CN111918961B - 心肌细胞成熟促进剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种心肌细胞成熟促进剂。本发明提供了一种心肌细胞成熟促进剂，其包含选自以下的一种或多种化合物：2‑甲氧基‑5‑((Z)‑2‑(3,4,5‑三甲氧基苯基)乙烯基)苯酚，(2‑(2‑甲氧基‑4‑甲基苯基)‑4‑甲基‑1,3‑噻唑‑5‑基)氨基甲酸(1‑乙基‑1H‑苯并三唑‑5‑基)甲酯，(2’β)‑22‑氧代长春花碱，2‑(2‑(4‑氯苯基)乙基)‑6‑(2‑呋喃基)‑3H‑咪唑并[4,5‑b]吡啶，4,5‑脱水‑1,2‑二脱氧‑4‑甲基‑2‑((N‑(吗啉‑4‑基乙酰基)‑L‑丙氨酰基‑O‑甲基‑L‑酪氨酰基)氨基)‑1‑苯基‑L‑苏式‑戊‑3‑酮糖，3‑(3‑甲氧基苯基)‑N7,N7‑二甲基异喹啉‑1,7‑二胺，4‑(2‑苄基苯甲酰基)‑2,5‑二甲基‑1H‑吡咯‑3‑甲酸甲酯，2’‑(4‑氨基苯基)‑1H,1’H‑2,5’‑联苯并咪唑‑5‑胺，及其盐。

Description

心肌细胞成熟促进剂
技术领域
本发明涉及一种心肌细胞成熟促进剂和一种成熟心肌细胞的制备方法。
(背景技术)
心脏疾病是世界上主要的死亡原因。目前作为严重心力衰竭患者的唯一治疗选择的心脏移植遭受供体短缺。作为心脏移植的替代方案的潜在治疗选择是移植衍生自多能干细胞(例如，iPS细胞(诱导性多能干细胞)、ES细胞(胚胎干细胞)等)的心肌细胞。希望迅速开发出替代选择。此外，还需要衍生自多能干细胞(例如，iPS细胞、ES细胞等)的心肌细胞作为用于药物毒性测试和心脏疾病模型研究的细胞。
提高效率和安全性对于将iPS细胞衍生的成熟心肌细胞应用于再生医学是至关重要的。关于效率，存在成本效率低的问题，因为能够诱导成熟的心肌细胞的数量少，并且在培养基中的诸如生长因子的蛋白质非常昂贵。关于安全性，存在心肌细胞具有低纯度的问题，并且除心肌细胞以外的增殖细胞可能受到污染，使得存在癌变的风险。
此外，对于使用心肌细胞的药物毒性测试和心脏疾病模型研究，必须收集大量充分模仿活体中的心肌细胞的成熟心肌细胞。心肌细胞在出生的相同时间失去其分裂潜能，并且这些细胞的再生非常困难。由于这样的特性，已经进行了许多项研究以诱导多能干细胞分化成心肌细胞，从而获得大量心肌细胞(专利文献1、专利文献2、非专利文献1、非专利文献2和非专利文献3)。
然而，通常，据说衍生自人多能干细胞的心肌细胞与胎儿心肌细胞类似处于未成熟阶段，并且与成体心肌细胞相比，其离子通道功能不足。因此，为了与离子通道有关的药物毒性和治疗剂筛选的目的，需要使用成熟心肌细胞。
因此，需要成熟心肌细胞及其制备方法作为用于心肌细胞移植以及用于药物毒性和治疗药物筛选的细胞。
专利文献3至9和非专利文献4公开了以下化合物。
(1)专利文献3
(2)专利文献4
(3)非专利文献4
(4)专利文献5
(5)专利文献6
(6)专利文献7
(7)专利文献8
(8)专利文献10(下述实施例化合物5的非对映异构体)
然而，所述文献均未公开上述化合物具有促进心肌细胞成熟的活性。
可以通过长期(例如，一年或更久)培养未成熟心肌细胞来获得成熟心肌细胞。然而，作为成熟心肌细胞的商业制备方法，这样的方法花费太多时间并且需要昂贵的培养基和培养基添加剂。
因此，仍需要开发能够在短的时间段内以低成本有效地制备具有高纯度的成熟心肌细胞的心肌细胞成熟促进剂。
文献列表
专利文献
专利文献1：WO 2007/002136
专利文献2：WO 2009/118928
专利文献3：WO 2006/094235
专利文献4：WO 92/16486
专利文献5：WO 2012/002527
专利文献6：WO 02/076402
专利文献7：WO 03/045929
专利文献8：WO 2008/063548
专利文献9：US 2007/0293465
非专利文献
非专利文献1：Yan P等人,Biochem Biophys Res Commun.379:115-20(2009)
非专利文献2：Laflamme MA等人,Nat Biotechnol,25:1015-1024(2007)
非专利文献3：Yang L等人,Nature,453:524-528(2008)
非专利文献4：Journal of Medicinal Chemistry,1993,第36卷,第2739-2744页
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的目的是提供一种心肌细胞成熟促进剂，其可以在短的时间段内以低成本有效地制备具有高纯度的成熟心肌细胞。
解决问题的手段
本发明人已经发现以下化合物或其盐具有促进心肌细胞成熟的活性。作为进一步研究的结果，他们已经完成了本发明。
因此，本发明如下。
[1]一种心肌细胞成熟促进剂，其包含选自以下的至少一种化合物：
2-甲氧基-5-((Z)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯酚，
(2-(2-甲氧基-4-甲基苯基)-4-甲基-1,3-噻唑-5-基)氨基甲酸(1-乙基-1H-苯并三唑-5-基)甲酯，
(2’β)-22-氧代长春花碱，
2-(2-(4-氯苯基)乙基)-6-(2-呋喃基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶，
4,5-脱水-1,2-二脱氧-4-甲基-2-((N-(吗啉-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-O-甲基-L-酪氨酰基)氨基)-1-苯基-L-苏式-戊-3-酮糖，
3-(3-甲氧基苯基)-N7,N7-二甲基异喹啉-1,7-二胺，
4-(2-苄基苯甲酰基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸甲酯，
2’-(4-氨基苯基)-1H,1’H-2,5’-联苯并咪唑-5-胺，
及其盐。
