の細胞凝集体においては、細胞と細胞とが面接着している。浮遊培養中の細胞凝集体では、細胞と培養器材等との間に、強固な細胞-基質結合は形成されておらず、細胞-基質結合は、ほとんど形成されないか、形成されていてもその寄与が小さい。浮遊培養中の細胞凝集体の内部には、内在の細胞-基質結合が存在してもよい。
「細胞と細胞とが面接着(plane attachment)する」とは、細胞と細胞とが面で接着することをいう。より詳細には、「細胞と細胞とが面接着する」とは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば1%以上、好ましくは3%以上、より好ましくは5%以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬(例えばDiI)による染色、細胞接着因子(例えばE-cadherin、N-cadherin等)の免疫組織化学等の手法により検出できる。
「細胞と細胞とが面接着(plane attachment)する」とは、細胞と細胞とが面で接着することをいう。より詳細には、「細胞と細胞とが面接着する」とは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば1%以上、好ましくは3%以上、より好ましくは5%以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬(例えばDiI)による染色、細胞接着因子(例えばE-cadherin、N-cadherin等)の免疫組織化学等の手法により検出できる。
浮遊培養を行う際に用いられる培養器材は、浮遊培養することが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器材としては、例えばフラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ、ローラーボトル、オーガンオンチップ等の生体機能チップ等が挙げられる。これらの培養器材は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器材としては、培養器材の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で、後述する人工的な処理がされていないもの等を使用できる。また、細胞非接着性の培養器材として、培養器材の表面が、細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理(例えば2‐methacryloyloxyethyl phosphorylcholine(MPC)ポリマー等の超親水性処理、タンパク低吸着処理等)されたものなどを使用することもできる。培養器材の培養面は、平底、U底又はV底でもよいし、凹凸があってもよい。
接着培養を行う際に用いられる培養器材は、接着培養することが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器材としては、例えばフラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、オーガンオンチップ等の生体機能チップ等が挙げられる。細胞接着性の培養器材としては、培養器材の表面が細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理されているもの等を使用できる。人工的な処理とは、例えば細胞外マトリクス、高分子等によるコーティング処理、及びガスプラズマ処理、正電荷処理等の表面加工が挙げられる。細胞が接着される細胞外マトリクスとしては、例えば基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等が挙げられ、高分子としては、ポリリジン、ポリオルニチン等が挙げられる。培養器材の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。
本発明において細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばBasal Medium Eagle(BME)、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow Minimum Essential Medium(Glasgow MEM)、Improved MEM Zinc Option、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)、Medium 199、Eagle Minimum Essential Medium(Eagle MEM)、Alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium(αMEM)、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)、F-12培地、DMEM/F12、IMDM/F12、ハム培地、RPMI 1640、Fischer’s培地、又はこれらの混合培地等が挙げられる。
多能性幹細胞の培養には、上記基礎培地をベースとした多能性幹細胞培養用の培地、好ましく公知の胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞用の培地、フィーダーフリー下で多能性幹細胞を培養するための培地(フィーダーフリー培地)等を用いることができる。フィーダーフリー培地としては、例えばEssential 8培地、TeSR培地、mTeSR培地、mTeSR-E8培地、StemFit培地等を挙げることができる。
「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。精製された血液由来成分や動物組織由来成分(例えば増殖因子)が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えばアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール又はこれらの均等物等を適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、国際公開第98/30679号に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。市販の血清代替物としては、例えばKnockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific社製)(以下、「KSR」と記すこともある。)、Chemically-defined Lipid concentrated(Thermo Fisher Scientific社製)、Glutamax(Thermo Fisher Scientific社製)、B27 Supplement(Thermo Fisher Scientific社製)、N2 Supplement(Thermo Fisher Scientific社製)等が挙げられる。
浮遊培養及び接着培養で用いる無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸(例えば非必須アミノ酸)、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
調製の煩雑さを回避するために、かかる無血清培地として、市販の幹細胞用培地、例えばSTEMdiff Hematopoietic Basal Medium(「Stemdiff. basal medium」と記載することがある。)と、STEMdiff Hematopoietic Supplement A(「Supp.A」と記載することがある。)又はSTEMdiff Hematopoietic Supplement B(「Supp.B」と記載することがある。)との混合液(STEMCELL Technologies社製)、Stemline II造血幹細胞増殖培地(Sigma Aldrich社製)、Hematopoietic Progenitor Medium(Promo Cell社製)、STEMα.A(STEM ALPHA社製)、PRIME-XV Hematopoietic Cell Basal XSFM(Irvine Scientific社製)等を用いることができる。本発明で用いられる無血清培地は、好ましくはSTEMdiff Hematopoietic Basal Mediumと、STEMdiff Hematopoietic Supplement A又はSTEMdiff Hematopoietic Supplement Bとの混合液である。
「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸(例えば非必須アミノ酸)、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、1-モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
本発明に用いる培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地(Chemically defined medium;CDM)である。
「基底膜標品」とは、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播種して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有する基底膜構成成分を含むものをいう。本発明においては、細胞凝集体の接着培養を行う際には、基底膜標品存在下で培養することができる。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層などとの間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリクス分子をいう。基底膜構成成分としては、IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(パールカン)、エンタクチン/ニドゲン、サイトカイン、成長因子等が挙げられる。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて支持体から除去することで作製することができる。基底膜標品としては、基底膜調製物として市販されている商品(例えば、マトリゲル(Corning社製))やGeltrex(Life Technologies社製)、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子(例えばラミニン、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど)を含むものが挙げられる。
本発明において、Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫等の組織乃至細胞から抽出、可溶化されたマトリゲル(Corning社製)等の基底膜標品を細胞及び組織の培養に用いることができる。同様に細胞培養に用いる基底膜成分として、ヒト可溶化羊膜(株式会社生物資源応用研究所社製)、HEK293細胞に産生させたヒト組み換えラミニン(BioLamina社製)、ヒト組み換えラミニン断片(ニッピ社製)、ヒト組み換えビトロネクチン(Thermo Fisher Scientific社製)等も用いることができる。
「物質Xを含む培地」及び「物質Xの存在下」とは、それぞれ外来性(exogenous)の物質Xが添加された培地もしくは外来性の物質Xを含む培地、及び外来性の物質Xの存在下を意味する。外来性の物質Xは、例えば培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Xを内在的(endogenous)に発現、分泌又は産生する内在的な物質Xと区別される。
「フィーダー細胞」とは、幹細胞を培養するときに共存させる当該幹細胞以外の細胞のことである。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞としては、例えばマウス線維芽細胞(MEF)、ヒト線維芽細胞、SNL細胞等が挙げられる。多能性幹細胞の分化誘導に用いられるフィーダー細胞としては、例えばOP9細胞、PA6細胞、C3H10T1/2細胞(clone8)等が挙げられる。フィーダー細胞は、増殖抑制処理したフィーダー細胞が好ましい。増殖抑制処理としては、増殖抑制剤(例えばマイトマイシンC)処理又はγ線照射等が挙げられる。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞は、液性因子(好ましくは未分化維持因子)の分泌、細胞接着用の足場(細胞外基質)の作成等により、多能性幹細胞の未分化維持に貢献する。多能性幹細胞の分化誘導に用いられるフィーダー細胞は、液性因子(好ましくは分化誘導因子)の分泌、細胞接着用の足場(細胞外基質)の作成等により、多能性幹細胞の特定の細胞及び組織への分化に貢献する。
「細胞凝集体」(cell Aggregate)とは、培地中に分散していた細胞が集合して形成された塊であって、細胞同士が接着している塊をいう。細胞塊、胚様体(Embryoid body)、スフェア(Sphere)、スフェロイド(Spheroid)、オルガノイド(Organoid)も細胞凝集体に包含される。細胞凝集体は、好ましくは細胞同士が面接着している。一部の態様において、細胞凝集体の一部分あるいは全部において、細胞同士が細胞接着し、例えば接着結合(adherence junction)を形成している場合がある。
「均一な細胞凝集体」とは、複数の細胞凝集体を培養する際に各細胞凝集体の大きさが一定であることを意味し、細胞凝集体の大きさを最大径の長さで評価する場合、均一な細胞凝集体とは、最大径の長さの分散が小さいことを意味する。より具体的には、複数の細胞凝集体のうち75%以上の細胞凝集体において、その最大径が複数の細胞凝集体の最大径平均値の±100%以内、好ましくは最大径平均値の±50%以内、より好ましくは最大径平均値の±20%以内であることを意味する。
「細胞集団」とは、2以上の細胞から構成される細胞群をいい、例えば1000以上の細胞で構成されてもよいし、1×104以上の細胞から構成されていてもよい。細胞集団は、一種の細胞から構成されていてもよいし、複数種の細胞から構成されていてもよい。細胞集団を構成する細胞は、培地中に浮遊していてもよいし、培養器材等に接着していてもよい。また、細胞集団を構成する細胞は、単一細胞であってもよいし、細胞集団の少なくとも一部において、細胞同士が細胞接着していてもよい。ここで「単一細胞」とは、例えば細胞同士の接着(例えば面接着)がほとんどなくなった細胞をいう。また、「単一細胞」とは、一部の態様において、細胞-細胞結合(例えば接着結合)がほとんどなくなった細胞をいう。
「分散させる」とは、細胞接着した細胞及び組織等を酵素処理、物理処理等の分散処理により、分離、好ましくは単一細胞に分離させることを指す。
「赤芽球」とは、赤血球にいたる分化途中段階の有核の幼若な赤血球前駆細胞を表す。「胚型赤芽球」及び「胚型赤血球」は、胎生初期の一次造血として卵黄嚢で作られ、β-グロビン遺伝子ファミリーのうち主にε-グロビンを含有する赤芽球及び赤血球をそれぞれ表す。「胎児型赤芽球」及び「胎児型赤血球」は、胎生期の二次造血として中腎(aorta-gonad-mesonephros:AGM)領域並びに肝臓及び脾臓で作られ、β-グロビン遺伝子ファミリーのうち主にγ-グロビンを含有する赤芽球及び赤血球をそれぞれ表す。「成人(成体)型赤芽球」及び「成人(成体)型赤血球」とは、妊娠後期以降に骨髄で作られ、β-グロビン遺伝子ファミリーのうち主にβ-グロビンを含有する赤芽球及び赤血球をそれぞれ表す。本明細書においては、β-グロビン遺伝子ファミリーとは、ε-、γ-及びβ-グロビン遺伝子を指す。
「ヘモグロビン」とは、生体において赤芽球及び赤血球に含まれる酸素運搬に関わるタンパク質を表す。ヘモグロビンは、鉄原子を含む錯体であるヘムとグロビンタンパク質とから構成される。ヘモグロビン中のグロビンタンパク質はα-及びζ-グロビンのいずれかのグロビン2個と、ε-、γ-及びβ-グロビンのいずれかのグロビン2個とから構成されるヘテロ4量体である。α-、ζ-グロビンのうちζ-グロビンは一次造血期のみ発現するが、α-グロビンは一次造血期及び二次造血期の両方で発現する。胎生初期の胚型赤芽球及び胚型赤血球は主としてε-グロビン、胎児型赤芽球及び胎児型赤血球は主としてγ-グロビン、成人型赤芽球及び成人型赤血球は主としてβ-グロビンをサブユニットとして含むヘモグロビンを含有している。図1に、ヒトの胎児期から出生後にかけて、赤芽球及び赤血球が発現するβ-グロビン遺伝子ファミリーの発現割合を示す。
表1を参照して、ヘムは、赤芽球の細胞質及びミトコンドリアにおいて、以下第1の反応~第8の反応で構成される8段階の反応により生合成される。
第1の反応では、ミトコンドリアにおいて、アミノレブリン酸合成酵素(ALAS2)により、グリシンとスクシニルCoAからδアミノレブリン酸が合成される。
第2の反応では、δアミノレブリン酸はミトコンドリアから細胞質に移行し、細胞質において、アミノレブリン酸脱水素酵素(ALAD)により、ポルフォビリノーゲンとなる。
第3の反応では、ポルフォビリノーゲンは、細胞質において、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素(PBGD)によりヒドロキシメチルビランとなる。
第4の反応では、ヒドロキシメチルビランは、細胞質において、ウロポルフィリノーゲンIII合成酵素(URO3S)によりウロポルフィリノーゲンIIIとなる。
第5の反応では、ウロポルフィリノーゲンIIIは、細胞質において、ウロポルフィリノーゲンIII脱炭酸酵素(UROD)により、コプロポルフィリノーゲンIIIとなる。
