WO2016076368A1 - 心筋細胞シート - Google Patents

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弘子 伊勢岡
芳樹 澤
繁 宮川
五月 福嶌
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テルモ株式会社
国立大学法人大阪大学
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a sheet-like cell culture containing cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells, a method for producing the same, a composition containing the sheet-like cell culture, and a method for treating a disease using the sheet-like cell culture. About.
  • Non-Patent Document 1 a graft containing cardiomyocytes prepared by a cell engineering technique into an affected area.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Non-Patent Documents 2 to 3 Attempts have been made to produce sheet-like cell cultures containing cardiomyocytes derived from such pluripotent stem cells and treatment experiments in animals.
  • Non-Patent Documents 2 to 3 the development of sheet-like cell cultures containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes has just begun, and there are still many unclear points regarding their functional characteristics and factors affecting them.
  • the present invention provides a sheet-shaped cell culture containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes having useful functional characteristics, a method for producing the same, a graft containing the sheet-shaped cell culture, and the sheet-shaped cell culture
  • the purpose is to provide a method for treating a disease using a product.
  • the ratio of the number of cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells to the total number of cells in the cell population used for forming the sheet-like cell culture is 50% to It was found that by adjusting to the range of 70%, the ability to produce cytokines useful for the treatment of diseases is increased, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to the following.
  • a sheet-like cell culture obtained by culturing a cell population containing cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells, wherein the ratio of the number of cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells to the total number of cells in the cell population is 50% to 70% of the sheet-shaped cell culture.
  • ⁇ 3> A cytokine-producing ability from a sheet-like cell culture obtained by culturing the cell population, wherein the ratio of the number of cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells to the total number of cells in the cell population is 25% or less or 90% or more
  • ⁇ 4> (1) subjecting pluripotent stem cells to cardiomyocyte induction treatment to obtain a first cell population containing cardiomyocytes, (2) obtaining a second cell population containing cardiomyocytes derived from the first cell population obtained in step (1); and (3) culturing the second cell population obtained in step (2). Any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the ratio of the number of cardiomyocytes to the total number of cells of the second cell population is 50% to 70%.
  • ⁇ 5> A composition comprising the sheet-shaped cell culture according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> above.
  • ⁇ 6> The composition according to ⁇ 5> above, for treating a heart disease.
  • ⁇ 7> Applying an effective amount of the sheet-shaped cell culture according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> above or the composition according to ⁇ 5> above to a subject in need thereof.
  • a method of treating a disease in said subject. ⁇ 8> (1) subjecting pluripotent stem cells to cardiomyocyte induction treatment to obtain a first cell population containing cardiomyocytes; (2) obtaining a second cell population containing cardiomyocytes derived from the first cell population obtained in step (1); and (3) culturing the second cell population obtained in step (2).
  • a sheet-like cell culture comprising cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells, wherein the ratio of the number of cardiomyocytes to the total number of cells of the second cell population is 50% to 70%
  • a method for increasing the ability of a culture to produce cytokines is 50% to 70%
  • the sheet-shaped cell culture of the present invention has a high ability to produce cytokines useful for treating diseases and can provide excellent therapeutic effects, it can be expected to make a great contribution to the medical field.
  • FIG. 1 is a photograph showing the appearance of completed sheet-shaped cell cultures AD.
  • FIG. 2 is a graph showing the quantification results of cytokines produced by the sheet-shaped cell cultures A to D. The vertical axis represents the concentration of each cytokine in the culture supernatant, * represents p ⁇ 0.05, and ** represents p ⁇ 0.01.
  • One aspect of the present invention is a sheet-like cell culture obtained by culturing a cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, the pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes relative to the total number of cells in the cell population
  • the number percentage is greater than about 25% and less than about 90%, preferably from about 30% to about 80%, more preferably from about 40% to about 75%, particularly preferably from about 50% to about 70%
  • the present invention relates to a sheet-shaped cell culture (hereinafter sometimes referred to as “sheet-shaped cell culture of the present invention”).
  • a pluripotent stem cell is a well-known term in the technical field, and means a cell having an ability to differentiate into various tissues of a living body.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), nuclear transfer embryonic stem cells (ntES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like.
  • a pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte means a cell having the characteristics of a cardiomyocyte derived from a pluripotent stem cell.
  • the characteristics of cardiomyocytes include, but are not limited to, the expression of cardiomyocyte markers, the presence of autonomous pulsations, and the like.
  • Non-limiting examples of cardiomyocyte markers include, for example, c-TNT (cardiac troponin T), CD172a (also known as SIRPA or SHPS-1), KDR (also known as CD309, FLK1 or VEGFR2), PDGFRA, EMILIN2, VCAM, etc.
  • the pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes are c-TNT positive and / or CD172a positive.
  • the cardiomyocytes can be obtained by inducing cardiomyocytes from pluripotent stem cells, that is, by subjecting the pluripotent stem cells to cardiomyocyte induction treatment.
  • Various techniques for inducing cardiomyocytes from pluripotent stem cells are known (for example, Burridge et al., Cell Cell Stem Cell. 2012 2012 Jan 6; 10 (1): 16-28).
  • Non-limiting examples of such induction methods include, for example, a method using embryoid body formation, a method using monolayer differentiation culture, and a method using forced aggregation.
  • mesoderm-inducing factor eg, activin A, BMP4, bFGF, VEGF, SCF, etc.
  • cardiac specification factor eg, VEGF, DKK1, Wnt signal inhibitor (eg, IWR-1) , IWP-2, IWP-4, etc.
  • BMP signal inhibitors eg, NOGGIN, etc.
  • TGF ⁇ / activin / NODAL signal inhibitors eg, SB431542, etc.
  • retinoic acid signal inhibitors eg, VEGF, bFGF, DKK1, etc.
  • cardiac differentiation factors eg, VEGF, bFGF, DKK1, etc.
  • cardiomyocyte induction treatment from pluripotent stem cells is carried out by applying (1) BMP4, (2) a combination of BMP4, bFGF and activin A to an embryoid body formed in suspension culture, (3) IWR- 1 and (4) including sequentially applying a combination of VEGF and bFGF.
  • Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes can be purified after induction to increase purity.
  • Purification methods include various separation methods using markers specific to cardiomyocytes (for example, cell surface markers), such as magnetic cell separation (MACS), flow cytometry, affinity separation, and specific methods. Examples include a method of expressing a selection marker (for example, antibiotic resistance gene) by a promoter, and a combination of these methods (for example, see Burridge et al. Above).
  • cell surface markers specific to cardiomyocytes include CD172a, KDR, PDGFRA, EMILIN2, and VCAM.
  • promoters specific for cardiomyocytes include NKX2-5, MYH6, MLC2V, and ISL1.
  • cardiomyocytes are purified based on the cell surface marker CD172a.
  • the pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes may be a cardiomyocyte population that is derived from pluripotent stem cells as described above and optionally subjected to the purification treatment as described above.
  • the purity of cardiomyocytes in the cardiomyocyte population is, for example, more than about 85%, more than about 86%, more than about 87%, about 88%. %, Over 89%, over 90%, over 91%, over 92%, over 93%, over 94%, over 95%, over 96%, over 97%, over 98% %, Greater than about 99%, and the like.
  • the pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in the present invention is a cardiomyocyte population having a cardiomyocyte purity of more than 90%.
  • the cell population containing cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells can be derived from cardiomyocyte-derived cell populations even if the cardiomyocyte-derived cell population obtained by subjecting pluripotent stem cells to cardiomyocyte induction treatment is used as it is.
  • Purified cardiomyocytes whether purified by purifying cardiomyocytes or using purified cardiomyocytes after removing some of the cardiomyocytes from the cardiomyocyte-derived cell population A mixture of the population with other cell populations may be used.
  • the cell population containing cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells is a cardiomyocyte population obtained by purifying a cell population obtained by subjecting pluripotent stem cells to cardiomyocyte induction treatment, The cardiomyocyte population is obtained by mixing at a predetermined ratio.
  • sheet-like cell culture refers to a sheet-like culture in which cells are connected to each other.
  • the cells may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via intervening substances.
  • the intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance that can connect cells at least physically (mechanically), and examples thereof include an extracellular matrix.
  • the intervening substance is preferably derived from cells, in particular, derived from the cells constituting the cell culture.
  • the cells are at least physically (mechanically) connected, but may be further functionally, for example, chemically or electrically connected.
  • the sheet-shaped cell culture is composed of one cell layer (single layer) or composed of two or more cell layers (stacked (multilayer), for example, two layers, three layers, four layers) Layer, 5 layers, 6 layers, etc.).
  • the sheet-shaped cell culture preferably does not contain a scaffold (support). Scaffolds may be used in the art to attach cells on and / or within its surface and maintain the physical integrity of sheet-like cell cultures, for example, polyvinylidene difluoride ( PVDF) membranes and the like are known, but the sheet-like cell culture in the present invention may be capable of maintaining its physical integrity without such a scaffold.
  • the sheet-like cell culture is preferably composed only of substances derived from the cells constituting the cell culture and does not contain any other substances.
  • the cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes comprises one or more non-cardiomyocytes selected from the group consisting of ⁇ SMA positive cells, CD31 positive cells, and TE-7 antigen positive cells.
  • ⁇ SMA and CD31 are well-known proteins
  • the TE-7 antigen is an antigen recognized by the TE-7 antibody (clone TE-7, mouse IgG1, manufactured by Merck Millipore) (for example, Goodpaster et al., J Histochem Cytochem. 2008 Apr; 56 (4): 347-58 etc.).
  • Non-limiting examples of ⁇ SMA positive cells include, for example, smooth muscle cells and myofibroblasts
  • non-limiting examples of CD31 positive cells include, for example, vascular endothelial cells, non-limiting TE-7 antigen-positive cells. Examples include fibroblasts and myofibroblasts, respectively.
  • the non-cardiomyocytes can be identified using an antibody that specifically binds to ⁇ SMA, CD31 or TE-7 antigen.
  • the non-cardiomyocytes may be isolated from a living body by a known method, or may be derived from pluripotent stem cells or the like.
  • the cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes contains ⁇ SMA-positive cells, CD31-positive cells, and TE-7 antigen-positive cells in addition to cardiomyocytes.
  • ⁇ SMA-positive cells, CD31-positive cells, and TE-7 antigen-positive cells are obtained by subjecting pluripotent stem cells to cardiomyocyte induction treatment.
  • the ⁇ SMA positive cells, CD31 positive cells, and TE-7 antigen positive cells are non-cardiomyocyte populations obtained by removing cardiomyocytes from cell populations obtained by subjecting pluripotent stem cells to cardiomyocyte induction treatment. Is included. The removal of cardiomyocytes can be achieved by, for example, the above-described purification of cardiomyocytes.
  • the ratio of the number of ⁇ SMA positive cells to the total number of cells in the non-cardiomyocyte population is, for example, about 65% to about 95%, about 75% to about 93%, about 80% to about 91%, about 85% to about 90 %, About 86% to about 89%, etc.
  • the ratio of the number of CD31 positive cells to the total number of cells of the non-cardiomyocyte population is, for example, about 1% to about 10%, about 2% to about 9% About 3% to about 8%, about 3.5% to about 7%, about 4% to about 6%, etc.
  • the number of TE-7 antigen positive cells relative to the total number of cells of the non-cardiomyocyte population For example, the ratio is about 0.1% to about 50%, about 0.2% to about 45%, about 0.4% to about 40%, about 0.5% to about 35%, about 0.6%. Up to about 32%, etc.
  • the ratio of the number of TE-7 antigen positive cells to the total number of total cells of the non-cardiomyocyte population is, for example, about 0.1% to about 10%, about 0.2% to about 5%, about 0 From about 4% to about 2%, from about 0.5% to about 1%, from about 0.6% to about 0.7%, etc.
  • the ratio of the number of TE-7 antigen positive cells to the total number of total cells of the non-cardiomyocyte population is, for example, about 0.5% to about 50%, about 3% to about 45%, about 7. It may be 5% to about 40%, about 15% to about 35%, about 30% to about 32%, and the like.
