CN113174365A - 一种表皮干细胞的分离及培养方法和细胞悬液 - Google Patents

一种表皮干细胞的分离及培养方法和细胞悬液 Download PDF

Info

Publication number
CN113174365A
CN113174365A CN202110330595.7A CN202110330595A CN113174365A CN 113174365 A CN113174365 A CN 113174365A CN 202110330595 A CN202110330595 A CN 202110330595A CN 113174365 A CN113174365 A CN 113174365A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
solution
cell
placing
skin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110330595.7A
Other languages
English (en)
Inventor
万绵水
林创鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202110330595.7A priority Critical patent/CN113174365A/zh
Publication of CN113174365A publication Critical patent/CN113174365A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明涉及一种表皮干细胞的分离及培养方法，包括：取大于或等于预设大小的初始皮片，进行预处理得到第一中间皮片；进行清洗得到第二中间皮片；放入混合消化液中，并置于恒温摇床进行消化得到第三中间皮片，混合消化液包括胰蛋白酶和乙二胺四乙酸，其中胰蛋白酶的质量体积比为0.5％～1.25％，消化时间为45～90min；取出第三中间皮片，刮取解离细胞；收集解离细胞得到细胞悬液，进行离心，弃上清；利用完全无血清角质形成细胞培养基进行细胞重悬，得到重悬细胞培养液；将重悬细胞培养液置于用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，按照预设时间进行换液，待细胞长满培养皿的70～80％进行传代培养。通过所述方法能够兼顾分离速度和分离比率，且能够提高细胞增殖能力。

Description

一种表皮干细胞的分离及培养方法和细胞悬液
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种表皮干细胞的分离及培养方法。本发明还涉及该方法制备出的表皮干细胞悬液。
背景技术
创面是正常皮肤(组织)的完整性被破坏以及一定量正常组织丢失后形成的表面。目前临床上用来覆盖创面的材料主要有患者自体皮、异体皮或异种皮，另外还有自体表皮细胞培养的表皮。但是，上述各种来源的皮各自均存在明显不足，如自体皮存在皮源不足的问题，异体皮或异种皮存在排斥反应的问题，培养表皮存在时间长、易感染、费用昂贵、弹性差等问题。故而，基于组织工程技术构建复合型人工皮肤，已成为当代烧伤医学及组织工程学的一大热点。
人工皮肤的构建需要分离种子细胞，目前用于分离表皮细胞的较为快速的方法主要是酶消化法。酶消化法主要包括直接消化法和表皮真皮分离法，其中，直接消化法是将皮肤剪碎，然后用酶进行消化，消化完成后进行纯化步骤实现表皮细胞和真皮细胞的分离，以获得表皮细胞；表皮真皮分离法是先用消化液将表皮和真皮分离，然后对表皮进行消化，以获得表皮细胞。
两种酶消化法各有优缺点，表皮真皮分离法分离得到的表皮细胞中干细胞比率相对较高，但需过夜消化，从取材到成功分离细胞需一天的时间，消化时间长；直接消化法分离时间短，但在消化后需要进行纯化步骤，操作过程繁琐。
另外，在分离细胞后的培养过程中，需要在培养基中添加重组人表皮生长因子(recombinant human epithelial growth factor，rhEGF)，以刺激细胞增殖，但促进作用是有限的，现有技术很难进一步提高细胞增殖能力。
因此，如何提高表皮干细胞的分离和培养效率成为亟待解决的技术问题。
发明内容
基于上述现状，本发明的主要目的在于提供一种表皮干细胞的分离及培养方法，以提高表皮干细胞的分离和培养效率。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一方面提供了一种表皮干细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：S100，取大于或等于预设尺寸的初始皮片并进行预处理得到第一中间皮片，预处理包括去除初始皮片的多余皮下脂肪、筋膜及血管；S200，对第一中间皮片进行清洗得到第二中间皮片；S300，将第二中间皮片放入混合消化液中，并置于恒温摇床进行消化得到第三中间皮片，混合消化液包括胰蛋白酶和乙二胺四乙酸，其中胰蛋白酶的质量体积比为0.5％～1.25％，消化时间为45～90min；S400，取出第三中间皮片，并将第三中间皮片置于乳酸林格氏液培养皿中，第三中间皮片的表皮背离乳酸林格氏液培养皿的底部，由上至下刮取解离细胞，解离细胞包括表皮细胞和真皮细胞；S500，收集解离细胞并分散于乳酸林格氏液培养皿中，得到细胞悬液，对细胞悬液进行离心处理，弃上清，保留沉淀的解离细胞；S600，将沉淀的解离细胞置置于完全无血清角质形成细胞培养基中进行重悬，得到重悬细胞培养液；S700，将重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，按照预设时间进行换液处理，待细胞长至培养皿的70～80％进行传代培养。
