CN104561101B

CN104561101B - MicroRNA 221‑3p在制备表皮细胞中的方法及应用

Info

Publication number: CN104561101B
Application number: CN201410822103.6A
Authority: CN
Inventors: 刘厚奇; 仵敏娟; 徐辰; 夏照帆; 王越; 徐莎; 熊俊
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2017-09-12
Anticipated expiration: 2034-12-22
Also published as: CN104561101A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及—种MicroRNA221‑3p在促表皮细胞增殖的新用途。本发明提供了MicroRNA221‑3p在制备促进表皮细胞增殖的试剂中的应用，所述试剂包括但不限于：1)MicroRNA221‑3p；2)含有MicroRNA 221‑3p编码基因的重组载体；3)含有MicroRNA 221‑3p编码基因的重组病毒；4)含有MicroRNA 221‑3p编码基因的重组病毒载体。本发明实验证明，MicroRNA221‑3p可以抑制PTEN的表达，显著提高表皮细胞的增殖速度，且表皮细胞的特性并未丢失。此说明，MicroRNA221‑3p与表皮细胞增殖有关。本发明为表皮细胞快速增殖以及更快获得组织工程皮肤的种子细胞提供了新的思路和方式。

Description

MicroRNA 221-3p在制备表皮细胞中的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及—种MicroRNA221-3p在促表皮细胞增殖中的新用途，也即一种促进表皮细胞增殖的方法，及其将该方法应用于制备皮肤移植物。

背景技术

皮肤有重要的保障作用，因其位于体表，所以，经常发生皮肤的各种创伤。皮肤创面修复是烧创伤治疗的重要组成部分，继各种皮瓣和微粒皮用于移植手术后，近年来又兴起了表皮细胞培养和体外构建皮肤组织的组织工程技术，并已成为医学生物工程领域的研究热点(Rhett JM,Ghatnekar GS,Palatinus JA,O'Quinn M,Yost MJ,Gourdie RG.Noveltherapies for scar reduction and regenerative healing of skinwounds.TrendsBiotechnol.2008Apr；26(4):173-80)表皮细胞分离和培养技术可为大面积深度烧伤创面的治疗提供充足的皮肤组织细胞。

但是，表皮细胞体外培养条件苛刻，增殖缓慢，限制了其在临床治疗中的应用。体外培养表皮细胞以游离方式或组织工程皮肤的方式应用于皮肤创面，是以表皮细胞修复皮肤创面的一种新方法。

MicroRNA(miRNA)是由21-25个核苷酸构成的分子，MicroRNA通过抑制其靶分子mRNA的翻译或者促进其降解而起到负性基因表达调控作用，随着近年研究的不断深入，人们发现微小RNA分子在细胞功能及器官发育中有着广泛的作用，如MicroRNA参与了胚胎的早期发育过程。在皮肤的发育过程中，有报道称miR-205可调控皮肤干细胞增殖(Wang D,Zhang Z,O'Loughlin E,Wang L,Fan X,Lai EC,Yi R.MicroRNA-205 controls neonatalexpansion of skin stem cells by modulating the PI(3)K pathway.Nat CellBiol.2013 Oct；15(10):1153-63)，miR-21是一种可调控表皮细胞中BMP的功能(Ahmed MI,Mardaryev AN,Lewis CJ,Sharov AA,Botchkareva NV.MicroRNA-21 is an importantdownstream component of BMP signalling in epidermal keratinocytes.J CellSci.2011 Oct 15；124(Pt 20):3399-404.)，进而调控表皮细胞的生长和增殖，MicroRNA-221可抵消或抑制细胞周期抑制剂p27的作用，从而促进肥大细胞增殖(Mayoral RJ,PipkinME,Pachkov M,van Nimwegen E,Rao A,Monticelli S.MicroRNA-221-222 regulate thecell cycle in mast cells.J Immunol.2009 Jan 1；182(1):433-45)。另有研究发现MicroRNA-221-3p和肝细胞的增殖密切相关(Yuan Q,Loya K,Rani B,S,Balakrishnan A,Lamle J,Cathomen T,Vogel A,Manns MP,Ott M,Cantz T,SharmaAD.MicroRNA-221 overexpression accelerates hepatocyte proliferationduring liver regeneration.Hepatology.2013 Jan；57(1):299-310)。

