CN109355257A - 不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法包括：从哺乳动物的脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出间充质干细胞，将从脂肪组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第一间充质干细胞，将从骨髓组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第二间充质干细胞，将从脐带组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第三间充质干细胞；将第一间充质干细胞、第二间充质干细胞、第三间充质干细胞按2:3:1比例混合，进行混合培养。采用混合培养时不同组织来源的间充质干细胞分泌的多种细胞因子可以相互促进增殖，同时添加的自体脐带血血清使得增殖更快，细胞一致性更好，解决了增殖不一致、增殖缓慢、传代少、需要多种规格培养基的问题。

Description

不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体地说，涉及一种不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法。

背景技术

间充质干细胞来源于发育早期的中胚层、外胚层，属于多功能干细胞，具体功能如下：一、具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、基质细胞等多种细胞的能力。二、具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。三、旁分泌功能，间充质干细胞通过旁分泌分泌多种细胞因子，这些细胞因子能促进机体自体干细胞增殖，血管增生，促进前体细胞迁移，抑制细胞凋亡，抑制瘢痕产生。四、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。五、低免疫原性，面目模糊，表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。正是由于间充质干细胞所具备的这些免疫学特性，使其在临床疾病治疗方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。间充质干细胞对修复受损组织和器官、改善内环境、提高自身免疫力起着至关重要的作用。间充质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能，可以用来修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损伤、烧伤烫伤、肌病等多种疾病。

单一来源的间充质干细胞能在适宜的体内或体外环境下分化成几种或多种成体细胞，但还是有一定的局限性，如骨髓来源的间充干细胞能分化为肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等，却很难分化为皮肤细胞、表皮细胞等，所以单一来源的间充质干细胞修复组织时存在一定的局限性。不同组织来源间充质干细胞培养时对培养基成分要求不同，尤其是各种干细胞生长因子添加量和种类不同，导致要配置多个规格的培养基，扩增速度也不同，这些都不利于批量化培养。

发明内容

本发明提供一种不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法，用以解决不同组织来源的间充质干细胞单独培养时难度不一致，扩增速度不一致，培养基配方不统一问题。

本发明公开的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法，包括：

从哺乳动物的脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出间充质干细胞，将从脂肪组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第一间充质干细胞，将从骨髓组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第二间充质干细胞，将从脐带组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第三间充质干细胞；

将从脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出的间充质干细胞进行混合培养，具体为：

将第一间充质干细胞、第二间充质干细胞、第三间充质干细胞按2:3:1比例混合，组成P1代混合细胞；

将P1代混合细胞以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P2代混合细胞；所述完全培养基为用于间充质干细胞培养的无血清培养基；所述D液的制备方法为：将脐带血放入离心管于4-8℃的环境中静置3小时后离心，取淡黄色上清液于4℃的温度环境保存备用，标记该液为D液；

将P2代混合细胞以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P3代混合细胞；

将P3代混合细胞以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P4代混合细胞；

将P4代混合细胞以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P5代混合细胞，并将P5代混合细胞以1×10⁸个/mL收集冻存；

对P5代混合细胞进行检测、鉴定，合格的P5代混合细胞即为可用于同源异体移植的间充质干细胞。

如上所述的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法，其中，从哺乳动物的脂肪组织中分离提纯出间充质干细胞的方法为：

将哺乳动物麻醉后，取腹股沟皮下脂肪，用酒精浸泡3min，去毛细血管，用PBS清洗3-5遍，把脂肪块剪成0.5-1mm³的粒块，放入培养皿中加适量Ⅰ型胶原酶，全面浸泡脂肪粒块，于37℃的温度环境消化60min，消化后取出放入离心管，100g离心10min(100牛离心力离心，低速离心机800-1000转/min可使离心力达到100牛)，去掉上层脂肪和中层液体，留下底部沉淀物加10mL完全培养基摇匀，100g离心10min(100牛离心力离心10分钟，低速离心机800-1000转/min可使离心力达到100牛)，去上清，加入完全培养基摇匀，制成细胞悬液，移入培养瓶，放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，24小时后观察细胞情况，待有长梭型细胞贴壁铺满培养瓶的20％-30％后清洗换液，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的75％时收集传代，按6000-8000个/cm²传代培养，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为第一间充质干细胞。

如上所述的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法，其中，从哺乳动物的骨髓组织中分离提纯出间充质干细胞的方法为：