优选地，在步骤S300中，混合消化液中的胰蛋白酶的质量体积比为0.75％～1.0％，所述消化时间为60～75min。进一步优选为混合消化液中的胰蛋白酶的质量体积比为1％，乙二胺四乙酸的质量体积比为0.1％，恒温摇床的温度为37℃，消化时间为1h。
优选地，在步骤S300中，每平方厘米初始皮片添加2-4ml的混合消化液。
优选地，恒温摇床的转速为80-120rpm。进一步优选为，100rpm。
优选地，在步骤S200中对第一中间皮片进行清洗包括：先用双抗溶液清洗一次，再用磷酸盐溶液清洗多次，其中，双抗溶液中，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml。
优选地，在步骤S100中，所述预设尺寸为大于8cm2。
优选地，在步骤S600中，完全无血清角质形成细胞培养基为：在基础无血清角质形成的细胞培养基中添加重组人生长因子、青霉素和链霉素。进一步优选为，细胞培养基中添加的重组人生长因子浓度为0.005μg/ml。
优选地，在步骤S700中，每平方厘米铺板添加1.0-3.0μg的人胎盘Ⅳ型胶原。进一步优选为，每平方厘米铺板添加2.0μg的人胎盘Ⅳ型胶原。
优选地，在步骤S700中，按照预设时间进行换液处理，包括：将重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿24h后，待细胞贴壁换液一次，之后每2～3天换液一次。
本发明第二方面提供了一种表皮干细胞悬液，采用本发明第一方面提供的方法制备，用于皮肤创伤愈合。
本发明提供的表皮干细胞的分离及培养方法，在消化过程中由于初始皮片带有真皮层，通过综合控制胰蛋白酶的浓度、反应时间等反应条件，使得消化后引入了适量的真皮成纤维细胞，且引入的真皮成纤维细胞的量不会与表皮干细胞形成竞争或与表皮干细胞形成的竞争较小，而该部分真皮成纤维细胞分泌的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或通过促分裂效应和非促分裂的激素样活性，特别是通过激活角膜基质成纤维细胞分裂增殖活性，使胶原纤维分泌增加、毛细血管增多和管腔扩张，即促进血管内皮细胞增殖分化，诱导毛细血管内皮细胞侵入三维胶原基质中，形成类似于毛细血管的管样结构，促进皮肤层血管新生。在此基础上，对患者创面位置的血液循环进行改善，提升肉芽生成的速度，使修复组织的强度和结构能够得到有效优化，并且碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)还能够将激活吞噬细胞的功能激活，使受损物质能够具有较强的抗感染能力，加快患者创面位置愈合的速度，为组织生长提供一个趋于稳定的符合表皮细胞生长的细胞外环境，进一步促进表皮干的细胞增殖能力。
相对于表皮真皮分离法，本发明无需过夜消化，大大缩短了消化时间；相比于直接消化法，直接对皮片进行消化，不将皮片剪碎成小块，并配合合适的消化液浓度和消化时间，避免了皮片中真皮层的过度消化，无需进行纯化步骤，简化分离过程；且通过添加合适生物蛋白的细胞重悬液，使得分散的表皮细胞可以较为理想地与创面贴附以获得良好的细胞利用率，表皮细胞进一步依靠部分重悬液或创面分泌的体液中的各种营养物质及生物活性蛋白因子进行增殖运动及细胞分化，提高创面修复效果。
本发明的其他有益效果，将在具体实施方式中通过具体技术特征和技术方案的介绍来阐述，本领域技术人员通过这些技术特征和技术方案的介绍，应能理解所述技术特征和技术方案带来的有益技术效果。
附图说明
以下将参照附图对根据本发明提供的表皮干细胞的分离及培养方法的优选实施方式进行描述。图中：
图1为根据本发明提供的一种表皮干细胞的分离及培养方法的流程图。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
在本文中，提及的PBS缓冲液或者PBS溶液或者PBS等，如无特别说明，均是指磷酸盐缓冲液。
在本文中，提及的双抗溶液或双抗，如无特别说明，均是指含100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的混合液。
在本文中，提及的EDTA为乙二胺四乙酸。
在本文中，提及的消化液浓度，如无特别说明，均是指质量体积比。
由于现有方法均是追求细胞悬液中表皮干细胞纯度的最大化，所采取的方法较为繁琐，基于此，本发明提供了一种表皮干细胞的分离及培养方法，如图1所示，其包括步骤：
S100，取大于或等于预设尺寸的初始皮片并进行预处理得到第一中间皮片，预处理包括去除初始皮片的多余皮下脂肪、筋膜及血管；
S200，对第一中间皮片进行清洗得到第二中间皮片；