  • the ratio of the number of TE-7 antigen-positive cells to the total number of cells of the non-cardiomyocyte population is, for example, about 0.2% to about 40%, about 0.5% to about 32%, about It may be 3% to about 25%, about 7.5% to about 20%, about 15% to about 17%, and the like.
  • non-cardiomyocyte population cells positive for two or more markers selected from ⁇ SMA, CD31 and TE-7 antigens may exist (for example, myofibroblasts are ⁇ SMA and TE-7).
  • the ratio of the number of ⁇ SMA positive cells to the total number of cells in a cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes is greater than about 25% and less than about 90% of the total number of cells in the cell population For example, about 6.5% to about 71.25%, about 7.5% to about 69.75%, about 8% to about 68.25%, about 8.5% to about 67.5% About 8.6% to about 66%, etc., and when the ratio of the number of cardiomyocytes is about 30% to about 80%, for example, about 13% to about 66.5%, about 15% May be about 65.1%, about 16% to about 63.7%, about 17% to about 63%, about 17.2% to about 62.3%, etc.
  • the ratio of the number of CD31 positive cells to the total number of cells in a cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes is greater than about 25% and less than about 90% of the total number of cells in the cell population For example, about 0.1% to about 7.5%, about 0.2% to about 6.75%, about 0.3% to about 6%, about 0.35% to about 5.25%, When the ratio of the number of cardiomyocytes is about 30% to about 80%, for example, about 0.2% to about 7%, about 0% 4% to about 6.3%, about 0.6% to about 5.6%, about 0.7% to about 4.9%, about 0.8% to about 4.2%, etc.
  • the ratio of the number of cardiomyocytes is about 40% to about 75%, for example, about 0.25% to about 6%, about 0.5% to about 5.4%, about 0.75% to About 4.8%, about 0.88% to about 4.2%, about 1
  • the ratio of the number of cardiomyocytes is about 50% to about 70%, for example, about 0.3% to about 5%, about 0.6% to about It may be 4.5%, about 0.9% to about 4%, about 1.05% to about 3.5%, about 1.2% to about 3%, and the like.
  • the ratio of the number of TE-7 antigen-positive cells to the total number of cells in a cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes is such that the ratio of the number of cardiomyocytes to the total number of cells in the cell population is more than about 25% and about 90%. Less than about 0.01% to about 37.5%, about 0.02% to about 33.75%, about 0.04% to about 30%, about 0.05% to about 26, for example.
  • the ratio of the number of cardiomyocytes is about 40% to about 75%, for example, about 0.03% to about 30%, about 0.05% to about 27%, about 0.1% to about 24 % About 0.13% to about 21%, about 0.15% to about 19.2%, etc., and when the proportion of the number of cardiomyocytes is about 50% to about 70%, for example, about 0% 0.03% to about 25%, about 0.06% to about 22.5%, about 0.12% to about 20%, about 0.15% to about 17.5%, about 0.18% to about 16 % Or the like.
  • the ratio of the number of TE-7 antigen positive cells to the total number of cells in a cell population comprising pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes is such that the ratio of the number of cardiomyocytes to the total number of cells in the cell population is greater than about 25%.
  • the ratio of the number of cardiomyocytes is about 30% to about 80%, for example, about 0% 0.02% to about 7%, about 0.04% to about 3.5%, about 0.08% to about 1.4%, about 0.1% to about 0.7%, about 0.12% to
  • the ratio of the number of cardiomyocytes is about 40% to about 75%, for example, about 0.03% to about 6%, about 0.05% to about 3 %, About 0.1% ⁇ 1.2%, about 0.13% to about 0.6%, about 0.15% to about 0.42%, etc.
  • the ratio of the number of cardiomyocytes is about 50% to about 70%
  • from about 0.03% to about 5% from about 0.06% to about 2.5%, from about 0.12% to about 1%, from about 0.15% to about 0.5%
  • the ratio of the number of TE-7 antigen-positive cells to the total number of cells in a cell population comprising pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes is about 25% of the total number of cells in the cell population.
  • greater than and less than about 90% for example, about 0.05% to about 37.5%, about 0.3% to about 33.75%, about 0.75% to about 30%, about 1. 5% to about 26.25%, about 3% to about 24%, etc.
  • the ratio of the number of cardiomyocytes is about 30% to about 80%, for example, about 0.1% to about 35%, about 0.6% to about 31.5%, about 1.5% to about 28%, about 3% to about 24.5%, about 6% to about 22.4%, etc.
  • the ratio of the number of cardiomyocytes is about 40% to about 75%, for example, about 0.13% to about 30%, about 0.75% to about 27%, about 1.88% to about 24% , About 3 75% to about 21%, about 7.5% to about 19.2%, etc., and when the ratio of the number of cardiomyocytes is about 50% to about 70%, for example, about 0.15% About 25%, about 0.9% to about 22.5%, about 2.25% to about 20%, about 4.5% to about 17.5%, about 9% to about 16%, etc. Good.
  • the ratio of the number of TE-7 antigen-positive cells to the total number of cells in a cell population comprising pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes is about 25% of the total number of cells in the cell population.
  • the ratio of the number of cardiomyocytes is about 30% to about 80%, for example, about 0.04% to about 28%, about 0.1% to about 22.4%, about 0.6% to about 17.5%, about 1.5% to about 14%, about 3% to about 11.9%, etc.
  • the ratio of the number of cardiomyocytes is about 40% to about 75%, for example, about 0.05% to about 24%, about 0.13% to about 19.2%, about 0.75% ⁇ About 5%, about 1.88% to about 12%, about 3.75% to about 10.2%, etc.
  • the ratio of the number of cardiomyocytes is about 50% to about 70%, About 0.06% to about 20%, about 0.15% to about 16%, about 0.9% to about 12.5%, about 2.25% to about 10%, about 4.5% to about It may be 8.5%.
  • cells positive for two or more markers selected from ⁇ SMA, CD31 and TE-7 antigens may be present.
  • the sum of the percentage of positive cells for each marker relative to the number of cells can exceed 100%.
  • the cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes is a mixture of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and the non-cardiomyocyte population
  • cells containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes The ratio of the number of various non-cardiomyocyte marker positive cells to the total number of cells in the population is the ratio of the number of various non-cardiomyocyte marker positive cells to the total number of cells in the above non-cardiomyocyte population and the number of cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells. It can be calculated by multiplying by the ratio of the total number of cells in the non-cardiomyocyte population to the total number of cells in the cell population.
  • the ratio of the number of ⁇ SMA positive cells to the number of CD31 positive cells in the non-cardiomyocyte population or the cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes is, for example, about 65 to about 95: about 1 to about 10, about 75.
  • the ratio of ⁇ SMA positive cells to TE-7 antigen positive cells can be, for example, about 65 to about 95: about 0.1 to about 50, about 75 to about 93: about 0.2 to about 45, About 80 to about 91: about 0.4 to about 40, about 85 to about 90: about 0.5 to about 35, about 86 to about 89: about 0.6 to about 32, etc., and CD31 positive cells
  • the ratio of the number to the number of TE-7 antigen positive cells is, for example, from about 1 to about 10: about 0.1 to about 50, from about 2 to about 9: from about 0.2 to about 45, from about 3 to about 8.
  • the ratio of the number of positive cells to the number of TE-7 antigen positive cells is, for example, about 65 to about 95: about 1 to about 10: about 0.1 to about 50, about 75 to about 93: about 2 to about 9: About 0.2 to about 45, about 80 to about 91: about 3 to about 8: about 0.4 to about 40, about 85 to about 90: about 3.5 to about 7: about 0.5 to about 35, About 86 to about 89: about 4 to about 6: about 0.6 to about 32, etc.
  • the cells constituting the sheet-shaped cell culture can be derived from any organism that can be treated with the sheet-shaped cell culture. Examples of such organisms include, but are not limited to, humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, sheep, rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, and the like. Is included. In one embodiment, the cells making up the sheet cell culture are human cells.
  • the cells forming the sheet-shaped cell culture may be heterogeneous cells or allogeneic cells.
  • heterologous cell as used herein means a cell derived from an organism of a species different from the recipient when the sheet-shaped cell culture is used for transplantation.
  • cells derived from monkeys or pigs correspond to xenogeneic cells.
  • the “same species-derived cell” means a cell derived from an organism of the same species as the recipient.
  • the human cell corresponds to the allogeneic cell.
  • the allogeneic cells include self-derived cells (also referred to as autologous cells or autologous cells), that is, cells derived from the recipient and allogeneic non-autologous cells (also referred to as allogeneic cells). Autologous cells are preferred in the present invention because no rejection occurs even after transplantation. However, it is also possible to use heterologous cells or allogeneic non-autologous cells. When using heterologous cells or allogeneic non-autologous cells, immunosuppressive treatment may be required to suppress rejection.
  • cells other than autologous cells that is, heterologous cells and allogeneic nonautologous cells may be collectively referred to as nonautologous cells.
  • the cells are autologous cells or allogeneic cells.
  • the cell is an autologous cell. In another embodiment of the invention, the cell is an allogeneic cell.
  • the autologous or allogeneic pluripotent stem cells are not limited, and, for example, collected autologous or allogeneic somatic cells (for example, skin cells (fibroblasts, keratinocytes, etc.) and blood cells (peripheral blood mononuclear cells, etc.)) Furthermore, it can be obtained by inducing autologous or allogeneic iPS cells by introducing genes such as OCT3 / 4, SOX2, KLF4, C-MYC, etc. Methods for inducing iPS cells from somatic cells are well known in the art (see, for example, Bayart and Cohen-Haguenauer, Curr Gene Ther. 2013 Apr; 13 (2): 73-92).
  • the sheet-like cell culture can be produced by any known method (for example, see Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 to 3, etc.).
  • the method for producing a sheet-shaped cell culture typically includes a step of seeding cells on a culture substrate, a step of culturing the seeded cells to form a sheet-shaped cell culture, and a formed sheet-shaped cell culture Including, but not limited to, isolating the product from the culture substrate.
  • the culture substrate is not particularly limited as long as cells can form a cell culture thereon, and includes, for example, containers of various materials, solid or semi-solid surfaces in containers, and the like.
  • the container preferably has a structure / material that does not allow permeation of a liquid such as a culture solution. Examples of such materials include, but are not limited to, polyethylene, polypropylene, Teflon (registered trademark), polyethylene terephthalate, polymethyl methacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, polyacrylamide, polydimethyl. Examples include acrylamide and metals (for example, iron, stainless steel, aluminum, copper, brass).
  • the container preferably has at least one flat surface.
  • Examples of such containers include, but are not limited to, cell culture dishes and cell culture bottles. Further, the container may have a solid or semi-solid surface therein. Examples of solid surfaces include plates and containers of various materials as described above, and examples of semi-solid surfaces include gels and soft polymer matrices.
  • the culture substrate may be prepared using the above materials, or commercially available materials may be used. Preferable culture substrates include, but are not limited to, substrates having an adhesive surface suitable for the formation of sheet cell cultures.
  • a substrate having a hydrophilic surface for example, a substrate coated with a hydrophilic compound such as polystyrene subjected to corona discharge treatment, collagen gel or hydrophilic polymer, and further, collagen, fibronectin, laminin , Substrates coated with an extracellular matrix such as vitronectin, proteoglycan and glycosaminoglycan, and cell adhesion factors such as cadherin family, selectin family and integrin family.
  • a hydrophilic compound such as polystyrene subjected to corona discharge treatment, collagen gel or hydrophilic polymer, and further, collagen, fibronectin, laminin , Substrates coated with an extracellular matrix such as vitronectin, proteoglycan and glycosaminoglycan, and cell adhesion factors such as cadherin family, selectin family and integrin family.
  • base materials are commercially available (for example, Corning (R) TC-Treated Culture Dish, manufactured by Corn
  • the surface of the culture substrate may be coated with a material whose physical properties change in response to stimulation, for example, temperature or light.
