JP5800712B2 - 真皮幹細胞の単離方法 - Google Patents
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Description
(1)酵素処理することで皮膚から解離した細胞を浮遊培養し、そして当該培養細胞から幹細胞マーカー陽性細胞を単離することを特徴とする、真皮幹細胞を単離する方法。
(2)前記幹細胞マーカー陽性細胞がCD34陽性細胞である、(1)に記載の方法。
(3)前記CD34陽性細胞が更にNG2陽性である、(2)に記載の方法。
(4)前記浮遊培養が、前記細胞の幹細胞マーカーの発現を回復させるのに十分な時間行われる、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
ヒト皮膚組織からの細胞分離
ヒト皮膚組織を10%ウシ胎児血清含有DMEM培地(Invitrogen)中、実体顕微鏡下で脂肪層部分をメスで除去した後、解剖用のハサミを用いて1-2 mm2の皮膚組織片に細切した。次に、得られた組織片を0.1% トリプシンと0.2%コラーゲナーゼを含む10 mlのDMEM培地に50 mlチューブ内で分散させ、恒温振とう機を用いて37℃で3時間振とうして皮膚組織を酵素的に消化した。酵素消化反応の終了後に30mlのDMEM培地を加え、ピペッティングにより細胞を分散させた。遠心分離後にDMEM培地に再懸濁してから細胞を数え、ヒト皮膚由来細胞とした。
ヒト皮膚から解離させた皮膚由来細胞を5 mlの間葉系幹細胞用培地 MesenPro (Invitrogen)に懸濁した後、ノンコートのT-25培養フラスコ(Falcon)に播種してCO2インキュベーターで一晩の培養を行った。次に、培養液を吸引除去して接着した細胞のみを残し、新しいMesenPro培地を5 mlを加えて培養を続けた。2日おきに培地を交換しながら培養を継続し、細胞密度が集密に達した時点で細胞を回収、得られた細胞をヒト真皮由来細胞とした。
ヒト皮膚由来細胞を10 mlの浮遊培養培地(DMEM/F-12(3:1) (Invitrogen)、40 ng/ml FGF2(Sigma)、20 ng/ml EGF(R&Dシステムズ)、B27(Invitrogen)、抗菌剤(和光純薬))に懸濁した後、ノンコートのT-25培養フラスコ(Falcon)に播種し、CO2インキュベーターで5日間の浮遊培養を行った。次に、ミルテニーバイオテク社のCD34 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec)を用いて細胞のソーティングを行った。操作条件はミルテニーバイオテク社の提示したプロトコールに従った。
真皮由来細胞をMesenPro培地で懸濁した後に、6 cmあるいは10 cmシャーレに低濃度で播種し、CO2インキュベーターで2週間の培養を行った。培養終了後にギムザ染色を行い、形成されたコロニーの数を計測した。ギムザは次のように行った。細胞をメタノールで固定した後に軽く風乾させ、水道水で5倍に希釈したギムザ染色液(ナカライテスク)をシャーレに注いで染色、最後に流水で適度な時間の洗浄を行った。
ヒト真皮由来細胞の継代培養は、MesenPro培地を用いて1 cm2当たり1000個の割合で播種することで行った。2日おきに培地を交換しながら培養を行い、細胞密度が集密に達した時点で凍結保存および継代培養を行った。
MesenPro培地で継代培養を行った各検体由来のヒト真皮由来細胞について、R&Dシステムズ社のHuman Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kitを用いて脂肪細胞および骨細胞への分化培養を行った。それぞれの真皮由来細胞を10%ウシ胎児血清含有のαMEM培地に懸濁し、脂肪細胞分化の場合は4万個、骨細胞分化の場合は1万8千個を、酸性コラーゲン溶液(Koken)でコートした2穴チャンバースライドに播種した。その後、10%ウシ胎児血清含有のαMEM培地で2日おきに培地を交換しながら培養を行った。
脂肪分化培養を行った真皮由来細胞を、4%パラホルムアルデヒド‐リン酸緩衝液により室温で15分間固定した。滅菌蒸留水でリンスした後、室温において60%イソプロパノールで1分間処理した。次に、室温においてオイルレッドO染色液と15分間反応させた。60%イソプロパノールで1分間処理して分別を行い、さらに滅菌蒸留水に馴染ませてから顕微鏡観察を行った。
骨分化培養を行った真皮由来細胞を、4%パラホルムアルデヒド‐リン酸緩衝液により室温で15分間固定した。滅菌蒸留水で3回洗浄した後、使用直前に調製した5%硝酸銀水溶液を加え、27Wの蛍光灯の下から約10cmにチャンバースライドを静置して全体をアルミ箔で被い、室温で1時間半の反応を行った。反応終了後に滅菌蒸留水で3回洗浄し、5%チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて2分間静置、さらに滅菌蒸留水で3回洗浄してから顕微鏡観察を行った。