将哺乳动物麻醉后取骨髓，放入培养皿中，加培养所需完全培养量的1/3完全培养基，混合均匀移入培养瓶，放入培养箱预培养30min，再加入另外2/3完全培养基，放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的75％时收集传代，按6000-8000个/cm²传代培养，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为第二间充质干细胞。

如上所述的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法，其中，从哺乳动物的脐带组织中分离提纯出间充质干细胞的方法为：

取哺乳动物的脐带，取脐带时用缝针线系紧两端，用注射器抽取脐带血，把脐带用酒精浸泡3min，用含1％双抗的PBS清洗3-5遍；将抽出脐带血的脐带去两端，剪成1cm长的脐带段，用含1％双抗的PBS清洗3-5遍，直至完全洗净血细胞，取出脐带段放在培养皿中加入完全培养基使脐带保持湿润，沿脐静脉剪开，去除脐静脉壁和两条脐动脉，取下脐带外壁内侧的华通氏胶，将华通氏胶切成1-2mm³的块，均匀平铺于培养瓶中，加入培养所需完全培养量的1/3完全培养基，放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，24小时后加入另外2/3完全培养基，7天后观察细胞情况，待有细胞爬出铺满培养瓶的20％-30％后清洗换液，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的75％时收集传代，按6000-8000个/cm²传代培养，待细胞铺满80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为第三间充质干细胞。

本发明提供的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法具有以下优点：

1、解决了现有技术中存在的单一组织来源的间充质干细胞修复组织时有局限性的问题。利用多组织来源的间充质干细胞混合培养，既不影响单一来源间充质干细胞的特性，又增加了干细胞在体内分化的广度，从而增强了干细胞治疗疾病的效果和增大了可治疗疾病的范围。

2、采用混合培养时不同组织来源的间充质干细胞分泌多种细胞因子可以相互促进增殖，同时添加微量自体脐带血血清使得增殖更快，细胞一致性更好，增加有效传代，解决了增殖不一致、增殖缓慢、传代少、需要多种规格培养基的问题，从而解决了批量工厂化培养的繁琐问题。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明提供的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法的流程图；

图2为本发明提供的应用实施例中的A细胞的示意图；

图3为本发明实施例的应用实施例中的B细胞的示意图；

图4为本发明实施例的应用实施例中的C细胞的示意图；

图5为本发明实施例的应用实施例中的P2代混合细胞的示意图；

图6为本发明实施例的应用实施例中的P5代混合细胞的示意图。

具体实施方式

以下将配合实施例及附图来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

图1为本发明提供的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法的流程图。如图1所示，本发明的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法可以包括以下步骤(S1～S7)：

S1、从哺乳动物的脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出间充质干细胞，将从脂肪组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第一间充质干细胞，将从骨髓组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第二间充质干细胞，将从脐带组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第三间充质干细胞。

S2、将第一间充质干细胞、第二间充质干细胞、第三间充质干细胞按2:3:1比例混合，组成P1代混合细胞。

S3、将P1代混合细胞接种到培养瓶中，加入完全培养基和D液，摇匀后放入培养箱培养，得到P2代混合细胞。

具体的，将P1代混合细胞以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P2代混合细胞；所述完全培养基为用于间充质干细胞培养的无血清培养基；所述D液的制备方法为：将脐带血放入离心管于4-8℃的环境中静置3小时后8000转/min离心6min，取淡黄色上清液于4℃的温度环境保存备用，标记该液为D液。

S4、将P2代混合细胞接种到培养瓶中，加入完全培养基和D液，摇匀后放入培养箱培养，得到P3代混合细胞。

具体的，将P2代混合细胞以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P3代混合细胞。

S5、将P3代混合细胞接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱培养，得到P4代混合细胞。

具体的，将P3代混合细胞以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P4代混合细胞。

S6、将P4代混合细胞接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱培养，得到P5代混合细胞。

具体的，将P4代混合细胞以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P5代混合细胞，并将P5代混合细胞以1×10⁸个/mL收集冻存。

S7、对P5代混合细胞进行检测、鉴定，合格的P5代混合细胞即为可用于同源异体移植的间充质干细胞。

本发明实施例的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法，不同组织来源的间充质干细胞分泌的多种细胞因子可以相互促进增殖，同时添加的自体脐带血血清使得增殖更快，细胞一致性更好，解决了增殖不一致、增殖缓慢、传代少、需要多种规格培养基的问题。