  • materials include, but are not limited to, (meth) acrylamide compounds, N-alkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N-cyclopropylmethacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N-ethoxyethylmethacrylamide, N-tetrahydrofurfurylacrylamide, N-tetrahydrofurfurylmethacrylate Amide), N, N-dialkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N, N-dimethyl (meth) acrylamide, N, N-ethyl
  • the sheet-like cell culture of the present invention is obtained by culturing the cell population, wherein the ratio of the number of cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells to the total number of cells in the cell population is 25% or less or 90% or more.
  • the cytokine-producing ability is higher than that of the obtained sheet-like cell culture.
  • Cytokine production ability means the ability to produce cytokines and includes any index related to cytokine production, including but not limited to, for example, the amount of cytokines released from sheet-like cell culture, and sheet-like cell culture Evaluation can be made based on the amount of cytokine, the amount of cytokine gene expressed by cells constituting the sheet-like cell culture, and the like.
  • cytokines mean proteinaceous factors that are released from cells and mediate various cell-cell interactions. Therefore, cytokines in the present invention are not limited to those released from immune cells.
  • a cytokine has an action of promoting the engraftment of a sheet-like cell culture to a transplant destination tissue.
  • the cytokine has an angiogenic effect.
  • a cytokine has an action of promoting tissue regeneration and repair.
  • cytokines have the effect of mobilizing stem cells (eg, cardiac stem cells, bone marrow stem cells, etc.).
  • the cytokine comprises a growth factor.
  • the cytokine has an angiogenic effect and / or stem cell mobilization effect.
  • the cytokine is selected from the group consisting of VEGF and SCF. Therefore, in one embodiment of the present invention, the cytokine production ability is the growth factor production ability.
  • the cytokine production ability is the ability to produce a cytokine having an angiogenesis action and / or stem cell mobilization action. Furthermore, in a specific embodiment of the present invention, the cytokine production ability is the ability to produce a growth factor selected from the group consisting of VEGF and SCF.
  • the amount of cytokine released from the sheet-shaped cell culture is not limited.
  • the cytokine contained in the culture solution (culture supernatant) can be obtained, for example, by measuring the amount (eg, cytokine concentration).
  • the amount of cytokine contained in the sheet-shaped cell culture is not limited, and can be obtained, for example, by culturing the sheet-shaped cell culture in a culture solution for a predetermined period and then crushing or dissolving the sheet-shaped cell culture. It can be obtained by measuring the amount of cytokine (for example, the concentration of cytokine) contained in the crushed liquid or lysate.
  • the amount of cytokine gene expressed by the cells constituting the sheet-shaped cell culture is not limited, for example, extracting total RNA from the sheet-shaped cell culture and quantifying the amount of cytokine gene contained therein Can be obtained.
  • Methods for measuring cytokine amounts and cytokine gene expression levels are well known in the art, and methods for measuring cytokine amounts are not limited and include, for example, electrophoresis, western blotting, and mass spectrometry.
  • EIA eg, ELISA, etc.
  • RIA eg, IRMA, RAST, RIST, etc.
  • MIA magnetic immunoassay
  • the method for measuring the expression level of cytokine gene is not limited, for example, Northern blotting method, Southern blotting method, DNA microarray analysis, RNase protection assay, RT-PCR, real-time PCR and other PCR methods, such as in situ hybridization And the like, respectively.
  • “High cytokine production ability” means that the cytokine production ability of the sheet-like cell culture of the present invention is the control sheet-like cell culture (ie, the number of cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells relative to the total number of cells in the cell population).
  • cytokine-producing ability of the sheet-like cell culture obtained by culturing the cell population having a ratio of 25% or less or 90% or more for example, about 10% or more, about 20% or more, about 30% or more, About 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 100% or more, about 110% or more, about 120% or more, about 130% or more, About 140% or more, about 150% or more, about 160% or more, about 170% or more, about 180% or more, about 190% or more, about 200% or more, about 250% or more, about 300% or more, about 350% or more, Over 400%, 450% or more, about 500% or more, about 550% or more means such as higher about 600% or more or about 650% or more.
  • the sheet-shaped cell culture of the present invention is substantially sterile. In one embodiment, the sheet cell culture of the present invention is sterile.
  • Another aspect of the present invention is the step of (1) subjecting pluripotent stem cells to cardiomyocyte induction treatment to obtain a first cell population containing cardiomyocytes, (2) obtaining a second cell population containing cardiomyocytes derived from the first cell population obtained in step (1); and (3) culturing the second cell population obtained in step (2).
  • Step (2) removes some of the cardiomyocytes from the first cell population even if the second cell population is obtained by purifying the cardiomyocytes from the first cell population to increase the purity of the cardiomyocytes.
  • the second cell population can be obtained by reducing the purity of cardiomyocytes, or the second cell population can be obtained by mixing the cardiomyocyte population purified from the first cell population with another cell population. Good.
  • the second cell population comprises a cardiomyocyte population obtained by purifying the first cell population and a non-cardiomyocyte, wherein the ratio of the number of cardiomyocytes to the total number of cells in the second cell population is: By mixing to be greater than about 25% and less than about 90%, preferably about 30% to about 80%, more preferably about 40% to about 75%, and particularly preferably about 50% to about 70%. obtain.
  • the second cell population may include one or more non-cardiomyocytes selected from the group consisting of ⁇ SMA positive cells, CD31 positive cells and TE-7 antigen positive cells, preferably ⁇ SMA positive
  • the cell may contain all three types of cells, CD31 positive cells and TE-7 antigen positive cells.
  • ⁇ SMA positive cells, CD31 positive cells and TE-7 antigen positive cells, and methods for obtaining these cells are as described above for the sheet-like cell culture of the present invention.
  • the ratio of the number of ⁇ SMA positive cells, the number of CD31 positive cells and the number of TE-7 antigen positive cells to the total number of cells in the second cell population was determined by the expression of “pluripotent stem cell-derived myocardium” in the sheet-like cell culture of the present invention. As described above for “a cell population containing cells”.
  • the step (2) comprises a predetermined ratio of a cardiomyocyte population obtained by purifying the first cell population and a non-cardiomyocyte population obtained after removing the cardiomyocytes from the first cell population. That is, the number of cardiomyocytes: the number of non-cardiomyocytes is more than about 25 and less than about 90: more than about 10 and less than about 75, preferably about 30 to about 80: about 20 to about 70, more preferably about 40 to about 75. About 25 to about 60, particularly preferably about 50 to about 70: about 30 to about 50.
  • the production method of the present invention may further include a step of recovering the formed sheet-shaped cell culture after the step of forming the sheet-shaped cell culture.
  • the recovery of the sheet-shaped cell culture is not particularly limited as long as the sheet-shaped cell culture can be released (peeled) from the culture substrate serving as a scaffold while at least partially maintaining the sheet structure. Enzymatic treatment with an enzyme (for example, trypsin) and / or mechanical treatment such as pipetting can be performed.
  • an enzyme for example, trypsin
  • a predetermined stimulation is applied.
  • it can be liberated non-enzymatically.
  • the temperature is set to be lower than the lower critical solution temperature (LCST) or higher upper limit critical solution temperature (UCST) for water of the temperature responsive material.
  • LCST lower critical solution temperature
  • UST upper limit critical solution temperature
  • the production method of the present invention comprises a step performed in vivo, without limitation, for example, from a subject (for example, skin cells, blood cells, etc. when using iPS cells) or a source of cells.
  • a step of collecting a tissue i.e., skin tissue, blood, etc. when iPS cells are used.
  • the production method of the present invention is performed under aseptic conditions in all steps.
  • the production method of the present invention is performed so that the finally obtained sheet-shaped cell culture is substantially sterile.
  • the production method of the present invention is performed such that the finally obtained sheet-shaped cell culture is sterile.
  • composition etc. a composition, a graft, a medical product and the like (hereinafter, may be collectively referred to as “composition etc.”) containing the sheet-shaped cell culture of the present invention.
  • the composition of the present invention includes various additional components such as a pharmaceutically acceptable carrier, the viability, engraftment and / or the sheet-shaped cell culture. Or the component which improves a function etc., the other active ingredient useful for treatment of a target disease, etc. may be included. Any known additional components can be used, and those skilled in the art are familiar with these additional components.
  • the composition of the present invention can be used in combination with components that enhance the viability, engraftment and / or function of the sheet-shaped cell culture, and other active ingredients useful for treating the target disease. .
  • the sheet-shaped cell culture and composition of the present invention are for treating a disease (eg, heart disease).
  • the sheet-like cell culture of the present invention can be used for producing a composition for treating a disease (for example, heart disease).
  • the disease include, but are not limited to, heart disease with myocardial infarction (including chronic heart failure associated with myocardial infarction), dilated cardiomyopathy, ischemic cardiomyopathy, systolic dysfunction (eg, left ventricular systolic dysfunction). (For example, heart failure, especially chronic heart failure).
  • Cytokines eg, VEGF, SCF, etc.
  • the disease may be useful for the treatment of cytokines, cardiomyocytes, and / or sheet cell cultures (cell sheets) selected from the group consisting of VEGF and SCF.
  • kits of the present invention are for producing the sheet-shaped cell culture or composition of the present invention, which includes some or all of the elements used for the production of the sheet-shaped cell culture or composition of the present invention. And / or a kit for treating a disease using the sheet-shaped cell culture or composition of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “kit of the present invention”).
  • kit of the present invention is not limited.
  • cells used for culturing a sheet-like cell culture for example, pluripotent stem cells, cell populations obtained by subjecting pluripotent stem cells to cardiomyocyte induction treatment (first Cell population), cardiomyocytes isolated from the first cell population, non-cardiomyocyte population obtained by removing the cardiomyocyte population from the first cell population, cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells (and optionally predetermined) Cell non-cardiomyocytes) at a predetermined ratio (second cell population, etc.), culture solution, culture dish, reagents used for purification of cardiomyocytes (eg, antibody, washing solution, beads, etc.), instruments ( For example, pipettes, syringes, tweezers, etc.), instructions on the production method and use method of sheet-like cell culture (eg, instructions, instructions, production medium, and information on the use method, such as a flexible disk, CD, DV , Blu-ray disc, memory card, may include a device such as a USB flash memory stick, etc.).
  • Another aspect of the present invention relates to a method for treating a disease in a subject comprising applying an effective amount of the sheet-shaped cell culture or composition of the present invention to the subject in need thereof.
  • the diseases to be treated are as described above for the sheet-shaped cell culture and composition of the present invention.
  • the term “subject” means any living individual, preferably an animal, more preferably a mammal, more preferably a human individual.
  • a subject may be healthy or may have some kind of disease.
  • treatment of a disease associated with a tissue abnormality Means a subject who is affected or at risk of being affected.
  • treatment is intended to encompass all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions aimed at healing, temporary remission or prevention of disease.
  • treatment may be medically acceptable for a variety of purposes, including delaying or stopping the progression of a disease associated with tissue abnormalities, regression or disappearance of a lesion, prevention of the onset of the disease, or prevention of recurrence, etc. Includes interventions.
  • a component that enhances the viability, engraftment and / or function of the sheet-shaped cell culture, another active component useful for the treatment of the target disease, and the like are used. It can be used in combination with cultures or compositions.
  • cytokines for example, VEGF, SCF, etc.
  • the treatment method of the present invention may further include a step of producing the sheet-shaped cell culture of the present invention according to the production method of the present invention.
  • cells for producing a sheet-shaped cell culture from a subject for example, skin cells, blood cells, etc. when iPS cells are used
  • the method may further include a step of collecting tissue serving as a cell supply source (for example, skin tissue, blood, etc. when iPS cells are used).
  • tissue serving as a cell supply source for example, skin tissue, blood, etc. when iPS cells are used.
  • a subject from which a cell or a tissue serving as a source of the cell is collected is the same individual as the subject who receives administration of a sheet-shaped cell culture or composition.