第6の反応では、コプロポルフィリノーゲンIIIは細胞質からミトコンドリア内に移行し、ミトコンドリアにおいて、コプロポルフィリノーゲン酸化酵素(CPO)により、プロトポルフィリノーゲンIXとなる。
第7の反応では、プロトポルフィリノーゲンIXは、ミトコンドリアにおいて、プロトポルフィリノーゲン酸化酵素(PPO)によって酸化され、プロトポルフィリンIX(PPIX)となる。
第8の反応では、ミトコンドリアにおいて、鉄付加酵素(FECH)によりプロトポルフィリンIX(PPIX)に鉄が付加され、ヘムとなる。
ヘムは細胞質に移行し、グロビンタンパクと結合してヘモグロビンとなる。
第1の反応では、ミトコンドリアにおいて、アミノレブリン酸合成酵素(ALAS2)により、グリシンとスクシニルCoAからδアミノレブリン酸が合成される。
第2の反応では、δアミノレブリン酸はミトコンドリアから細胞質に移行し、細胞質において、アミノレブリン酸脱水素酵素(ALAD)により、ポルフォビリノーゲンとなる。
第3の反応では、ポルフォビリノーゲンは、細胞質において、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素(PBGD)によりヒドロキシメチルビランとなる。
第4の反応では、ヒドロキシメチルビランは、細胞質において、ウロポルフィリノーゲンIII合成酵素(URO3S)によりウロポルフィリノーゲンIIIとなる。
第5の反応では、ウロポルフィリノーゲンIIIは、細胞質において、ウロポルフィリノーゲンIII脱炭酸酵素(UROD)により、コプロポルフィリノーゲンIIIとなる。
第6の反応では、コプロポルフィリノーゲンIIIは細胞質からミトコンドリア内に移行し、ミトコンドリアにおいて、コプロポルフィリノーゲン酸化酵素(CPO)により、プロトポルフィリノーゲンIXとなる。
第7の反応では、プロトポルフィリノーゲンIXは、ミトコンドリアにおいて、プロトポルフィリノーゲン酸化酵素(PPO)によって酸化され、プロトポルフィリンIX(PPIX)となる。
第8の反応では、ミトコンドリアにおいて、鉄付加酵素(FECH)によりプロトポルフィリンIX(PPIX)に鉄が付加され、ヘムとなる。
ヘムは細胞質に移行し、グロビンタンパクと結合してヘモグロビンとなる。
ヘム生合成経路の第8の反応において、FECHのはたらきが阻害された場合、その基質であるプロトポルフィリンIX(PPIX)が蓄積する。
また、第7の反応において、プロトポルフィリノーゲン酸化酵素(PPO)のはたらきが阻害された場合においては、プロトポルフィリノーゲンIXは細胞質に漏出し、自然酸化され、プロトポルフィリンIX(PPIX)となる。細胞質には鉄付加酵素(FECH)が存在しないため、プロトポルフィリンIX(PPIX)は細胞質に蓄積される。
従って、生合成経路の下流酵素(PPOまたはFECH)を阻害する化合物が暴露された場合、ヘムの生合成は阻害され、プロトポルフィリンIX(PPIX)が蓄積する。このため、プロトポルフィリンIX(PPIX)の蓄積は、ヘム生合成阻害及び下流酵素阻害の指標となる。
一方で、生合成経路の上流酵素(ALAS2、ALAD、PBGD、URO3S、UROD、CPO)のはたらきが阻害された場合では、ヘムの生合成が阻害されるが、プロトポルフィリンIX(PPIX)は蓄積されない。
ヘムの生合成阻害が強く生じた場合には貧血が誘発される。貧血が胚発生期の非常に重要な時期に誘発された場合、胎児死亡や胎児発達遅延、心肥大に伴う心室中隔欠損等の催奇形性が生じる可能性がある。
また、第7の反応において、プロトポルフィリノーゲン酸化酵素(PPO)のはたらきが阻害された場合においては、プロトポルフィリノーゲンIXは細胞質に漏出し、自然酸化され、プロトポルフィリンIX(PPIX)となる。細胞質には鉄付加酵素(FECH)が存在しないため、プロトポルフィリンIX(PPIX)は細胞質に蓄積される。
従って、生合成経路の下流酵素(PPOまたはFECH)を阻害する化合物が暴露された場合、ヘムの生合成は阻害され、プロトポルフィリンIX(PPIX)が蓄積する。このため、プロトポルフィリンIX(PPIX)の蓄積は、ヘム生合成阻害及び下流酵素阻害の指標となる。
一方で、生合成経路の上流酵素(ALAS2、ALAD、PBGD、URO3S、UROD、CPO)のはたらきが阻害された場合では、ヘムの生合成が阻害されるが、プロトポルフィリンIX(PPIX)は蓄積されない。
ヘムの生合成阻害が強く生じた場合には貧血が誘発される。貧血が胚発生期の非常に重要な時期に誘発された場合、胎児死亡や胎児発達遅延、心肥大に伴う心室中隔欠損等の催奇形性が生じる可能性がある。
[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]
本発明は、胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法を提供する。以下、本発明の製造方法とも称する。本発明の製造方法は、複数回実施した場合であっても、再現性のよい結果を得ることができる。本発明の製造方法の一態様は、
多能性幹細胞を浮遊培養して、細胞凝集体を形成させる工程(1)、及び
工程(1)で得られた細胞凝集体から胚型赤芽球を含む細胞集団を得る工程(2)を含む。
本発明は、胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法を提供する。以下、本発明の製造方法とも称する。本発明の製造方法は、複数回実施した場合であっても、再現性のよい結果を得ることができる。本発明の製造方法の一態様は、
多能性幹細胞を浮遊培養して、細胞凝集体を形成させる工程(1)、及び
工程(1)で得られた細胞凝集体から胚型赤芽球を含む細胞集団を得る工程(2)を含む。
<工程(1)>
工程(1)において用いられる培地は、上記定義の項で記載したようなものである限り特に限定されない。工程(1)において用いられる培地は血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避し、また、血清のメーカーやロットの違いによる成分のバラツキが再現性に影響することを避ける観点から、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、市販の幹細胞用培地、例えばSTEMdiff Hematopoietic Basal MediumとSTEMdiff Hematopoietic Supplement Aとの混合液(STEMCELL Technologies社製)を使用することが好ましい。工程(1)において用いられる培地は、細胞保護剤を含むこともまた好ましい。その際に用いる細胞保護剤は、細胞死を抑制するために、好ましくはRho-associated protein kinase(ROCK)阻害物質を含み、より好ましくはY-27632を含む。工程(1)は、エリスロポエチン、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン3(IL-3)、インターロイキン11(IL-11)、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子(IGF)等の増殖因子、並びにフィーダー細胞が存在しない条件下で行うことが好ましい。
工程(1)において用いられる培地は、上記定義の項で記載したようなものである限り特に限定されない。工程(1)において用いられる培地は血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避し、また、血清のメーカーやロットの違いによる成分のバラツキが再現性に影響することを避ける観点から、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、市販の幹細胞用培地、例えばSTEMdiff Hematopoietic Basal MediumとSTEMdiff Hematopoietic Supplement Aとの混合液(STEMCELL Technologies社製)を使用することが好ましい。工程(1)において用いられる培地は、細胞保護剤を含むこともまた好ましい。その際に用いる細胞保護剤は、細胞死を抑制するために、好ましくはRho-associated protein kinase(ROCK)阻害物質を含み、より好ましくはY-27632を含む。工程(1)は、エリスロポエチン、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン3(IL-3)、インターロイキン11(IL-11)、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子(IGF)等の増殖因子、並びにフィーダー細胞が存在しない条件下で行うことが好ましい。
工程(1)の開始に際しては、未分化状態を維持する条件で培養されていた多能性幹細胞が単一細胞に分散されていることが好ましい。このため、工程(1)の前に多能性幹細胞を分散させる操作を行うことが好ましい。分散させる操作により得られた「分散された細胞」は、好ましくは単一細胞であるが、例えば2以上100以下の少数の細胞からなる細胞の塊を含んでもよく、2以上50以下の細胞からなる細胞の塊を含んでもよい。「分散された細胞」は、例えば単一細胞を7割以上及び細胞の塊を3割以下含んでいてもよく、好ましくは単一細胞を8割以上及び細胞の塊を2割以下含む。「分散された細胞」とは、細胞同士の接着(例えば面接着)がほとんどなくなった状態が挙げられる。一部の態様において、「分散された細胞」とは、細胞-細胞結合(例えば接着結合)がほとんどなくなった状態が挙げられる。
未分化状態を維持する条件で培養されていた多能性幹細胞を分散させる方法としては、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられ、これらの処理を組み合わせて行ってもよい。分散処理は、好ましくは細胞保護剤添加処理と同時に細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。分散された細胞は上記培地中に懸濁される。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理、スクレーパーでの掻き取り操作等が挙げられる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase、パパイン等の酵素及びエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤の少なくとも1つを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えばTripLE Select (Thermo Fisher Scientific社製)、TripLE Express (Thermo Fisher Scientific社製)、Accutase(Innovative Cell Technologies社製)、Accumax(Innovative Cell Technologies社製)等を用いることもできる。
細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、FGFシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、Rho-associated protein kinase(ROCK)阻害物質、ミオシン阻害物質、又は血清代替物を挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ROCK阻害物質が挙げられる。分散により誘導される多能性幹細胞(特に、ヒト多能性幹細胞)の細胞死を抑制するために、ROCK阻害物質を工程(1)開始時から添加してもよい。ROCK阻害物質としては、Y-27632((R)-(+)-trans-4-(1-Aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide,dihydrochloride)、Fasudil(HA1077)(1-(5-Isoquinolinylsulfonyl)homopiperazine,hydrochloride)、H-1152(5-[[(2S)-hexahydro-2-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl]sulfonyl]-4-methyl-isoquinoline,dihydrochloride)、HA-1100(Hydroxyfasudil)([1-(1-Hydroxy-5-isoquinolinesulfonyl)homopiperazine,hydrochloride)等を挙げることができる。細胞保護剤としては、調製済みの細胞保護剤を用いることもできる。調製済みの細胞保護剤としては、例えばRevitaCell Supplement(Thermo Fisher Scientific社製)、CloneR(Stemcell Technologies社製)が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。
多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば多能性幹細胞のコロニーを、細胞保護剤としてROCK阻害物質の存在下で、細胞分散液(Accumax、Accutase等)で処理し、さらにピペッティングにより分散させる方法が挙げられる。
分散された多能性幹細胞の懸濁液を培養器材中に播種し、分散させた多能性幹細胞を、培養器材に対して非接着性の条件下で培養、すなわち浮遊培養することにより、複数の多能性幹細胞を集合させて細胞凝集体を形成する。浮遊培養するために、工程(1)において培養器材は上述した細胞非接着性の培養器材を用いることが好ましい。
この際、分散された多能性幹細胞を、10cmディッシュのような、比較的大きな培養器材に播種することにより、1つの培養器材中に複数の細胞凝集体を同時に形成させてもよいが、細胞凝集体ごとの大きさのばらつきを生じにくくする観点からは、例えば細胞非接着性の96ウェルマイクロプレートのようなマルチウェルプレート(U底、V底)の各ウェルに一定数の分散された多能性幹細胞を播種することが好ましい。これを静置培養すると、細胞が迅速に凝集することにより、各ウェルにおいて1個の細胞凝集体を形成させることができる。マルチウェルプレートとしては、例えばPrimeSurface 96V底プレート(MS-9096V、住友ベークライト株式会社製)が挙げられる。この細胞凝集体を複数のウェルから回収すれば、均一な細胞凝集体の集団を得ることができる。細胞凝集体が均一であれば、その後の工程において、ウェルごと及び反復実験ごとの製造効率をより安定させて、より再現性よく胚型赤芽球を含む細胞集団を得ることができる。
工程(1)において播種する多能性幹細胞の細胞数は、細胞凝集体をより均一に、効率的に形成させるために適宜設定することができる。例えば96ウェルマイクロウェルプレートを用いてヒト多能性幹細胞を浮遊培養する場合、1ウェルあたり通常約1×102から約1×105細胞、好ましくは約5×102から約5×104細胞、より好ましくは約1×103から約2×104細胞、更に好ましくは約1.5×103から約1.6×104細胞、特に好ましくは約2×103から約4×103細胞となるように調製した細胞懸濁液を各ウェルに添加し、プレートを静置して細胞凝集体を形成させる。細胞数は、血球計算盤で計数することによって求めることができる。
分散された多能性幹細胞から細胞凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な細胞凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。分散された細胞から細胞凝集体が形成されるには、細胞が集合し、次いで集合した細胞が細胞凝集体を形成する。例えばヒト多能性幹細胞(ヒトiPS細胞等)の場合には、分散された細胞を播種する時点(すなわち浮遊培養開始時)から、好ましくは約24時間以内、より好ましくは約12時間以内、さらに好ましくは6時間以内に細胞が集合し、好ましくは約72時間以内、より好ましくは約48時間以内、さらに好ましくは24時間以内に細胞凝集体が形成される。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することにより適宜調節することが可能である。
本発明の製造方法においては、分散された多能性幹細胞を迅速に集合させることで、均一な細胞凝集体を形成させることが好ましい。細胞を集合させる実験的な操作としては、例えばウェルの小さなプレート(例えばウェルの底面積が平底換算で0.1~2.0cm2程度のプレート)やマイクロポア等を用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を集合させる方法が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、例えば24ウェルプレート(面積が平底換算で1.88cm2程度)、48ウェルプレート(面積が平底換算で1.0cm2程度)、96ウェルプレート(面積が平底換算で0.35cm2程度、内径6~8mm程度)、384ウェルプレートが挙げられる。好ましくは96ウェルプレートが挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを上から見たときの底面の形状としては、多角形、長方形、楕円、真円が挙げられ、好ましくは真円が挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを横から見たときの底面の形状としては、外周部が高く内凹部が低くくぼんだ構造が好ましく、例えばU底、V底、M底が挙げられ、好ましくはU底又はV底、最も好ましくはV底が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、細胞培養皿(例えば、60mm~150mmディッシュ、カルチャーフラスコ)の底面に凹凸又はくぼみがあるものを用いてもよい。ウェルの小さなプレートの底面は、細胞非接着性の底面、好ましくは細胞非接着性コートした底面であることが好ましい。
