JP6587877B2 - 表皮幹細胞を分離するためのマーカー及び三次元培養表皮の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)ITGAV、ITGA2、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれる1種又は2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、表皮の細胞集団から表皮幹細胞を分離する方法。
(2)ITGAV、ITGA2、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれる1種又は2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、三次元培養表皮の製造に用いる表皮幹細胞の品質を評価する方法。
(3)ITGAV、ITGA2、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれる1種又は2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、表皮の細胞集団から表皮幹細胞を分離する工程と、分離した表皮幹細胞を培養して重層化した表皮角化細胞を作製する工程を含む、三次元培養表皮の製造方法。
(4)ITGAV、ITGA2、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれる2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子を含む、表皮幹細胞の検出又は分離用マーカーのセット。
(5)ITGAV、ITGA2、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれるマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子に対して特異的親和性を有する物質を少なくとも1種含む、表皮幹細胞の検出又は分離用キット。
(6)特異的親和性を有する物質が、ITGAV、ITGA2、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれるマーカータンパク質に対する抗体である、(5)に記載のキット。
(7)特異的親和性を有する物質が、ITGAV、ITGA2、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれるマーカータンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、(5)に記載のキット。
(実施例1)フローサイトメトリーによる表皮幹細胞の分離及び未分化性の評価
(1)フローサイトメトリーによる表皮幹細胞の分離
表皮角化細胞から表面タンパク質であるITGAV、ITGA2、ITGB3、NGFRを指標として細胞を分離した。本試験では、表皮角化細胞として、市販の正常ヒト成人表皮角化細胞(クラボウ社製)を用いた。なお、細胞の増殖には同社市販の培養液としてHuMedia−KG2を用いた。
(1)でFACS Ariaにより分離した各細胞について、幹細胞の特性である未分化性の評価を以下のようにして行った。なお、分離前の雑多細胞群を標準細胞として用いた。
ATGCCTGCAGTTTTTCATCC(配列番号9)
GAGGCAGGTCTTCAGAGGAA(配列番号10)
GAPDH(内部標準)遺伝子用のプライマーセット:
TGCACCACCAACTGCTTAGC(配列番号11)
TCTTCTGGGTGGCAGTGATG(配列番号12)
実施例1において、FACS Ariaにより分離した各細胞と分離前の標準細胞を用いてそれぞれ三次元培養表皮を製造し、その性能の評価を行った。三次元培養表皮の作製には、市販されているケラチノサイト三次元培養スターターキット(フナコシ社製)を用い、添付されているプロトコールに従って作製した。なお、三次元培養表皮の培養日数は、10日間とした。
CCATCAGGAGCAAATGAAACAG(配列番号13)
GCTCGACAGGCACCTTCTG(配列番号14)
FLG遺伝子用プライマー:
GGCACTGAAAGGCAAAAAGG(配列番号15)
AAACCCGGATTCACCATAATCA(配列番号16)
OCLN遺伝子用プライマー:
GGAGTGATTCGGATCCTGTC(配列番号17)
ACAATGGCAATGGCCTCCTG(配列番号18)
CLDN1遺伝子用プライマー:
CAGAGCACCGGGCAGATC(配列番号19)
TTGCAATGTGCTGCTCAGATT(配列番号20)
Claims (6)
- ITGAV、ITGA2、及びITGB3よりなる群から選ばれる1種又は2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、表皮の細胞集団から表皮幹細胞を分離する方法。
- ITGAV、ITGA2、及びITGB3よりなる群から選ばれる1種又は2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、三次元培養表皮の製造に用いる表皮幹細胞の品質を評価する方法。
- ITGAV、ITGA2、及びITGB3よりなる群から選ばれる1種又は2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、表皮の細胞集団から表皮幹細胞を分離する工程と、分離した表皮幹細胞を培養して重層化した表皮角化細胞を作製する工程を含む、三次元培養表皮の製造方法。
- ITGAV、ITGA2、及びITGB3よりなる群から選ばれるマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子に対して特異的親和性を有する物質を少なくとも1種含む、表皮幹細胞の検出又は分離用キット。
- 特異的親和性を有する物質が、ITGAV、ITGA2、及びITGB3よりなる群から選ばれるマーカータンパク質に対する抗体である、請求項4に記載のキット。
- 特異的親和性を有する物質が、ITGAV、ITGA2、及びITGB3よりなる群から選ばれるマーカータンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、請求項4に記載のキット。
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JP2015184242A JP6587877B2 (ja) | 2015-09-17 | 2015-09-17 | 表皮幹細胞を分離するためのマーカー及び三次元培養表皮の製造方法 |
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