  • the subject from whom the cell or tissue that is the source of the cell is collected is a separate body of the same type as the subject receiving the sheet-like cell culture or composition. In another embodiment, the subject from whom the cell or tissue that serves as the source of the cell is collected is an individual different from the subject receiving the sheet-like cell culture or composition.
  • the effective amount is, for example, an amount that can suppress the onset or recurrence of a disease, reduce symptoms, or delay or stop progression (for example, the size, weight, number, etc. of sheet-like cell culture).
  • it is an amount that prevents the onset and recurrence of the disease or cures the disease.
  • an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred.
  • Such an amount can be appropriately determined by, for example, testing in laboratory animals such as mice, rats, dogs or pigs, and disease model animals, and such test methods are well known to those skilled in the art.
  • the size of the tissue lesion to be treated can be an important index for determining the effective amount.
  • the administration method typically includes direct application to tissues.
  • the frequency of administration is typically once per treatment, but multiple administrations are possible if the desired effect is not obtained.
  • the sheet-shaped cell culture or composition of the present invention may be fixed to the target tissue by a locking means such as a suture thread or a staple.
  • Another aspect of the present invention is the step of (1) subjecting pluripotent stem cells to cardiomyocyte induction treatment to obtain a first cell population containing cardiomyocytes, (2) obtaining a second cell population containing cardiomyocytes derived from the first cell population obtained in step (1); and (3) culturing the second cell population obtained in step (2).
  • cytokine a method for increasing the cytokine-producing ability of a sheet-like cell culture containing cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells, preferably about 40% to about 75%, particularly preferably about 50% to about 70% (hereinafter referred to as “cytokine”) It may be referred to as “productivity increasing method”).
  • cytokine production ability of a sheet-like cell culture is defined as the ratio of the number of cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells to the total number of cells in a control sheet-like cell culture.
  • Example 1 Induction of cardiomyocytes from human iPS cells
  • Human iPS cells (253G1 strain) were purchased from RIKEN BioResource Center, and 5 ng / mL bFGF (basic fibroblast growth factor, manufactured by Reprocell) in a 10 cm diameter culture dish. This was maintained on mouse embryonic fibroblasts treated with mitomycin C (MEF, manufactured by Reprocell) in Prime ES Cell Medium (manufactured by Reprocell) supplemented with the same below. Cell passage was performed every 3 to 4 days using a cell detachment solution (CTK solution, manufactured by Reprocell, the same below) while maintaining colonies (not in a single cell suspension).
  • CTK solution cell detachment solution
  • the induction of cardiomyocytes was performed by applying a predetermined additive to the embryoid body (EB) in suspension culture at a predetermined time.
  • the suspension was resuspended in TM 1 (manufactured by STEMCELL Technologies) and introduced into a culture apparatus with a stirring function (Bio Jr. 8, manufactured by Able).
  • the stirring speed was maintained at 40 rpm, the dissolved oxygen concentration was 40%, the pH was 7.2, and the temperature was 37 ° C.
  • the dissolved oxygen concentration was adjusted by air, oxygen or nitrogen, and the pH was adjusted by adding CO 2 .
  • a basic medium for inducing cardiomyocytes to which 0.5 ng / mL BMP4 (manufactured by R & D Systems, the same applies below) was added one day after the start of culture (day 0) in the culture apparatus (day 1).
  • BMP4 manufactured by R & D Systems, the same applies below
  • the medium was replaced with a basic medium for cardiomyocyte induction containing the following additives at the following times.
  • Day 2 10 ng / mL BMP4, 5 ng / mL bFGF and 3 ng / mL Activin A (R & D Systems), Day 5: 4 ⁇ M Wnt signal inhibitor (IWR-1-endo, Wako Pure Chemical Industries) ), Day 7: 5 ng / mL VEGF (R & D Systems) and 10 ng / mL bFGF. Thereafter, on days 9, 11, 13, and 15, the medium was changed with the same medium as that on day 7 (that is, a basic medium for cardiomyocyte induction to which 5 ng / mL VEGF and 10 ng / mL bFGF were added).
  • a cell population (cell mass) containing cardiomyocytes derived from human iPS cells was obtained.
  • the cell population was dissociated with 0.05% trypsin / EDTA, and the remaining cell aggregates were removed with a strainer (BD Bioscience) and used for the subsequent experiments.
  • Example 2 Analysis of the composition ratio of non-cardiomyocytes Using a part of the dissociated cell population obtained in Example 1, the composition ratio of non-cardiomyocytes in the cell population was examined.
  • cell populations are non-cardiomyocyte markers (CD31, a marker for vascular endothelial cells, ⁇ SMA, a marker for smooth muscle cells, or TE-7 antigen, a marker for fibroblasts) and a cardiomyocyte marker. Double labeled for both c-TNT.
  • CD31-expressing cells are labeled by reacting the cell population with PE-conjugated anti-human CD31 antibody (clone WM59, mouse IgG1, manufactured by BD), and then fixing the cells with a fixing / permeabilizing agent (BD Cytofix / Cytoperm TM Fixation / Permeabilization).
  • PE-conjugated anti-human CD31 antibody clone WM59, mouse IgG1, manufactured by BD
  • a fixing / permeabilizing agent BD Cytofix / Cytoperm TM Fixation / Permeabilization
  • the labeling of ⁇ SMA-expressing cells is carried out by fixing and permeabilizing the cells with a fixing / permeabilizing agent, and treating the treated cells into anti-c-TNT antibody and anti- ⁇ SMA antibody (clone E184, rabbit IgG, manufactured by Abcam). Next, it is reacted with a fluorescently labeled secondary antibody (Alexa Fluor (R) 647-conjugated anti-mouse IgG2a antibody and Alexa Fluor (R) 488-conjugated anti-rabbit antibody, both manufactured by Life Technologies) that bind to the primary antibody.
  • a fluorescently labeled secondary antibody Alexa Fluor (R) 647-conjugated anti-mouse IgG2a antibody and Alexa Fluor (R) 488-conjugated anti-rabbit antibody, both manufactured by Life Technologies
  • TE-7 antigen-expressing cells are labeled by immobilizing and permeabilizing the cells with a fixing / permeabilizing agent, and treating the treated cells with anti-c-TNT antibody and anti-human fibroblast antibody (clone TE-7, mouse).
  • IgG1 Merck Millipore
  • the fluorescent antibody-labeled secondary antibody that binds to the primary antibody (Alexa Fluor (R) 647-conjugated anti-mouse IgG2a antibody and Alexa Fluor (R) 488-conjugated anti-mouse IgG1 antibody, Both were carried out by reacting with Life Technologies).
  • Example 3 Isolation of Cardiomyocytes
  • a PE phycoerythrin
  • clone SE5A5 which specifically binds a part of the dissociated cell population obtained in Example 1 to CD172, which is a cardiomyocyte marker. BioLegend.
  • the labeled cells were loaded with anti-PE microbeads (Miltenyi Biotec), and the mixture of cells and beads was passed through LS Columns (Miltenyi Biotec) installed in MidiMACS TM Separator (Miltenyi Biotec), and CD172 positive Of cardiomyocytes and a non-cardiomyocyte population containing CD172-negative non-cardiomyocytes.
  • the ratio of the number of cells expressing another cardiomyocyte marker c-TNT to the total number of cells in the separated cardiomyocyte population was analyzed by flow cytometry. That is, the isolated cardiomyocyte population is fixed and permeabilized with a fixing / permeabilizing agent, and the treated cells are treated with an anti-c-TNT antibody, followed by a fluorescent-labeled secondary antibody (Alexa Fluor (R) 647-conjugated anti-mouse IgG2a After reaction with an antibody (Life Technologies), the labeled cells were analyzed using a BD FACSCanto TM II flow cytometer and BD FACSDiva TM software (both from BD). As a result of the analysis, the ratio of the number of c-TNT positive cells to the total number of cells in the cardiomyocyte population separated as described above was more than 90%.
  • Example 4 Preparation of Sheet Cell Culture
  • the cardiomyocyte population and non-cardiomyocyte population separated in Example 3 were mixed at the ratios shown in Table 2 below to prepare cell populations AD for forming sheet cell cultures.
  • the ratio (%) in the table means the ratio of the number of cells in various cell populations to the total number of cells in the cell population.
  • the ratio of each non-cardiomyocyte marker positive cell in the non-cardiomyocyte population calculated in Example 2 is considered to be substantially unchanged before and after the separation step of the cardiomyocyte population and the non-cardiomyocyte population, It can also be applied to non-cardiomyocyte populations.
  • Cell populations A to D were seeded at a density of 2.1 ⁇ 10 5 cells / cm 2 in a temperature-responsive culture dish (UpCell®, manufactured by Cellseed ) , and 10% FBS containing no ROCK inhibitor.
  • a sheet-like cell culture is formed by growing and culturing in DMEM at 37 ° C. and 5% CO 2 for 5 days. The culture was detached (FIG. 1).
  • the sheet-like cell cultures formed from the cell populations A to D are referred to as sheet-like cell cultures A to D, respectively.
  • Example 5 Evaluation of Sheet-like Cell Culture (1) Appearance Sheet-like cell cultures B to D formed from a cell population having a cardiomyocyte population ratio of 50% or more showed spontaneous synchronous pulsations. Further, the sheet-like cell cultures A to C were able to form a white circular shape suitable for transplantation, but the sheet-like cell culture D was not able to form a stable sheet-like structure. (FIG. 1).
  • a high cytokine production amount can be obtained by setting the ratio of the cardiomyocyte population in the cell population forming the sheet-like cell culture to 50% to 70%.
  • VEGF is known to have an angiogenic action and increase the survival rate of grafts (eg, Suzuki et al., Circulation. 2001 Sep 18; 104 (12 Suppl 1): I207-12), It is known that SCF can mobilize bone marrow stem cells that can differentiate into cardiomyocytes (for example, Lutz et al., Cardiovasc Res. 2008 Jan; 77 (1): 143-50). Therefore, it is predicted that the sheet-shaped cell culture of the present invention having a high production amount of these cytokines has a high therapeutic effect.
  • Type I and type III collagens are more highly expressed in sheet cell cultures A and B, while laminins ⁇ 2 and ⁇ 4, the major extracellular matrix components of heart tissue, are found in sheet cell culture C. It was more expressed.
  • the electric conduction velocity of the sheet-shaped cell cultures A to D was measured by a multi-electrode array.
  • the cell populations A to D prepared in Example 4 were seeded on a MED probe (Alpha Med Scientific) at a density of 2.1 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , respectively.
  • a MED probe Alpha Med Scientific
  • the extracellular potential was measured using Med Scientific, the peak time of each channel was detected using MED64 Mobius (WitWerx), and the conduction velocity was calculated.
  • the conduction velocities of the sheet cell cultures B to D are 3.5 ⁇ 1.8 cm / sec, 8.6 ⁇ 2.8 cm / sec and 16 ⁇ 5.0 cm / sec, respectively, and the proportion of the cardiomyocyte population is The larger the number, the larger.