工程(1)においては、多能性幹細胞を培養器材に播種した後に遠心して細胞を集合させ、細胞凝集体の形成を促進することが好ましい。遠心の条件は適宜設定可能であるが、例えばスイングローターのプレート用遠心機を用いて100Gから300Gの遠心加速度で1分から10分間遠心操作を行うことにより、細胞凝集体の形成を促進することができる。
工程(1)における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。
細胞凝集体が形成されたことは、細胞凝集体のサイズ及び細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態及びその均一性、分化及び未分化マーカーの発現及びその均一性、分化マーカーの発現制御及びその同期性、分化効率の凝集体間の再現性等に基づき判断することが可能である。
細胞凝集体が形成された後、所望の細胞凝集体を得るためにそのまま細胞凝集体の培養を継続してもよい。工程(1)における浮遊培養の時間、すなわち上記の細胞が集合するまでの時間と、細胞凝集体が形成されるまでの時間と、必要に応じて継続される浮遊培養時間との合計時間は、通常8時間以上6日間以内程度、好ましくは12時間以上96時間以内程度である。すなわち、好ましくは工程(1)の開始から後述する工程(2a)の開始までの時間は、好ましくは12時間以上96時間以内程度である。培養時間が短すぎると、細胞凝集体を構成する細胞の数が少ない傾向にあり、培養時間が長すぎると過度に細胞の分化が進む傾向がある。
<工程(2)>
工程(2)は、工程(1)で得られた細胞凝集体から胚型赤芽球を含む細胞集団を得る工程である。
工程(2)は、工程(1)で得られた細胞凝集体から胚型赤芽球を含む細胞集団を得る工程である。
胚型赤芽球を含む細胞集団は、胚型赤芽球を含んでいればどのような細胞集団でもよく、細胞凝集体に由来する全ての細胞を含んでもよいし、全ての細胞からなる細胞集団の一部であってもよい。細胞集団は、好ましくは生体内で胚型赤芽球が存在する環境とは異なる環境で存在し、好ましくは生体内で胚型赤芽球が存在する環境における細胞の集団とは構成する細胞の種類もしくは細胞の存在比率が異なる細胞集団である。
工程(2)で得られる細胞集団は、胚型赤芽球を含む。胚型赤芽球は、上記定義の項で述べた細胞であり、胚型赤芽球であるかどうかは、ε-グロビンに対する免疫染色により特定される。細胞集団に含まれる胚型赤芽球の遺伝子発現及び機能は、生体内における胚型赤芽球のそれらと同様であると想定される。
免疫染色の結果の解釈は、当業者の目視による判別、又は撮影した画像に対する画像解析ソフトを用いた定量的な解析等、当業者に周知の方法により行うことができる。免疫染色の結果の解釈に当たっては、例えば蛋白質核酸酵素Vol.54 No.2(2009)P185-192等を参照し、自家蛍光、二次抗体の非特異的吸着、多重染色時の蛍光の漏れこみ等により生じる偽陽性を排除せねばならない。ε-グロビンの発現の有無は、後述の予備実験に示す方法に従って判断した。
胚型赤芽球を含む細胞集団は、任意の細胞集団を指すが、細胞集団を構成する細胞のうち、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%の細胞は胚型赤芽球である。本発明に係る製造方法によれば、胚型赤芽球を数多く得ることができ、集団に含まれる胚型赤芽球の割合も大きくすることができる。細胞集団における胚型赤芽球の割合は、核染色によって観察される生細胞のうち、後述する予備実験における免疫染色と同様の方法によってε-グロビンが発現していると認定された細胞の数として求めることができる。
また、細胞集団において、細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、好ましくは少なくとも50%が、より好ましくは少なくとも60%がε-グロビン遺伝子である。本発明に係る製造方法によれば、ε-グロビンを高発現している細胞集団を得ることができる。βグロビン遺伝子ファミリーのうちのε-グロビン遺伝子の発現割合は、βグロビン遺伝子ファミリーのmRNAの総量におけるε-グロビン遺伝子のmRNAの相対発現量として求めることができる。mRNAの相対発現量は、後述する実施例1におけるリアルタイムPCRと同様の方法によって求めることができる。
<工程(2a)>
工程(2)は、細胞凝集体を接着培養する工程(2a)を含む。
工程(2)は、細胞凝集体を接着培養する工程(2a)を含む。
工程(2a)において用いられる培地は、上述の定義の項で記載したようなものである限り特に限定されない。工程(2a)において用いられる培地は血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避し、また、血清のメーカーやロットの違いによる成分のバラツキが再現性に影響することを避ける観点から、本発明においては無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、市販の幹細胞用培地、例えばSTEMdiff Hematopoietic Basal MediumとSTEMdiff Hematopoietic Supplement Bとの混合液(STEMCELL Technologies社製)を使用することが好ましい。工程(2a)において用いられる培地は、多能性幹細胞の細胞死を抑制するために、細胞保護剤を含むこともまた好ましい。その際に用いる細胞保護剤は好ましくは工程(1)で用いたものと同一の物であり、より好ましくはROCK阻害物質を含み、さらに好ましくはY-27632を含む。
工程(2a)は、細胞接着性の培養器材を用いて行うことが好ましい。細胞接着性の培養器材は、上述した細胞接着が可能になる表面処理等が行われていれば、特に限定されない。このような培養器材としては、例えば市販の接着細胞培養用の3.5cmディッシュ、6cmディッシュ、10cmディッシュ、および24ウェルプレート、6ウェルプレート等の細胞培養用プレート等を用いることができる。
工程(2a)において用いられる培養器材は、細胞凝集体の接着と赤芽球への分化を促進する観点から、細胞の接着、付着を促進する基質でコートされていることが好ましい。上記のような基質として、例えば基底膜標品、組み換え細胞外マトリックス、Poly-D-Lysine、Poly-L-Lysine、Poly-L-Ornithine、Synthemax等の合成基質等が挙げられる。本発明で用いられる細胞の接着、付着を促進する基質は、好ましくは基底膜標品を含み、より好ましくはマトリゲルを含む。
工程(2a)における接着培養は、工程(1)において形成させた細胞凝集体を、細胞接着性の培養器材に移設することによって行われる。その際に用いる移設方法は特に限定はされないが、細胞凝集体への物理的な負荷が少ないほうが好ましい。このような移設方法として、例えばワイドボアピペットチップとマイクロピペットを用いた凝集体の移設等が挙げられる。
工程(2a)は、フィーダー細胞存在下で行ってもよい。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、好ましくは骨髄間質細胞、骨髄間質細胞由来細胞株又は繊維芽細胞であり、好ましくOP9細胞(マウス骨髄ストローマ細胞)又はC3H10T1/2細胞(clone8)(マウス胚由来繊維芽細胞)、より好ましくはOP9細胞である。播種したフィーダー細胞上に細胞凝集体を接着培養させることで、胚型赤芽球への分化を促進することができ、特に多能性幹細胞としてラットES細胞を用いた場合、胚型赤芽球への分化効率をより向上させることができる。
工程(2a)は、エリスロポエチン、エリスロポエチン受容体作動薬、エリスロポエチン受容体を介する情報伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で行うことが好ましい。エリスロポエチン受容体作動薬としては、例えばダルベポエチン、メトキシポリエチレングリコール-エポエチンベータ、エリスロポエチン模倣ペプチド等が挙げられる。エリスロポエチン受容体を介する情報伝達経路作用物質としては、例えばJanus kinase 2(JAK2)を活性化させる物質、JAK2の脱リン酸化酵素に対する阻害剤等が挙げられる。上記物質の濃度は適宜設定することができるが、胚型赤芽球への分化の効率化の観点からは、工程(2a)をエリスロポエチンの存在下で行うときは、その濃度は例えば1ng/mL以上500ng/mL以下であり、好ましくは10ng/mL以上100ng/mL以下である。エリスロポエチン以外の物質を用いるときは、上記濃度のエリスロポエチンと同等の情報伝達経路作用を示す濃度で用いることが好ましい。また、これらの因子の添加時期は、工程(2a)の開始と同時であってもよいし、異なっていてもよい。
また、工程(2a)は、胚型赤芽球への分化の効率化の観点からは、さらなる増殖因子等の存在下で行ってもよく、好ましくは幹細胞因子(SCF)、インターロイキン3(IL-3)、インターロイキン11(IL-11)、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子(IGF)からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で行う。これらの因子の濃度は適宜設定することができるが、工程(2a)を幹細胞因子の存在下で行うときは、その濃度は例えば1ng/mL以上500ng/mL以下であり、好ましくは10ng/mL以上100ng/mL以下である。工程(2a)をインターロイキン3の存在下で行うときは、その濃度は例えば0.1ng/mL以上100ng/mL以下であり、好ましくは1ng/mL以上50ng/mL以下である。工程(2a)をインターロイキン11の存在下で行うときは、その濃度は例えば0.1ng/mL以上100ng/mL以下であり、好ましくは1ng/mL以上50ng/mL以下である。工程(2a)をヒドロコルチゾンの存在下で行うときは、その濃度は例えば0.01μM以上50μM以下であり、好ましくは0.1μM以上10μM以下である。工程(2a)をインスリン様成長因子の存在下で行うときは、その濃度は例えば0.1ng/mL以上100ng/mL以下であり、好ましくは1ng/mL以上50ng/mL以下である。また、これらの因子の添加時期は、工程(2a)の開始と同時であってもよいし、異なっていてもよい。
工程(2a)における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。
工程(2a)の培養時間は、目的の細胞集団が得られるまでの間で、細胞の種類や培養条件により適宜設定することができる。ヒトiPS細胞を用いた場合は、例えば2日以上18日以内であり、好ましくは3日以上18日以内であり、より好ましくは4日以上10日以内である。ラットES細胞を用いた場合は、例えば2日以上18日以内であり、好ましくは2日以上10日以内であり、より好ましくは3日以上8日以内である。培養時間が短すぎると、胚型赤芽球が得られない傾向にあり、培養期間が長すぎると、胚型赤芽球の分化が過度に進む傾向がある。
<工程(2b)>
工程(2)は、胚型赤芽球を含む細胞集団を回収する工程(2b)をさらに含んでいてもよい。
工程(2)は、胚型赤芽球を含む細胞集団を回収する工程(2b)をさらに含んでいてもよい。
工程(2b)で回収される細胞集団は、工程(2a)の培養後に得られる接着細胞及び浮遊細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種であってよいが、細胞集団における胚型赤芽球の占める割合を上昇させる観点からは、浮遊細胞のみを回収することが好ましい。浮遊細胞のみを回収することにより、細胞集団を構成する細胞のうち、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%の細胞が胚型赤芽球である細胞集団を得られやすくなる。また、浮遊細胞のみを回収することにより、細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、好ましくは少なくとも50%が、より好ましくは少なくとも60%がε-グロビン遺伝子である細胞集団を得られやすくなる。回収する浮遊細胞は、浮遊細胞の全部であってもよいし、一部であってもよい。
浮遊細胞を回収する方法としては特に限定されないが、浮遊細胞を含む培地をピペット等でチューブ等に回収する方法であることができる。チューブ等を遠心し、上清を除くことで、細胞集団のペレットを得ることができる。浮遊細胞を回収する他の方法としては、例えば細胞表面マーカーに対する抗体を用いた蛍光活性化セルソーティング(fluorescence activated cell sorting:FACS)、磁気細胞分離(MACS)、フィルトレーション等が挙げられる。
工程(2b)は、細胞を安定化させるために、細胞保護剤の存在下で行ってもよく、その際に用いる細胞保護剤は好ましくはROCK阻害物質を含み、より好ましくはY-27632を含む。
<工程(3)>
工程(2)により得られた胚型赤芽球を含む細胞集団をさらに培養する工程(3)を含んでもよい。
工程(2)により得られた胚型赤芽球を含む細胞集団をさらに培養する工程(3)を含んでもよい。
工程(3)で培養する細胞集団は、好ましくは工程(2b)において回収した細胞集団であり、より好ましくは工程(2b)において浮遊した細胞を回収した、胚型赤芽球を含む細胞集団である。工程(3)は、好ましくは細胞接着性の培養器材を用いて、浮遊培養を行う。細胞接着性の培養器材を用いて細胞集団を浮遊培養することで、赤芽球以外の接着性の細胞を培養器材に接着させ、浮遊した細胞集団から接着性の細胞を除くことができる。また、工程(3)は、好ましくはフィーダー細胞の非存在下で行う。
工程(3)で用いられる培地は、上記工程(2a)で用いた培地と同じであってもよく、異なっていてもよい。工程(3)は、ヒトiPS細胞を用いた場合は、例えば市販のSTEMdiff Hematopoietic Basal MediumとSTEMdiff Hematopoietic Supplement Bとの混合液(STEMCELL Technologies社製)を使用することが好ましく、ラットES細胞を用いた場合には、StemlineII培地(シグマアルドリッチ社製)を使用することが好ましい。工程(3)で用いられる培地は、細胞を安定化させるために、細胞保護剤を含んでもよく、好ましくはROCK阻害物質を含み、より好ましくはY-27632を含む。
工程(3)は、エリスロポエチン、エリスロポエチン受容体作動薬、エリスロポエチン受容体を介する情報伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で行うことが好ましい。これらの因子としては、上述の工程(2a)で用いた因子を続けて用いてもよい。これらの因子の濃度は、上述の工程(2a)で用いた濃度と同じ濃度であってもよいし、異なっていてもよい。工程(3)をエリスロポエチンの存在下で行うときは、その濃度は例えば1ng/mL以上500ng/mL以下であり、好ましくは10ng/mL以上100ng/mL以下である。エリスロポエチン以外の物質を用いるときは、上記濃度のエリスロポエチンと同等の情報伝達経路作用を示す濃度で用いることが好ましい。また、工程(3)は幹細胞因子の存在下で行ってもよい。幹細胞因子は、上述の(2a)で用いた濃度と同じ濃度で用いてもよいし、異なっていてもよい。これらの因子の添加時期は、工程(3)の開始と同時であってもよいし、異なっていてもよい。
また、工程(3)においては、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つを含まないことが好ましく、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子の全てを含まないことがより好ましい。また、工程(3)はフィーダー細胞が存在しない条件下で行うことが好ましい。胚型赤芽球を含む細胞集団は、分化誘導条件下で培養を続けると、胚型赤芽球のマーカーであるε-グロビンの発現が減少し、γ-グロビン及びβ-グロビンの発現が上昇して、胎児型又は成人型の赤芽球へと分化が進んでしまうことが知られている。しかし、工程(3)を上記条件下で行うと、培養を継続しても、細胞集団を構成する細胞のうちε-グロビンが発現した胚型赤芽球の割合を高いまま維持することができ、また、集団において細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうちのε-グロビンの発現量を高く維持することができる。
工程(3)における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。
工程(3)の培養時間は、目的の細胞集団を得るために、細胞の種類や培養条件により適宜設定することができるが、例えば2日以上とすることができる。ヒトiPS細胞を用いた場合は、4日以上としてもよく、8日以上14日以内としてもよい。ラットES細胞を用いた場合は、3日以上としてもよく、4日以上10日以内としてもよい。
本発明に係る製造方法に用いられる多能性幹細胞は特に限定されないが、好ましくはES細胞又はiPS細胞である。本発明に係る製造方法に用いられる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞が好ましく、霊長類多能性幹細胞、げっ歯類多能性幹細胞又はウサギ多能性幹細胞であることがより好ましく、ヒト多能性幹細胞又はラット多能性幹細胞であることがさらに好ましい。
[3.胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法]
胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法は、
多能性幹細胞を浮遊培養して、細胞凝集体を形成させる工程(A)、
工程(A)で得られた細胞凝集体から胚型赤芽球を含む細胞集団を得る工程(B)、
細胞集団を試験化合物の存在下で培養する工程(C)、及び
工程(C)で培養した胚型赤芽球を含む細胞集団の1)細胞数、2)ヘム濃度、3)プロトポルフィリンIX濃度、及び4)グロビン発現量のうちの少なくとも1つの項目を測定する工程(D)を含む。
胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法は、
多能性幹細胞を浮遊培養して、細胞凝集体を形成させる工程(A)、
工程(A)で得られた細胞凝集体から胚型赤芽球を含む細胞集団を得る工程(B)、
細胞集団を試験化合物の存在下で培養する工程(C)、及び
工程(C)で培養した胚型赤芽球を含む細胞集団の1)細胞数、2)ヘム濃度、3)プロトポルフィリンIX濃度、及び4)グロビン発現量のうちの少なくとも1つの項目を測定する工程(D)を含む。
<工程(A)>
工程(A)は、上記[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]における工程(1)と同じ方法で行うことができる。
工程(A)は、上記[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]における工程(1)と同じ方法で行うことができる。
<工程(B)>
工程(B)は、上記[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]における工程(2)と同じ方法で行うことができる。工程(B)は、細胞凝集体を接着培養する工程(Ba)を含む。工程(Ba)は上記[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]における工程(2a)と同じ方法で行うことができる。また、工程(B)は、細胞集団を回収する工程(Bb)をさらに含んでもよい。工程(Bb)は、上記[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]における工程(2b)と同じ方法で行うことができる。
工程(B)は、上記[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]における工程(2)と同じ方法で行うことができる。工程(B)は、細胞凝集体を接着培養する工程(Ba)を含む。工程(Ba)は上記[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]における工程(2a)と同じ方法で行うことができる。また、工程(B)は、細胞集団を回収する工程(Bb)をさらに含んでもよい。工程(Bb)は、上記[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]における工程(2b)と同じ方法で行うことができる。
<工程(C)>
工程(C)では、工程(B)で得られた細胞集団を試験化合物の存在下で培養する。工程(C)で培養する細胞集団は、好ましくは工程(Bb)において回収した細胞集団であり、より好ましくは工程(Bb)において浮遊細胞を回収した細胞集団である。
工程(C)では、工程(B)で得られた細胞集団を試験化合物の存在下で培養する。工程(C)で培養する細胞集団は、好ましくは工程(Bb)において回収した細胞集団であり、より好ましくは工程(Bb)において浮遊細胞を回収した細胞集団である。
工程(C)で用いられる培地、増殖因子、培養器材、その他培養条件等は、特に記載しない限り、好ましくは上記[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]の工程(3)と同じものを用いる。工程(C)は、好ましくは、好ましくは細胞接着性の培養器材を用いて、浮遊培養を行う。また、工程(C)は、好ましくはフィーダー細胞の非存在下で行う。
工程(C)の試験化合物は、特に限定されないが、ヘモグロビン合成の阻害、胎児の正常発生の阻害、催奇形性もしくは胚致死を誘導する物質又はこれらが疑われる物質を用いることが好ましい。試験化合物としては、例えばジヒドロアルテミシニン、スクシニルアセトン等が挙げられる。試験化合物の濃度は試験に適切な範囲で適宜設定することができる。試験化合物の対照としては、試験化合物の溶解に用いた溶媒を用いることができ、例えばジメチルスルホキシド(DMSO)等が挙げられるが、試験化合物を添加しない条件を用いてもよい。
試験化合物の存在下で細胞集団を培養する方法は、細胞集団を構成する細胞が試験化合物に接触する方法であれば特に限定されないが、例えば細胞集団を培養している培地に試験化合物を添加する方法、又は試験化合物をあらかじめ添加した培地で、細胞集団の培養を開始する方法が挙げられる。
本方法において、細胞集団を構成する細胞のうち、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%の細胞が胚型赤芽球である。すなわち、工程(B)で得られ、工程(C)において培養し、工程(D)の分析に供するまで、細胞集団は、その70%以上の細胞で胚型赤芽球マーカーであるε-グロビンの発現を保持していることが好ましい。細胞集団における胚型赤芽球の割合は、核染色によって観察される生細胞のうち、後述する予備実験における免疫染色と同様の方法によってε-グロビンが発現していると認定された細胞の数として求めることができる。細胞集団における胚型赤芽球の割合が上記範囲であれば、胚型赤芽球に対する化合物の影響をより適切に調べることができる。
また、本方法において、細胞集団において、細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、好ましくは少なくとも50%が、より好ましくは少なくとも60%がε-グロビン遺伝子であることが好ましい。すなわち、工程(B)で得られ、工程(C)において培養し、工程(D)で分析に供するまで、細胞集団は、細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、好ましくは少なくとも50%がε-グロビン遺伝子を発現し、より好ましくは少なくとも60%がε-グロビン遺伝子を発現する。βグロビン遺伝子ファミリーのうちのε-グロビン遺伝子の発現割合は、βグロビン遺伝子ファミリーのmRNAの総量におけるε-グロビン遺伝子のmRNAの相対発現量として求めることができる。mRNAの相対発現量は、後述する実施例1におけるリアルタイムPCRと同様の方法によって求めることができる。βグロビン遺伝子ファミリーのmRNAの総量におけるε-グロビン遺伝子のmRNAの相対発現量が上記範囲であれば、胚型赤芽球に対する化合物の影響をより精度よく調べることができる。
工程(C)においては、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つを含まないことが好ましく、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子の全てを含まないことがより好ましい。また、工程(C)はフィーダー細胞が存在しない条件下で行うことが好ましい。胚型赤芽球を含む細胞集団は、分化誘導条件下で培養を続けると、胚型赤芽球のマーカーであるε-グロビンの発現が減少し、γ-グロビン及びβ-グロビンの発現が上昇して、胎児型又は成人型の赤芽球へと分化が進んでしまうことが知られている。しかし、工程(C)を上記条件下で行うと、培養を継続しても、細胞集団を構成する細胞のうちε-グロビンが発現した胚型赤芽球の割合を高いまま維持することができ、また、集団において細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうちのε-グロビンの発現量を高く維持することができる。このため、化合物の影響を調べるために数日間の培養することが望ましい場合でも、特に胚型赤芽球へ与える影響を調べることができる。
工程(C)の培養時間は、細胞の種類や培養条件により適宜設定することができるが、例えば2日以上とすることができる。ヒトiPS細胞を用いた場合は、4日以上としてもよく、8日以上14日以内としてもよい。ラットES細胞を用いた場合は、3日以上としてもよく、4日以上10日以内としてもよい。
<工程(D)>
工程(D)では、工程(C)で培養した細胞集団の1)細胞数、2)細胞生存率、3)ヘム濃度、4)プロトポルフィリンIX濃度、及び5)グロビン発現量からなる群より選ばれる少なくとも1つの項目を測定する。上記の項目の測定結果と、対照(例えばDMSO等の溶媒対照)の存在下で工程(C)を行った細胞集団の上記項目を測定することで、試験化合物が胚型赤芽球に与える影響を調べることができる。また、対照化合物を含む複数の試験化合物を用いて、それぞれの試験化合物の存在下で工程(C)を行った細胞集団の上記項目を測定し、結果を比較することで、ヘモグロビン合成の阻害、胎児の正常発生の阻害、催奇形性もしくは胚致死を誘導し得る試験化合物をスクリーニングすることもできる。
工程(D)では、工程(C)で培養した細胞集団の1)細胞数、2)細胞生存率、3)ヘム濃度、4)プロトポルフィリンIX濃度、及び5)グロビン発現量からなる群より選ばれる少なくとも1つの項目を測定する。上記の項目の測定結果と、対照(例えばDMSO等の溶媒対照)の存在下で工程(C)を行った細胞集団の上記項目を測定することで、試験化合物が胚型赤芽球に与える影響を調べることができる。また、対照化合物を含む複数の試験化合物を用いて、それぞれの試験化合物の存在下で工程(C)を行った細胞集団の上記項目を測定し、結果を比較することで、ヘモグロビン合成の阻害、胎児の正常発生の阻害、催奇形性もしくは胚致死を誘導し得る試験化合物をスクリーニングすることもできる。
1)細胞数及び2)細胞生存率
細胞数は、工程(C)の培養後の細胞集団中の生細胞数を血球計算盤や自動セルカウンター等で計数することで求めることができる。細胞生存率は、トリパンブルー染色による死細胞染色による方法、細胞内在性のATP定量による方法、ミトコンドリア活性を利用したMTTアッセイ法、カルセインAM等を用いた生細胞のエステラーゼ活性測定法等の方法よって適宜測定することができる。例えば、トリパンブルー染色による方法では、工程(C)の培養終了時のトリパンブルー陰性細胞数を、トリパンブルー陰性細胞数と陽性細胞数の合計値で除した値をいう。
細胞数は、工程(C)の培養後の細胞集団中の生細胞数を血球計算盤や自動セルカウンター等で計数することで求めることができる。細胞生存率は、トリパンブルー染色による死細胞染色による方法、細胞内在性のATP定量による方法、ミトコンドリア活性を利用したMTTアッセイ法、カルセインAM等を用いた生細胞のエステラーゼ活性測定法等の方法よって適宜測定することができる。例えば、トリパンブルー染色による方法では、工程(C)の培養終了時のトリパンブルー陰性細胞数を、トリパンブルー陰性細胞数と陽性細胞数の合計値で除した値をいう。
3)ヘム濃度及び4)プロトポルフィリンIX濃度
ヘム濃度及びプロトポルフィリンIXの濃度は、細胞集団を、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)等で分析することで、測定することができる。
ヘム濃度及びプロトポルフィリンIXの濃度は、細胞集団を、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)等で分析することで、測定することができる。
5)グロビン発現量
グロビン発現量は、RNA又はタンパク質の発現を検出するための用いられる公知の方法によって測定することができる。グロビンのRNA発現量は、例えば細胞集団から公知の方法でRNAを抽出した後、リアルタイムPCR、トランスクリプトーム解析等によって測定することができる。グロビンのタンパク質発現量は、例えば細胞集団から公知の方法でタンパク質を抽出した後、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)等で測定することができる。
グロビン発現量は、RNA又はタンパク質の発現を検出するための用いられる公知の方法によって測定することができる。グロビンのRNA発現量は、例えば細胞集団から公知の方法でRNAを抽出した後、リアルタイムPCR、トランスクリプトーム解析等によって測定することができる。グロビンのタンパク質発現量は、例えば細胞集団から公知の方法でタンパク質を抽出した後、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)等で測定することができる。
上記1)~5)の項目の他、分化マーカー遺伝子の発現を測定することにより、細胞の分化への影響を調べることができる。上記の項目は、例示された方法以外にも、メタボロミクス解析、エキソソーム解析、エピゲノム変化解析等により、試験化合物が胚型赤芽球を含む細胞集団へ与える影響を調べることができる。
本発明に係る試験法に用いられる多能性幹細胞は、特に限定されないが、好ましくはES細胞又はiPS細胞である。本発明に係る試験法に用いられる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞が好ましく、霊長類多能性幹細胞、げっ歯類多能性幹細胞又はウサギ多能性幹細胞であることがより好ましく、ヒト多能性幹細胞又はラット多能性幹細胞であることがさらに好ましい。
<複数の生物種由来の胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法>
上記の化合物試験法を、複数の生物種由来の胚型赤芽球を含む細胞集団を用いて行い、工程(D)において、複数の生物種由来の多能性幹細胞から得られるそれぞれの細胞集団について測定を行ってもよい。複数の生物種由来の多能性幹細胞から得られるそれぞれの細胞集団について、上記測定を行い、その結果を比較することで、試験化合物が細胞集団に与える影響の種差を調べることができる。
上記の化合物試験法を、複数の生物種由来の胚型赤芽球を含む細胞集団を用いて行い、工程(D)において、複数の生物種由来の多能性幹細胞から得られるそれぞれの細胞集団について測定を行ってもよい。複数の生物種由来の多能性幹細胞から得られるそれぞれの細胞集団について、上記測定を行い、その結果を比較することで、試験化合物が細胞集団に与える影響の種差を調べることができる。
複数の生物種は、哺乳動物であることが好ましく、霊長類、げっ歯類及びウサギ目からなる群に属する生物のうち少なくとも2種を含むことがより好ましく、ヒト及びラットを含むことがさらに好ましい。
[4.胚型赤芽球を含む細胞集団]
本発明に係る胚型赤芽球を含む細胞集団は、細胞集団を構成する細胞のうち、少なくとも70%の細胞が胚型赤芽球であり、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%の細胞が胚型赤芽球である。
本発明に係る胚型赤芽球を含む細胞集団は、細胞集団を構成する細胞のうち、少なくとも70%の細胞が胚型赤芽球であり、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%の細胞が胚型赤芽球である。
胚型赤芽球を含む細胞集団は、上記[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]に記載された方法と同様にして製造してもよく、このうち、例えば浮遊した細胞集団を回収することで、少なくとも70%又は80%の細胞が胚型赤芽球である細胞集団を得ることができる。浮遊した細胞集団はさらにFACS、MACS等によってε-グロビンを発現する細胞を集めることで、少なくとも90%の細胞が胚型赤芽球である細胞集団を得ることができる。
胚型赤芽球を含む細胞集団は、化合物試験に用いられる細胞集団であってもよい。化合物試験とは、例えば上記[3.胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法]に記載の試験挙げられる。
胚型赤芽球を含む細胞集団は、ε-グロビンの発現が維持された状態で保存されていることが好ましい。保存されているとは、例えば細胞集団が移動可能な状態におかれることを含む。また、ε-グロビンの発現が維持された状態とは、細胞集団における胚型赤芽球の割合、又は細胞集団において、βグロビン遺伝子ファミリーのうちε-グロビンの発現量の、保存前と保存後の変化量が例えば30%以内であり、好ましくは20%以内であることをいう。
このような保存状態としては、例えばインターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つ、フィーダー細胞並びにフィーダー細胞の培養上清に接触しない状態で培地、生理食塩水、保存液等に保存されている状態が挙げられる。また、保存は冷凍条件下(0℃未満)でも、低温条件下(例えば0℃以上25℃未満)であってもよく、培養温度に近い条件下(25℃以上38℃以下)であってもよい。冷凍条件下では、例えば細胞凍結液に細胞集団を懸濁し、クライオチューブ等に分注し、超低温(-150℃~-70℃)又は液体窒素(-196℃)下で冷凍保存することができる。
細胞集団がε-グロビンの発現が維持された状態で保存されているとき、例えば細胞集団をさらに培養した際に、胚型赤芽球の割合が高い細胞集団を培養することができる。
[5.細胞培養組成物]
細胞培養組成物は、胚型赤芽球を含む細胞集団と、培地とを含む。胚型赤芽球を含む細胞集団は、上記[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]に記載された方法と同様にして製造してもよい。細胞培養組成物は、細胞集団を培地に懸濁した懸濁液であってもよいし、細胞集団と培地とは別であってもよい。