S300，将第二中间皮片放入混合消化液中，并置于恒温摇床进行消化得到第三中间皮片，混合消化液包括胰蛋白酶和乙二胺四乙酸，其中胰蛋白酶的质量体积比为0.5％～1.25％，消化时间为45～90min；
S400，取出第三中间皮片，将第三中间皮片置于乳酸林格氏液培养皿中，使第三中间皮片的表皮背离乳酸林格氏液培养皿的底部，由上至下刮取解离细胞，解离细胞包括表皮细胞和真皮细胞；
S500，收集解离细胞并分散于乳酸林格氏液培养皿中，得到细胞悬液，对细胞悬液进行离心处理，弃上清，保留沉淀的解离细胞；
S600，将沉淀的解离细胞置于完全无血清角质形成细胞培养基中进行重悬，得到重悬细胞培养液；
S700，将重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，按照预设时间进行换液处理，待细胞长至培养皿的70～80％进行传代培养。
具体地，在步骤S100中，所取初始皮片的具体尺寸由预设尺寸和患者需要治疗创面的大小决定。例如可以根据RECELL产品的技术文件介绍，一般1cm2的皮片可以治疗80cm2的患处，也可以根据其他资料按照较为保守的1cm2皮片对应治疗20-40cm2创面，确定初始皮片的具体尺寸。
将初始皮片取下后可以临时放置于装有PBS溶液的EP管中，保持皮片湿润、避免干燥。在预处理过程中，将皮片以表皮面朝下，皮下组织面朝上的状态置于预先加有生理盐水或PBS溶液的培养皿中，利用手术镊固定皮片，用手术刀将多余的皮下脂肪、筋膜及血管等刮除，得到仅由真皮和表皮组成的第一中间皮片，以避免皮下脂肪等对后续消化的影响。
在步骤S200中，清洗过程可以先用双抗溶液清洗第一中间皮片，杀死皮片上的细菌，避免造成细胞污染；再使用PBS溶液将皮片上的双抗溶液洗去，避免双抗溶液对皮片的过度刺激，完整清洗后得到待消化的第二中间皮片。
在步骤S300中，由于本方案所选的胰蛋白酶的酶活性相对较高，对细胞的损害相对较大，配合摇床进行动态消化，建立适宜的消化体系，从而实现既能缩短消化时间，又能尽量避免对细胞损伤的效果。
步骤S300是直接对第二中间皮片进行消化，相对于现有技术中将皮片剪碎的直接消化法，本方案中皮片无需剪碎，皮片面积较大。本方案无需剪碎的理由在于，将皮片剪成小块后真皮更容易被消化，由此会导致引入大量的真皮细胞，而大量的真皮细胞会与表皮细胞形成竞争关系，争夺营养物质。而本方案由于皮片面积较大，真皮的消化相对较难，通过设置合理的胰蛋白酶浓度(即质量体积比)和消化时间，能够将引入的真皮细胞量控制在较为合理的范围，使引入的真皮细胞不会与表皮干细胞形成竞争或与表皮细胞形成很小的竞争。
在步骤S400中，可以利用手术镊固定第三中间皮片，再通过另一手术镊由上至下轻轻将解离的细胞刮下，部分肉眼可见成块细胞团，可以用镊子将其进一步分散在乳酸林格氏液培养皿中。
在步骤S500中，培养皿中的乳酸林格氏液能够稀释混合消化液中的胰蛋白酶，以达到终止消化的目的，避免胰蛋白酶对细胞的进一步损伤。
在步骤S500中，对细胞悬液进行离心处理的离心转速为800～1200rpm，离心时间为8～15min。进一步选优为离心转1000rpm，离心时间10min。
在步骤S600得到重悬细胞培养液后，可以通过台盼蓝进行染色，死细胞会被染上颜色，而活细胞不会被染色，再通过细胞计数板计算细胞活率及细胞密度。
在步骤S700中，人胎盘IV型胶原能够提高表皮干细胞贴壁的效率和克隆形成能力。
以上步骤S100～S700均为无菌操作。
众所周知的，真皮细胞中的某些种类的细胞会分泌一些促进细胞增殖的生长因子，但是由于真皮细胞在细胞培养过程中会与表皮细胞形成竞争，真皮细胞的量与其分泌的生长因子量之间并非线性关系，也无法形成规律，真皮细胞的量与促进细胞增殖能力之间也难以形成规律，因此，现有技术的两种酶消化法中，直接消化法在分离后会通过纯化步骤将表皮干细胞筛选出来；表皮真皮分离法在进行表皮细胞消化前先将真皮分离开，均是为了获得较为纯化的表皮干细胞，即追求细胞培养液中表皮干细胞以外的细胞含量的最小化。
在分离得到细胞培养液后，通过添加重组生长因子促进细胞增殖，但通过添加重组生长因子的方式对细胞增殖的促进能力有限，使细胞增殖能力难以再进一步提升。
而本发明在消化过程中由于皮片带有真皮层，通过综合控制胰蛋白酶的浓度和反应时间条件等反应条件，使得消化后引入了适量的真皮成纤维细胞，且引入的真皮成纤维细胞量较为合适，不会与表皮干细胞形成竞争或与表皮干细胞形成的竞争较小，该部分真皮成纤维细胞分泌的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)或通过促分裂效应和非促分裂的激素样活性，特别是通过激活角膜基质成纤维细胞分裂增殖活性，使胶原纤维分泌增加、毛细血管增多和管腔扩张，即促进血管内皮细胞增殖分化，诱导毛细血管内皮细胞侵入三维胶原基质中，形成类似于毛细血管的管样结构，促进皮肤层血管新生。在此基础上，对患者创面位置的血液循环进行改善，提升肉芽生成的速度，使修复组织的强度和结构能够得到有效优化，同时碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)还能够将激活吞噬细胞的功能激活，使受损组织能够具有较强的抗感染能力，加快患者创面位置愈合的速度。为组织生长提供一个趋于稳定的符合表皮细胞生长的细胞外环境，进一步促进表皮干的细胞增殖能力。