[2]一种用于制备成熟心肌细胞的方法，其包括以下步骤：在根据上述[1]所述的心肌细胞成熟促进剂的存在下培养未成熟心肌细胞。
[3]一种通过根据上述[2]所述的方法制备的成熟心肌细胞。
发明效果
由于上述化合物或其盐具有使心肌细胞成熟的作用，因此它们可用作心肌细胞成熟促进剂。与用于长时间段培养未成熟心肌细胞的方法相比，用于使用上述化合物促进心肌细胞成熟的方法在短的时间段内以低成本使未成熟心肌细胞成熟。
附图说明
[图1]
图1示出了实验实施例2中通过流式细胞术进行的mCherry表达分析的结果。附图从上按顺序示出了在对照(无添加)、对照(添加DMSO)和添加实施例编号2的化合物情况下的结果。
(具体实施方式)
本发明的心肌细胞成熟促进剂包含选自以下化合物的一种或多种化合物：
2-甲氧基-5-((Z)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯酚(实施例编号1)，
(2-(2-甲氧基-4-甲基苯基)-4-甲基-1,3-噻唑-5-基)氨基甲酸(1-乙基-1H-苯并三唑-5-基)甲酯(实施例编号2)，
(2’β)-22-氧代长春花碱(实施例编号3)，
2-(2-(4-氯苯基)乙基)-6-(2-呋喃基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶(实施例编号4)，
4,5-脱水-1,2-二脱氧-4-甲基-2-((N-(吗啉-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-O-甲基-L-酪氨酰基)氨基)-1-苯基-L-苏式-戊-3-酮糖(实施例编号5)，
3-(3-甲氧基苯基)-N7,N7-二甲基异喹啉-1,7-二胺(实施例编号6)，
4-(2-苄基苯甲酰基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸甲酯(实施例编号7)，
2’-(4-氨基苯基)-1H,1’H-2,5’-联苯并咪唑-5-胺(实施例编号8)，
及其盐。
当上述化合物呈盐的形式时，所述盐优选是药理学上可接受的盐，并且此类盐的例子包括与无机碱形成的盐、与有机碱形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或酸性氨基酸形成的盐等。
与无机碱形成的盐的优选例子包括碱金属盐，诸如钠盐、钾盐等；碱土金属盐，诸如钙盐、镁盐等；铝盐；铵盐等。
与有机碱形成的盐的优选例子包括与以下形成的盐：三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇[三(羟甲基)甲胺]、叔丁胺、环己胺、苄胺、二环己胺、N,N-二苄基乙二胺等。
与无机酸形成的盐的优选例子包括与以下形成的盐：盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等。
与有机酸形成的盐的优选例子包括与以下形成的盐：甲酸、乙酸、三氟乙酸、邻苯二甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等。
与碱性氨基酸形成的盐的优选例子包括与以下形成的盐：精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等。
与酸性氨基酸形成的盐的优选例子包括与以下形成的盐：天冬氨酸、谷氨酸等。
本发明的心肌细胞成熟促进剂可以包含上述化合物或其盐中的一种或多种。
上述化合物或其盐可以各自根据本身已知的方法，例如根据专利文献3至9和非专利文献4中描述的方法或与其类似的方法来产生。
上述化合物可以是水合物、非水合物、溶剂化物或非溶剂化物。
此外，可以将上述化合物用同位素(例如，2H、3H、11C、14C、18F、35S、125I等)等标记或取代。
上述化合物中还包括其中1H转化为2H(D)的氘转化形式。
上述化合物中还包括互变异构体。
上述化合物可以是药学上可接受的共晶或共晶盐。共晶或共晶盐意指在室温下用两种或更多种特殊固体构成的结晶物质，每种特殊固体具有不同的物理特性(例如，结构、熔点、熔化热、吸湿性、溶解性和稳定性)。共晶或共晶盐可以通过本身已知的共结晶方法来产生。
本发明的心肌细胞成熟促进剂可以按原样使用，或者通过与药理学上可接受的载体混合并且根据本身已知的方法配制混合物来使用。
由于上述化合物或其盐具有优异的促进心肌细胞成熟的活性，因此它们可用作心肌细胞成熟促进剂。因此，通过在上述化合物或其盐的存在下培养未成熟心肌细胞，与仅在培养基组分中培养时相比，可以在更短的时间段内制备成熟心肌细胞。
如本文所用，术语“多能性”意指分化为具有不同形态和/或功能的各种组织或细胞以及分化为三个胚层的任何系列细胞的能力。“多能性”不能分化为胚盘。因此，“多能性”不同于可以分化为活体的每个组织(包括胚盘)的术语“全能性”，因为它没有形成个体的能力。
如本文所用，术语“多潜能性”意指分化成多种有限数量的系列细胞的能力。例如，间充质干细胞、造血干细胞和神经干细胞是多潜能的，而不是多能的。
如本文所用，“干细胞”的例子包括多能干细胞。
施用了本发明的心肌细胞成熟促进剂的“心肌细胞”不受特别限制，并且它们优选衍生自哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猪、猴、人)，更优选衍生自人。
可以通过本发明的心肌细胞成熟促进剂促进其成熟的心肌细胞不受特别限制，只要可以确定基于下述标记物表达水平、形态和结构(例如，肌节、线粒体)、特性(例如，搏动性、电生理成熟度)等，它们处于未成熟阶段。
可以通过本发明的心肌细胞成熟促进剂促进其成熟的心肌细胞也可以是通过从多能干细胞进行分化诱导而制备的细胞，或从活体分离的未成熟心肌细胞(例如，衍生自小鼠或大鼠胎儿或新生儿的心肌细胞)。
多能干细胞的例子包括但不限于胚胎干(ES)细胞、种系干细胞(“GS细胞”)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)、诱导性多能干(iPS)细胞、衍生自通过核转移获得的克隆胚胎的胚胎干细胞(ntES细胞)等。多能干细胞优选是ES细胞、iPS细胞或ntES细胞。