細胞培養組成物は、胚型赤芽球を含む細胞集団と、培地とを含む。胚型赤芽球を含む細胞集団は、上記[2.胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法]に記載された方法と同様にして製造してもよい。細胞培養組成物は、細胞集団を培地に懸濁した懸濁液であってもよいし、細胞集団と培地とは別であってもよい。
培地としては、上記[3.胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法]の工程(C)に用いられる培地であってもよい。
細胞培養組成物に含まれる培地は、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つを含まないことが好ましく、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子の全てを含まないことがより好ましい。また、細胞培養組成物に含まれる培地は、フィーダー細胞の培養上清を含まないことが好ましい。
また、細胞培養組成物に含まれる培地は、エリスロポエチン、エリスロポエチン受容体作動薬、エリスロポエチン受容体を介する情報伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つを含むことが好ましい。また、細胞培養組成物に含まれる培地は幹細胞因子を含有していてもよい。
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。
[予備実験:免疫染色結果の定量化と判断基準]
蛍光免疫染色標本の陽性又は陰性の判別のための蛍光強度の定量化を行った。染色強度の定量化手法としては、実施例1において作製した浮遊培養(工程(1))開始から10日目の浮遊した細胞集団の塗抹標本に対して、実施例1と同様の方法によって抗HBE1抗体による蛍光免疫染色を行った。結果の撮影像(図2の上段)(最大励起波長490nm、最大蛍光波長525nm)に対し、線分A-A’で示す関心領域の線形の蛍光強度プロファイルを出力し、細胞がある領域と細胞の存在しない領域の蛍光強度を比較した。図2の下段に示した解析結果では、細胞の存在しない領域の蛍光強度が170であり、目視で陽性と判別された蛍光強度の強い領域の数値は4095、上記よりも蛍光強度の弱い陽性領域の数値は1438であった。一方、目視で陰性と判別された領域の数値は511であった。よって、図2の下段のグラフに破線で示す通り、明視野中で細胞が存在しないと確認した領域の蛍光強度の平均値に対し、5倍以上高い数値を示した所を陽性とすることにより、抗原の染色結果の陽性又は陰性の判別を定量的に行えることが分かった。以下の実験は、本予備実験と同様の方法によって発現の陽性又は陰性の判断を行った。
蛍光免疫染色標本の陽性又は陰性の判別のための蛍光強度の定量化を行った。染色強度の定量化手法としては、実施例1において作製した浮遊培養(工程(1))開始から10日目の浮遊した細胞集団の塗抹標本に対して、実施例1と同様の方法によって抗HBE1抗体による蛍光免疫染色を行った。結果の撮影像(図2の上段)(最大励起波長490nm、最大蛍光波長525nm)に対し、線分A-A’で示す関心領域の線形の蛍光強度プロファイルを出力し、細胞がある領域と細胞の存在しない領域の蛍光強度を比較した。図2の下段に示した解析結果では、細胞の存在しない領域の蛍光強度が170であり、目視で陽性と判別された蛍光強度の強い領域の数値は4095、上記よりも蛍光強度の弱い陽性領域の数値は1438であった。一方、目視で陰性と判別された領域の数値は511であった。よって、図2の下段のグラフに破線で示す通り、明視野中で細胞が存在しないと確認した領域の蛍光強度の平均値に対し、5倍以上高い数値を示した所を陽性とすることにより、抗原の染色結果の陽性又は陰性の判別を定量的に行えることが分かった。以下の実験は、本予備実験と同様の方法によって発現の陽性又は陰性の判断を行った。
[実施例1:ヒトiPS細胞から作製された胚型赤芽球を含む細胞集団]
<維持培養>
ヒトiPS細胞(HC-6#10株、理化学研究所より入手)は、Scientific Reports,4,3594(2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で維持培養した。フィーダーフリー培地としては、StemFit AK02N培地(味の素株式会社製)(以下、「StemFit培地」と記す。)を、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(株式会社ニッピ社製)を用いた。
<維持培養>
ヒトiPS細胞(HC-6#10株、理化学研究所より入手)は、Scientific Reports,4,3594(2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で維持培養した。フィーダーフリー培地としては、StemFit AK02N培地(味の素株式会社製)(以下、「StemFit培地」と記す。)を、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(株式会社ニッピ社製)を用いた。
具体的な維持培養操作としては、まずサブコンフレントになったヒトiPS細胞を、PBSにて洗浄後、Accumax(Innovative Cell Technologies社製)を用いて酵素処理を行った後、StemFit培地を添加しセルスクレーパーを用いて培養ディッシュ表面より細胞を剥がし、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。その後、単一細胞へ分散されたヒトiPS細胞を、0.5μg/cm2の条件でLaminin511-E8にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Y27632(ROCK阻害物質、和光純薬株式会社製、10μM)存在下、StemFit培地にてフィーダーフリー培養した。プラスチック培養ディッシュとして、6ウェルプレート(Corning社製、細胞培養用、培養面積9.5cm2)を用いた場合、単一細胞へ分散されたヒトiPS細胞の播種細胞数は1.4×104とした。播種した1日後に、Y27632を含まないStemFit培地に全量培地交換した。以降、1日~2日に一回Y27632を含まないStemFit培地にて全量培地交換した。その後、播種した7日後にサブコンフレント(培養面積の6割が細胞に覆われる程度)になるまで培養した。
<工程(1)>
図3に示す手順に従って、ヒトiPS細胞の分化誘導を開始した。調製したサブコンフレントのヒトiPS細胞を、PBSにて洗浄後、Accumaxを用いて酵素処理を行った後、StemFit培地を添加しセルスクレーパーを用いて培養ディッシュ表面より細胞を剥がし、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。ヒトiPS細胞を含む懸濁液を遠心し、培地を除去した。ヒトiPS細胞を、STEMdiff Hematopoietic Basal MediumとSTEMdiff Hematopoietic Supplement Aとの混合液(STEMCELL Technologies社製)(以下、「STEMdiff+A培地」と記す。)に再度懸濁し、Y27632(終濃度20μM)存在下で、非細胞接着性の96ウェル培養プレート(PrimeSurface 96V底プレート、住友ベークライト株式会社製)に、1ウェルあたり75μLの培地に3×103細胞となるように播種した。
培養プレートを遠心機(日立工機株式会社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心した後、37℃、5%CO2の条件下で浮遊培養した(工程(1)開始)。
図3に示す手順に従って、ヒトiPS細胞の分化誘導を開始した。調製したサブコンフレントのヒトiPS細胞を、PBSにて洗浄後、Accumaxを用いて酵素処理を行った後、StemFit培地を添加しセルスクレーパーを用いて培養ディッシュ表面より細胞を剥がし、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。ヒトiPS細胞を含む懸濁液を遠心し、培地を除去した。ヒトiPS細胞を、STEMdiff Hematopoietic Basal MediumとSTEMdiff Hematopoietic Supplement Aとの混合液(STEMCELL Technologies社製)(以下、「STEMdiff+A培地」と記す。)に再度懸濁し、Y27632(終濃度20μM)存在下で、非細胞接着性の96ウェル培養プレート(PrimeSurface 96V底プレート、住友ベークライト株式会社製)に、1ウェルあたり75μLの培地に3×103細胞となるように播種した。
培養プレートを遠心機(日立工機株式会社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心した後、37℃、5%CO2の条件下で浮遊培養した(工程(1)開始)。
<工程(2)>
浮遊培養(工程(1))開始から3日目のヒトiPS細胞由来の細胞凝集体を、20倍希釈したグロースファクターリデュースドマトリゲル(Corning社製)でコートした細胞接着性の6ウェルプレートに、マイクロピペットを用いて1ウェルあたり5個移設し、37℃、5%CO2の条件下で接着培養を行った(工程(2a)開始)。その際の培地には、STEMdiff Hematopoietic Basal MediumとSTEMdiff Hematopoietic Supplement Bとの混合液(STEMCELL Technologies社製)にヒト組み換えエリスロポエチン(GenScript社製、終濃度30ng/mL)とY27632(終濃度20μM)を添加した培地(以下、「STEMdiff+B培地」と記す。)を1ウェルあたり1mL用いた。浮遊培養(工程(1))開始から3日目(工程(2a)開始直後)の細胞凝集体の様子を倒立顕微鏡(株式会社キーエンス製、BIOREVO)を用いて、明視野観察を行った(図4のA)。
浮遊培養(工程(1))開始から3日目のヒトiPS細胞由来の細胞凝集体を、20倍希釈したグロースファクターリデュースドマトリゲル(Corning社製)でコートした細胞接着性の6ウェルプレートに、マイクロピペットを用いて1ウェルあたり5個移設し、37℃、5%CO2の条件下で接着培養を行った(工程(2a)開始)。その際の培地には、STEMdiff Hematopoietic Basal MediumとSTEMdiff Hematopoietic Supplement Bとの混合液(STEMCELL Technologies社製)にヒト組み換えエリスロポエチン(GenScript社製、終濃度30ng/mL)とY27632(終濃度20μM)を添加した培地(以下、「STEMdiff+B培地」と記す。)を1ウェルあたり1mL用いた。浮遊培養(工程(1))開始から3日目(工程(2a)開始直後)の細胞凝集体の様子を倒立顕微鏡(株式会社キーエンス製、BIOREVO)を用いて、明視野観察を行った(図4のA)。
浮遊培養(工程(1))開始から7日目(工程(2a)開始から4日目)にSTEMdiff+B培地をさらに0.5mL追加した。浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(2a)開始から7日目)に倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行ったところ、培地中に浮遊している細胞集団が見られた(図4のB)。
浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(2a)開始から7日目)に、浮遊した細胞集団を含む培地を回収し(工程(2b))、遠心機(エッペンドルフ社製、centrifuge 5424)にて7500rpmで3分間遠心した後、上清を除去した。
<工程(3)>
一部の細胞は、浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(2a)開始から7日目)に、マイクロピペットを用いて浮遊した細胞集団を含む培地を15mLチューブへと移し、遠心機(日立工機株式会社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心を行った。上清を除去した後、沈殿にStemdiff+B培地を添加して細胞を懸濁し、細胞接着性の6ウェルプレート(Corning社製)に、1ウェルあたり1.5mLの培地に2×105細胞となるように播種し、浮遊培養を開始した(工程(3)開始)。浮遊培養(工程(1))開始から14日目(工程(3)開始から4日目)に、上記回収方法と同じ方法で、細胞集団を回収した。
一部の細胞は、浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(2a)開始から7日目)に、マイクロピペットを用いて浮遊した細胞集団を含む培地を15mLチューブへと移し、遠心機(日立工機株式会社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心を行った。上清を除去した後、沈殿にStemdiff+B培地を添加して細胞を懸濁し、細胞接着性の6ウェルプレート(Corning社製)に、1ウェルあたり1.5mLの培地に2×105細胞となるように播種し、浮遊培養を開始した(工程(3)開始)。浮遊培養(工程(1))開始から14日目(工程(3)開始から4日目)に、上記回収方法と同じ方法で、細胞集団を回収した。
さらに一部の細胞は、浮遊培養(工程(1))開始から14日目(工程(3)開始から4日目)にSTEMdiff+B培地を1mL追加し、続けて培養を行った。浮遊培養(工程(1))開始から18日目(工程(3)開始から8日目)に、上記回収方法と同じ方法で、細胞集団を回収した。得られた細胞ペレットを観察すると、非常に濃い赤色を示した(図5)。
<免疫染色による細胞集団の評価>
上記細胞集団を構成する細胞のうち、胚型赤芽球の割合を免疫染色により調べた。浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目に得られた細胞集団をPBS(Thermo Fisher Scientific社製)にて洗浄した後、4%パラホルムアルデヒド(和光純薬株式会社製)を用いて15分間固定した。サイトスピン4(Thermo Fisher Scientific社製)とサイトフューネルス(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて塗抹標本のスライドグラスを作製した後、0.2%トライトンX-100(和光純薬株式会社製)を添加したTBS(タカラバイオ株式会社製)を用いて5分間膜透過処理を行った。次いで、上記スライドグラスをSuperblock Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて1時間乃至3時間ブロッキングした後、胚型赤芽球マーカーである抗ε-グロビン(HBE1)抗体(Genetex社製、希釈率750倍)及び赤芽球マーカーである抗グリコフォリンA(GPA)抗体(Novusbio社製、希釈率100倍)を用いて蛍光免疫染色を行った。蛍光標識二次抗体としてAlexa488標識ロバ抗ウサギ抗体及びロバ抗マウス抗体(Thermo Fisher Scientific社製、希釈率1000倍)をそれぞれ用いた。また、核の対比染色の為、2μg/mlのHoechst 33342(同仁化学社製)を二次抗体希釈液中に添加した。染色した細胞の観察及び画像の取得には、正立蛍光顕微鏡Axio Imager M2(Carl Zeiss社製)及び附属ソフトウェアのAxio Visionを用いた。
上記細胞集団を構成する細胞のうち、胚型赤芽球の割合を免疫染色により調べた。浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目に得られた細胞集団をPBS(Thermo Fisher Scientific社製)にて洗浄した後、4%パラホルムアルデヒド(和光純薬株式会社製)を用いて15分間固定した。サイトスピン4(Thermo Fisher Scientific社製)とサイトフューネルス(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて塗抹標本のスライドグラスを作製した後、0.2%トライトンX-100(和光純薬株式会社製)を添加したTBS(タカラバイオ株式会社製)を用いて5分間膜透過処理を行った。次いで、上記スライドグラスをSuperblock Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて1時間乃至3時間ブロッキングした後、胚型赤芽球マーカーである抗ε-グロビン(HBE1)抗体(Genetex社製、希釈率750倍)及び赤芽球マーカーである抗グリコフォリンA(GPA)抗体(Novusbio社製、希釈率100倍)を用いて蛍光免疫染色を行った。蛍光標識二次抗体としてAlexa488標識ロバ抗ウサギ抗体及びロバ抗マウス抗体(Thermo Fisher Scientific社製、希釈率1000倍)をそれぞれ用いた。また、核の対比染色の為、2μg/mlのHoechst 33342(同仁化学社製)を二次抗体希釈液中に添加した。染色した細胞の観察及び画像の取得には、正立蛍光顕微鏡Axio Imager M2(Carl Zeiss社製)及び附属ソフトウェアのAxio Visionを用いた。
染色結果画像を図6に示す。浮遊培養(工程(1))開始から10日目に得られた細胞のうち約80%以上がε-グロビン陽性かつグリコフォリンA陽性であった(図6のA、B、G及びH)。本発明に係る製造方法により、ヒトiPS細胞から、胚型赤芽球を多く含む細胞集団を製造可能であることが示された。また、浮遊培養(工程(1))開始から14日目及び18日目に得られた細胞集団も、約80%以上がε-グロビン陽性かつグリコフォリンA陽性であった(図6のC、D、I及びJ、並びにE、F、K及びL)。本発明に係る製造方法によれば、細胞集団の培養を継続した後も細胞集団中の胚型赤芽球の割合を高く維持することができることがわかった。