并且，相比于现有技术的表皮真皮分离法，本发明无需过夜消化，大大缩短了消化时间；相比于现有技术的直接消化法，直接对皮片进行消化，不将皮片剪碎成小块，配合合适的消化液浓度和消化时间，避免了皮片中真皮层的过度消化，无需进行纯化步骤，简化了分离过程；且通过添加合适生物蛋白的细胞重悬液，使得分散的表皮细胞可以较为理想地与创面贴附以获得良好的细胞利用率，表皮细胞进一步依靠部分重悬液或创面分泌的体液中的各种营养物质及生物活性蛋白因子进行增殖运动及细胞分化，提高创面修复效果。
作为一个优选的实施方式，在步骤S300中，混合消化液中的胰蛋白酶的质量体积比为0.75％～1.0％，消化时间为60～75min。
通过合理设置胰蛋白酶的浓度和消化时间，能够降低胰蛋白酶对细胞的损伤，缩短消化时间，保证细胞活率，提高分离效率。
作为一个优选的实施方式，在步骤S300中，每平方厘米初始皮片添加2-4ml混合消化液。
由于整个消化过程是在摇床中进行，因此消化液的量可以适当降低，每平方厘米初始皮片添加2-4ml混合消化液足以保证消化效果，降低了消化过程的成本消耗。
作为一个优选的实施方式，在步骤S300中，恒温摇床的转速为80-120rpm。
摇床的转速会影响氧气传递效率(OTR)，一般来说转速越快，氧气传递效率越高，但转速高又会导致剪切力大，可能导致细胞损伤。80-120rpm既能够保证表皮细胞需氧量的要求，同时也能够避免剪切力对细胞的损伤。
作为一个优选的实施方式，在步骤S200中对所述第一中间皮片进行清洗包括：先用双抗溶液清洗一次，再用磷酸盐溶液清洗多次，其中，双抗溶液中，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml。
先用双抗溶液清洗第一中间皮片，能够杀死皮片上的细菌，避免造成细胞污染；再使用PBS溶液将皮片上的双抗溶液洗去，能够避免双抗溶液对皮片的过度刺激。
作为一个优选的实施方式，在步骤S100中，预设尺寸为大于8cm2。
合适的皮片面积能够有效避免真皮细胞的过度消化，将引入真皮细胞的量控制在合理范围，以实现不与表皮细胞竞争或形成较小的竞争关系，保证表皮细胞活所需营养物质和细胞活率。
作为一个优选的实施方式，在步骤S600中，完全无血清角质形成细胞培养基为：在基础无血清角质形成的细胞培养基中添加重组人生长因子、青霉素和链霉素。
通过添加重组人生长因子、青霉素和链霉素，不仅有利于保持表皮干细胞的活性，还有利于促进表皮细胞贴壁，提高吸附能力。
作为一个优选的实施方式，在步骤S700中，每平方厘米铺板添加1.0-3.0μg的人胎盘Ⅳ型胶原。
人胎盘Ⅳ型胶原有利于提高表皮干细胞贴壁效率和提高表皮干细胞的克隆形成能力。
作为一个优选的实施方式，按照预设时间进行换液处理，包括：将重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿24h后，待细胞贴壁换液一次，之后每2～3天换液一次。
24h换液能够洗去未贴壁的死亡细胞，之后表皮干细胞能够稳定生长，每2-3天进行换液去除代谢产物，补充营养物质，防止细胞密度过大影响繁殖。
本发明还提供了一种表皮干细胞悬液，通过上述实施方式提供的制备方法制得，用于皮肤创伤愈合。
以下结合具体实施例对发明作进一步详细的说明。
实施例一：
(1)取初始皮片并进行预处理：在无菌条件下，取患者大约8cm2非创面的皮片，将皮片的表皮面朝下，皮下组织面朝上置于预先加有生理盐水或PBS溶液的培养皿中，利用手术镊固定，手术刀将多余的皮下脂肪、筋膜及血管刮除已避免其对后续消化的影响，从而得到预处理后的第一中间皮片。
(2)清洗：将预处理后的皮片先用双抗(100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素)清洗1遍，再用PBS清洗3遍，得到清洗后的第二中间皮片。
(3)消化：将清洗后的皮片放入含质量体积比为0.5％的胰蛋白酶和质量体积百分比为0.1％的乙二胺四乙酸(EDTA)的混合消化液中，并置于恒温摇床中进行消化。其中，每平方厘米的皮片添加2ml的混合消化液，恒温摇床设置温度为37℃，摇床转速80rpm，消化时间90min。消化后得到第三中间皮片。
(4)刮取解离细胞：取出消化后的第三中间皮片，表皮面朝上置于预先加有乳酸林格氏液的培养皿中，利用手术镊固定，另一只手用手术镊轻轻由上至下将已经解离的细胞刮下，得到解离的细胞，其中包含了真皮细胞和表皮细胞。针对部分肉眼可见成块细胞团可以用镊子将其进一步分散。
(5)离心处理：收集刮下来的解离细胞，置于乳酸林格氏液中得到细胞悬液，将细胞悬液置于离心机中，设置离心转速900rpm，离心时间13min，离心后弃上清，保留沉淀的解离细胞。
(6)细胞重悬：利用完全无血清角质形成细胞培养基将沉淀的解离细胞重悬。台盼蓝染色，细胞计数板计算细胞活率及细胞密度。
(7)培养：将重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，24h后待细胞贴壁换液一次，之后每2～3天进行换液处理，待细胞长满整个培养皿的70～80％进行传代培养。其中，每平方厘米铺板添加1.0μg的人胎盘Ⅳ型胶原。
实施例二：