(A)胚胎干细胞
ES细胞是由哺乳动物(诸如人、小鼠等)的早期胚胎(例如，胚泡)的内细胞团建立的干细胞，所述细胞具有多能性和通过自我更新的生长能力。
ES细胞是来源于胚泡的内细胞团的胚胎衍生干细胞，胚泡是在受精卵的8细胞期和桑椹胚期之后形成的胚胎。ES细胞具有分化为构成成体的任何细胞的能力，即所谓的分化全能性和通过自我更新的生长能力。ES细胞于1981年在小鼠中发现(M.J.Evans和M.H.Kaufman(1981),Nature 292:154-156)，并且在这之后建立了灵长类动物(诸如人、猴等)的ES细胞系(J.A.Thomson等人(1998),Science 282:1145-1147；J.A.Thomson等人(1995),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:7844-7848；J.A.Thomson等人(1996),Biol.Reprod.,55:254-259；J.A.Thomson和V.S.Marshall(1998),Curr.Top.Dev.Biol.,38:133-165)。
可以通过从受试者动物的受精卵的胚泡中去除内细胞团，然后在饲养成纤维细胞上培养所述内细胞团来建立ES细胞。可以通过使用补充有一种或多种物质(诸如白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等)的培养基进行继代培养来维持所述细胞。建立和维持人和猴ES细胞的方法描述于以下：例如US 5,843,780B；Thomson JA等人(1995),Proc Natl.Acad.Sci.USA.92:7844-7848；Thomson JA等人(1998),Science.282:1145-1147；H.Suemori等人(2006),Biochem.Biophys.Res.Commun.,345:926-932；M.Ueno等人(2006),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:9554-9559；H.Suemori等人(2001),Dev.Dyn.,222:273-279；H.Kawasaki等人(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:1580-1585；和Klimanskaya I等人(2006),Nature.444:481-485。
关于用于制备ES细胞的培养基，可以例如使用补充有0.1mM 2-巯基乙醇、0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酸、20％KSR和4ng/ml bFGF的DMEM/F-12培养基在2％CO2/98％空气的潮湿气氛下在37℃下维持人ES细胞(O.Fumitaka等人(2008),Nat.Biotechnol.,26:215-224)。需要每3至4天对ES细胞进行继代培养，并且所述继代培养可以使用例如在含有1mM CaCl2和20％KSR的PBS中的0.25％胰蛋白酶和0.1mg/ml胶原酶IV来进行。
ES细胞的选择通常可以通过实时PCR方法使用基因标记(诸如碱性磷酸酶、Oct-3/4、Nanog等)的表达作为指标来进行。特别地，对于人ES细胞的选择，基因标记(诸如OCT-3/4、NANOG、ECAD等)的表达可以用作指标(E.Kroon等人(2008),Nat.Biotechnol.,26:443-452)。
关于ES细胞，作为小鼠ES细胞，可以使用由inGenious靶向实验室、Riken(Institute of Physical and Chemical Research)等建立的各种小鼠ES细胞系，并且作为人ES细胞，可以使用由NIH、Riken、Kyoto University、Cellartis等建立的各种人ES细胞系。例如，人ES细胞系的例子包括NIH的CHB-1-CHB-12系、RUES1系、RUES2系、HUES1-HUES28系等；WisCell Research的H1系和H9系；和Riken的KhES-1系、KhES-2系、KhES-3系、KhES-4系、KhES-5系、SSES1系、SSES2系、SSES3系等。可替代地，可以使用临床级细胞系、从这些细胞系制备的研究或临床细胞系等。
(B)种系干细胞
种系干细胞是衍生自睾丸的多能干细胞，并且起着作为精子发生的源的作用。与ES细胞类似，可以诱导这些细胞以分化为各种系列的细胞，并且例如具有能够通过将细胞移植到小鼠胚泡中而制备嵌合小鼠的特性(M.Kanatsu-Shinohara等人(2003)Biol.Reprod.,69:612-616；K.Shinohara等人(2004),Cell,119:1001-1012)。种系干细胞能够在含有胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)的培养基中自我更新，并且通过在与针对ES细胞的培养条件相同的培养条件下重复其继代培养，可以获得种系干细胞(MasanoriTakehashi等人(2008),Experimental Medicine,26(5)(号外):41-46,Yodosha(东京，日本))。
(C)胚胎生殖细胞
胚胎生殖细胞是从胎儿原始生殖细胞建立的，并且具有与ES细胞类似的多能性。它们可以通过在诸如LIF、bFGF、干细胞因子等物质的存在下培养原始生殖细胞来建立(Y.Matsui等人(1992),Cell,70:841-847；J.L.Resnick等人(1992),Nature,359:550-551)。
(D)诱导性多能干细胞