MicroRNA与细胞功能的研究越来越多，但目前尚无MicroRNA-221-3p过表达可促进表皮细胞增殖的研究及应用的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供MicroRNA221-3p的新用途，本发明的另一目的在于提供一种促进表皮细胞增殖的方法，本发明的第三目的在于提供MicroRNA221-3p或者利用MicroRNA221-3p促进表皮细胞增殖的方法在制备组织工程皮肤和皮肤移植物中的应用。

本发明为了克服表皮细胞体外培养(制备)中增殖缓慢的缺陷，提高表皮细胞在创面修复中的临床应用效果，提供了借助MicroRNA—具体为MicroRNA221-3p来实现表皮细胞快速增殖的新方法。

本发明所述的MicroRNA221-3p，Accession number：MIMAT0000278，具体序列如下：

agcuacauugucugcuggguuuc(SEQ ID NO:1)。

本发明的第一方面，提供了MicroRNA221-3p的新用途，即MicroRNA221-3p在制备促进表皮细胞增殖的试剂中的应用。

所述的试剂，为提高MicroRNA221-3p表达量的试剂，包括但不限于以下任一：

A)MicroRNA221-3p；

B)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组载体；

C)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒；

D)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒载体。

所述的MicroRNA221-3p，经查找人类基因组数据库，由位于X染色体的基因簇编码，其基因序列定位于Xp11.3。其序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的MicroRNA 221-3p前体(MI0000298)，其序列如下：

UGAACAUCCAGGUCUGGGGCAUGAACCUGGCAUACAAUGUAGAUUUCUGUGUUCGUUAGGCAACAGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUCAGGCUACCUGGAAACAUGUUCUC(SEQ ID NO:2)。

所述的促进表皮细胞增殖，是指体外培养的条件下，通过质粒转染或慢病毒感染的方式上调表皮细胞中的MicroRNA 221-3p，和阴性对照相比，MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞增殖速度加快。

本发明的第二方面，提供一种促进表皮细胞增殖的方法，该方法包括：构建一种MicroRNA 221-3p高表达的表皮细胞。

较佳地，该方法包括Ⅰ)和Ⅲ)、或者Ⅱ)和Ⅲ)：

Ⅰ)人工合成MicroRNA221-3p的成熟体，经脂质体转染，获得MicroRNA 221-3py高表达的的表皮细胞；

Ⅱ)构建含有MicroRNA221-3p的编码基因的重组载体、构建含有MicroRNA221-3p的编码基因的重组病毒，或构建含有MicroRNA221-3p的编码基因的重组病毒载体(简称为GFP-MIR-221-3p)；

将获得的重组载体、重组病毒，或重组病毒载体转染表皮细胞，获得MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞；

Ⅲ)步骤Ⅰ)或Ⅱ)得到的MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞，放入37℃5％二氧化碳培养箱静置培养，所用培养基同未做处理的表皮细胞，均为20％胎牛血清，高糖DMEM。

本发明在表皮细胞培养时，采用绘制生长曲线法测量表皮细胞的增殖速度，发现MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞，比转染阴性对照的表皮细胞，增殖速度显著加快。

本发明的第三方面，提供了MicroRNA221-3p在制备组织工程皮肤和皮肤移植物中的应用，以及或者一种促进表皮细胞增殖的方法在制备组织工程皮肤和皮肤移植物中的应用。