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Abstract

　機能的特性に優れた、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物を提供する。　多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団を培養して得られるシート状細胞培養物であって、前記細胞集団の全細胞数に対する多能性幹細胞由来の心筋細胞数の割合が、５０％～７０％である、前記シート状細胞培養物、該シート状細胞培養物の製造方法、該シート状細胞培養物を含む組成物、該シート状細胞培養物または該組成物を用いた疾患の処置方法。

Description

心筋細胞シート
　本発明は、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物、その製造方法、当該シート状細胞培養物を含む組成物等、当該シート状細胞培養物を用いた疾患の処置方法などに関する。
　成体の心筋細胞は自己複製能に乏しく、心筋組織が損傷を受けた場合、その修復は極めて困難である。近年、損傷した心筋組織の修復のために、細胞工学的手法により作製した心筋細胞を含む移植片を患部に移植する試みが行われている（特許文献１、非特許文献１）。かかる移植片の作製に用いる心筋細胞の給源として最近注目されているのが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞から誘導した心筋細胞であり、このような多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物の作製や動物での治療実験が試みられている（非特許文献２～３）。しかしながら、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物の開発は始まったばかりであり、その機能的特性や、それに影響する因子などについては依然不明な部分が多い。
特表２００７－５２８７５５号公報
Shimizu et al., Circ Res. 2002 Feb 22;90(3):e40-e48 Matsuura et al., Biomaterials. 2011 Oct;32(30):7355-62 Kawamura et al., Circulation. 2012 Sep 11;126(11 Suppl 1):S29-37
　本発明は、有用な機能的特性を有する、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物、その製造方法、当該シート状細胞培養物を含む移植片、および、当該シート状細胞培養物を用いた疾患の処置方法等の提供を目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、シート状細胞培養物の形成に用いる細胞集団の全細胞数に対する多能性幹細胞由来の心筋細胞数の割合を５０％～７０％の範囲に調節することで、疾患の治療に有用なサイトカインの産生能が高まることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下に関する。
　＜１＞多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団を培養して得られるシート状細胞培養物であって、前記細胞集団の全細胞数に対する多能性幹細胞由来の心筋細胞数の割合が、５０％～７０％である、前記シート状細胞培養物。
　＜２＞細胞集団が、αＳＭＡ陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞およびＴＥ－７抗原陽性細胞からなる群から選択される細胞をさらに含む、上記＜１＞に記載のシート状細胞培養物。
　＜３＞細胞集団の全細胞数に対する多能性幹細胞由来の心筋細胞数の割合が２５％以下または９０％以上である、前記細胞集団を培養して得られるシート状細胞培養物よりサイトカイン産生能が高い、上記＜１＞または＜２＞に記載のシート状細胞培養物。
　＜４＞（１）多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供し、心筋細胞を含む第１の細胞集団を得るステップ、
（２）ステップ（１）で得た第１の細胞集団に由来する心筋細胞を含む第２の細胞集団を得るステップ、および
（３）ステップ（２）で得た第２の細胞集団を培養してシート状細胞培養物を形成するステップ
を含み、第２の細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が５０％～７０％である、上記＜１＞～＜３＞のいずれか一つに記載のシート状細胞培養物の製造方法。
　＜５＞上記＜１＞～＜３＞のいずれか一つに記載のシート状細胞培養物を含む組成物。
　＜６＞心疾患を処置するための、上記＜５＞に記載の組成物。
　＜７＞上記＜１＞～＜３＞のいずれか一つに記載のシート状細胞培養物または上記＜５＞に記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、前記対象における疾患を処置する方法。
　＜８＞（１）多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供し、心筋細胞を含む第１の細胞集団を得るステップ、
（２）ステップ（１）で得た第１の細胞集団に由来する心筋細胞を含む第２の細胞集団を得るステップ、および
（３）ステップ（２）で得た第２の細胞集団を培養してシート状細胞培養物を形成するステップ
を含み、第２の細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が５０％～７０％である、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物のサイトカイン産生能を高める方法。
　本発明のシート状細胞培養物は、疾患の治療に有用なサイトカインの産生能が高く、優れた治療効果をもたらすことができるため、医療分野への多大な貢献が期待できる。
図１は、完成したシート状細胞培養物Ａ～Ｄの外観を示した写真図である。 図２は、シート状細胞培養物Ａ～Ｄが産生したサイトカインの定量結果を示したグラフである。なお、縦軸は培養上清中の各サイトカインの濃度を示し、*はｐ＜０．０５、**はｐ＜０．０１をそれぞれ表す。
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物（インターネットから入手可能な情報を含む）は、その全体を参照により本明細書に援用する。
　本発明の一側面は、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団を培養して得られるシート状細胞培養物であって、前記細胞集団の全細胞数に対する多能性幹細胞由来の心筋細胞数の割合が、約２５％超かつ約９０％未満、好ましくは約３０％～約８０％、より好ましくは約４０％～約７５％、特に好ましくは約５０％～約７０％である、前記シート状細胞培養物（以下、「本発明のシート状細胞培養物」と称する場合がある）に関する。
　多能性幹細胞は、当該技術分野で周知の用語であり、生体の様々な組織に分化する能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の非限定例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。
　本発明において、「多能性幹細胞由来の心筋細胞」は、多能性幹細胞に由来する心筋細胞の特徴を有する細胞を意味する。心筋細胞の特徴としては、限定されずに、例えば、心筋細胞マーカーの発現、自律的拍動の存在などが挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定例としては、例えば、ｃ－ＴＮＴ（cardiac troponin T）、ＣＤ１７２ａ（別名ＳＩＲＰＡまたはＳＨＰＳ－１）、ＫＤＲ（別名ＣＤ３０９、ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２）、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。一態様において、多能性幹細胞由来の心筋細胞は、ｃ－ＴＮＴ陽性かつ／またはＣＤ１７２ａ陽性である。当該心筋細胞は、多能性幹細胞から心筋細胞を誘導すること、すなわち、多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供することによって得ることができる。多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する様々な手法が知られている（例えば、Burridge et al., Cell Stem Cell. 2012 Jan 6;10(1):16-28）。かかる誘導法の非限定例としては、例えば、胚様体形成による方法、単層分化培養による方法、強制凝集による方法などが挙げられる。いずれの方法においても、中胚葉誘導因子（例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦなど）、心臓特異化（cardiac specification）因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、Ｗｎｔシグナルインヒビター（例えば、ＩＷＲ－１、ＩＷＰ－２、ＩＷＰ－４等）、ＢＭＰシグナルインヒビター（例えば、ＮＯＧＧＩＮ等）、ＴＧＦβ／アクチビン／ＮＯＤＡＬシグナルインヒビター（例えば、SB431542等）、レチノイン酸シグナルインヒビターなど）および心臓分化因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＤＫＫ１など）を、順次作用させることにより誘導効率を高めることができる。一態様において、多能性幹細胞からの心筋細胞誘導処理は、浮遊培養下で形成した胚様体に、（１）ＢＭＰ４、（２）ＢＭＰ４とｂＦＧＦとアクチビンＡとの組み合わせ、（３）ＩＷＲ－１、および、（４）ＶＥＧＦとｂＦＧＦとの組み合わせを順次作用させることを含む。
　多能性幹細胞由来の心筋細胞は、誘導後に精製し、純度を高めることができる。精製方法としては、心筋細胞に特異的なマーカー（例えば、細胞表面マーカーなど）を用いた種々の分離法、例えば、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）、フローサイトメトリー法、アフィニティ分離法や、特異的プロモーターにより選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子など）を発現させる方法、さらにはこれらの方法の組合せなどが挙げられる（例えば、上記Burridge et al.など参照）。心筋細胞に特異的な細胞表面マーカーとしては、例えば、ＣＤ１７２ａ、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。また、心筋細胞に特異的なプロモーターとしては、例えば、ＮＫＸ２－５、ＭＹＨ６、ＭＬＣ２Ｖ、ＩＳＬ１などが挙げられる。一態様において、心筋細胞は細胞表面マーカーであるＣＤ１７２ａに基づいて精製される。
　多能性幹細胞由来の心筋細胞は、上記のように多能性幹細胞から誘導し、任意に上記のような精製処理に供した心筋細胞集団であってもよい。当該心筋細胞集団における心筋細胞の純度（例えば、心筋細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞マーカー陽性細胞数の割合）は、例えば、約８５％超、約８６％超、約８７％超、約８８％超、約８９％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超などであってよい。一態様において、本発明における多能性幹細胞由来の心筋細胞は、心筋細胞の純度が９０％超の心筋細胞集団である。
　多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団は、多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供して得られる心筋細胞誘導後の細胞集団をそのまま利用しても、心筋細胞誘導後の細胞集団から心筋細胞を精製して純度を高めたものを利用しても、心筋細胞誘導後の細胞集団から心筋細胞の一部を除去して純度を低下させたものを利用しても、精製した心筋細胞集団を他の細胞集団と混合したものを利用してもよい。一態様において、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団は、多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供して得られる細胞集団を精製して得た心筋細胞集団と、精製後に残った非心筋細胞集団とを、所定の比率で混合して得たものである。
　本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。
　シート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本発明におけるシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができるものであってもよい。また、シート状細胞培養物は、好ましくは、細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
　一態様において、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団は、αＳＭＡ陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞およびＴＥ－７抗原陽性細胞からなる群から選択される１種または２種以上の非心筋細胞をさらに含んでいる。αＳＭＡおよびＣＤ３１は周知のタンパク質であり、ＴＥ－７抗原は、ＴＥ－７抗体（clone TE-7、マウスIgG1、Merck Millipore社製）により認識される抗原である（例えば、Goodpaster et al., J Histochem Cytochem. 2008 Apr;56(4):347-58など参照）。αＳＭＡ陽性細胞の非限定例としては、例えば、平滑筋細胞や筋線維芽細胞などが、ＣＤ３１陽性細胞の非限定例としては、例えば、血管内皮細胞などが、ＴＥ－７抗原陽性細胞の非限定例としては、例えば、線維芽細胞や筋線維芽細胞などがそれぞれ挙げられる。上記非心筋細胞は、αＳＭＡ、ＣＤ３１またはＴＥ－７抗原に特異的に結合する抗体等を用いて同定することができる。上記非心筋細胞は、既知の方法により生体から単離してもよいし、多能性幹細胞などから誘導してもよい。
　一態様において、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団は、心筋細胞に加え、αＳＭＡ陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞およびＴＥ－７抗原陽性細胞を含んでいる。一態様において、αＳＭＡ陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞およびＴＥ－７抗原陽性細胞は、多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供することにより得たものである。好ましい態様において、αＳＭＡ陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞およびＴＥ－７抗原陽性細胞は、多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供して得た細胞集団から、心筋細胞を除去して得た非心筋細胞集団に含まれるものである。心筋細胞の除去は、例えば、上述の心筋細胞の精製などにより達成することができる。
　上記非心筋細胞集団の全細胞数に対するαＳＭＡ陽性細胞数の割合は、例えば、約６５％～約９５％、約７５％～約９３％、約８０％～約９１％、約８５％～約９０％、約８６％～約８９％等であってよく、上記非心筋細胞集団の全細胞数に対するＣＤ３１陽性細胞数の割合は、例えば、約１％～約１０％、約２％～約９％、約３％～約８％、約３．５％～約７％、約４％～約６％等であってよく、上記非心筋細胞集団の全細胞数に対するＴＥ－７抗原陽性細胞数の割合は、例えば、約０．１％～約５０％、約０．２％～約４５％、約０．４％～約４０％、約０．５％～約３５％、約０．６％～約３２％等であってよい。