“诱导性多能干细胞(iPSC)”是指通过将某种因子(核重编程因子)引入哺乳动物体细胞或未分化干细胞中以进行重编程而获得的细胞。目前，存在各种“诱导性多能干细胞”，并且也可以使用如下那些：由Yamanaka等人通过将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc四种因子引入小鼠成纤维细胞中而建立的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)；以及衍生自通过将相同的四种因子引入人成纤维细胞中而建立的人细胞的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.等人Cell,(2007)131:861-872.)；通过引入上面描述的四种因子并且然后以Nanog的表达作为指标进行筛选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,和Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)；用其中不包含c-Myc的方法制备的iPS细胞(Nakagawa M,Yamanaka S.等人Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)；和通过用无病毒方法引入六种因子而建立的iPS细胞(Okita K等人Nat.Methods2011年5月；8(5):409-12,Okita K等人Stem Cells.31(3):458-66)。另外，还可以使用由Thomson等人制备的诱导性多能干细胞(它是通过引入OCT3/4、SOX2、NANOG和LIN28四种因子而建立的)(Yu J.,Thomson JA.等人,Science(2007)318:1917-1920.)、由Daley等人制备的诱导性多能干细胞(Park IH,Daley GQ.等人,Nature(2007)451:141-146)、和由Sakurada等人制备的诱导性多能干细胞(日本专利申请特开平2008-307007)等。
此外，还可以使用在所有公开的论文(例如，Shi Y.,Ding S.等人,Cell StemCell,(2008)第3卷,第5期,568-574；Kim JB.,Scholer HR.等人,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.等人,Nature Biotechnology,(2008)26,第7期,795-797)或专利(例如，日本专利申请特开平2008-307007、日本专利申请特开平2008-283972、US2008-2336610、US 2009-047263、WO 2007-069666、WO 2008-118220、WO 2008-124133、WO2008-151058、WO 2009-006930、WO 2009-006997、WO 2009-007852)中描述的本领域已知的任何诱导性多能干细胞。
作为诱导性多能细胞系，可以使用由NIH、Riken、Kyoto University等建立的各种iPSC系。例如，人iPSC系的例子包括Riken的HiPS-RIKEN-1A系、HiPS-RIKEN-2A系、HiPS-RIKEN-12A系、和Nips-B2系；Kyoto University的253G1系、201B7系、409B2系、454E2系、606A1系、610B1和648A1系等。可替代地，可以使用由Kyoto University、CellularDynamics International等提供的临床级细胞系、从这些细胞系制备的研究或临床细胞系等。
本文所用的术语“体细胞”意指除种系细胞和全能细胞(诸如卵、卵母细胞、ES细胞等)以外的任何动物细胞(优选包括人的哺乳动物的细胞)。体细胞的例子包括但不限于胎儿体细胞，初生儿体细胞，和成熟、健康或患病的体细胞中的任何一种，以及原代培养细胞、继代培养细胞和已建立的细胞系中的任何一种。体细胞的具体例子包括(1)组织干细胞(体干细胞)，诸如神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等；(2)组织祖细胞；(3)分化细胞，诸如淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠上皮细胞、脾细胞、胰腺细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞、脂肪细胞等。
在本发明中，从其中收集体细胞的哺乳动物个体不受限制，并且优选是人。在将所获得的iPS细胞用于人再生医学的情况下，鉴于预防排斥反应，尤其优选从患者本人或具有相同或基本上相同的人白细胞抗原(HLA)类型的另一个人中收集体细胞。在此，“基本上相同”的HLA类型意指，HLA类型的匹配程度允许当将从衍生自体细胞的iPS细胞进行分化诱导而获得的细胞移植到患者时，通过使用一种或多种免疫抑制剂和/或类似物使移植细胞存活。例如，这意味着所述人具有与患者的主要HLA相同的主要HLA(例如，在三个基因位点HLA-A、HLA-B和HLA-DR处)(以下同样适用)。另一方面，在不将所述细胞给予(移植)于人的情况下，例如，在用于测试候选药物对心肌细胞的毒性的方法中，有待用作iPS细胞来源的体细胞源不受限制。在将iPS细胞用作用于评估患者的药物敏感性或副作用的细胞来源筛选的情况下，优选从患者本人或具有与药物敏感性或副作用相关的一种或多种相同的遗传多态性的另一个人中收集体细胞。
(E)衍生自通过核转移获得的克隆胚胎的ES细胞
ntES细胞是源自通过核转移技术制备的克隆胚胎的ES细胞，并且具有衍生自受精卵的ES细胞的特性几乎相同的特性(T.Wakayama等人(2001),Science,292:740-743；S.Wakayama等人(2005),Biol.Reprod.,72:932-936；J.Byrne等人(2007),Nature,450:497-502)。即，ntES(核转移ES)细胞是从衍生自通过用体细胞核替换未受精卵的核而获得的克隆胚胎的胚泡的内细胞团建立的ES细胞。对于ntES细胞的制备，采用核转移技术(J.B.Cibelli等人(1998),Nature Biotechnol.,16:642-646)和ES细胞制备技术(上面描述的)的组合(Sayaka Wakayama等人(2008),Experimental Medicine 26(5)(号外),第47-52页)。在核转移中，可以通过将体细胞核注射到哺乳动物去核的未受精卵中并且将所得物培养若干小时来实现重编程。