本发明获得了一种MicroRNA 221-3p高表达的表皮细胞(也称为重组表皮细胞)，所述的重组表皮细胞进一步应用于制备组织工程皮肤和皮肤创面修复材料。

本发明提供了一种具有促进表皮细胞增殖的产品(试剂)，所述的活性成分为以下任一：

A)MicroRNA221-3p；

B)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组载体；

C)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒；

D)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒载体。

本发明经实验证明，MicroRNA221-3p过表达后，可抑制PTEN的表达。PTEN，Phosphatase and tensinhomoIogy，是与细胞骨架蛋白同源的第10号染色体缺失的磷酸酶基因，PTEN可抑制表皮细胞的增殖。本发明的MicroRNA221-3p过表达后，通过抑制PTEN的表达，可显著促进表皮细胞的增殖。因此说明，MicroRNA221-3p与表皮细胞增殖有关，MicroRNA221-3p可用于制备表皮细胞、促进表皮细胞增殖。本发明克服表皮细胞体外培养中增殖缓慢的缺陷，使表皮细胞可以大量地、低成本地在创面修复、皮肤移植中得到广泛的临床。

附图说明

图1为荧光显微镜观察慢病毒载体介导GFP-MIR-221-3p在表皮细胞中的表达情况；其中A为GFP-MIR-221-3p转染的表皮细胞(简称为EC^high)的明视野，清晰可见表皮细胞的形态；B图为A图中EC^high细胞的暗视野，可见荧光；C为慢病毒空载体转染的表皮细胞(简称为EC^nc)的明视野；D为图为C图中EC^nc的暗视野，可见荧光。

图2为计数法绘制GFP-MIR-221-3p感染后表皮细胞的生长曲线，测定其增殖能力。可见EC^high增殖速度加快。

图3为免疫组化鉴定GFP-MIR-221-3p慢病毒感染后EC中特异性抗原的表达；其中A为EC^high中广谱角蛋白的检测；B为EC^high中角蛋白14的检测；C为EC^nc中广谱角蛋白的检测；D为EC^nc中角蛋白14的检测。

图4为western-blot和RT-PCR检测MicroRNA221-3p高表达后PTEN的表达，其中A为western-blot的观察结果，B图显示MicroRNA221-3p表达增加，C图显示PTEN表达降低。

图5为GFP-MIR-221-3p感染后表皮细胞的安全性鉴定。图中箭头表示为细胞移植部位，大体观察从左向右依次是A：EC^high移植组，B：EC^nc移植组，C：EC移植组，D：PBS移植组。苏木精-伊红(HE)染色观察结果从左向右依次是E：EC^high移植组，F：EC^nc移植组，G：EC移植组，H：PBS移植组。结果显示各组致瘤实验均为阴性；，大体观察未见异常；HE染色结果，也未见畸胎瘤形成。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：稳定高表达MicroRNA221-3p的表皮细胞的获得

一、表皮细胞获得

成人体皮来自长海医院整形外科。原代培养得到表皮细胞。

取包皮后将其装在含有无菌PBS或者DMEM培养基的无菌离心管内，尽快操作。在无菌培养皿内以适量75％乙醇酒精棉球反复擦拭包皮1分钟左右。将包皮换到另一个无菌培养皿中，用含双抗磷酸盐缓冲液Phosphate Buffered Saline(PBS)液(青、链霉素浓度均为100IU/ml)彻底清洗，尽量剪去皮下组织，PBS液洗两遍。将皮片剪切成1-2mm宽的条状，浸泡于约5倍于组织的0.25％Dispase酶液中，4℃消化16-18小时。从取出皮片上轻轻撕离表皮，双抗PBS洗两遍。加入适量预热至37℃的胰酶消化液(含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA)先后两次消化表皮，分别为8分钟和5分钟。将开始混浊的消化液经80目钢网过滤至加有小牛血清的培养皿内，再用PBS冲洗表皮。洗液与细胞悬液混合后离心5分钟，200g，弃上清。再用PBS洗一次后，用表皮细胞无血清培养基DK-SFM重悬细胞接种培养。取传代后的细胞进行后续操作。