　一態様において、上記非心筋細胞集団の全総細胞数に対するＴＥ－７抗原陽性細胞数の割合は、例えば、約０．１％～約１０％、約０．２％～約５％、約０．４％～約２％、約０．５％～約１％、約０．６％～約０．７％等であってよい。別の態様において、上記非心筋細胞集団の全総細胞数に対するＴＥ－７抗原陽性細胞数の割合は、例えば、約０．５％～約５０％、約３％～約４５％、約７．５％～約４０％、約１５％～約３５％、約３０％～約３２％等であってよい。別の態様において、上記非心筋細胞集団の全総細胞数に対するＴＥ－７抗原陽性細胞数の割合は、例えば、約０．２％～約４０％、約０．５％～約３２％、約３％～約２５％、約７．５％～約２０％、約１５％～約１７％等であってよい。
　なお、上記非心筋細胞集団には、αＳＭＡ、ＣＤ３１およびＴＥ－７抗原から選択される２種以上のマーカーに陽性である細胞が存在し得るため（例えば、筋線維芽細胞はαＳＭＡおよびＴＥ－７抗原の両方に陽性と考えられる（例えば、上記Goodpaster et al.など参照））、上記非心筋細胞集団の全細胞数に対する各非心筋細胞マーカー陽性細胞数のパーセンテージの合計は１００％を超えることもある。
　多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団の全細胞数に対するαＳＭＡ陽性細胞数の割合は、該細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が約２５％超かつ約９０％未満の場合には、例えば、約６．５％～約７１．２５％、約７．５％～約６９．７５％、約８％～約６８．２５％、約８．５％～約６７．５％、約８．６％～約６６％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約３０％～約８０％の場合には、例えば、約１３％～約６６．５％、約１５％～約６５．１％、約１６％～約６３．７％、約１７％～約６３％、約１７．２％～約６２．３％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約４０％～約７５％の場合には、例えば、約１６．２５％～約５７％、約１８．７５％～約５５．８％、約２０％～約５４．６％、約２１．２５％～約５４％、約２１．５％～約５３．４％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約５０％～約７０％の場合には、例えば、約１９．５％～約４７．５％、約２２．５％～約４６．５％、約２４％～約４５．５％、約２５．５％～約４５％、約２５．８％～約４４．５％等であってよい。
　多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団の全細胞数に対するＣＤ３１陽性細胞数の割合は、該細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が約２５％超かつ約９０％未満の場合に、例えば、約０．１％～約７．５％、約０．２％～約６．７５％、約０．３％～約６％、約０．３５％～約５．２５％、約０．４％～約４．５％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約３０％～約８０％の場合には、例えば、約０．２％～約７％、約０．４％～約６．３％、約０．６％～約５．６％、約０．７％～約４．９％、約０．８％～約４．２％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約４０％～約７５％の場合には、例えば、約０．２５％～約６％、約０．５％～約５．４％、約０．７５％～約４．８％、約０．８８％～約４．２％、約１％～約３．６％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約５０％～約７０％の場合には、例えば、約０．３％～約５％、約０．６％～約４．５％、約０．９％～約４％、約１．０５％～約３．５％、約１．２％～約３％等であってよい。
　多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団の全細胞数に対するＴＥ－７抗原陽性細胞数の割合は、該細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が約２５％超かつ約９０％未満の場合には、例えば、約０．０１％～約３７．５％、約０．０２％～約３３．７５％、約０．０４％～約３０％、約０．０５％～約２６．２５％、約０．０６％～約２４％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約３０％～約８０％の場合には、例えば、約０．０２％～約３５％、約０．０４％～約３１．５％、約０．０８％～約２８％、約０．１％～約２４．５％、約０．１２％～約２２．４％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約４０％～約７５％の場合には、例えば、約０．０３％～約３０％、約０．０５％～約２７％、約０．１％～約２４％、約０．１３％～約２１％、約０．１５％～約１９．２％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約５０％～約７０％の場合には、例えば、約０．０３％～約２５％、約０．０６％～約２２．５％、約０．１２％～約２０％、約０．１５％～約１７．５％、約０．１８％～約１６％等であってよい。
　一態様において、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団の全細胞数に対するＴＥ－７抗原陽性細胞数の割合は、該細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が約２５％超かつ約９０％未満の場合には、例えば、約０．０１％～約７．５％、約０．０２％～約３．７５％、約０．０４％～約１．５％、約０．０５％～約０．７５％、約０．０６％～約０．５３％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約３０％～約８０％の場合には、例えば、約０．０２％～約７％、約０．０４％～約３．５％、約０．０８％～約１．４％、約０．１％～約０．７％、約０．１２％～約０．４９％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約４０％～約７５％の場合には、例えば、約０．０３％～約６％、約０．０５％～約３％、約０．１％～約１．２％、約０．１３％～約０．６％、約０．１５％～約０．４２％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約５０％～約７０％の場合には、例えば、約０．０３％～約５％、約０．０６％～約２．５％、約０．１２％～約１％、約０．１５％～約０．５％、約０．１８％～約０．３５％等であってよい。
　別の態様において、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団の全細胞数に対するＴＥ－７抗原陽性細胞数の割合は、該細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が約２５％超かつ約９０％未満の場合には、例えば、約０．０５％～約３７．５％、約０．３％～約３３．７５％、約０．７５％～約３０％、約１．５％～約２６．２５％、約３％～約２４％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約３０％～約８０％の場合には、例えば、約０．１％～約３５％、約０．６％～約３１．５％、約１．５％～約２８％、約３％～約２４．５％、約６％～約２２．４％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約４０％～約７５％の場合には、例えば、約０．１３％～約３０％、約０．７５％～約２７％、約１．８８％～約２４％、約３．７５％～約２１％、約７．５％～約１９．２％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約５０％～約７０％の場合には、例えば、約０．１５％～約２５％、約０．９％～約２２．５％、約２．２５％～約２０％、約４．５％～約１７．５％、約９％～約１６％等であってよい。
　別の態様において、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団の全細胞数に対するＴＥ－７抗原陽性細胞数の割合は、該細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が約２５％超かつ約９０％未満の場合には、例えば、約０．０２％～約３０％、約０．０５％～約２４％、約０．３％～約１８．７５％、約０．７５％～約１５％、約１．５％～約１２．７５％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約３０％～約８０％の場合には、例えば、約０．０４％～約２８％、約０．１％～約２２．４％、約０．６％～約１７．５％、約１．５％～約１４％、約３％～約１１．９％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約４０％～約７５％の場合には、例えば、約０．０５％～約２４％、約０．１３％～約１９．２％、約０．７５％～約１５％、約１．８８％～約１２％、約３．７５％～約１０．２％等であってよく、前記心筋細胞数の割合が約５０％～約７０％の場合には、例えば、約０．０６％～約２０％、約０．１５％～約１６％、約０．９％～約１２．５％、約２．２５％～約１０％、約４．５％～約８．５％等であってよい。
　なお、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団には、αＳＭＡ、ＣＤ３１およびＴＥ－７抗原から選択される２種以上のマーカーに陽性である細胞が存在し得るため、当該細胞集団の全細胞数に対する各マーカーの陽性細胞数のパーセンテージの合計は１００％を超えることもある。また、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団が、多能性幹細胞由来の心筋細胞と前記非心筋細胞集団とを混合したものである場合、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団の全細胞数に対する各種非心筋細胞マーカー陽性細胞数の割合は、上記の非心筋細胞集団の全細胞数に対する各種非心筋細胞マーカー陽性細胞数の割合と、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団の全細胞数に対する非心筋細胞集団の全細胞数の割合とを乗じることにより算出することができる。
　上記非心筋細胞集団または多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団における、αＳＭＡ陽性細胞数とＣＤ３１陽性細胞数との比は、例えば、約６５～約９５：約１～約１０、約７５～約９３：約２～約９、約８０～約９１：約３～約８、約８５～約９０：約３．５～約７、約８６～約８９：約４～約６等であってよく、αＳＭＡ陽性細胞数とＴＥ－７抗原陽性細胞数との比は、例えば、約６５～約９５：約０．１～約５０、約７５～約９３：約０．２～約４５、約８０～約９１：約０．４～約４０、約８５～約９０：約０．５～約３５、約８６～約８９：約０．６～約３２等であってよく、ＣＤ３１陽性細胞数とＴＥ－７抗原陽性細胞数との比は、例えば、約１～約１０：約０．１～約５０、約２～約９：約０．２～約４５、約３～約８：約０．４～約４０、約３．５～約７：約０．５～約３５、約４～約６：約０．６～約３２等であってよく、αＳＭＡ陽性細胞数とＣＤ３１陽性細胞数とＴＥ－７抗原陽性細胞数との比は、例えば、約６５～約９５：約１～約１０：約０．１～約５０、約７５～約９３：約２～約９：約０．２～約４５、約８０～約９１：約３～約８：約０．４～約４０、約８５～約９０：約３．５～約７：約０．５～約３５、約８６～約８９：約４～約６：約０．６～約３２等であってよい。
　シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。一態様において、シート状細胞培養物を構成する細胞はヒト細胞である。
　シート状細胞培養物を形成する細胞は、異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本発明においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本発明の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本発明の一態様において、細胞は自家細胞である。本発明の別の態様において、細胞は他家細胞である。
　自家または他家多能性幹細胞は、限定されずに、例えば、採取した自家または他家体細胞（例えば、皮膚細胞（線維芽細胞、ケラチノサイト等）や血球（末梢血単核球等）など）に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－ＭＹＣ等の遺伝子を導入するなどして自家または他家ｉＰＳ細胞を誘導することにより得ることができる。体細胞からｉＰＳ細胞を誘導する方法は当該技術分野において周知である（例えば、Bayart and Cohen-Haguenauer, Curr Gene Ther. 2013 Apr;13(2):73-92など参照）。
　シート状細胞培養物は、既知の任意の方法（例えば、特許文献１、非特許文献１～３など参照）で製造することができる。シート状細胞培養物の製造方法は、典型的には、細胞を培養基材上に播種するステップ、播種した細胞を培養してシート状細胞培養物を形成するステップ、形成されたシート状細胞培養物を培養基材から単離するステップを含むが、これに限定されない。
　培養基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材が挙げられる。具体的には、親水性の表面を有する基材、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R) TC-Treated Culture Dish、Corning社製など）。
　培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）－モルホリン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ－イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平2-211865、特開2003-33177など参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、セルシード社のUpCell(R)）、これらを本発明の製造方法に使用することができる。
　一態様において、本発明のシート状細胞培養物は、細胞集団の全細胞数に対する多能性幹細胞由来の心筋細胞数の割合が２５％以下または９０％以上である、前記細胞集団を培養して得られるシート状細胞培養物よりサイトカイン産生能が高い。サイトカイン産生能は、サイトカインを産生する能力を意味し、サイトカイン産生に係る任意の指標、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物から放出されるサイトカインの量、シート状細胞培養物に含まれるサイトカインの量、シート状細胞培養物を構成する細胞が発現するサイトカイン遺伝子の量などに基づいて評価することができる。
　本発明において、サイトカインとは、細胞から放出され、種々の細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子を意味する。したがって、本発明におけるサイトカインは、免疫細胞から放出されるものに限られない。本発明の一態様において、サイトカインは、シート状細胞培養物の移植先の組織への生着を促進する作用を有する。本発明の一態様において、サイトカインは、血管新生作用を有する。本発明の一態様において、サイトカインは、組織の再生や修復を促進する作用を有する。本発明の一態様において、サイトカインは、幹細胞（例えば、心臓幹細胞、骨髄幹細胞など）を動員する作用を有する。このようなサイトカインは当該技術分野において知られており、当業者は既知の情報をもとに、適切なサイトカインを決定することができる（例えば、Lui et al., Stem Cell Res. 2014 Jul 8. pii: S1873-5061(14)00080-4、Cochain et al., Antioxid Redox Signal. 2013 Mar 20;18(9):1100-13など参照）。本発明の一態様において、サイトカインは成長因子を含む。本発明の一態様において、サイトカインは血管新生作用および／または幹細胞動員作用を有する。本発明の特定の態様において、サイトカインはＶＥＧＦおよびＳＣＦからなる群から選択される。したがって、本発明の一態様において、サイトカイン産生能は、成長因子の産生能である。また、本発明の一態様において、サイトカイン産生能は、血管新生作用および／または幹細胞動員作用を有するサイトカインの産生能である。さらに、本発明の特定の態様において、サイトカイン産生能は、ＶＥＧＦおよびＳＣＦからなる群から選択される成長因子の産生能である。