如本文所用，术语“心肌细胞”意指表达选自心肌肌钙蛋白(cTNT)、αMHC(α肌球蛋白重链，MYH6)和βMHC(MYH7)的至少一种标记基因的细胞。cTNT的例子包括在人的情况下的NCBI登录号NM_000364和在小鼠的情况下的NM_001130176。αMHC的例子包括在人的情况下的NCBI登录号NM_002471和在小鼠的情况下的NM_001164171。βMHC的例子包括在人的情况下的NCBI登录号NM_000257和在小鼠的情况下的NM_080728。
已知的是，随着心肌细胞的成熟，发生同种型转换，其中肌钙蛋白I1(TNNI1)的表达减少而肌钙蛋白I3(TNNI3)的表达增加(Fikru B.Bedada,(2014)3(4):594–605.)。如本文所用，“心肌细胞成熟(是成熟的)”意指至少TNNI3表达增加。
关于诱导多能干细胞分化为未成熟心肌细胞的方法，可以通过例如由LaflammeMA等人(Laflamme MA和Murry CE,Nature 2011,Review)报告的方法从多能干细胞来制备心肌细胞。
所述方法的其他例子包括但不限于其中通过悬浮培养诱导性多能干细胞形成细胞团(类胚体)来制备心肌细胞的方法、其中在抑制骨形态发生蛋白(BMP)信号传导的物质存在下制备心肌细胞的方法(WO 2005/033298)、其中通过依次添加激活素A和BMP来制备心肌细胞的方法(WO 2007/002136)、其中在促进典型Wnt信号传导通路的激活的物质的存在下制备心肌细胞的方法(WO 2007/126077)、其中从诱导性多能干细胞中分离Flk/KDR阳性细胞，然后在环孢菌素A的存在下制备心肌细胞的方法(WO 2009/118928)等。
另外，还建议了通过类胚体的形成使用细胞因子来诱导分化为心肌细胞的方法(Yang L等人,Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+embryonic-stem-cell-derived population.,Nature.,2008年5月22日；453(7194):524-8)、通过在无细胞因子条件下进行粘附培养来诱导分化为心肌细胞的方法(Lian X等人,Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells viatemporal modulation of canonical Wnt signaling.,Proc Natl Acad Sci USA.,2012年7月3日；109(27):E1848-57)、通过在无细胞因子条件下粘附培养和悬浮培养的组合使用来诱导分化为心肌细胞的方法(Minami I等人,A small molecule that promotescardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined,cytokine-and xeno-free conditions.,Cell Rep.,2012年11月29日；2(5):1448-60)等。
从多能干细胞获得未成熟心肌细胞的培养基不受特别限制，并且可以使用本身已知的培养基。其例子包括IMDM培养基、培养基199培养基、Eagle最低必需培养基(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)培养基、Ham的F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer培养基、神经基底培养基(Life Technologies)、StemPro34(Invitrogen)、从StemFit AK02去除溶液C后的培养基(AJINOMOTO AK02、400mL溶液A和100mL的B溶液，总共500mL)、必需6培养基(Thermo Fischer Scientific)及其混合培养基等。
根据细胞和培养条件，可以将本身已知的添加剂添加到这些培养基中。例如，培养基可以含有血清，或者也可以不含血清。如果需要，所述培养基可以含有以下中的一种或多种：血清替代品诸如白蛋白、转铁蛋白、敲除血清替代品(KSR)(在ES细胞培养期间FBS的血清替代品)、N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、痕量元素、2-巯基乙醇、1-硫醇甘油等，并且还可以含有以下中的一种或多种：诸如脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax(Invitrogen)、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子量化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等物质。其中，优选的培养基是StemPro34或从StemFit AK02中去除溶液C后的培养基，每种培养基含有转铁蛋白、1-硫醇甘油、L-谷氨酰胺和抗坏血酸、或含有B27补充剂的RPMI1640。
使用激活素A、BMP4和bFGF的组合或CHIR99021作为初始添加剂用于使用上述培养基分化诱导为心肌细胞。
在激活素A、BMP4和bFGF的组合的情况下，这些添加剂的使用浓度优选是1ng/ml至100ng/ml的激活素A、1ng/ml至100ng/ml的BMP4、和1ng/ml至100ng/ml的bFGF，更优选是6ng/ml的激活素A、10ng/ml的BMP4、和5ng/ml的bFGF。
在CHIR99021的情况下，使用浓度优选是100nM至100μM，更优选是4至6μM。