ヒト皮膚組織を凍結組織包埋剤OTCコンパウンド(サクラファインテックジャパン)に包埋し、凍結切片作成装置クライオスタット(Leica)にて凍結切片を作製した。室温で風乾した凍結切片を、-20℃で15分間冷却した冷アセトンを用いて室温で15分間固定した。次に、TBSで洗浄後に無血清ブロッキング試薬(DAKO)で30分間ブロッキング処理を行い、3%BSA含有のTBSTで100倍に希釈したマウスAnti-ヒトCD34抗体(ベクトン・ディッキンソン)とウサギAnti-ヒトNG2抗体(ミリポア)と4℃で一晩反応させた。TBSTで15分間を2回、TBSで15分間を1回の計3回の洗浄を行った後、3%BSA含有のTBSTで200倍希釈したAlexa 488標識-anti-rabbit IgG とAlexa 594標識-anti-mouse IgG標識の二次抗体(Invitrogen)と1時間反応させた。反応後の切片をTBSTで15分間を2回、TBSで15分間を1回の計3回洗浄した後、Hoechist 33258で核染色を行ってから、共焦点蛍光顕微鏡 LSM5 PASCAL(Zeiss)を用いて観察した。
脂肪細胞分化あるいは骨細胞分化を行った真皮由来細胞をPBSで洗浄した後に、4%PFAで15分間固定した。TBSで洗浄後に0.1% TritonX-100含有のTBS溶液と15分間反応させることで、細胞膜の透過性を高める処理(パーミライゼーション)を行った。また、軟骨細胞分化の場合は、分化実験後の真皮由来細胞の細胞塊の凍結切片を作製して、上記と同様な操作行い染色に使用した。次に、無血清ブロッキング試薬(DAKO)で30分間ブロッキング処理を行った後、3%BSA含有のTBSTで25倍に希釈したAnti-FABP-4抗体(脂肪検出用)、Anti-Osteocalcin抗体(骨検出用)あるいはAnti-Aggrecan抗体(軟骨検出用)と4℃で一晩反応させた。TBSTで15分間を2回、TBSで15分間を1回の計3回の洗浄を行った後、3%BSA含有のTBSTで200倍希釈したAlexa 350(あるいはAlexa 448、Alexa 594)標識の二次抗体(Invitrogen)と1時間反応させた。TBSTで15分間を2回、TBSで15分間を1回の計3回の洗浄を行った後、褪色防止剤を含有するVector Sheered(Vector社)とカバーガラスで封入し、蛍光顕微鏡(Olympus)を用いて観察を行った。
Isogen(ニッポンジーン)を用い、提供されたプロトコールを用いて真皮由来細胞からtotal RNAを抽出した。精製したtotal RNAの濃度は核酸定量装置Nanodrop(Thermo scientific)により測定した。各真皮由来細胞について同量のtotal RNAを用いて、ランダムプライマー(Invitrogen)と逆転写酵素Superscript III(Invitrogen)により、Invitrogen社のマニュアルに従いcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型に反応試薬LightCycler FastStart DNA Master PLUS SYBR Green (Roche)、反応装置LightCycler(Roche)を用いて定量PCRを行った。組成条件はRocheのプロトコールに従った。また、PCRの条件は、初期変性95℃で10分、変性95℃で10秒、アニール60℃で10秒、伸長72℃で10秒とした。使用したプライマーの配列は以下の通りである。
G3PDH:
フォワードプライマー:5‘-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3‘(配列番号1)
リバースプライマー:5‘-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3‘(配列番号2)
HGF:
フォワードプライマー:5‘-GAGGGAAGGTGACTCTGAATGAG-3‘(配列番号3)
リバースプライマー:5‘-AATACCAGGACGATTTGGAATGGCAC-3‘(配列番号4)
NANOG:
フォワードプライマー:5‘-TGCTTATTCAGGACAGCCCT-3‘(配列番号5)
リバースプライマー:5‘-TCTGGTCTTCTGTTTCTTGACT -3‘(配列番号6)
SDF1a:
フォワードプライマー:5‘-TGSGCTACAGATGCCCATGC-3‘(配列番号7)
リバースプライマー:5‘-CCACTTTAGCTTCGGGTCAA-3‘(配列番号8)
脂肪層を取り除いたヒト皮膚組織を酵素で解離させ、24時間までにノンコート培養皿に接着した細胞を間葉系幹細胞培地MesenProで培養したところ、培養開始から1週間の時点において図1に示すような線維芽細胞様の細胞の出現を認めた。次に、この細胞を集密まで増やした後にコロニーアッセイ行ったところ、多数の円形状のコロニーを形成した(図2)。また、2回の継代培養を行って脂肪・骨・軟骨への細胞分化を調べたところ、図3に示す通り分化培養開始の2〜3週間の時点で、それぞれの分化マーカーを発現しており、脂肪・骨・軟骨に分化したことが確認された。以上の結果から、ヒト皮膚に間葉系幹細胞が存在することが明らかになった。
Claims (3)
- 酵素処理することで皮膚から解離した細胞を浮遊培養し、そして
当該培養細胞からCD34及びNG2二重陽性の接着性細胞を単離することを特徴とする、真皮幹細胞を単離する方法。 - 前記浮遊培養が、前記細胞の幹細胞マーカーの発現を回復させるのに十分な時間行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
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JPN6010057989; 山西治代他: '真皮間葉系幹細胞の特性及び局在イメージングに関する検討' 日皮会誌 第120巻 第3号 臨時増刊号, 20100310, p. 655, P2-2 * |
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