下面将给出的是本发明提供的技术方案的应用实施例。

第一部分：分离提纯犬、猫脂肪来源间充质干细胞、分离提纯犬骨髓来源间充质干细胞、分离提纯犬脐带来源间充质干细胞。

1、分离提纯犬、猫脂肪来源间充质干细胞。

麻醉后取犬、猫腹股沟皮下脂肪，酒精浸泡3min，去毛细血管，PBS清洗3-5遍，把脂肪块剪成0.5-1mm³小块，放入培养皿中加适量Ⅰ型胶原酶，全面浸泡脂肪块混合均匀，37℃消化60min，消化后取出放入离心管，100g离心10min(100牛离心力离心10分钟，低速离心机800-1000转/min可使离心力达到100牛)，去掉上层脂肪和中层液体，留下底部沉淀物加10mL完全培养基①轻轻摇匀，100g离心10min(100牛离心力离心10分钟，低速离心机800-1000转/min可使离心力达到100牛)，去上清，加入适量完全培养基摇匀，制成细胞悬液，移入培养瓶，放入培养箱5％CO₂，湿度90％，温度37℃培养，24小时后观察细胞情况，有大量长梭型细胞贴壁后清洗换液②，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液，待细胞铺满75％时收集传代，按6000-8000个/cm²传代培养，待细胞铺满80％-90％时收集得到P1代细胞，如图2，标记为A细胞，检测支原体衣原体等，通过流式鉴定后液氮保存备用。

注①完全培养基：为成分明确的适合间充质干细胞培养的无血清完全培养基，无特殊说明均为此培养基，下同。

注②清洗换液：去掉培养瓶中旧液，用PBS清洗2-3次，只剩下瓶内贴壁细胞，再加入适量新鲜完全培养基，无特殊说明下同。

2、分离提纯犬、猫骨髓来源建充质干细胞

麻醉后取犬、猫骨髓，放入培养皿中，加培养所需完全培养量的1/3完全培养基，混合均匀移入培养瓶，放入培养箱预培养30min，再加入另外2/3完全培养基，放入培养箱5％CO₂，湿度90％，温度37℃培养，每天观察细胞情况，每3天清洗换液，待细胞铺满75％时收集传代，按6000-8000个/cm²传代培养，待细胞铺满80％-90％时收集得到P1代细胞，如图3，标记为B细胞，检测支原体衣原体等，通过流式鉴定后液氮保存备用。

3、分离提纯犬、猫脐带来源间充质干细胞。

取犬、猫脐带，取脐带时用缝针线系紧两端，用注射器抽取脐带血备用。把脐带取回试验室，酒精浸泡3min，含1％双抗的PBS清洗3-5遍，将脐带血放入离心管于4-8℃冰箱静置3小时后离心，取淡黄色上清液4℃保存备用，标记此液为D液。

将抽出脐带血的脐带去两端，剪成1cm长小段，用含1％双抗PBS清洗3-5遍，直至完全洗净血细胞，取出脐带小段放在培养皿中加入几滴完全培养基使脐带保持湿润，沿脐静脉剪开，去除脐静脉壁和两条脐动脉，取下脐带外壁内侧的华通氏胶，将华通氏胶切成1-2mm³的小块，均匀平铺于培养瓶中加入培养所需完全培养量的1/3完全培养基，放入培养箱5％CO₂，湿度90，温度37℃培养，24小时后加入另外2/3完全培养基，7天后观察细胞情况，有大量细胞爬出后清洗换液，细胞爬出较少时不清洗，换液时保留脐带组织块直至有大量细胞爬出后清洗换液，此后每3天清洗换液，待细胞铺满75％时收集传代，按6000-8000个/cm²传代培养，待细胞铺满80％-90％时收集得到P1代细胞，如图4，标记为C细胞。检测支原体衣原体等，通过鉴定后液氮保存备用。

第二部分：混合培养，进一步提纯间充质干细胞。

(1)将A、B、C细胞按2:3:1比例混合，以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入适量完全培养基后，按总体积加入0.1％D液摇匀后放入培养箱5％CO₂，湿度90％，温度37℃培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液，待细胞铺满80％-90％时收集细胞，如图5，得到P2代混合细胞。

(2)用P2混合代细胞继续以8000-10000个/cm²接种传代，按总体积加入0.1％D液摇匀后放入培养箱5％CO₂，湿度90％，温度37℃培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液，待细胞铺满80％-90％时收集细胞，得到P3代混合细胞。