　シート状細胞培養物から放出されるサイトカインの量は、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物を所定の期間培養液中で培養した後、当該培養液（培養上清）に含まれるサイトカインの量（例えば、サイトカインの濃度など）を測定することなどにより得ることができる。シート状細胞培養物に含まれるサイトカインの量は、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物を所定の期間培養液中で培養した後、シート状細胞培養物を破砕または溶解し、得られた破砕液または溶解液中に含まれるサイトカインの量（例えば、サイトカインの濃度など）を測定することなどにより得ることができる。シート状細胞培養物を構成する細胞が発現するサイトカイン遺伝子の量は、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物から全ＲＮＡを抽出し、これに含まれるサイトカイン遺伝子の量を定量することなどにより得ることができる。
　サイトカインの量やサイトカイン遺伝子の発現量を測定する手法は、当該技術分野において周知であり、サイトカインの量を測定する手法としては、限定されずに、例えば、電気泳動法、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、ＥＩＡ（例えば、ＥＬＩＳＡなど）、ＲＩＡ（例えば、ＩＲＭＡ、ＲＡＳＴ、ＲＩＳＴなど）、磁気免疫測定法（ＭＩＡ、例えば、磁気ビーズを用いた免疫測定法など）、免疫組織化学法、免疫細胞化学法などが、サイトカイン遺伝子の発現量を測定する手法としては、限定されずに、例えば、ノーザンブロッティング法、サザンブロッティング法、ＤＮＡマイクロアレイ解析、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション法などが、それぞれ挙げられる。
　「サイトカイン産生能が高い」とは、本発明のシート状細胞培養物のサイトカイン産生能が、対照シート状細胞培養物（すなわち、細胞集団の全細胞数に対する多能性幹細胞由来の心筋細胞数の割合が２５％以下または９０％以上である、前記細胞集団を培養して得られるシート状細胞培養物）のサイトカイン産生能より、例えば、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上、約１１０％以上、約１２０％以上、約１３０％以上、約１４０％以上、約１５０％以上、約１６０％以上、約１７０％以上、約１８０％以上、約１９０％以上、約２００％以上、約２５０％以上、約３００％以上、約３５０％以上、約４００％以上、約４５０％以上、約５００％以上、約５５０％以上、約６００％以上または約６５０％以上高いことなどを意味する。
　一態様において、本発明のシート状細胞培養物は実質的に無菌である。一態様において、本発明のシート状細胞培養物は無菌である。
　本発明の別の側面は、（１）多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供し、心筋細胞を含む第１の細胞集団を得るステップ、
（２）ステップ（１）で得た第１の細胞集団に由来する心筋細胞を含む第２の細胞集団を得るステップ、および
（３）ステップ（２）で得た第２の細胞集団を培養してシート状細胞培養物を形成するステップ
を含み、第２の細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が、約２５％超かつ約９０％未満、好ましくは約３０％～約８０％、より好ましくは約４０％～約７５％、特に好ましくは約５０％～約７０％である、上記シート状細胞培養物の製造方法（以下、「本発明の製造方法」と称することがある）に関する。
　多能性幹細胞の心筋細胞誘導処理、細胞集団からの心筋細胞の単離、シート状細胞培養物およびシート状細胞培養物の形成については、本発明のシート状細胞培養物について上記したとおりである。ステップ（２）は、第１の細胞集団から心筋細胞を精製して心筋細胞の純度を高めることにより第２の細胞集団を得ても、第１の細胞集団から心筋細胞の一部を除去して心筋細胞の純度を低下させることにより第２の細胞集団を得ても、第１の細胞集団から精製した心筋細胞集団を他の細胞集団と混合することにより第２の細胞集団を得てもよい。一態様において、第２の細胞集団は、第１の細胞集団を精製して得た心筋細胞集団と、非心筋細胞とを、第２の細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が、約２５％超かつ約９０％未満、好ましくは約３０％～約８０％、より好ましくは約４０％～約７５％、特に好ましく約は約５０％～約７０％となるように混合することにより得る。
　第２の細胞集団は、αＳＭＡ陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞およびＴＥ－７抗原陽性細胞からなる群から選択される１種または２種以上の非心筋細胞を含んでいてもよく、好ましくは、αＳＭＡ陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞およびＴＥ－７抗原陽性細胞の３種の細胞をすべて含んでいてもよい。αＳＭＡ陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞およびＴＥ－７抗原陽性細胞、ならびにこれら細胞の取得方法は本発明のシート状細胞培養物について上記したとおりである。また、第２の細胞集団の全細胞数に対するαＳＭＡ陽性細胞数、ＣＤ３１陽性細胞数およびＴＥ－７抗原陽性細胞数の割合は、本発明のシート状細胞培養物の「多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団」について上記したとおりである。
　特定の態様において、ステップ（２）は、第１の細胞集団を精製して得た心筋細胞集団と、第１の細胞集団から心筋細胞を除去した後に得られる非心筋細胞集団とを所定の割合すなわち、心筋細胞数：非心筋細胞数が、約２５超かつ約９０未満：約１０超かつ約７５未満、好ましくは約３０～約８０：約２０～約７０、より好ましくは約４０～約７５：約２５～約６０、特に好ましくは約５０～約７０：約３０～約５０となるように混合することを含む。
　本発明の製造方法は、シート状細胞培養物を形成するステップの後に、形成されたシート状細胞培養物を回収するステップをさらに含んでもよい。シート状細胞培養物の回収は、シート状細胞培養物が少なくとも部分的に、シート構造を保ったまま、足場となっている培養基材から遊離（剥離）できれば特に限定されず、例えば、タンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）による酵素処理および／またはピペッティングなどの機械的処理によって行うことができる。また、細胞を、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面を被覆した培養基材上で培養してシート状細胞培養物を形成した場合には、所定の刺激を加えることで、非酵素的に遊離することもできる。例えば、細胞を温度応答性培養皿で培養して細胞培養物を形成した場合には、温度を温度応答性材料の水に対する下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）以下または上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）以上とすることにより、シート状細胞培養物を非酵素的に遊離することができる。
　一態様において、本発明の製造方法はその全ステップがin vitroで行われる。別の態様において、本発明の製造方法は、in vivoで行われるステップ、限定されずに、例えば、対象から細胞（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚細胞、血球等）または細胞の給源となる組織（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚組織、血液等）を採取するステップを含む。一態様において、本発明の製造方法はその全ステップが無菌条件下で行われる。一態様において、本発明の製造方法は、最終的に得られるシート状細胞培養物が実質的に無菌となるように行われる。一態様において、本発明の製造方法は、最終的に得られるシート状細胞培養物が無菌となるように行われる。
　本発明の別の側面は、本発明のシート状細胞培養物を含む組成物、移植片および医療製品など（以下、「組成物等」と総称することがある）に関する。
　本発明の組成物等は、本発明のシート状細胞培養物に加えて、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体や、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。また、本発明の組成物等は、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などと併用することができる。
　一態様において、本発明のシート状細胞培養物および組成物等は疾患（例えば、心疾患）を処置するためのものである。また、本発明のシート状細胞培養物は、疾患（例えば、心疾患）を処置するための組成物等の製造に使用することができる。疾患としては、限定されずに、例えば、心筋梗塞（心筋梗塞に伴う慢性心不全を含む）、拡張型心筋症、虚血性心筋症、収縮機能障害（例えば、左室収縮機能障害）を伴う心疾患（例えば、心不全、特に慢性心不全）などが挙げられる。本発明のシート状細胞培養物が産生するサイトカイン（例えば、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ等）は、疾患の処置に寄与し得る。疾患は、ＶＥＧＦおよびＳＣＦからなる群から選択されるサイトカイン、心筋細胞、および／または、シート状細胞培養物（細胞シート）が、その処置に有用なものであってもよい。
　本発明の別の側面は、本発明のシート状細胞培養物または組成物等の製造に用いる一部またはすべての要素を含む、本発明のシート状細胞培養物または組成物等を製造するための、および／または、本発明のシート状細胞培養物または組成物等を用いて疾患を処置するためのキット（以下、「本発明のキット」と称することがある）に関する。本発明のキットは、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物の培養に用いる細胞（例えば、多能性幹細胞、多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供して得られる細胞集団（第１の細胞集団）、第１の細胞集団から単離した心筋細胞、第１の細胞集団から心筋細胞集団を除去して得た非心筋細胞集団、多能性幹細胞由来の心筋細胞（および任意に所定の非心筋細胞）を所定の割合で含む細胞集団（第２の細胞集団）等）、培養液、培養皿、心筋細胞の精製に用いる試薬（例えば、抗体、洗浄液、ビーズ等）、器具類（例えば、ピペット、スポイト、ピンセット等）、シート状細胞培養物の製造方法や使用方法に関する指示（例えば、使用説明書、製造方法や使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリー等）などを含んでいてもよい。
　本発明の別の側面は、本発明のシート状細胞培養物または組成物等の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、前記対象における疾患を処置する方法に関する。処置の対象となる疾患は、本発明のシート状細胞培養物および組成物等について上記したとおりである。
　本発明において、用語「対象」は、任意の生物個体、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体を意味する。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、組織の異常に関連する疾患の処置が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
　また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、組織の異常に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　本発明の処置方法においては、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本発明のシート状細胞培養物または組成物等と併用することができる。また、本発明の処置方法においては、本発明のシート状細胞培養物が産生するサイトカイン（例えば、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ等）が、疾患の処置に寄与し得る。
　本発明の処置方法は、本発明の製造方法に従って、本発明のシート状細胞培養物を製造するステップをさらに含んでもよい。本発明の処置方法は、シート状細胞培養物を製造するステップの前に、対象からシート状細胞培養物を製造するための細胞（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚細胞、血球等）または細胞の給源となる組織（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚組織、血液等）を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象とは異種の個体である。
　本発明において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、シート状細胞培養物のサイズ、重量、枚数等）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。
　投与方法としては、典型的には組織への直接的な適用が挙げられる。投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。組織に適用する際、本発明のシート状細胞培養物や組成物等を対象の組織に縫合糸やステープルなどの係止手段により固定してもよい。
　本発明の別の側面は、（１）多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供し、心筋細胞を含む第１の細胞集団を得るステップ、
（２）ステップ（１）で得た第１の細胞集団に由来する心筋細胞を含む第２の細胞集団を得るステップ、および
（３）ステップ（２）で得た第２の細胞集団を培養してシート状細胞培養物を形成するステップ
を含み、第２の細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が約２５％超かつ約９０％未満 、好ましくは約３０％～約８０％、より好ましくは約４０％～約７５％、特に好ましくは約５０％～約７０％である、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物のサイトカイン産生能を高める方法（以下、「サイトカイン産生能増大方法」と称することがある）に関する。
　本発明のサイトカイン産生能増大方法における各ステップは、本発明の製造方法について上記したとおりである。また、「サイトカイン産生能を高める」とは、シート状細胞培養物のサイトカイン産生能を、対照シート状細胞培養物（すなわち、細胞集団の全細胞数に対する多能性幹細胞由来の心筋細胞数の割合が２５％以下または９０％以上である、前記細胞集団を培養して得られるシート状細胞培養物）のサイトカイン産生能より、例えば、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上、約１１０％以上、約１２０％以上約１３０％以上約１４０％以上、約１５０％以上、約１６０％以上、約１７０％以上、約１８０％以上、約１９０％以上、約２００％以上、約２５０％以上、約３００％以上、約３５０％以上、約４００％以上、約４５０％以上、約５００％以上、約５５０％以上、約６００％以上または約６５０％以上高めることなどを意味する。