<リアルタイムPCRによる細胞集団の評価>
上記細胞集団において、細胞が発現しているβグロビン遺伝子ファミリーの発現割合をリアルタイムPCRにより調べた。浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目の浮遊した細胞集団を含む培地を遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心した後、上清を除去した。得られた細胞をPBS(Thermo Fisher Scientific社製)にて洗浄した後、遠心機(エッペンドルフ社製、centrifuge 5424)にて7500rpmで3分間遠心した後、RNeasy Micro Kit(QIAGEN社製)を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAをSuperScript III(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて逆転写し、得られたcDNAを鋳型としてTaqMan probe(Thermo Fisher Scientific社製)及びTaqMan Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて、96ウェルプレートでFast PCRの条件で添付説明書の記載に従ってリアルタイムPCRを行った。Taqman probeは、表2に記載のヒトのプローブを用いた。
上記細胞集団において、細胞が発現しているβグロビン遺伝子ファミリーの発現割合をリアルタイムPCRにより調べた。浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目の浮遊した細胞集団を含む培地を遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心した後、上清を除去した。得られた細胞をPBS(Thermo Fisher Scientific社製)にて洗浄した後、遠心機(エッペンドルフ社製、centrifuge 5424)にて7500rpmで3分間遠心した後、RNeasy Micro Kit(QIAGEN社製)を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAをSuperScript III(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて逆転写し、得られたcDNAを鋳型としてTaqMan probe(Thermo Fisher Scientific社製)及びTaqMan Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて、96ウェルプレートでFast PCRの条件で添付説明書の記載に従ってリアルタイムPCRを行った。Taqman probeは、表2に記載のヒトのプローブを用いた。
ε-グロビン、γ-グロビン及びβ-グロビンの各βグロビン遺伝子ファミリーに対するTaqMan probeの標的配列を含む遺伝子産物を用いて検量線を作成し、発現する各βグロビン遺伝子ファミリーのmRNAコピー数を定量した。発現する各βグロビン遺伝子ファミリーのコピー数を総βグロビン遺伝子ファミリーのコピー数で除して得られる値を、各βグロビン遺伝子ファミリーの発現割合として示した。胚型赤芽球を含む細胞集団の製造とリアルタイムPCRによる解析とは、独立に3回行い、その平均値と標準誤差を求めた。
結果を表3に示す。浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目のいずれの細胞集団においても、細胞が発現している総βグロビン遺伝子ファミリーのうち約6割以上が胚型赤芽球マーカーのε-グロビン遺伝子であった。本発明に係る製造方法によれば、ヒトiPS細胞から、ε-グロビンを高発現する細胞集団を製造可能であることが示された。また、本発明に係る製造方法によれば、細胞集団の培養を継続した後も、ε-グロビンの発現が高く維持されることがわかった。また、3回の独立した実験を行っても、その標準誤差は十分に小さく、本発明の製造方法は、再現性の高い方法であることがいえる。
[実施例2:ラットES細胞から作製された胚型赤芽球を含む細胞集団]
<維持培養>
ラットES細胞(DAラット由来、DSファーマバイオメディカル社より入手)は、マイトマイシンC処理したマウス線維芽細胞(リプロセル社製)上に播種し、37℃、5%CO2条件下で維持培養した。その際の培地には、A-83-01(和光純薬株式会社社製、終濃度0.5μM)、CHIR99021(ケイマンケミカル社製、終濃度3μM)、Y-27632(終濃度10μM)、1%Antibiotic-Antimycotic(Thermo Fisher Scientific社製)、ラットLIF(ミリポア社製、終濃度2000U/mL)及び2-メルカプトエタノール(和光純薬株式会社製、終濃度0.1mM)を添加したStemMedium(DSファーマバイオメディカル社製)(以下、「ラットES培地」と記す。)を用いて浮遊培養を行った。
<維持培養>
ラットES細胞(DAラット由来、DSファーマバイオメディカル社より入手)は、マイトマイシンC処理したマウス線維芽細胞(リプロセル社製)上に播種し、37℃、5%CO2条件下で維持培養した。その際の培地には、A-83-01(和光純薬株式会社社製、終濃度0.5μM)、CHIR99021(ケイマンケミカル社製、終濃度3μM)、Y-27632(終濃度10μM)、1%Antibiotic-Antimycotic(Thermo Fisher Scientific社製)、ラットLIF(ミリポア社製、終濃度2000U/mL)及び2-メルカプトエタノール(和光純薬株式会社製、終濃度0.1mM)を添加したStemMedium(DSファーマバイオメディカル社製)(以下、「ラットES培地」と記す。)を用いて浮遊培養を行った。
具体的な維持培養操作としては、浮遊状態のラットES細胞株のコロニーを15mL遠沈管に回収し、遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで3分間遠心操作を行い、上清を除去した。その後、Accutase(Innovative Cell Technologies社製)を用いて酵素処理を行った後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。次いで、単一細胞へ分散されたラットES細胞を遠心し、上清を除去した後、ラットES培地を添加しピペッティングにより単一細胞へ分散した。その後、単一細胞へ分散されたラットES細胞をマイトマイシンC処理したマウス線維芽細胞(リプロセル社製)を播種したプラスチック培養ディッシュ上に播種し、37℃、5%CO2条件下で浮遊培養した。プラスチック培養ディッシュとして、10cmディッシュ(Corning社製、細胞培養用)を用いた場合、単一細胞へ分散されたラットES細胞の播種細胞数は0.9×105乃至1.8×105とした。その後、3乃至4日間培養した。
<工程(1)>
図7に示す手順に従って、ラットES細胞の分化誘導を開始した。調製した浮遊状態のラットES細胞株のコロニーを、15mL遠沈管に回収し、遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心操作を行い、上清を除去した。その後、Accutase(Innovative Cell Technologies社製)を用いて酵素処理を行った後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。次いで、単一細胞へ分散されたラットES細胞を遠心し、上清を除去した。ラットES細胞をSTEMdiff+A培地に懸濁し、Y27632(終濃度20μM)存在下で、非細胞接着性の96ウェル培養プレート(PrimeSurface 96V底プレート、住友ベークライト社製)に1ウェルあたり75μLの培地に3×103細胞となるように播種した。
遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心した後、37℃、5%CO2の条件下で浮遊培養した(工程(1)開始)。
図7に示す手順に従って、ラットES細胞の分化誘導を開始した。調製した浮遊状態のラットES細胞株のコロニーを、15mL遠沈管に回収し、遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心操作を行い、上清を除去した。その後、Accutase(Innovative Cell Technologies社製)を用いて酵素処理を行った後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。次いで、単一細胞へ分散されたラットES細胞を遠心し、上清を除去した。ラットES細胞をSTEMdiff+A培地に懸濁し、Y27632(終濃度20μM)存在下で、非細胞接着性の96ウェル培養プレート(PrimeSurface 96V底プレート、住友ベークライト社製)に1ウェルあたり75μLの培地に3×103細胞となるように播種した。
遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心した後、37℃、5%CO2の条件下で浮遊培養した(工程(1)開始)。
<工程(2)>
工程(2a)を行うためのフィーダー細胞はあらかじめ準備した。フィーダー細胞としては、OP9細胞(マウス骨髄ストローマ細胞、ATCCより入手)を用いた。OP9細胞は、10%FBS(Corning社製)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製)を添加したαMEM培地(ナカライテスク社製)(以下、「OP9培地」と記す。)を用いて、10cmディッシュ(Corning社製)上で維持培養した。3乃至4日に一度継代操作を行った。継代操作としては、OP9細胞が接着したディッシュ上から上清を除去しPBSで洗浄を行い、0.25%Trypsin/1mM EDTA solution(ナカライテスク社製)を用いて酵素処理を行った後、OP9培地を添加しピペッティングし、OP9細胞を回収した。遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで3分間遠心操作を行った後、上清を除去し、OP9細胞をディッシュ1枚あたり1×105乃至2×105細胞となるようOP9培地に懸濁した後、37℃、5%CO2の条件下で培養した。フィーダー細胞として用いる際には、1ウェルあたり4.5×104細胞となるようにOP9細胞をOP9培地に懸濁した後、20倍希釈したグロースファクターリデュースドマトリゲル(Corning社製)でコートした6ウェルプレート(Corning社製)に播種し、37℃、5%CO2の条件下で培養した。培養3日目に、マイトマイシンC(ナカライテスク社製)処理を行い、フィーダー細胞として用いた。
工程(2a)を行うためのフィーダー細胞はあらかじめ準備した。フィーダー細胞としては、OP9細胞(マウス骨髄ストローマ細胞、ATCCより入手)を用いた。OP9細胞は、10%FBS(Corning社製)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製)を添加したαMEM培地(ナカライテスク社製)(以下、「OP9培地」と記す。)を用いて、10cmディッシュ(Corning社製)上で維持培養した。3乃至4日に一度継代操作を行った。継代操作としては、OP9細胞が接着したディッシュ上から上清を除去しPBSで洗浄を行い、0.25%Trypsin/1mM EDTA solution(ナカライテスク社製)を用いて酵素処理を行った後、OP9培地を添加しピペッティングし、OP9細胞を回収した。遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで3分間遠心操作を行った後、上清を除去し、OP9細胞をディッシュ1枚あたり1×105乃至2×105細胞となるようOP9培地に懸濁した後、37℃、5%CO2の条件下で培養した。フィーダー細胞として用いる際には、1ウェルあたり4.5×104細胞となるようにOP9細胞をOP9培地に懸濁した後、20倍希釈したグロースファクターリデュースドマトリゲル(Corning社製)でコートした6ウェルプレート(Corning社製)に播種し、37℃、5%CO2の条件下で培養した。培養3日目に、マイトマイシンC(ナカライテスク社製)処理を行い、フィーダー細胞として用いた。
浮遊培養(工程(1))開始から3日目のラットES細胞由来の細胞凝集体を、上記6ウェルプレートにマイクロピペットを用いて1ウェルあたり5個移設し、37℃、5%CO2の条件下で接着培養を行った(工程(2a)開始)。また、培地には、STEMdiff Hematopoietic Basal MediumとSTEMdiff Hematopoietic Supplement Bとの混合液(STEMCELL Technologies社製)にラット組み換え幹細胞因子(R&D Systems社製、終濃度30ng/mL)及びY27632(終濃度20μM)を添加した培地(以下、「ラットSTEMdiff+B培地」と記す。)にラット組み換えエリスロポエチン(R&D Systems社製、30ng/mL)を加えた培地を1ウェルあたり1mL用いた。浮遊培養(工程(1))開始から3日目(工程(2a)開始直後)の細胞凝集体の様子を倒立顕微鏡(株式会社キーエンス製、BIOREVO)を用いて、明視野観察を行った(図8のA)。
浮遊培養(工程(1))開始から5日目(工程(2a)開始から2日目)に6ウェルプレートから培地を除去し、ラットSTEMdiff+B培地に、ヒドロコルチゾン(和光純薬株式会社製、終濃度1μM)、ラット組み換えインターロイキン3(R&D Systems社製、終濃度10ng/mL)、ヒト組み換えインターロイキン11(R&D Systems社、終濃度20ng/mL)、ヒト組み換えインスリン様成長因子1(R&D Systems社製、終濃度20ng/mL)及びラット組み換えエリスロポエチン(R&D Systems社製、終濃度60ng/mL)を添加した培地1mLを添加した。浮遊培養(工程(1))開始から8日目(工程(2a)開始から5日目)に倒立顕微鏡を用いて明視野で観察したところ、培地中に浮遊している細胞集団が見られた(図8のB)。
浮遊培養(工程(1))開始から8日目(工程(2a)開始から5日目)の浮遊した細胞集団を培地ごと回収し(工程(2b))、遠心機(エッペンドルフ社製、centrifuge 5424)にて7500rpmで3分間遠心し、上清を除去した。
<工程(3)>
一部の細胞は、浮遊培養(工程(1))開始から8日目(工程(2a)開始から5日目)に、マイクロピペットを用いて浮遊した細胞集団を含む培地を15mlチューブへと移し、遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心した。上清を除去した後、沈殿にラット組み換えエリスロポエチン(R&D Systems社製、終濃度60ng/mL)、ラット組み換え幹細胞因子(R&D Systems社製、終濃度30ng/mL)及びY27632(和光純薬株式会社製、終濃度20μM)を添加したStemlineII培地(シグマアルドリッチ社製)(以下、ラットStemlineII培地と記す。)を添加して細胞を懸濁し、細胞接着性の6ウェルプレート(Corning社製)で浮遊培養を開始した(工程(3)開始)。細胞は、1ウェルあたり1.5mlのラットStemlineII培地に2×105細胞となるように播種した。浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(3)開始から2日目)に上記回収方法と同じ方法で、細胞集団を回収した。
一部の細胞は、浮遊培養(工程(1))開始から8日目(工程(2a)開始から5日目)に、マイクロピペットを用いて浮遊した細胞集団を含む培地を15mlチューブへと移し、遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心した。上清を除去した後、沈殿にラット組み換えエリスロポエチン(R&D Systems社製、終濃度60ng/mL)、ラット組み換え幹細胞因子(R&D Systems社製、終濃度30ng/mL)及びY27632(和光純薬株式会社製、終濃度20μM)を添加したStemlineII培地(シグマアルドリッチ社製)(以下、ラットStemlineII培地と記す。)を添加して細胞を懸濁し、細胞接着性の6ウェルプレート(Corning社製)で浮遊培養を開始した(工程(3)開始)。細胞は、1ウェルあたり1.5mlのラットStemlineII培地に2×105細胞となるように播種した。浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(3)開始から2日目)に上記回収方法と同じ方法で、細胞集団を回収した。
さらに一部の細胞は、浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(3)開始から2日目)にラットStemlineII培地を1mL添加し、続けて培養を行った。浮遊培養(工程(1))開始から12日目(工程(3)開始から4日目)に上記回収方法と同じ方法で、細胞集団を回収した。得られた細胞ペレットを観察すると、非常に濃い赤色を示した(図9)。
<免疫染色による細胞集団の評価>