在添加上述添加剂之后，通过向培养基中添加血管内皮生长因子(VEGF)和Wnt抑制剂，可以使多能干细胞分化为心肌细胞。
待使用的VEGF的浓度优选是1至100ng/ml，更优选10ng/ml。
Wnt抑制剂的例子包括DKK1蛋白(例如，在人的情况下的NCBI登录号：NM_012242)、硬化蛋白(例如，在人的情况下的NCBI登录号：NM_025237)、IWR-1(Merck Millipore)、IWP-2(Sigma-Aldrich)、IWP-3(Sigma-Aldrich)、IWP-4(Sigma-Aldrich)、PNU-74654(Sigma-Aldrich)、XAV939(Sigma-Aldrich)及其衍生物等。其中，优选使用IWP-3、IWP-4和IWR-1。
待使用的Wnt抑制剂的浓度不受特别限制，只要它抑制Wnt，并且它优选是1nM至50μM，特别优选1至2μM。
从多能干细胞制备未成熟心肌细胞的培养时间段是例如5至365天、优选5至100天、更优选5至60天、进一步更优选5至40天、仍更优选5至30天。
待用作本发明的心肌细胞成熟促进剂的化合物的量不受特别限制，并且它是例如每个1×104至1×107个细胞的未成熟心肌细胞0.01至100μM、优选0.1至30μM、更优选1至10μM。
作为心肌细胞成熟度的指标，可以使用用于心肌细胞成熟、形态和结构(例如，肌节、线粒体)、特性(例如，搏动性、电生理成熟度)等的标记物的表达水平。这些指标可以通过本身已知的方法来确认。
例如，用于心肌细胞成熟的标记物的表达水平可以通过使用PCR测量标记基因的表达水平来分析；使用蛋白质印迹等通过标记蛋白的表达水平来分析；或者通过使用显微镜或流式细胞术进行荧光标记来分析。电生理成熟度的指标可以使用膜片钳技术等通过静息膜电位的深度来分析。肌节微观结构或线粒体的指标可以通过电子显微镜来观察；使用显微镜或流式细胞术通过荧光标记来分析；或者通过细胞外通量分析仪等进行功能分析。
在一个实施方案中，通过使用本发明的心肌细胞成熟促进剂获得的成熟心肌细胞可以用于心脏再生医学。例如，可以将包含通过本发明的方法制备的心肌细胞的细胞团的组合物给予患有心脏疾病的患者的心脏。具体地，可以将通过本发明的方法获得的心肌细胞作为细胞悬液或以心肌细胞片(单层或多层)的形式直接移植到患有心脏疾病的患者的心脏中。例如，对于心肌细胞片的制备方法，参考WO 2012/133945、WO 2013/137491、WO2014/192909和WO 2016/076368。
在另一个实施方案中，通过使用本发明的心肌细胞成熟促进剂获得的心肌细胞还可以用于药物筛选或药物心脏毒性评估以治疗心脏疾病，因为心肌细胞是同质成熟的。例如，通过将测试药物给予通过本发明的方法获得的心肌细胞并且然后测量心肌细胞的反应，可以评估测试药物的效果和毒性。
在另一个实施方案中，通过使用本发明的心肌细胞成熟促进剂获得的具有降低的自动性的心肌细胞可以用于心脏再生医学。
实施例
实验实施例1
对于心肌细胞成熟的检测，制备其中报告蛋白序列EmGFP(序列编号1)和mCherry(序列编号2)分别插入TNNI1和TNNI3的基因位点的双敲入人iPS细胞系(使用从CTL购买的PBMC(LP_167，样品ID:20130318)从游离型载体(负载基因；OCT3/4、KLF4、SOX2、L-MYC、LIN28、小鼠p53DD)制备人iPS细胞(参考文献；Okita K等人Stem Cells.2012年11月29日.doi:10.1002/stem.1293))。
通过常规方法进行上述报告iPS细胞系的维持培养(Okita K等人StemCells.2012年11月29日.doi:10.1002/stem.1293)。
对于分化诱导为心肌细胞，将报告iPS细胞系用0.5×TrypLE select(LifeTechnologies，用0.5mM EDTA/PBS以1/2稀释)处理4至5分钟，并且将细胞使用细胞刮刀(IWAKI)剥落并且然后通过移液解离为单个细胞。通过离心(1,000rpm，5min)去除培养基，并且将所获得的细胞以每30mL生物反应器1×107个细胞接种到生物反应器(ABLE)上，并且然后在37℃下在5％氧气条件下(55rpm，搅拌悬浮培养方法)在通过在从StemFit AK02(AJINOMOTO AK02、400mL溶液A和100mL B溶液，总共500mL)中去除溶液C之后将1％L-谷氨酰胺、150μg/mL的转铁蛋白、50μg/mL的抗坏血酸(Sigma)、4×10-4M的单硫代甘油、10μMRock抑制剂(Y-27632)、2ng/mL BMP4(R&D)和0.5％基质胶(Matrigel)(生长因子减少)添加到培养基中而制备的培养基中培养以形成类胚体(0天)。
在下一天(第1天)，将9μL(最终浓度3ng/mL)的10μg/mL的激活素A、15μL(最终浓度5ng/mL)的10μg/mL bFGF和24μL(最终浓度10ng/mL)的10μg/mL BMP4添加到生物反应器中，并且将细胞在37℃下在5％氧气条件下培养另外2天。
然后(第3天)，将所获得的类胚体收集在50mL离心管中，并且然后经受离心(200g，1min)。去除培养基，并且将类胚体在37℃下在5％氧气条件下(55rpm，搅拌悬浮培养方法)在通过在从StemFit AK02(AJINOMOTO AK02、400mL溶液A和100mL B溶液，总共500mL)中去除溶液C之后将1％L-谷氨酰胺、150μg/mL的转铁蛋白、50μg/mL的抗坏血酸(Sigma)、4×10- 4M的单硫代甘油、10ng/mL VEGF、1μM IWP-3、0.6μM dorsomorphin和5.4μM SB431542添加到培养基中而制备的培养基中培养3天。