二、细胞转染

1.转染GFP-MIR-221-3P慢病毒表达系统(其中外源基因为

MicroRNA221-3p，Accession number为MIMAT0000278，购自上海吉凯基因化学技术有限公司，为能表达MicroRNA221-3p的慢病毒颗粒)，根据该公司指南转染细胞。

1).分别将生长良好的从步骤一得到的传代后的表皮细胞于转染前一天接种到24孔板中(正常培养，37度，5％CO2培养箱)，转染时细胞密度在40％左右。

2).用含有6μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。

3).继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。

4).然后37度继续培养72小时，得到表皮细胞(epidermal cell,EC^high细胞系)。采用同样的方法将NC的慢病毒表达系统(购自上海吉凯基因化学技术有限公司，其与GFP-MIR-221-3P相比无外源基因MicroRNA221-3p)转染EC，得到EC^nc。

2.检测细胞中MicroRNA221-3p的表达，

1).荧光显微镜观察

将上述获得的EC^high和EC^nc分别置于荧光倒置显微镜下，观察荧光发光情况，MicroRNA221-3p的表达情况，结果如图1所示，从图中可以看出，EC^high细胞系稳定高表达MicroRNA221-3p。荧光显微镜观察其转染效率高达80％。

2).RT-PCR检测

利用Trizol(Invitrogen，15596-026)提取上述获得的EC^high和EC^nc的总RNA，以总RNA为模板，MicroRNA221-3p引物(吉玛公司合成)，进行QRT-PCR，以U6为内参(吉玛公司合成)，以未转染的EC^nc作为对照。结果如图1所示。EC^high的相对表达率为68，EC^nc的相对表达率为1。可以看出，MicroRNA221-3p在EC^high中稳定高表达。

引物序列如下：

U6的引物：

U6的逆转录引物：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT(SEQ ID NO:3)

通用引物：CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGCAA(SEQ ID NO:4)

P2：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT(SEQ ID NO:5)

MicroRNA221-3p的引物：

MicroRNA221-3p的逆转录引物：

CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAAACCCA(SEQ ID NO:6)

通用引物：CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGCAA(SEQ ID NO:7)

P2：GGCAGCTACATTGTCTGCTGG(SEQ ID NO:8)

实施例2：EC^high稳定高表达MicroRNA221-3p的功能研究及生物学特性鉴定

一、细胞生长曲线

将各组细胞以每孔10000个细胞接种于24孔板，培养7天，每天对胰酶消化成单细胞悬液，借助细胞计数板和显微镜进行细胞计数实验，每个时间点每种细胞做3复孔，实验重复3次。结果发现EC^high组细胞增殖能力强于EC^nc，如图2所示。

二、免疫组织化学检测表皮细胞特性

1.接种EC^high、EC^nc的细胞爬片

2.分为2组，一组为实验组，另一组为抗体对照组

3.4％BSA封闭非特异性结合位点

4.1：200的浓度加入一抗

5.37度孵育半小时

6.PBS洗3遍

7.1：500的浓度加入二抗

8.PBS洗3遍

9.DAB显色。

实验结果表明，GFP-MIR-221-3P过表达慢病毒感染前后，细胞形态均为铺路石样，感染前后均高表达表皮细胞特异性抗原角蛋白和角蛋白14，如图3所示。

三、MicroRNA221-3p高表达后可抑制PTEN的表达

1.RT-PCR检测

利用Trizol(Invitrogen,15596-026)提取上述获得的EC^high和EC^nc的总RNA，逆转录为cDNA。设计引物，检测PTEN表达水平。β-actin作为检测用内参。以未转染的EC^nc作为对照。

引物序列如下：

PTEN的引物如下：

P1:TTGGCGGTGTCATAATGTCT(SEQ ID NO:9)

P2:GCAGAAAGACTTGAAGGCGTA(SEQ ID NO:10)

β-actin的引物如下：

P1：AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG(SEQ ID NO:11)

P2：GCTGTCACCTTCACCGTTCC(SEQ ID NO:12)

结果如图4所示，可见经GFP-MIR-221-3p转染后，MicroRNA-221-3p表达增加，而PTEN的表达降低。

2)western-blot检测PTEN的表达

(1)去培养液后用温的PBS冲洗2～3遍

(2)于6孔板来说每孔加200～300μl，60～80℃的1×loading buffer。

(3)用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min.