　本発明を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これらは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。
例１　ヒトｉＰＳ細胞からの心筋細胞の誘導
　ヒトｉＰＳ細胞（253G1株）を理化学研究所バイオリソースセンターから購入し、直径１０ｃｍの培養皿内で、５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor、リプロセル社製、以下同様）を添加したPrimate ES Cell Medium（リプロセル社製）中、マイトマイシンＣ処理を施したマウス胎児線維芽細胞（MEF、リプロセル社製）上で維持した。細胞の継代は、３～４日ごとに、コロニーを維持したまま（単細胞懸濁液にせずに）、細胞剥離液（CTK溶液、リプロセル社製、以下同様）を用いて行った。
　心筋細胞の誘導は、浮遊培養下の胚様体（ＥＢ）に所定の添加物を所定の時期に作用させることにより行った。１０枚の培養皿から細胞剥離液で剥離したヒトｉＰＳ細胞の凝集塊（約２×１０７細胞）を、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤（Y-27632、和光純薬社製）を添加した１００ｍＬのmTeSRTM1（STEMCELL Technologies社製）に再懸濁し、撹拌機能付培養装置（Bio Jr. 8、エイブル社製）に導入した。培養中、撹拌速度を４０ｒｐｍ、溶解酸素濃度を４０％、ｐＨを７．２、温度を３７℃にそれぞれ維持した。溶解酸素濃度の調節は空気、酸素または窒素により、ｐＨの調節はＣＯ２の添加によりそれぞれ行った。
　培養装置内での培養開始（０日目）の１日後（１日目）に、培地を、０．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４（R&D Systems社製、以下同様）を添加した心筋細胞誘導用基本培地（５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（Sigma-Aldrich社製）、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび４００μＭの１－チオグリセロール（Sigma-Aldrich社製）を含むStemPro(R)-34 SFM（Life Technologies社製））に置換した。その後、以下の時期に、培地を、以下の添加物を含む心筋細胞誘導用基本培地に置換した。２日目：１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび３ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（R&D Systems社製）、５日目：４μＭのＷｎｔシグナル阻害剤（IWR-1-endo、和光純薬社製）、７日目：５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（R&D Systems社製）および１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ。その後、９、１１、１３および１５日目に、７日目と同じ培地（すなわち、５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加した心筋細胞誘導用基本培地）で培地交換を行った。こうしてヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団（細胞塊）を得た。当該細胞集団は、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで解離後、残存する細胞凝集物をストレイナー（BD Bioscience社製）で除去し、その後の実験に供した。
例２　非心筋細胞の構成比の解析
　例１で得た解離した細胞集団の一部を用いて、当該細胞集団における非心筋細胞の構成比を調べた。まず、細胞集団を、非心筋細胞マーカー（血管内皮細胞等のマーカーであるＣＤ３１、平滑筋細胞等のマーカーであるαＳＭＡまたは線維芽細胞等のマーカーであるＴＥ－７抗原）と心筋細胞マーカーであるｃ－ＴＮＴの両方について二重標識した。
　ＣＤ３１発現細胞の標識は、細胞集団を、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ３１抗体（clone WM59、マウスIｇG1、BD社製）と反応させた後、細胞を固定・透過処理剤（BD Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeabilization Solution Kit、BD社製、以下同様）で固定、透過処理し、処理後の細胞を、抗ｃ－ＴＮＴ抗体（Troponin T-C Antibody (CT3)、マウスIgG2a、Santa Cruz Biotechnology社製、以下同様）、次いで、蛍光標識二次抗体（Alexa Fluor(R) 647結合抗マウスIgG2a抗体、Life Technologies社製）と反応させることにより行った。
　αＳＭＡ発現細胞の標識は、細胞を固定・透過処理剤で固定、透過処理し、処理後の細胞を、抗ｃ－ＴＮＴ抗体と、抗αＳＭＡ抗体（clone E184、ウサギIgG、Abcam社製）とに反応させ、次いで、上記一次抗体に結合する蛍光標識二次抗体（Alexa Fluor(R) 647結合抗マウスIgG2a抗体およびAlexa Fluor(R) 488結合抗ウサギ抗体、いずれもLife Technologies社製）と反応させることにより行った。
　ＴＥ－７抗原発現細胞の標識は、細胞を固定・透過処理剤で固定、透過処理し、処理後の細胞を、抗ｃ－ＴＮＴ抗体と、抗ヒト線維芽細胞抗体（clone TE-7、マウスIgG1、Merck Millipore社製）とに反応させ、次いで、上記一次抗体に結合する蛍光標識二次抗体（Alexa Fluor(R) 647結合抗マウスIgG2a抗体およびAlexa Fluor(R) 488結合抗マウスIgG1抗体、いずれもLife Technologies社製）と反応させることにより行った。
　標識した細胞を、BD FACSCantoTM II フローサイトメーターおよびBD FACSDivaTM ソフトウェア（いずれもBD社製）を用いて解析した。非心筋細胞集団の全細胞数に対する各非心筋細胞マーカー陽性細胞数の割合は、ｃ－ＴＮＴ陰性画分の細胞集団（非心筋細胞集団）の全細胞数に対する各非心筋細胞マーカー陽性細胞数の割合として算出した。結果を下表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
例３　心筋細胞の分離
　例１で得た解離した細胞集団の一部を、心筋細胞マーカーであるＣＤ１７２に特異的に結合する、ＰＥ（フィコエリスリン）結合抗ヒトＣＤ１７２ａ／ｂ抗体（clone SE5A5、BioLegend社製）で標識した。標識した細胞に抗ＰＥマイクロビーズ（Miltenyi Biotec社製）を負荷し、細胞とビーズの混合物をMidiMACSTM Separator（Miltenyi Biotec社製）に設置したLS Columns（Miltenyi Biotec社製）に通して、ＣＤ１７２陽性の心筋細胞を含む心筋細胞集団と、ＣＤ１７２陰性の非心筋細胞を含む非心筋細胞集団とに分離した。
　分離した心筋細胞集団の一部を用いて、別の心筋細胞マーカーであるｃ－ＴＮＴを発現する細胞数の、分離した心筋細胞集団の全細胞数に対する割合をフローサイトメトリーで解析した。すなわち、分離した心筋細胞集団を固定・透過処理剤で固定、透過処理し、処理後の細胞を、抗ｃ－ＴＮＴ抗体、次いで、蛍光標識二次抗体（Alexa Fluor(R) 647結合抗マウスIgG2a抗体、Life Technologies社製）と反応させた後、標識した細胞を、BD FACSCantoTM II フローサイトメーターおよびBD FACSDivaTM ソフトウェア（いずれもBD社製）を用いて解析した。解析の結果、上記で分離した心筋細胞集団の全細胞数に対するｃ－ＴＮＴ陽性細胞数の割合は９０％超であった。
例４　シート状細胞培養物の作製
　例３で分離した心筋細胞集団と非心筋細胞集団とを下表２の比率で混合し、シート状細胞培養物形成用の細胞集団Ａ～Ｄを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　なお、表中の割合（％）は、細胞集団の全細胞数に対する各種細胞集団の細胞数の割合を意味する。また、例２で算出した非心筋細胞集団における各非心筋細胞マーカー陽性細胞の割合は、心筋細胞集団と非心筋細胞集団の分離ステップの前後で実質的に変化しないと考えられるため、分離後の非心筋細胞集団についても適用可能である。
　細胞集団Ａ～Ｄを、それぞれ２．１×１０５個／ｃｍ２の密度で、温度応答性培養皿（UpCell(R)、セルシード社製）に播種し、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２にて５日間増殖培養してシート状細胞培養物を形成し、温度処理（室温での１０～３０分程度の静置）により培養皿からシート状細胞培養物を剥離した（図１）。以下では、細胞集団Ａ～Ｄで形成したシート状細胞培養物を、それぞれシート状細胞培養物Ａ～Ｄと記す。
例５　シート状細胞培養物の評価
（１）外観
　心筋細胞集団の割合が５０％以上の細胞集団で形成したシート状細胞培養物Ｂ～Ｄは、自発的な同期拍動を示した。また、シート状細胞培養物Ａ～Ｃは、移植に適した白色円形の形状を形成することができたが、シート状細胞培養物Ｄは安定したシート状の構造を形成することができなかった（図１）。
（２）サイトカインの産生
　シート状細胞培養物Ａ～Ｄを、１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２にて２日間培養して得た培養上清に含まれるＶＥＧＦおよびＳＣＦの濃度を、Bio-Plex(R) Suspension Array System（Bio-Rad Laboratories社製）を用い、製品マニュアルに従って測定した（ｎ＝４）。ＶＥＧＦの定量にはBio-Plex ProTM ヒトサイトカイン 28-Plex アッセイを、ＳＣＦの定量にはBio-Plex ProTM ヒトサイトカイン 21-Plex アッセイをそれぞれ用いた。各群間の統計学的有意差の評価には、Non-repeated Measures ANOVAを用いた。
　図２に示す結果から、シート状細胞培養物を形成する細胞集団における心筋細胞集団の割合を５０％～７０％とすることで、高いサイトカイン産生量が得られることが分かる。ＶＥＧＦは血管新生作用を有し、移植片の生存率を高めることなどが知られており（例えば、Suzuki et al., Circulation. 2001 Sep 18;104(12 Suppl 1):I207-12など）、ＳＣＦは、心筋細胞に分化し得る骨髄幹細胞を動員し得ることなどが知られている（例えば、Lutz et al., Cardiovasc Res. 2008 Jan;77(1):143-50など）。したがって、これらのサイトカインの産生量が高い本発明のシート状細胞培養物は、高い治療効果を有することが予測される。
（３）細胞外マトリックス構成成分の発現
　シート状細胞培養物Ａ～ＤをＰＢＳで２回洗浄後、RNeasy(R) Mini（Qiagen社製）で全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡを基にSuperScript(R) VILOTM cDNA Synthesis Kit（Life Technologies社製）を用いてｃＤＮＡを合成したのち、TaqMan(R) Gene Expression AssaysおよびTaqMan(R) Fast Advanced Master Mix（いずれもLife Technologies社製）を用いてリアルタイムＰＣＲにより細胞外マトリックス構成成分の発現量を定量した。なお、TaqMan(R) Gene Expression AssaysのAssay IDおよび検出遺伝子は下表３に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンは、シート状細胞培養物ＡおよびＢでより多く発現しており、一方、心組織の主要な細胞外マトリックス構成成分であるラミニンα２およびα４は、シート状細胞培養物Ｃでより多く発現していた。
（４）電気伝導速度
　シート状細胞培養物Ａ～Ｄの電気伝導速度を多電極アレイ（multi-electrode array）により測定した。例４で調製した細胞集団Ａ～Ｄを、それぞれ２．１×１０５個／ｃｍ２の密度で、MEDプローブ（アルファメッドサイエンティフィック社製）に播種した。１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２にて５日間増殖培養してシート状細胞培養物を形成した後、シート状細胞培養物がプローブに付着したままの状態でMED64システム（アルファメッドサイエンティフィック社製）を用いて、細胞外電位を測定し、MED64 Mobius（WitWerx社製）を用いて各チャネルのピーク時間を検出し、伝導速度を算出した。シート状細胞培養物Ｂ～Ｄの伝導速度は、それぞれ３．５±１．８ｃｍ／秒、８．６±２．８ｃｍ／秒および１６±５．０ｃｍ／秒であり、心筋細胞集団の割合が多いほど大きくなった。
　本明細書に記載された本発明の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、すべて本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。

Claims (8)

  1. 　多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団を培養して得られるシート状細胞培養物であって、前記細胞集団の全細胞数に対する多能性幹細胞由来の心筋細胞数の割合が、５０％～７０％である、前記シート状細胞培養物。
  2. 　細胞集団が、αＳＭＡ陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞およびＴＥ－７抗原陽性細胞からなる群から選択される細胞をさらに含む、請求項１に記載のシート状細胞培養物。
  3. 　細胞集団の全細胞数に対する多能性幹細胞由来の心筋細胞数の割合が２５％以下または９０％以上である、前記細胞集団を培養して得られるシート状細胞培養物よりサイトカイン産生能が高い、請求項１または２に記載のシート状細胞培養物。
  4. 　（１）多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供し、心筋細胞を含む第１の細胞集団を得るステップ、
    （２）ステップ（１）で得た第１の細胞集団に由来する心筋細胞を含む第２の細胞集団を得るステップ、および
    （３）ステップ（２）で得た第２の細胞集団を培養してシート状細胞培養物を形成するステップ
    を含み、第２の細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が５０％～７０％である、請求項１～３のいずれか一項に記載のシート状細胞培養物の製造方法。
  5. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のシート状細胞培養物を含む組成物。
  6. 　心疾患を処置するための、請求項５に記載の組成物。
  7. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のシート状細胞培養物または請求項５に記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、前記対象における疾患を処置する方法。
  8. 　（１）多能性幹細胞を心筋細胞誘導処理に供し、心筋細胞を含む第１の細胞集団を得るステップ、
    （２）ステップ（１）で得た第１の細胞集団に由来する心筋細胞を含む第２の細胞集団を得るステップ、および
    （３）ステップ（２）で得た第２の細胞集団を培養してシート状細胞培養物を形成するステップ
    を含み、第２の細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞数の割合が５０％～７０％である、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物のサイトカイン産生能を高める方法。
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