然后(第6天)，将生物反应器静置以沉淀类胚体，并且去除80％至90％的培养基。将通过在从StemFit AK02(AJINOMOTO AK02、400mL溶液A和100mL B溶液，总共500mL)中去除溶液C之后将1％L-谷氨酰胺、150μg/mL的转铁蛋白、50μg/mL的抗坏血酸(Sigma)、4×10- 4M的单硫代甘油和5ng/mL VEGF添加到培养基中而制备的培养基添加到生物反应器中，使得总体积变为30mL，并且将类胚体在37℃下在5％氧气条件下(55rpm，搅拌悬浮培养方法)培养8天。在培养期间，每2至3天在相同条件下将所述培养基用培养基替换。
在分化诱导开始之后第14天，将类胚体用2mg/mL胶原酶类型I(Sigma)处理2h，并且然后用0.25％胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)处理10min。向其中添加50％FBS/IMDM(Thermo Fisher Science)，并且通过移液将类胚体解离为单个细胞，并且然后经受离心(1,000rpm，5分钟)。离心后，去除上清液，并且将细胞重悬于100mL用于心肌细胞分化的基于StemFit AK02培养基的AK02培养基(通过将50μg/mL的抗坏血酸、2mM L-谷氨酰胺、150mg/mL的转铁蛋白、4×10-4M的单硫代甘油和VEGF 5ng/ml添加到AJINOMOTO AK02(400mL溶液A和100mL B溶液，总共500mL)中制备的)中。将重悬的细胞以1.0×104细胞/孔接种在预先涂覆有iMatrix-511(购买自Nippi,Inc.)的CellCarrier-384超微板(Perkin Elmer/6057300)上，并且在用于心肌细胞分化的基于StemFit AK02培养基的AK02培养基(通过将50μg/mL的抗坏血酸、2mM的L-谷氨酰胺、150mg/mL的转铁蛋白和4×10-4M的单硫代甘油添加到AJINOMOTO AK02(400mL溶液A和100mL B溶液，总共500mL)中制备的，以70μL/孔)中培养。
在培养第3天和第6天，将测试化合物(下表1中示出的实施例编号1至8的化合物，1μM，每孔一种化合物)以50μL/孔添加到孔中。在培养第8天，将细胞用多聚甲醛(Wako PureChemical Corporation，163-20145)固定，并且使用作为一次抗体的大鼠抗mCherry(Invitrogen，M11217)和作为二次抗体的山羊抗大鼠IgG Alexa 647(Invitrogen，A-21247)经受免疫染色。通过HCS(高内涵筛选)系统(Perkin Elmer/OperaPhenix HighContents Imaging System高内涵成像系统)(拍摄模式；非共焦，物镜；10×空气NA0.3)测量Alexa 647的表达水平。
由测量的荧光强度计算出的对照孔(未添加测试化合物)的平均荧光强度(平均值n＝60)是797。结果在表2(平均值n＝3)中示出。
表1
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表2
实施例编号 平均荧光强度(在1μM下)
1 1381
2 1331
3 1710
4 1125
5 1791
6 1305
7 1294
8 1150
实验实施例2
对于心肌细胞成熟的检测，制备其中报告蛋白序列EmGFP(序列编号1)和mCherry(序列编号2)分别插入TNNI1和TNNI3的基因位点的双敲入人iPS细胞系(使用从CTL购买的PBMC(LP_167，样品ID:20130318)从游离型载体(负载基因；OCT3/4、KLF4、SOX2、L-MYC、LIN28、小鼠p53DD)制备人iPS细胞(参考文献；Okita K等人Stem Cells.2012年11月29日.doi:10.1002/stem.1293))。
通过常规方法进行上述报告iPS细胞系的维持培养(Okita K等人StemCells.2012年11月29日.doi:10.1002/stem.1293)。
对于分化诱导为心肌细胞，将报告iPS细胞系用0.5×TrypLE select(LifeTechnologies，用0.5mM EDTA/PBS以1/2稀释)处理4至5分钟，并且将细胞使用细胞刮刀(IWAKI)剥落并且然后通过移液解离为单个细胞。通过离心(1,000rpm，5min)去除培养基，并且将获得的细胞以2x106个细胞/1.5mL/孔悬浮在6孔板中的通过将1％L-谷氨酰胺、150μg/mL的转铁蛋白、50μg/mL的抗坏血酸(Sigma)、4×10-4M的单硫代甘油、10μM Rock抑制剂(Y-27632)、2ng/mL BMP4(R&D)和0.5％基质胶(生长因子减少)添加到StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中制备的培养基中，并且然后在37℃下在5％氧气条件下经受静置培养以形成类胚体(0天)。
在下一天(第1天)，将通过将1％L-谷氨酰胺、150μg/mL的转铁蛋白、50μg/mL的抗坏血酸(Sigma)、4×10-4M的单硫代甘油、1.8μL(浓度12ng/mL)的10μg/mL的激活素A、15μL(浓度10ng/mL)的10μg/mL bFGF和2.7μL(浓度18ng/mL)的10μg/mL BMP4添加到1.5mLStemPro-34 SFM(ThermoFisher)中制备的培养基添加到含有类胚体的6孔板的每个孔中以将与0天培养基组合的体积调节至最终3mL(激活素A：6ng/ml，bFGF：5ng/ml，BMP4：10ng/ml)，并且将类胚体在37℃下在5％氧气条件下培养另外2天。
然后(第3天)，将含有类胚体的6孔板倾斜，并且然后静置1至2分钟，直到类胚体在孔的边缘沉淀，并且吸出上清液以免抽吸类胚体。然后，向每个孔中添加IMDM(ThermoFisher)培养基，并且如上，将板倾斜，并且然后静置1至2分钟，并且吸出上清液以免抽吸类胚体。将通过将1％L-谷氨酰胺、150μg/mL的转铁蛋白、50μg/mL的抗坏血酸(Sigma)、4×10-4M的单硫代甘油、10ng/mL VEGF、1μM IWP-3、0.6μM dorsomorphin和5.4μMSB431542添加到3mL StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中制备的培养基添加到6孔板的每个孔中，并且然后将类胚体在37℃下在5％氧气条件下培养3天。