浮遊培養(工程(1))開始から8日目、10日目及び12日目に得られた細胞集団を免疫染色し、胚型赤芽球の割合を調べた。免疫染色は、実施例1と同じ方法で行った。一次抗体は、胚型赤芽球マーカーである抗ε-グロビン(HBE1)抗体(Genetex社製、希釈率750倍)、蛍光標識二次抗体としてAlexa488標識ロバ抗ウサギ抗体(Thermo Fisher Scientific社製、希釈率1000倍)をそれぞれ用いた。染色した細胞の観察及び画像の取得には、正立蛍光顕微鏡Axio Imager M2(Carl Zeiss社製)及び附属ソフトウェアのAxio Visionを用いた。
浮遊培養(工程(1))開始から8日目、10日目及び12日目に得られた細胞集団を免疫染色し、胚型赤芽球の割合を調べた。免疫染色は、実施例1と同じ方法で行った。一次抗体は、胚型赤芽球マーカーである抗ε-グロビン(HBE1)抗体(Genetex社製、希釈率750倍)、蛍光標識二次抗体としてAlexa488標識ロバ抗ウサギ抗体(Thermo Fisher Scientific社製、希釈率1000倍)をそれぞれ用いた。染色した細胞の観察及び画像の取得には、正立蛍光顕微鏡Axio Imager M2(Carl Zeiss社製)及び附属ソフトウェアのAxio Visionを用いた。
染色結果を図10に示す。浮遊培養(工程(1))開始から8日目に得られた細胞のうち約80%以上がε-グロビン陽性であった(図10のA及びB)。本発明に係る製造方法により、ラットES細胞から胚型赤芽球を多く含む細胞集団を製造可能であることが示された。また、浮遊培養(工程(1))開始から10日目及び12日目に得られた細胞集団も、約80%以上がε-グロビン陽性であった(図10のC~F)。本発明に係る製造方法によれば、細胞集団の培養を継続した後も胚型赤芽球の割合が高く維持されていることがわかった。
<リアルタイムPCRによる細胞集団の評価>
上記浮遊培養(工程(1))開始から10日目及び12日目の細胞集団において、細胞が発現しているβグロビン遺伝子ファミリーの発現割合を求めた。リアルタイムPCRは、実施例1と同じ方法で行った。Taqman probeは、表2に記載のラットのプローブを用いた。
上記浮遊培養(工程(1))開始から10日目及び12日目の細胞集団において、細胞が発現しているβグロビン遺伝子ファミリーの発現割合を求めた。リアルタイムPCRは、実施例1と同じ方法で行った。Taqman probeは、表2に記載のラットのプローブを用いた。
ε-グロビン、γ-グロビン及びβ-グロビンの各βグロビン遺伝子ファミリーに対するTaqMan probeの標的配列を含む遺伝子産物を用いて検量線を作成し、発現する各βグロビン遺伝子ファミリーのmRNAコピー数を定量した。各βグロビン遺伝子ファミリーのコピー数を総βグロビン遺伝子ファミリーのコピー数で除して得られる値を、各βグロビン遺伝子ファミリーの発現割合として示した。胚型赤芽球を含む細胞集団の製造とリアルタイムPCRによる解析とは、独立に3回行い、その平均値と標準誤差を求めた。
結果を表4に示す。浮遊培養(工程(1))開始から10日目及び12日目のいずれの細胞集団においても、細胞が発現している総βグロビン遺伝子ファミリーのうち約6割以上が胚型赤芽球マーカーのε-グロビン遺伝子であった。本発明に係る製造方法によれば、ラットES細胞から、ε-グロビンを高発現する細胞集団を製造可能であることが示された。また、本発明に係る製造方法によれば、細胞集団の培養を継続した後も、ε-グロビンの発現が高く維持された細胞集団を得ることができることがわかった。また、3回の独立した実験を行っても、その標準誤差は十分に小さく、本発明の製造方法は、再現性の高い方法であることがいえる。
[参考例1:K562細胞の培養と分化段階の評価]
他の血球系細胞として、ヒト慢性骨髄性白血病由来細胞株K562細胞(ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手)を用いてε-グロビンの発現を調べた。K562細胞は、次のように維持培養した。10%FBS(Corning社製)、及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製)を添加したRPMI培地(Roswell Park Memorial Institute 1640、Thermo Fisher Scientific社製)(以下、「K562培地」と記す。)を用いて、低接着6cmディッシュ(住友ベークライト株式会社製)上で浮遊培養した。7日に一度、浮遊細胞を含む培地を回収し、遠心機(日立工機社製、SCT5BA)にて1000rpmで5分間遠心し、上清を除去した。ディッシュ1枚あたり5×105細胞となるように、5mLのK562培地にK562細胞を懸濁して播種した後、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
他の血球系細胞として、ヒト慢性骨髄性白血病由来細胞株K562細胞(ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手)を用いてε-グロビンの発現を調べた。K562細胞は、次のように維持培養した。10%FBS(Corning社製)、及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製)を添加したRPMI培地(Roswell Park Memorial Institute 1640、Thermo Fisher Scientific社製)(以下、「K562培地」と記す。)を用いて、低接着6cmディッシュ(住友ベークライト株式会社製)上で浮遊培養した。7日に一度、浮遊細胞を含む培地を回収し、遠心機(日立工機社製、SCT5BA)にて1000rpmで5分間遠心し、上清を除去した。ディッシュ1枚あたり5×105細胞となるように、5mLのK562培地にK562細胞を懸濁して播種した後、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
K562細胞は、誘導因子(酪酸ナトリウム)を加えると、ε-グロビンの発現が上昇することが知られている。そこで、酪酸ナトリウムを加えてからのε-グロビンの経時的な発現変化を調べた。K562細胞の分化培養には、1mM酪酸ナトリウム(シグマアルドリッチ社製)を含むK562培地を用いた。低接着6cmディッシュ1枚あたり5×105細胞となるように、5mLの上記培地に細胞を懸濁してディッシュに播種し、37℃、5%CO2の条件下で培養した。分化培養開始から0、2、4及び8日目に浮遊細胞を含む培地を回収し、遠心機(日立工機社製、SCT5BA)にて1000rpmで5分間遠心操作を行い、上清を除去した。
実施例1のリアルタイムPCRによる評価方法と同様にして、細胞が発現している各βグロビン遺伝子ファミリーの発現割合を求めた。結果を表5に示す。いずれの条件下においても、発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、約3割以下が胚型赤芽球マーカーのε-グロビン遺伝子であった。
[参考例2:REL細胞の培養と分化段階の評価]
他の血球系細胞として、ラット赤白血病細胞REL細胞(Institute of Molecular Genetics and Genetic Engineering (Prof. Popovic Serbia)より入手)を用いて、ε-グロビン発現変化を調べた。REL細胞は、次のように維持培養した。40%FBS(Corning社製)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製)を添加したRPMI培地(Roswell Park Memorial Institute 1640、Thermo Fisher Scientific社製)(以下、「REL培地」と記す。)を用いて、低接着6cmディッシュ(住友ベークライト株式会社製)上で浮遊培養した。2日に一度浮遊細胞を含む培地を回収し、遠心機(日立工機社製、SCT5BA)にて1000rpmで5分間遠心し、上清を除去した。ディッシュ1枚あたり5×105細胞となるように、5mlのREL培地にREL細胞を懸濁して播種した後、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
他の血球系細胞として、ラット赤白血病細胞REL細胞(Institute of Molecular Genetics and Genetic Engineering (Prof. Popovic Serbia)より入手)を用いて、ε-グロビン発現変化を調べた。REL細胞は、次のように維持培養した。40%FBS(Corning社製)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製)を添加したRPMI培地(Roswell Park Memorial Institute 1640、Thermo Fisher Scientific社製)(以下、「REL培地」と記す。)を用いて、低接着6cmディッシュ(住友ベークライト株式会社製)上で浮遊培養した。2日に一度浮遊細胞を含む培地を回収し、遠心機(日立工機社製、SCT5BA)にて1000rpmで5分間遠心し、上清を除去した。ディッシュ1枚あたり5×105細胞となるように、5mlのREL培地にREL細胞を懸濁して播種した後、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
REL細胞に誘導因子(Hexamethylene bisacetamide:HMBA)を添加して、ε-グロビンの経時的な発現変化を調べた。REL細胞の分化培養には、REL培地にHMBA(シグマアルドリッチ社製、終濃度1mM)を添加した培地を用いた。低接着6ディッシュ(住友ベークライト株式会社製)1枚あたりREL細胞が5×105細胞となるように5mLの上記培地に懸濁して播種した後、37℃、5%CO2の条件下で培養した。分化培養開始から0、2、4及び8日目に浮遊細胞を含む培地を回収し、遠心機(日立工機社製、SCT5BA)にて1000rpmで5分間遠心操作を行い、上清を除去した。
実施例1のリアルタイムPCRによる評価方法と同様にして、細胞が発現している各βグロビン遺伝子ファミリーの発現割合を求めた。結果を表6に示す。いずれの条件下においても、発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、ほぼ全てが成体型赤芽球マーカーのβ-グロビン遺伝子であった。
[実施例3:ヒトiPS細胞から作製された胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験]
図11に示す手順に従って、ヒトiPS細胞から作製された胚型赤芽球を含む細胞集団用いた化合物試験を行った。ヒトiPS細胞を実施例1と同様の方法により分化誘導し、浮遊培養(工程(A))開始から10日目の胚型赤芽球を含む細胞集団を得た(工程(A)及び工程(B))。遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心し、上清を除去した。次いで、沈殿にStemdiff+B培地を添加して細胞を懸濁し、細胞接着性の6ウェルプレート(Corning社製)に、1ウェルあたり1.5mLの培地に2×105細胞となるように播種し、浮遊培養を開始した(工程(C)開始)。その際の培地には、試験化合物としてジヒドロアルテミシニン(以下、「DHA」と記す。)(終濃度0.5μM又は1μM)又はスクシニルアセトン(以下、「SA」と記す。)(終濃度10μM又は30μM)を、溶媒対照としてDMSOを添加した。
図11に示す手順に従って、ヒトiPS細胞から作製された胚型赤芽球を含む細胞集団用いた化合物試験を行った。ヒトiPS細胞を実施例1と同様の方法により分化誘導し、浮遊培養(工程(A))開始から10日目の胚型赤芽球を含む細胞集団を得た(工程(A)及び工程(B))。遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心し、上清を除去した。次いで、沈殿にStemdiff+B培地を添加して細胞を懸濁し、細胞接着性の6ウェルプレート(Corning社製)に、1ウェルあたり1.5mLの培地に2×105細胞となるように播種し、浮遊培養を開始した(工程(C)開始)。その際の培地には、試験化合物としてジヒドロアルテミシニン(以下、「DHA」と記す。)(終濃度0.5μM又は1μM)又はスクシニルアセトン(以下、「SA」と記す。)(終濃度10μM又は30μM)を、溶媒対照としてDMSOを添加した。
浮遊培養(工程(A))開始から18日目(工程(C)の開始から8日目)に、6ウェルプレートから細胞集団を含む培地を回収した。0.4×105細胞乃至1×105細胞をエッペンチューブに分取し、遠心機(エッペンドルフ社製、centrifuge 5424)にて7500rpmで3分間遠心して、上清を除去し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットに含まれるヘム濃度及びプロトポルフィリンIX(以下、「PPIX」と記す。)濃度を、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)を用いて定量した(工程(D))。試験化合物の添加によるヘム濃度及びPPIX濃度の変化を検討することによって、試験化合物がヘム生合成経路に与える影響を評価することができる。また、培養後に回収された細胞数を計数し、生存率を求めた。
測定結果を図12に示す。ヘム濃度及びPPIX濃度は106細胞当たりの重量(ng/106cells)として示した。ヘム合成を阻害することが公知であるDHA及びSAは、浮遊培養(工程(A))開始から18日目(工程(C)開始から8日目)において、溶媒対照と比べてヘム濃度を低下させた(図12のA)。DHAはPPIX濃度を増加させた一方で、SAはPPIX濃度に大きな影響を与えなかった(図12のB)。このことから、DHAはヘム生合成経路の下流酵素を阻害することでPPIXを蓄積させ、一方でSAはヘム生合成経路の上流酵素を阻害するためPPIX濃度が蓄積しないことが示唆された。DHAは、最下流の鉄付加酵素を阻害することで貧血を誘発するとの仮説が提唱されている(Clark et al.(2018)Birth Defects Research 110:553-578)。SAは、生合成経路上流のアミノレブリン酸脱水酵素を阻害することが報告されている(Sassa et al.(1983).The Journal of Clinical Investigation 71:625-634)。また、DHA及びSAは、細胞集団を構成する細胞の生細胞数及び生存率を低下させた(図12のC及びD)。実施例1より、細胞集団は、高い割合で胚型赤芽球を含むため、本発明に係る化合物試験法は、胚型赤芽球に対する試験化合物の影響を精度よく評価可能であることが示された。
[実施例4:ラットES細胞から作製された胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験]
図13に示す手順に従って、ラットES細胞から作製された胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験を行った。ラットES細胞を実施例2と同様の方法により分化誘導し、浮遊培養(工程(A))開始から8日目の胚型赤芽球を含む細胞集団を得た(工程(A)及び工程(B))。遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心し、上清を除去した。次いで、沈殿にラットStemlineII培地を添加して細胞を懸濁し、細胞接着性の6ウェルプレート(Corning社製)に、1ウェルあたり1.5mLの培地に2×105細胞となるように播種し、浮遊培養を開始した(工程(C)開始)。その際の培地には、試験化合物としてDHA(終濃度0.5μM)を、溶媒対照としてDMSOを添加した。
図13に示す手順に従って、ラットES細胞から作製された胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験を行った。ラットES細胞を実施例2と同様の方法により分化誘導し、浮遊培養(工程(A))開始から8日目の胚型赤芽球を含む細胞集団を得た(工程(A)及び工程(B))。遠心機(日立工機社製、CF8DL)にて1000rpmで5分間遠心し、上清を除去した。次いで、沈殿にラットStemlineII培地を添加して細胞を懸濁し、細胞接着性の6ウェルプレート(Corning社製)に、1ウェルあたり1.5mLの培地に2×105細胞となるように播種し、浮遊培養を開始した(工程(C)開始)。その際の培地には、試験化合物としてDHA(終濃度0.5μM)を、溶媒対照としてDMSOを添加した。
浮遊培養(工程(A))開始から12日目(工程(C)の開始から4日目)に、6ウェルプレートから細胞集団を含む培地を回収した。0.35×105細胞乃至1×105細胞をエッペンチューブに分取し、遠心機(エッペンドルフ社製、centrifuge 5424)にて7500rpmで3分間遠心して、上清を除去し、細胞沈殿物を得た。この細胞沈殿物に含まれるヘム濃度を、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)を用いて定量した(工程(D))。試験化合物の添加によるヘム濃度の変化を検討することによって、試験化合物のヘム合成への影響を評価することができる。
ヘム濃度の測定結果を図14に示す。ヘム濃度は106細胞当たりの重量(ng/106cells)として示した。ヘム合成を阻害することが公知であるDHAは、浮遊培養(工程(A))開始から12日目(工程(C)開始から4日目)において、溶媒対照と比べてヘム濃度を低下させた。実施例2より、細胞集団は高い割合で胚型赤芽球を含むため、本発明に係る化合物試験法は、胚型赤芽球に対する試験化合物の影響を精度よく評価可能であることが示された。また、本発明に係る化合物試験法は、複数の細胞種由来の胚型赤芽球を含む細胞集団に対して試験化合物の影響を評価可能であることが示された。