(1)取初始皮片并进行预处理：在无菌条件下，取患者大约9cm2非创面的皮片，将皮片的表皮面朝下，皮下组织面朝上置于预先加有生理盐水或PBS溶液的培养皿中，利用手术镊固定，手术刀将多余的皮下脂肪、筋膜及血管刮除已避免其对后续消化的影响，从而得到预处理后的第一中间皮片。
(2)清洗：将预处理后的皮片先用双抗清洗1遍，再用PBS清洗3遍，得到清洗后的第二中间皮片。
(3)消化：将清洗后的皮片放入含质量体积比为0.75％的胰蛋白酶和质量体积百分比为0.1％的乙二胺四乙酸(EDTA)的混合消化液中，并置于恒温摇床中进行消化。其中，每平方厘米的皮片添加2ml的混合消化液，恒温摇床设置温度为37℃，摇床转速80rpm，消化时间75min。消化后得到第三中间皮片。
(4)刮取解离细胞：取出消化后的第三中间皮片，表皮面朝上置于预先加有乳酸林格氏液的培养皿中，利用手术镊固定，另一只手用手术镊轻轻由上至下将解离的细胞刮下，得到解离的细胞，其中包含了真皮细胞和表皮细胞。针对部分肉眼可见成块细胞团可以用镊子将其进一步分散。
(5)离心处理：收集刮下来的解离细胞，置于乳酸林格氏液中得到细胞悬液，将细胞悬液置于离心机中，设置离心转速1200rpm，离心时间8min，离心后弃上清，保留沉淀的解离细胞。
(6)细胞重悬：利用完全无血清角质形成细胞培养基将沉淀的解离细胞重悬。台盼蓝染色，细胞计数板计算细胞活率及细胞密度。
(7)培养：将重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，24h后待细胞贴壁换液一次，之后每2～3天进行换液处理，待细胞长满整个培养皿的70～80％进行传代培养。其中，每平方厘米铺板添加1.5μg的人胎盘Ⅳ型胶原。
实施例三：
(1)取初始皮片并进行预处理：在无菌条件下，取患者大约12cm2非创面的皮片，将皮片的表皮面朝下，皮下组织面朝上置于预先加有生理盐水或PBS溶液的培养皿中，利用手术镊固定，手术刀将多余的皮下脂肪、筋膜及血管刮除已避免其对后续消化的影响，从而得到预处理后的第一中间皮片。
(2)清洗：将预处理后的皮片先用双抗清洗1遍，再用PBS清洗3遍，得到清洗后的第二中间皮片。
(3)消化：将清洗后的皮片放入含质量体积比为1.25％的胰蛋白酶和质量体积百分比为0.1％的EDTA的混合消化液中，并置于恒温摇床中进行消化。其中，每平方厘米的皮片添加4ml的消化液，恒温摇床设置温度为37℃，摇床转速120rpm，消化时间45min。
(4)刮取解离细胞：取出消化后的皮片，表皮面朝上置于预先加有乳酸林格氏液的培养皿中，利用手术镊固定，另一只手用手术镊轻轻由上至下将已经解离的细胞刮下，由于皮片中包含真皮层，解离的细胞包含了真皮细胞和表皮细胞，针对部分肉眼可见成块细胞团可以用镊子将其进一步分散；
(5)离心处理：收集刮下来的解离细胞，置于乳酸林格氏液中得到细胞悬液，将细胞悬液置于离心机中，设置离心转速800rpm，离心时间15min，离心后弃上清，保留沉淀的解离细胞。
(6)细胞重悬：利用完全无血清角质形成细胞培养基将沉淀的解离细胞重悬。台盼蓝染色，细胞计数板计算细胞活率及细胞密度。
(7)培养：将重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，24h后待细胞贴壁换液一次，之后每2～3天进行换液处理，待细胞长满整个培养皿的70～80％进行传代培养。其中，每平方厘米铺板需要3.0μg的人胎盘Ⅳ型胶原。
实施例四：
(1)取皮片并进行预处理：在无菌条件下，取患者大约9cm2非创面的皮片，将皮片的表皮面朝下，皮下组织面朝上置于预先加有生理盐水或PBS溶液的培养皿中，利用手术镊固定，手术刀将多余的皮下脂肪、筋膜及血管刮除已避免其对后续消化的影响，从而得到预处理后的第一中间皮片。
(2)清洗：将预处理后的皮片先用双抗清洗1遍，再用PBS清洗3遍，得到清洗后的第二中间皮片。
(3)消化：将清洗后的皮片放入含质量体积比为1.0％的胰蛋白酶和质量体积百分比为0.1％的EDTA的混合消化液中，并置于恒温摇床中进行消化。其中，每平方厘米的皮片添加3ml的消化液，恒温摇床设置温度为37℃，摇床转速100rpm，消化时间60min。
(4)刮取解离细胞：取出消化后的皮片，表皮面朝上置于预先加有乳酸林格氏液的培养皿中，利用手术镊固定，另一只手用手术镊轻轻由上至下将已经解离的细胞刮下，由于皮片中包含真皮层，解离的细胞包含了真皮细胞和表皮细胞，针对部分肉眼可见成块细胞团可以用镊子将其进一步分散；
(5)离心处理：收集刮下来的解离细胞，置于乳酸林格氏液中得到细胞悬液，将细胞悬液置于离心机中，设置离心转速1000rpm，离心时间10min，离心后弃上清，保留沉淀的解离细胞。
(6)细胞重悬：利用完全无血清角质形成细胞培养基将沉淀的解离细胞重悬。台盼蓝染色，细胞计数板计算细胞活率及细胞密度。
(7)培养：将重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，24h后待细胞贴壁换液一次，之后每2～3天进行换液处理，待细胞长满整个培养皿的70～80％进行传代培养。其中，每平方厘米铺板需要2.0μg的人胎盘Ⅳ型胶原。
通过以上四个实施例，可以得到四种重悬细胞培养液，四种重悬细胞培养液的对比结果如下：
表1
Figure BDA0002994092040000121