(3)将P3代混合细胞以8000-10000个/cm²接种传代，加入适量完全培养基，不再添加D液，放入培养箱5％CO₂，湿度90％，温度37℃培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液，待细胞铺满80％-90％时收集细胞，得到P4代混合细胞。

将P4代混合细胞细胞以8000-10000个/cm²接种传代，加入适量完全培养基，不再添加D液，放入培养箱5％CO₂，湿度90，温度37℃培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液，待细胞铺满80％-90％时收集细胞，如图6，得到P5代混合细胞细胞，P5代混合细胞以1×10⁸个/mL收集冻存，以方便使用。P5代混合细胞，为目标细胞，此细胞通过检测、鉴定后可直接同源异体移植。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法，其特征在于，包括：

从哺乳动物的脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出间充质干细胞，将从脂肪组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第一间充质干细胞，将从骨髓组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第二间充质干细胞，将从脐带组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第三间充质干细胞；

将从脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出的间充质干细胞进行混合培养，具体为：

将第一间充质干细胞、第二间充质干细胞、第三间充质干细胞按2:3:1比例混合，组成P1代混合细胞；

将P1代混合细胞以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P2代混合细胞；所述完全培养基为用于间充质干细胞培养的无血清培养基；所述D液的制备方法为：将脐带血放入离心管于4-8℃的环境中静置3小时后离心，取淡黄色上清液于4℃的温度环境保存备用，标记该液为D液；

将P2代混合细胞以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P3代混合细胞；

将P3代混合细胞以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P4代混合细胞；

将P4代混合细胞以8000-10000个/cm²接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P5代混合细胞，并将P5代混合细胞以1×10⁸个/mL收集冻存；

对P5代混合细胞进行检测、鉴定，合格的P5代混合细胞即为可用于同源异体移植的间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法，其特征在于，从哺乳动物的脂肪组织中分离提纯出间充质干细胞的方法为：

将哺乳动物麻醉后，取腹股沟皮下脂肪，用酒精浸泡3min，去毛细血管，用PBS清洗3-5遍，把脂肪块剪成0.5-1mm³的粒块，放入培养皿中加适量Ⅰ型胶原酶，全面浸泡脂肪粒块，于37℃的温度环境消化60min，消化后取出放入离心管，每100g离心10min，去掉上层脂肪和中层液体，留下底部沉淀物加10mL完全培养基摇匀，再每100g离心10min，去上清，加入完全培养基摇匀，制成细胞悬液，移入培养瓶，放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，24小时后观察细胞情况，待有长梭型细胞贴壁铺满培养瓶的20％-30％后清洗换液，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的75％时收集传代，按6000-8000个/cm²传代培养，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为第一间充质干细胞。

3.如权利要求1所述的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法，其特征在于，从哺乳动物的骨髓组织中分离提纯出间充质干细胞的方法为：

将哺乳动物麻醉后取骨髓，放入培养皿中，加培养所需完全培养量的1/3完全培养基，混合均匀移入培养瓶，放入培养箱预培养30min，再加入另外2/3完全培养基，放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的75％时收集传代，按6000-8000个/cm²传代培养，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为第二间充质干细胞。

4.如权利要求1-3任一项所述的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法，其特征在于，从哺乳动物的脐带组织中分离提纯出间充质干细胞的方法为：

取哺乳动物的脐带，取脐带时用缝针线系紧两端，用注射器抽取脐带血，把脐带用酒精浸泡3min，用含1％双抗的PBS清洗3-5遍；将抽出脐带血的脐带去两端，剪成1cm长的脐带段，用含1％双抗的PBS清洗3-5遍，直至完全洗净血细胞，取出脐带段放在培养皿中加入完全培养基使脐带保持湿润，沿脐静脉剪开，去除脐静脉壁和两条脐动脉，取下脐带外壁内侧的华通氏胶，将华通氏胶切成1-2mm³的块，均匀平铺于培养瓶中，加入培养所需完全培养量的1/3完全培养基，放入培养箱，在CO₂浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，24小时后加入另外2/3完全培养基，7天后观察细胞情况，待有细胞爬出铺满培养瓶的20％-30％后清洗换液，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的75％时收集传代，按6000-8000个/cm²传代培养，待细胞铺满80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为第三间充质干细胞。