また、実施例3と実施例4の結果から、ヒトの多能性幹細胞由来の胚型赤芽球と、ラットの多能性幹細胞由来の胚型赤芽球とを比較すると、ヒトとラットでほぼ同程度にDHAによるヘム合成阻害の作用を受けることがわかった。
[実施例5:ヒトiPS細胞から作製された胚型赤芽球を含む細胞集団]
実施例1とは異なるヒトiPS細胞株を用いて、胚型赤芽球を含む細胞集団を作製した。
<維持培養>
ヒトiPS細胞(201B7株)は、京都大学より入手した。ヒトiPS細胞(201B7株)は、実施例1に記載のヒトiPS細胞の維持培養方法と同じ方法で維持培養した。
実施例1とは異なるヒトiPS細胞株を用いて、胚型赤芽球を含む細胞集団を作製した。
<維持培養>
ヒトiPS細胞(201B7株)は、京都大学より入手した。ヒトiPS細胞(201B7株)は、実施例1に記載のヒトiPS細胞の維持培養方法と同じ方法で維持培養した。
<工程(1)~工程(3)>
実施例1と同じ方法により、ヒトiPS細胞(201B7株)の分化誘導を行った。浮遊培養(工程(1))開始から3日目(工程(2a)開始直後)の細胞凝集体の明視野観察像を図15のAに示す。浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(2a)開始から7日目)には、培地中に浮遊している細胞集団が観察された(図15のB)。
実施例1と同じ方法により、ヒトiPS細胞(201B7株)の分化誘導を行った。浮遊培養(工程(1))開始から3日目(工程(2a)開始直後)の細胞凝集体の明視野観察像を図15のAに示す。浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(2a)開始から7日目)には、培地中に浮遊している細胞集団が観察された(図15のB)。
浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(2a)開始から7日目)、浮遊培養(工程(1))開始から14日目(工程(3)開始から4日目)、及び浮遊培養(工程(1))開始から18日目(工程(3)開始から8日目)に、浮遊した細胞集団を含む培地を回収し、上清を除去して細胞集団を回収した。浮遊培養(工程(1))開始から18日目の細胞ペレットを観察すると、非常に濃い赤色を示した(図16)。
<免疫染色による細胞集団の評価>
浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目に得られた細胞集団を免疫染色し、胚型赤芽球の割合を調べた。免疫染色は、実施例1と同じ方法で行った。
浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目に得られた細胞集団を免疫染色し、胚型赤芽球の割合を調べた。免疫染色は、実施例1と同じ方法で行った。
染色結果画像を図17に示す。浮遊培養(工程(1))開始から10日目に得られた細胞のうち約80%以上がε-グロビン陽性かつグリコフォリンA陽性であった(図17のA、B、G及びH)。本発明に係る製造方法により、様々なヒトiPS細胞株から、胚型赤芽球を多く含む細胞集団を製造可能であることが示された。また、浮遊培養(工程(1))開始から14日目及び18日目に得られた細胞集団も、約80%以上がε-グロビン陽性かつグリコフォリンA陽性であった(図17のC、D、I及びJ、並びにE、F、K及びL)。本発明に係る製造方法によれば、細胞集団の培養を継続した後も細胞集団中の胚型赤芽球の割合を高く維持することができることがわかった。
<リアルタイムPCRによる細胞集団の評価>
浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目の細胞集団において、細胞が発現しているβグロビン遺伝子ファミリーの発現割合をリアルタイムPCRにより調べた。リアルタイムPCRは、実施例1と同じ方法で行った。Taqman probeは、表2に記載のヒトのプローブを用いた。
浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目の細胞集団において、細胞が発現しているβグロビン遺伝子ファミリーの発現割合をリアルタイムPCRにより調べた。リアルタイムPCRは、実施例1と同じ方法で行った。Taqman probeは、表2に記載のヒトのプローブを用いた。
ε-グロビン、γ-グロビン及びβ-グロビンの各βグロビン遺伝子ファミリーに対するTaqMan probeの標的配列を含む遺伝子産物を用いて検量線を作成し、発現する各βグロビン遺伝子ファミリーのmRNAコピー数を定量した。各βグロビン遺伝子ファミリーのコピー数を総βグロビン遺伝子ファミリーのコピー数で除して得られる値を、各βグロビン遺伝子ファミリーの発現割合として示した。
結果を表7に示す。浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目のいずれの細胞集団においても、細胞が発現している総βグロビン遺伝子ファミリーのうち約6割以上が胚型赤芽球マーカーのε-グロビン遺伝子であった。本発明に係る製造方法によれば、様々なヒトiPS細胞株から、ε-グロビンを高発現する細胞集団を製造可能であることが示された。また、本発明に係る製造方法によれば、細胞集団の培養を継続した後も、ε-グロビンの発現が高く維持されることがわかった。
[実施例6:ヒトES細胞から作製された胚型赤芽球を含む細胞集団]
<維持培養>
ヒトES細胞(KhES-1株)は、京都大学より入手した。ヒトES細胞は、実施例1に記載のヒトiPS細胞の維持培養方法と同じ方法で維持培養した。
<維持培養>
ヒトES細胞(KhES-1株)は、京都大学より入手した。ヒトES細胞は、実施例1に記載のヒトiPS細胞の維持培養方法と同じ方法で維持培養した。
<工程(1)~工程(3)>
実施例1と同じ方法により、ヒトES細胞の分化誘導を行った。浮遊培養(工程(1))開始から3日目(工程(2a)開始直後)の細胞凝集体の明視野観察像を図18のAに示す。浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(2a)開始から7日目)には、培地中に浮遊している細胞集団が観察された(図18のB)。
実施例1と同じ方法により、ヒトES細胞の分化誘導を行った。浮遊培養(工程(1))開始から3日目(工程(2a)開始直後)の細胞凝集体の明視野観察像を図18のAに示す。浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(2a)開始から7日目)には、培地中に浮遊している細胞集団が観察された(図18のB)。
浮遊培養(工程(1))開始から10日目(工程(2a)開始から7日目)、浮遊培養(工程(1))開始から14日目(工程(3)開始から4日目)、及び浮遊培養(工程(1))開始から18日目(工程(3)開始から8日目)に、浮遊した細胞集団を含む培地を回収し、上清を除去して細胞集団を回収した。浮遊培養(工程(1))開始から18日目の細胞ペレットを観察すると、非常に濃い赤色を示した(図19)。
<免疫染色による細胞集団の評価>
浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目に得られた細胞集団を免疫染色し、胚型赤芽球の割合を調べた。免疫染色は、実施例1と同じ方法で行った。
浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目に得られた細胞集団を免疫染色し、胚型赤芽球の割合を調べた。免疫染色は、実施例1と同じ方法で行った。
染色結果画像を図20に示す。浮遊培養(工程(1))開始から10日目に得られた細胞のうち約80%以上がε-グロビン陽性かつグリコフォリンA陽性であった(図20のA、B、G及びH)。本発明に係る製造方法により、ヒトES細胞から、胚型赤芽球を多く含む細胞集団を製造可能であることが示された。また、浮遊培養(工程(1))開始から14日目及び18日目に得られた細胞集団も、約80%以上がε-グロビン陽性かつグリコフォリンA陽性であった(図20のC、D、I及びJ、並びにE、F、K及びL)。本発明に係る製造方法によれば、細胞集団の培養を継続した後も細胞集団中の胚型赤芽球の割合を高く維持することができることがわかった。
<リアルタイムPCRによる細胞集団の評価>
浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目の細胞集団において、細胞が発現しているβグロビン遺伝子ファミリーの発現割合をリアルタイムPCRにより調べた。リアルタイムPCRは、実施例1と同じ方法で行った。Taqman probeは、表2に記載のヒトのプローブを用いた。
浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目の細胞集団において、細胞が発現しているβグロビン遺伝子ファミリーの発現割合をリアルタイムPCRにより調べた。リアルタイムPCRは、実施例1と同じ方法で行った。Taqman probeは、表2に記載のヒトのプローブを用いた。
ε-グロビン、γ-グロビン及びβ-グロビンの各βグロビン遺伝子ファミリーに対するTaqMan probeの標的配列を含む遺伝子産物を用いて検量線を作成し、発現する各βグロビン遺伝子ファミリーのmRNAコピー数を定量した。各βグロビン遺伝子ファミリーのコピー数を総βグロビン遺伝子ファミリーのコピー数で除して得られる値を、各βグロビン遺伝子ファミリーの発現割合として示した。
結果を表8に示す。浮遊培養(工程(1))開始から10日目、14日目及び18日目のいずれの細胞集団においても、細胞が発現している総βグロビン遺伝子ファミリーのうち約6割以上が胚型赤芽球マーカーのε-グロビン遺伝子であった。本発明に係る製造方法によれば、ヒトES細胞から、ε-グロビンを高発現する細胞集団を製造可能であることが示された。また、本発明に係る製造方法によれば、細胞集団の培養を継続した後も、ε-グロビンの発現が高く維持されることがわかった。ヒトES細胞1株とヒトiPS細胞2株の合計3種類の株のヒト多能性幹細胞を用いても、高い割合で胚型赤芽球を含む細胞集団を製造できたことから、本発明の製造方法は、再現性の高い方法であることがいえる。
Claims (37)
- 胚型赤芽球を含む細胞集団の製造方法であって、
多能性幹細胞を浮遊培養して、細胞凝集体を形成させる工程(1)、及び
前記工程(1)で得られた細胞凝集体から前記細胞集団を得る工程(2)を含み、
前記工程(2)は、前記細胞凝集体を接着培養する工程(2a)を含む、製造方法。 - 前記工程(2)は、前記細胞集団を回収する工程(2b)をさらに含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記細胞集団を構成する細胞のうち、少なくとも70%の細胞は前記胚型赤芽球である、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記細胞集団において、細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、少なくとも50%がε-グロビン遺伝子である、請求項1~3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程(1)を、細胞非接着性の培養器材を用いて行う、請求項1~4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程(2a)を、細胞接着性の培養器材を用いて行う、請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記細胞接着性の培養器材は、基底膜標品でコートされている、請求項6に記載の製造方法。
- 前記工程(1)の前に、多能性幹細胞を分散させる工程を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程(1)は、前記多能性幹細胞を遠心する工程を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程(1)の開始から前記工程(2a)の開始までの時間は、12時間以上96時間以内である、請求項1~9のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程(2a)の培養時間は、2日以上18日以内である、請求項1~10のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程(1)及び工程(2a)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程を、ROCK阻害剤の存在下で行う、請求項1~11のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程(2a)を、エリスロポエチン、エリスロポエチン受容体作動薬及びエリスロポエチン受容体を介する情報伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で行う、請求項1~12のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記工程(2a)を、フィーダー細胞の存在下で行う、請求項1~13のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記フィーダー細胞は、骨髄間質細胞又は骨髄間質細胞由来細胞株である、請求項14に記載の製造方法。
- 前記フィーダー細胞は、OP9細胞である、請求項15に記載の製造方法。
- 前記工程(2a)を、幹細胞因子、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で行う、請求項1~16のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記多能性幹細胞は霊長類多能性幹細胞又はげっ歯類多能性幹細胞である、請求項1~17のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞又はラット多能性幹細胞である、請求項1~17のいずれか一項に記載の製造方法。
- 胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法であって、
多能性幹細胞を浮遊培養して、細胞凝集体を形成させる工程(A)、
前記工程(A)で得られた細胞凝集体から前記細胞集団を得る工程(B)、
前記細胞集団を試験化合物の存在下で培養する工程(C)、及び
前記工程(C)で培養した前記細胞集団の1)細胞数、2)細胞生存率、3)ヘム濃度、4)プロトポルフィリンIX濃度、及び5)グロビン発現量からなる群より選ばれる少なくとも1つの項目を測定する工程(D)を含み、
前記工程(B)は、前記細胞凝集体を接着培養する工程(Ba)を含む、化合物試験法。 - 前記工程(B)は、前記細胞集団を回収する工程(Bb)をさらに含む、請求項20に記載の化合物試験法。
- 前記細胞集団を構成する細胞のうち、少なくとも70%の細胞が前記胚型赤芽球である、請求項20又は21に記載の化合物試験法。
- 前記細胞集団において、細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、少なくとも50%がε-グロビン遺伝子である、請求項20~22のいずれか一項に記載の化合物試験法。
- 前記工程(C)を、フィーダー細胞の非存在下で行う、請求項20~23のいずれか一項に記載の化合物試験法。
- 前記工程(C)を、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つの非存在下で行う、請求項20~24のいずれか一項に記載の化合物試験法。
- 前記工程(C)の培養時間は2日以上である、請求項20~25のいずれか一項に記載の化合物試験法。
- 前記多能性幹細胞は霊長類多能性幹細胞又はげっ歯類多能性幹細胞である、請求項20~26のいずれか一項に記載の化合物試験法。
- 前記多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞又はラット多能性幹細胞である、請求項20~26のいずれか一項に記載の化合物試験法。
- 複数の生物種由来の胚型赤芽球を含む細胞集団を用いた化合物試験法であって、
前記工程(D)において、前記複数の生物種由来の多能性幹細胞から得られるそれぞれの前記細胞集団について前記測定を行う、請求項20~28のいずれか一項に記載の化合物試験法。 - 前記複数の生物種は、霊長類及びげっ歯類からなる群に属する生物のうち少なくとも2種を含む、請求項29に記載の化合物試験法。
- 前記複数の生物種は、ヒト及びラットを含む、請求項29に記載の化合物試験法。
- 胚型赤芽球を含む細胞集団であって、
前記細胞集団を構成する細胞のうち、少なくとも70%の細胞が前記胚型赤芽球である、細胞集団。 - 胚型赤芽球を含む細胞集団であって、
細胞が発現するβグロビン遺伝子ファミリーのうち、少なくとも50%がε-グロビン遺伝子である、細胞集団。 - 化合物試験に用いられる、請求項1~19のいずれか一項に記載の製造方法により得られる細胞集団又は請求項32もしくは33に記載の細胞集団。
- ε-グロビンの発現が維持される状態で保存されている、請求項1~19のいずれか一項に記載の製造方法により得られる細胞集団又は請求項32~34のいずれか一項に記載の細胞集団。
- 請求項1~19のいずれか一項に記載の製造方法により得られる細胞集団又は請求項32~35のいずれか一項に記載の細胞集団と、培地とを含む、細胞培養組成物。
- 前記培地は、インターロイキン3、インターロイキン11、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも1つを含まない、請求項36に記載の細胞培養組成物。
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