然后(第6天)，将含有类胚体的6孔板倾斜，并且然后静置1至2分钟，直到类胚体在孔的边缘沉淀，并且吸出上清液以免抽吸类胚体。将通过将1％L-谷氨酰胺、150μg/mL的转铁蛋白、50μg/mL的抗坏血酸(Sigma)、4×10-4M的单硫代甘油和5ng/mL VEGF添加到2mLStemPro-34 SFM(ThermoFisher)中制备的培养基添加到6孔板的每个孔中，并且然后将类胚体37℃下在5％氧气条件下培养4天。在第8天，在相同条件下将所述培养基用培养基替换。
然后(第10天)，将含有类胚体的6孔板倾斜，并且然后静置1至2分钟，直到类胚体在孔的边缘沉淀，并且吸出上清液以免抽吸类胚体。将通过将(1)1％L-谷氨酰胺、150μg/mL的转铁蛋白、50μg/mL的抗坏血酸(Sigma)、4×10-4M的单硫代甘油和5ng/mL VEGF和(2)40nM的实施例编号2的化合物或DMSO(相对于培养基体积，添加0.1％)添加到2mL StemPro-34SFM(ThermoFisher)中制备的培养基添加到6孔板的每个孔中，并且然后将类胚体在37℃下在通用氧气条件下培养6天。在第13天，在相同条件下将所述培养基用培养基替换。
在第16天，在通过荧光显微镜对在每种条件下的类胚体进行拍照之后，将含有类胚体的6孔板倾斜，并且然后静置1至2分钟，直到类胚体在孔的边缘沉淀，并且吸出上清液以免抽吸类胚体。然后，向每个孔中添加2mL PBS，并且如上，将板倾斜，并且然后静置1至2分钟，并且吸出PBS以免抽吸类胚体。将通过将10μg/mL的DNA酶和100μg/mL的释放酶(Liberase)添加到3mL IMDM中制备的溶液添加到每个孔中，并且将板在37℃下在通用氧气条件下静置1h。1h后，将板倾斜，并且然后静置1至2分钟，直到类胚体在孔的边缘沉淀，并且吸出上清液以免抽吸类胚体。然后，向每个孔中添加2mL PBS，并且如上，将板倾斜，并且然后静置1至2分钟，并且吸出PBS以免抽吸类胚体。将通过将10μg/mL的DNA酶添加到2mLTrypLE select中制备的溶液添加到每个孔中，并且将板在37℃下在通用氧气条件下静置10分钟。然后，将通过将1％L-谷氨酰胺、150μg/mL的转铁蛋白、50μg/mL的抗坏血酸(Sigma)、4×10-4M的单硫代甘油、5ng/mL VEGF和10μg/mL的DNA酶添加到2mL StemPro-34SFM(ThermoFisher)中制备的培养基添加到每个孔中，并且通过移液将类胚体解离为单个细胞，并且然后经受离心(1,000rpm，5分钟)。离心后，去除上清液，将细胞悬浮于1至2mL2％FBS/PBS中，并且通过流式细胞术(BD FACSAria融合细胞分选仪)分析在TNNI1+细胞中的mCherry表达。结果在表3和图1中示出。
表3
工业实用性
由于上述化合物或其盐具有促进心肌细胞成熟的活性，因此它们可用作心肌细胞成熟促进剂。
本申请基于2018年3月30日在日本提交的专利申请号2018-69871，将其内容全部包含在本文中。
SEQUENCE LISTING
<110> 国立大学法人京都大学
武田药品工业株式会社
<120> 心肌细胞成熟促进剂
<130> 092885
<150> JP2018-069871
<151> 2018-3-30
<160> 2
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 祖母绿荧光蛋白(EmGFP)
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccttcaccta cggcgtgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaag gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gacccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 2
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry
<400> 2
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711

Claims (2)

1.选自以下的至少一种化合物在制备心肌细胞成熟促进剂中的用途：
2-甲氧基-5-((Z)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯酚，
(2-(2-甲氧基-4-甲基苯基)-4-甲基-1,3-噻唑-5-基)氨基甲酸(1-乙基-1H-苯并三唑-5-基)甲酯，
(2’β)-22-氧代长春花碱，
2-(2-(4-氯苯基)乙基)-6-(2-呋喃基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶，
4,5-脱水-1,2-二脱氧-4-甲基-2-((N-(吗啉-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-O-甲基-L-酪氨酰基)氨基)-1-苯基-L-苏式-戊-3-酮糖，
3-(3-甲氧基苯基)-N7,N7-二甲基异喹啉-1,7-二胺，
4-(2-苄基苯甲酰基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸甲酯，
2’-(4-氨基苯基)-1H,1’H-2,5’-联苯并咪唑-5-胺，
及其盐。
2.一种用于制备成熟心肌细胞的方法，其包括以下步骤：在根据权利要求1所述的心肌细胞成熟促进剂的存在下培养未成熟心肌细胞。
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