(4)将EP管置于0℃后再14000～16000g离心2min，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。

(5)待样品恢复到室温后上样。

(6)电泳、转膜。

(7)浸没于5％BSA封闭液中室温缓慢摇荡一小时。一抗室温下轻摇孵育一小时。

(8)根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体，按相应比例稀释(1:1000～1:10000)，室温轻摇一小时。

(9)洗涤，使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法。结果可见，和EC^nc相比，EC^high组PTEN的表达量显著降低。如图4所示。

四、GFP-MIR-221-3p感染后表皮细胞的安全性鉴定

1.细胞生长状态的比较

用倒置显微镜观察慢EC^high，EC^nc和EC。细胞形态未见明显改变，存在接触抑制。

2.体内致瘤试验

实验所用裸鼠BALB/c Nu品系，SPF级。体重约15～25g，3周龄，购自上海实验动物中心，共12只裸鼠，分4组：EC^high注射组，EC^nc注射组，EC注射组，PBS注射组。细胞量为10⁴，用1ml注射器抽取细胞悬液0.15ml注入裸鼠前肢背部皮下。SPF级条件下喂养、每日观察，移植后4周取材。

各组动物，经实验处理后，在外形、活性等方面无差异。处死后各组裸鼠之间相比，H-E染色，肝、脾、肾等脏器无差异。

对各组裸鼠注射部位的皮肤组织做H-E染色，显微镜下观察发现：无畸胎瘤形成。如图5所示。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.MicroRNA221-3p在制备促进表皮细胞增殖的试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的MicroRNA221-3p在制备促进表皮细胞增殖的试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂，为提高MicroRNA221-3p表达量的试剂。

3.根据权利要求2所述的MicroRNA221-3p在制备促进表皮细胞增殖的试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂包括以下任一：

A)MicroRNA221-3p；

B)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组载体；

C)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒。

4.一种促进表皮细胞增殖的体外培养表皮细胞方法，其特征在于，该方法包括构建一种MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞，体外培养。

5.根据权利要求4所述的一种促进表皮细胞增殖的体外培养表皮细胞方法，其特征在于，构建一种MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞，选自步骤Ⅰ)或者步骤Ⅱ)：

Ⅰ)人工合成MicroRNA221-3p的成熟体，经脂质体转染，获得MicroRNA221-3py高表达的的表皮细胞；

Ⅱ)构建含有MicroRNA221-3p的编码基因的重组载体或构建含有MicroRNA221-3p的编码基因的重组病毒；将获得的重组载体或重组病毒转染表皮细胞，获得MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞。

6.根据权利要求4或5所述的一种促进表皮细胞增殖的体外培养表皮细胞方法，其特征在于，体外培养方法如下：

构建得到的MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞，放入37℃5％二氧化碳培养箱静置培养，所用培养基为20％胎牛血清、高糖DMEM。

7.MicroRNA221-3p在制备组织工程皮肤和皮肤移植物中的应用。

8.如权利要求4或5所述的促进表皮细胞增殖的体外培养表皮细胞方法在制备组织工程皮肤和皮肤移植物中的应用。

9.一种MicroRNA221-3p高表达的表皮细胞在制备组织工程皮肤和皮肤移植物中的应用。

10.一种具有促进表皮细胞增殖的试剂，其特征在于，所述试剂的活性成分包括以下任一：

A)MicroRNA221-3p；

B)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组载体；

C)含有MicroRNA 221-3p编码基因的重组病毒。