以上对比结果表明，当胰蛋白酶浓度较低时，应配合较长的消化时间，以保证细胞解离；当胰蛋白酶较高时，应配合较短的消化时间，以减小对细胞的损伤；同时应将皮片面积设置为大于8cm2，以控制真皮细胞的引入量，减少与表皮干细胞的竞争。上述实施例均保证较高的细胞活率和细胞传代数。
对比例一至七，采用与本发明前述实施例四相同的操作步骤，区别仅在于混合消化液中的胰蛋白酶的浓度和消化时间的差异，对比例一至七中的具体胰蛋白酶浓度及消化时间，如表2所示：
表2
Figure BDA0002994092040000122
对比例八、九，采用与本发明前述实施例四相同的胰蛋白酶的浓度和消化时间，差异在于操作步骤分别按照现有技术中的直接消化法和真皮表皮分离法，对比例八、九具体操作如下：
对比例八
(1)取断层的初始皮片；
(2)清洗皮片，并制成若干块皮片，每块皮片的粒径在1-5mm；
(3)每平方厘米断层皮片添加3ml的混合消化液，胰蛋白酶在消化酶中的质量体积比为1.0％，EDTA在消化酶中的质量体积比为0.1％；进行动态消化，摇床转速为100rpm，消化时间60min；
(4)采用PBS冲刷细胞，将得到的溶液转移到目数为40目的过滤容器中进行过滤，去除表皮残渣后，在过滤所得下层细胞液内添加抑制剂，得细胞悬液；
(5)将细胞悬液置于离心机中，设置离心转速1000rpm，离心时间10min，离心后弃上清，保留沉淀的解离细胞；
(6)利用完全无血清角质形成细胞培养基将沉淀的解离细胞重悬。台盼蓝染色，细胞计数板计算细胞活率及细胞密度。
(7)将重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，24h后待细胞贴壁换液一次，之后每2～3天进行换液处理，待细胞长满整个培养皿的70～80％进行传代培养。其中，每平方厘米铺板添加2.0μg的人胎盘Ⅳ型胶原。
对比例九
(1)取1cm2的初始皮片；
(2)清洗皮片；
(3)加入质量体积比为1.0％的胰蛋白酶，质量体积比为0.1％的EDTA的混合消化液中进行消化，消化60min；
(4)加入乳酸林格氏液终止消化，用镊子分离表皮和真皮，并用无菌手术刀从表皮基底层轻轻刮取表皮基底细胞；
(5)收集表皮基底细胞，然后用乳酸林格氏液进行稀释，得到表皮基底细胞细胞悬液；
(6)用100μm细胞滤网对表皮基底细胞细胞悬液过滤，得到纯化后的表皮基底细胞悬液；
(7)离心处理，离心转速为1000rpm，离心时间10min，弃上清，保留沉淀的解离细胞；
(8)利用完全无血清角质形成细胞培养基将沉淀的解离细胞重悬。台盼蓝染色，细胞计数板计算细胞活率及细胞密度；
(9)将重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，24h后待细胞贴壁换液一次，之后每2～3天进行换液处理，待细胞长满整个培养皿的70～80％进行传代培养。其中，每平方厘米铺板添加2.0μg的人胎盘Ⅳ型胶原。
分析通过前述对比例得到重悬细胞培养液，整理对比结果如下表：
表3
细胞活率(％) 细胞传代数
对比例一 0.6253 3.92
对比例二 0.5628 4.26
对比例三 0.5475 4.54
对比例四 0.6105 3.76
对比例五 0.4218 4.15
对比例六 0.6524 4.42
对比例七 0.4964 4.35
对比例八 0.5298 5.11
对比例九 0.6132 4.78
根据表3可知，对比例一至七中混合消化液中的胰蛋白酶的浓度和消化时间与分离得到的细胞数量非线性关系也无法形成规律，真皮细胞的量与促进细胞增殖能力之间也难以形成规律。只能通过合理控制浓度和时间，将真皮细胞的引入量控制在合理范围内，才能实现细胞增殖速度的进一步提升。
根据对比例八和九与本发明实施例的结果，可知相比于现有分离方法获取纯度较高的表皮干细胞悬液，外加重组人生长因子，本发明通过综合控制胰蛋白酶的浓度和反应时间条件等反应条件，使得消化后引入了适量的真皮成纤维细胞，且引入的真皮成纤维细胞量较为合适，不会与表皮干细胞形成竞争或与表皮干细胞形成的竞争较小，该部分真皮成纤维细胞分泌的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)或通过促分裂效应和非促分裂的激素样活性，特别是通过激活角膜基质成纤维细胞分裂增殖活性，使胶原纤维分泌增加、毛细血管增多和管腔扩张，即促进血管内皮细胞增殖分化，诱导毛细血管内皮细胞侵入三维胶原基质中，形成类似于毛细血管的管样结构，促进皮肤层血管新生。在此基础上，对患者创面位置的血液循环进行改善，提升肉芽生成的速度，使修复组织的强度和结构能够得到有效优化，同时碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)还能够将激活吞噬细胞的功能激活，使受损组织能够具有较强的抗感染能力，加快患者创面位置愈合的速度。为组织生长提供一个趋于稳定的符合表皮细胞生长的细胞外环境，进一步促进表皮干的细胞增殖能力。
并且，本发明无需过夜消化，大大缩短了消化时间；无需将皮片剪碎成小块，避免了皮片中真皮层的过度消化，无需进行纯化步骤，简化了分离过程。
需要说明的是，本发明中采用步骤编号(字母或数字编号)来指代某些具体的方法步骤，仅仅是出于描述方便和简洁的目的，而绝不是用字母或数字来限制这些方法步骤的顺序。本领域的技术人员能够明了，相关方法步骤的顺序，应由技术本身决定，不应因步骤编号的存在而被不适当地限制。
