JP6606413B2 - 真皮幹細胞の検出及び分離方法 - Google Patents
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Description
(1)ITGA2、ITGA8、ITGB1、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれる1種又は2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の真皮組織から真皮幹細胞を分離する方法。
(2)ITGA2、ITGA8、ITGB1、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれる1種又は2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の真皮組織における真皮幹細胞を検出する方法。
(3)ITGA2、ITGA8、ITGB1、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれる1種又は2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の真皮組織における真皮幹細胞の品質を評価する方法。
(4)真皮幹細胞が、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、及び平滑筋細胞への分化能を有する、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)ITGA2、ITGA8、ITGB1、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれる2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子を含む、真皮幹細胞の検出又は分離用マーカーのセット。
(6)ITGA2、ITGA8、ITGB1、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれるマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子に対して特異的親和性を有する物質を少なくとも1種含む、真皮幹細胞の検出又は分離用キット。
(7)特異的親和性を有する物質が、ITGA2、ITGA8、ITGB1、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれるマーカータンパク質に対する抗体である、(6)に記載のキット。
(8)特異的親和性を有する物質が、ITGA2、ITGA8、ITGB1、ITGB3、及びNGFRよりなる群から選ばれるマーカータンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、(6)に記載のキット。
抗ITGA2抗体(コスモバイオ社製)、抗ITGA8抗体(R&D systems社製)、抗ITGB1抗体(日本BD社製)、抗ITGB3抗体(フナコシ社製)、及び抗NGFR抗体(Acris社製)等の市販品を用いることができる。マーカータンパク質の検出には、これらの抗体を適宜標識すればよい。標識物質は、蛍光色素、放射性同位体、酵素等を使用することができる。また、抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインAやプロテインGなどを用いることも可能である。これらの抗体を用いて真皮幹細胞の選別と分離を行う場合は、後述の蛍光細胞分離法(Fluorescence activated cell sorting :FACS)で行うことができる。
(1)フローサイトメトリーによる真皮由来細胞からの幹細胞の分離
皮膚から分離した真皮由来細胞と、さらにその真皮由来細胞から表面タンパク質である
ITGA2、ITGA8、ITGB1、ITGB3、NGFRを指標として細胞を分離した。本試験では、皮膚から分離した真皮由来細胞として、市販されているヒト皮膚線維芽細胞(東洋紡株式会社製)を用いた。なお、細胞の増殖には同社市販の培養液としてヒト線維芽細胞増殖培地を用いた。
(1)でFACS Ariaにより分離した各細胞について、幹細胞の特性である未分化性の評価を以下のようにして行った。
各細胞をPBS(−)にて2回洗浄し、Trizol Reagent(Invitrogen社製)によって各細胞からRNAを抽出した。2−STEPリアルタイムPCRキット(Applied Biosystems社製)を用いて抽出したRNAをcDNAに逆転写した後、ABI7300(Applied Biosystems社製)により、下記のプライマーセットを用いてリアルタイムPCR(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40cycles)を実施し、未分化マーカーであるNanog(Cell Res.2007 Jan;17(1):42−9.Review.Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency.Pan G,Thomson JA.)の遺伝子発現量を測定した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。
ATGCCTGCAGTTTTTCATCC(配列番号11)
GAGGCAGGTCTTCAGAGGAA(配列番号12)
GAPDH(内部標準)遺伝子用のプライマーセット:
TGCACCACCAACTGCTTAGC(配列番号13)
TCTTCTGGGTGGCAGTGATG(配列番号14)
未分化マーカー遺伝子NANOGの発現が高く、特に、ITGA2とNGFR、ITGA8とNGFRを組み合わせた場合に顕著であった。
実施例1においてFACS Ariaにより分離した各細胞と分離前の標準細胞を用いて、以下の方法で分化誘導培養を行い、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞への分化誘導の確認を行った。
FACS Ariaにより分離した各細胞と分離前の標準細胞を、脂肪細胞分化誘導用培地(DSバイオファーマ社製)にて、37℃、5%CO2の条件で14日間培養した。培地は3日間毎に新鮮な脂肪細胞誘導用培地に交換した。脂肪細胞への分化誘導確認は細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、オイルレッドO染色により行った。
FACS Ariaにより分離した各細胞と分離前の標準細胞を、骨芽細胞分化誘導用培地(DSバイオファーマ社製)にて、37℃、5%CO2の条件で14日間培養した。培地は3日間毎に新鮮な骨芽細胞分化誘導用培地に交換した。骨芽細胞への分化誘導確認は細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、アルカリフォスファターゼ染色により行った。
FACS Ariaにより分離した各細胞と分離前の標準細胞を、軟骨細胞誘導用培地(DSバイオファーマ社製)にて、37℃、5%CO2の条件で14日間培養した。培地は3日間毎に新鮮な軟骨細胞分化誘導用培地に交換した。軟骨細胞への分化誘導確認は細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、アルシアンブルー染色により行った。
FACS Ariaにより分離した各細胞と分離前の標準細胞を、平滑筋細胞分化誘導用培地(KURABO社製)にて、37℃、5%CO2の条件で14日間培養した。培地は3日間毎に新鮮な平滑筋細胞分化誘導用培地に交換した。平滑筋細胞への分化誘導確認は細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色(α―Smooth muscle actinの有無)により行った。
ITGA2、ITGA8、ITGB1、ITGB3、NGFRをもとに真皮由来細胞から分離した幹細胞の脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞への分化誘導率を評価した。具体的には、(1)〜(4)の分化誘導確認により、顕微鏡観察にて細胞の分化有無を計測し、その結果をもとに分化誘導率(総細胞数に対する分化した細胞数の割合%)を算出した。細胞の分化誘導率(%)の評価基準は、分化誘導率が10%以下を「−」、10〜20%を「+」、20〜30%を「++」、30%〜40%以上を「+++」、40%〜50%以上を「++++」、50%以上を「+++++」とした。結果を以下の表2に示す。
Claims (7)
- ITGA2、ITGA8、及びITGB3よりなる群から選ばれる1種又は2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の真皮組織から真皮幹細胞を分離する方法。
- ITGA2、ITGA8、及びITGB3よりなる群から選ばれる1種又は2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の真皮組織における真皮幹細胞を検出する方法。
- ITGA2、ITGA8、及びITGB3よりなる群から選ばれる1種又は2種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の真皮組織における真皮幹細胞の品質を評価する方法。
- 真皮幹細胞が、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、及び平滑筋細胞への分化能を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- ITGA2、ITGA8、及びITGB3よりなる群から選ばれるマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子に対して特異的親和性を有する物質を少なくとも1種含む、真皮幹細胞の検出又は分離用キット。
- 特異的親和性を有する物質が、ITGA2、ITGA8、及びITGB3よりなる群から選ばれるマーカータンパク質に対する抗体である、請求項5に記載のキット。
- 特異的親和性を有する物質が、ITGA2、ITGA8、及びITGB3よりなる群から選ばれるマーカータンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、請求項5に記載のキット。
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