本领域的技术人员能够理解的是，在不冲突的前提下，上述各优选方案可以自由地组合、叠加。
应当理解，上述的实施方式仅是示例性的，而非限制性的，在不偏离本发明的基本原理的情况下，本领域的技术人员可以针对上述细节做出的各种明显的或等同的修改或替换，都将包含于本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种表皮干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S100，取大于或等于预设尺寸的初始皮片并进行预处理得到第一中间皮片，所述预处理包括去除所述初始皮片的多余皮下脂肪、筋膜及血管；
S200，对所述第一中间皮片进行清洗得到第二中间皮片；
S300，将所述第二中间皮片放入混合消化液中，并置于恒温摇床进行消化得到第三中间皮片，所述混合消化液包括胰蛋白酶和乙二胺四乙酸，其中胰蛋白酶的质量体积比为0.5％～1.25％，消化时间为45～90min；
S400，取出所述第三中间皮片，将所述第三中间皮片置于乳酸林格氏液培养皿中，使所述第三中间皮片的表皮背离所述乳酸林格氏液培养皿的底部，由上至下刮取解离细胞，所述解离细胞包括表皮细胞和真皮细胞；
S500，收集所述解离细胞并分散于所述乳酸林格氏液培养皿中，得到细胞悬液，对所述细胞悬液进行离心处理，弃上清，保留沉淀的解离细胞；
S600，将所述沉淀的解离细胞置于完全无血清角质形成细胞培养基中进行重悬，得到重悬细胞培养液；
S700，将所述重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，按照预设时间进行换液处理，待细胞长至所述培养皿的70～80％进行传代培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S300中，所述混合消化液中的胰蛋白酶的质量体积比为0.75％～1.0％，所述消化时间为60～75min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤S300中，每平方厘米初始皮片添加2-4ml所述混合消化液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤S300中，所述恒温摇床的转速为80-120rpm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S200中所述对所述第一中间皮片进行清洗包括：先用双抗溶液清洗一次，再用磷酸盐溶液清洗多次，其中，所述双抗溶液中，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S100中，所述预设尺寸为大于8cm2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S600中，所述完全无血清角质形成细胞培养基为：在基础无血清角质形成的细胞培养基中添加重组人生长因子、青霉素和链霉素。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S700中，每平方厘米铺板添加1.0-3.0μg的所述人胎盘Ⅳ型胶原。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤S700中，按照预设时间进行换液处理，包括：将所述重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿24h后，待细胞贴壁换液一次，之后每2～3天换液一次。
10.一种表皮干细胞悬液，其特征在于，采用如权利要求1～9任一所述的方法制备，用于皮肤创伤愈合。
CN202110330595.7A 2021-03-26 2021-03-26 一种表皮干细胞的分离及培养方法和细胞悬液 Pending CN113174365A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110330595.7A CN113174365A (zh) 2021-03-26 2021-03-26 一种表皮干细胞的分离及培养方法和细胞悬液

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110330595.7A CN113174365A (zh) 2021-03-26 2021-03-26 一种表皮干细胞的分离及培养方法和细胞悬液

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113174365A true CN113174365A (zh) 2021-07-27

Family

ID=76922410

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110330595.7A Pending CN113174365A (zh) 2021-03-26 2021-03-26 一种表皮干细胞的分离及培养方法和细胞悬液

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113174365A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101152580A (zh) * 2007-09-13 2008-04-02 陆洪光 用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法
KR20080071656A (ko) * 2007-01-31 2008-08-05 주식회사 에버브릿지 배양된 모낭구성세포를 이용한 생인공피부 제조방법
CN102498205A (zh) * 2009-09-15 2012-06-13 株式会社资生堂 真皮干细胞的分离方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080071656A (ko) * 2007-01-31 2008-08-05 주식회사 에버브릿지 배양된 모낭구성세포를 이용한 생인공피부 제조방법
CN101152580A (zh) * 2007-09-13 2008-04-02 陆洪光 用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法
CN102498205A (zh) * 2009-09-15 2012-06-13 株式会社资生堂 真皮干细胞的分离方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨斌 等: "表皮干细胞的快速高效分离", 组织工程与重建外科杂志, vol. 1, no. 5, pages 268 - 271 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108525021B (zh) 基于3d打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤及其制备方法
Saxena et al. Vascularized three‐dimensional skeletal muscle tissue‐engineering
CN105013013B (zh) 一种皮肤溃疡修复基质的制备方法
US20130034524A1 (en) Non-Enzymatic Method for Harvesting Adipose-Derived Stromal Cells and Adipose-Derived Stem Cells from Fat and Lipo-Aspirate
CN1571835A (zh) 在创伤治疗中可用作生物活性物质的角质细胞
CN104324053B (zh) 一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液
CN110812318B (zh) 用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法
CN105820998A (zh) 临床回输级细胞治疗用人脂肪干细胞ADSCs分离提取培养方法
CN109876010A (zh) 一种用于治疗烧烫伤术后修复皮下组织的人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备方法
CN108721606A (zh) 一种基于干细胞生长因子的妊娠纹修复产品及其制备方法
CN105477626A (zh) 混合干细胞制剂及其制备方法
CN105688287A (zh) 用于治疗皮肤创伤的羊膜贴片及其制备方法
CN107254431B (zh) 一种新型组织工程皮肤制备方法
CN104971382B (zh) 一种用无血清和牛垂体提取物培养液构建的创口贴式人工活性组织及其构建方法
CN113174365A (zh) 一种表皮干细胞的分离及培养方法和细胞悬液
CN115418341B (zh) 成纤维细胞向毛乳头细胞转分化的方法及其应用
EP3350312B1 (en) A method of culturing cells
CN105963795A (zh) 一种基于胶原制备组织工程表皮的方法
CN104561101B (zh) MicroRNA 221‑3p在制备表皮细胞中的方法及应用
CN109771697B (zh) 一种真皮成纤维细胞皮片及其构建方法和应用
KR100701297B1 (ko) 태반추출물을 이용한 섬유아세포의 배양방법 및 이를이용한 피부재생용 조성물
CN110129264B (zh) 表皮细胞培养基和基于同一块组织制备成纤维细胞和表皮细胞的方法及应用
CN111714698A (zh) 含有细胞的生物凝胶组合物、其制备方法及应用
KR100725133B1 (ko) 자가혈청과 태반추출물을 이용한 섬유아세포의 배양방법 및이를 이용한 피부재생용 조성물
CN110157660A (zh) 诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基和方法、成纤维细胞及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination