CN107189982A - 一种人脐带间充质干细胞的培养方法 - Google Patents

一种人脐带间充质干细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的培养方法，其包括以下步骤：(1)获取脐带组织；(2)分离华通氏胶；(3)将华通氏胶切割成组织块，将组织块接种至T75培养瓶中，加入适量原代培养基置于CO2培养箱中培养，前3天静置培养，第4天补加原代培养基5ml，之后每2天‑3天换一次液，在大部分组织块都有细胞爬出时去掉组织块，换液，在细胞密度达到80％或以上时进行传代扩增；(4)处理后，用传代培养基重悬，传代。本发明的有益之处在于：(1)在培养过程中，不使用动物来源的添加物，更加安全；(2)操作简单方便，培养时间短。

Description

一种人脐带间充质干细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及一种细胞的培养方法，具体涉及一种人脐带间充质干细胞的培养方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSCs)来源于发育早期的中胚层和外胚层，存在于全身结缔组织和器官组织中，是一类具有造血支持和免疫调控等特性、同时具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。
MSCs在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍有多向分化潜能，因此可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤的修复。
MSCs能分泌产生多种促进生长分化的细胞因子，包括HGF、IL-6、IGF-1、TGF-α、TGF-β、BDNF、EGF、FGF、SDF-1、和VEGF等细胞因子，具有免于调控功能。
因此，MSCs在再生医学领域有重要作用。
MSCs最初是在骨髓中发现的，后来发现脐带、脐血、胎盘和其他一些组织也存在MSCs。
脐带MSCs是存在于脐带华尔通胶(Wharton'sjelly)和血管周围组织中的一种干细胞。来源于脐带的MSCs具有取材方便、来源丰富、易于采集和运输、生物学特性稳定、免疫原性低、无异体排斥反应、成本低、对捐献者无损害及不涉及伦理问题等优势，所以在未来医疗应用方面具有很大的潜力。
目前，脐带MSCs的原代分离方法主要有：酶解法、组织块培养法。在酶解法中，使用到的胶原酶等大都来源于动物；在组织块培养法中，培养体系大都含有动物血清。
酶解法和组织块培养法都引入了来源于动物的成分，由于这些来源于动物的酶和血清等成分不明确，所以增加了病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险，至少一年不能排除血清中含有的易变物质，使用血清有可能改变细胞在体内的正常状态，对人体存在安全隐患。
此外，由于动物来源的酶和血清批次之间存在差异，也会降低细胞培养的可重复性，所以酶解法和组织块培养法都存在培养操作复杂、培养时间长等问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种操作简单方便、培养时间短、不含动物来源的添加物的人脐带间充质干细胞的培养方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：取健康产妇39周～40周正常分娩或剖腹产脐带组织，手术室洁净条件下，将脐带组织放入预先加注有100ml组织保护液的T75培养瓶中，密封，2℃～8℃条件下保存；
Step2：将脐带组织置于百级超净台环境下的培养皿中，用PBS将组织表面血污清洗干净，然后将脐带剪成小段，并去除脐带内2条动脉和1条静脉以及脐带表面羊膜，剩余部分即为华通氏胶，最后用镊子和手术刀分离出华通氏胶；
Step3：配制原代培养基，成分为：α-MEM培养基90ml、UltraGRO营养添加物10ml、肝素钠200IU、硫酸庆大霉素8000IU；
Step4：配制传代培养基，成分为：α-MEM培养基475ml、UltraGRO营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU；
Step5：将分离出的华通氏胶置于培养皿中，用手术刀切割成很小的组织块，然后将组织块接种至T75培养瓶中，置于CO2培养箱中倒置1h，1h后加入适量原代培养基使组织块湿润，之后将培养瓶置于CO2培养箱中培养，前3天静置培养，第4天补加原代培养基5ml，观察生长情况，之后每2天-3天换一次液，在大部分组织块都有细胞爬出时，去掉组织块，换液，在细胞密度达到80％或以上时进行传代扩增；
Step6：用移液器移去T75培养瓶内的细胞培养液，用PBS清洗，然后向T75培养瓶中加入4倍稀释的Accutase酶液6ml，消化1min-2min，离心收集细胞，弃去上清液，收集的细胞用D-PBS离心洗涤一次，弃去上清液，用传代培养基重悬，传代，传代密度为10000个细胞/cm2-15000个细胞/cm2。
前述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在Step1中，前述组织保护液的成分为：肝素2500IU、庆大霉素16000IU、0.9％生理盐水100ml。
前述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在Step2中，将脐带剪成3cm～5cm长的小段。
前述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在Step5中，将华通氏胶切割成1mm3左右大小的组织块。
前述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在Step6中，离心条件为：1000rpm×5min。
本发明的有益之处在于：
1、在培养过程中，不使用动物来源的添加物，减少了病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险，使用更加安全；
2、在培养过程中，使用的试剂少，配制简单，操作方便，试剂对细胞作用明显，明显缩短了培养时间；
3、避免了动物来源的酶和血清中某些成分对细胞的毒性；
4、试剂批次稳定，提高了细胞培养的可重复性。
附图说明
图1(a)是实验组原代培养第10天时得到的细胞数量情况图；
图1(b)是对照组原代培养第10天时得到的细胞数量情况图；
图2是实验组和对照组不同代细胞的增殖能力对比图；
图3(a)是实验组P15代细胞的形态图；
图3(b)是对照组P15代细胞的形态图；
图4(a)至图4(e)是实验组的流式检测结果图；
图5(a)至图5(e)是对照组的流式检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、获取脐带组织
取健康产妇39周～40周正常分娩或剖腹产脐带组织，手术室洁净条件下，将脐带组织放入预先加注有100ml组织保护液的T75培养瓶中，密封，2℃～8℃条件下运输至实验室。
组织保护液的成分为：肝素2500IU、庆大霉素16000IU、0.9％生理盐水100ml。
二、分离华通氏胶
将脐带组织置于百级超净台环境下的15cm培养皿中，用PBS清洗2遍～3遍，将组织表面血污清洗干净，然后将脐带剪成小段(3cm～5cm)，并去除脐带内2条动脉和1条静脉以及脐带表面羊膜，剩余部分即为华通氏胶，最后用镊子和手术刀分离出华通氏胶。
三、培养组织块
原代培养基的成分为：α-MEM培养基90ml、UltraGRO营养添加物10ml、肝素钠200IU、硫酸庆大霉素8000IU。
传代培养基的成分为：α-MEM培养基475ml、UltraGRO营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU。
将分离出的华通氏胶置于15cm培养皿中，用手术刀切割成1mm3左右大小的组织块，然后将组织块接种至T75培养瓶中，置于CO2培养箱中倒置1h，1h后加入适量原代培养基使组织块湿润，之后将培养瓶置于CO2培养箱中培养。
前3天静置培养。
第4天补加原代培养基5ml，观察生长情况，之后每2天-3天换一次液。
在大部分组织块都有细胞爬出时，去掉组织块，换液，在细胞密度达到80％(或以上)时进行传代扩增。
用移液器移去T75培养瓶内的细胞培养液，用PBS洗两遍，然后向T75培养瓶中加入4倍稀释的Accutase酶液6ml，消化1min-2min，1000rpm×5min收集细胞，弃去上清液，收集的细胞用D-PBS1000rpm×5min洗涤一次，弃去上清液，用传代培养基重悬，传代，传代密度为10000个细胞/cm2-15000个细胞/cm2。
四、设置对照组
用常规的加胎牛血清的培养方法作为对照组。
培养基的成分为：α-MEM培养基450ml、FBS 50ml、EGF5μg、L-谷氨酰胺10mM、100×NEAA5ml、硫酸庆大霉素40000IU。
将分离出的华通氏胶置于15cm培养皿中，用手术刀切割成1mm3左右大小的组织块，然后将组织块接种至T75培养瓶中，置于CO2培养箱中倒置1h，1h后加入适量培养基使组织块湿润，之后将培养瓶置于CO2培养箱中培养。
前3天静置培养。
第4天补加培养基5ml，观察生长情况，之后每2天～3天换一次液。
在大部分组织块都有细胞爬出时，去掉组织块，换液，在细胞密度达到80％(或以上)时进行传代扩增。
用移液器移去T75培养瓶内的细胞培养液，用PBS洗两遍，然后向T75培养瓶中加入4倍稀释的Accutase酶液6ml，消化1min～2min，1000rpm×5min收集细胞，弃去上清液，收集的细胞用D-PBS1000rpm×5min洗涤一次，弃去上清液，用培养基重悬后，传代，传代密度为8000个细胞/cm2～12000个细胞/cm2。
五、对比项目及结果
1、比较原代培养时间及原代传代时收获的细胞数目
组别 原代培养时间 原代传代时获得的细胞数目
实验组 10天 5.9×106个
对照组 14天 3.8×106个
实验组原代培养第10天时得到的细胞数量情况见图1(a)。
对照组原代培养第10天时得到的细胞数量情况见图1(b)。
从上表和图1(a)、图1(b)可以看出，实验组(即本发明的培养方法)原代培养时间明显短于对照组，培养到第10天时实验组的细胞数量已经达到传代条件，并且远远多于对照组。
2、比较细胞增殖能力
将实验组和对照组细胞一直传至P15代。
实验组：P15代细胞仍然保持良好的增殖能力，2天～3天融合率仍可达到80％以上。
对照组：从P6代开始，细胞增殖速度明显减缓，并且细胞变大，同时还出现了老化。
分别从实验组和对照组中取P2代、P6代和P10代培养的人脐带间充质干细胞，计数，稀释细胞悬液至2.25×104个/ml，准备10块12孔细胞培养板：
取其中5块细胞培养板，第1排4个孔接种实验组P2代细胞，第2排4个孔接种实验组P6代细胞，第3排4个孔接种实验组P10代细胞，每孔2ml；
取另外5块细胞培养板，第1排4个孔接种对照组P2代细胞，第2排4个孔接种对照组P6代细胞，第3排4个孔接种对照组P10代细胞，每孔2ml，细胞数量与实验组保持一致。
24h后，取出两组第1块细胞培养板，计数每种细胞的4个孔中的细胞数。
36h后，取出两组第2块细胞培养板，计数每种细胞的4个孔中的细胞数。
48h后，取出两组第3块细胞培养板，计数每种细胞的4个孔中的细胞数。
72h后，取出两组第4块细胞培养板，计数每种细胞的4个孔中的细胞数。
96h后，取出两组第5块细胞培养板，计数每种细胞的4个孔中的细胞数。
实验组和对照组不同代细胞的增殖能力对比结果见图2。
由图2可知，实验组P2代、P6代和P10代细胞的增殖速度和增殖数量都远高于对照组P2代、P6代和P10代；实验组P10代细胞还有较强的增值能力，而对照组P10代细胞增殖能力下降非常明显。
3、观察细胞形态
将实验组和对照组细胞一直传至P15代，观察两组P15代培养的人脐带间充质干细胞的形态。
实验组P15代细胞的形态见图3(a)。
对照组P15代细胞的形态见图3(b)。
由图3(a)和图3(b)可以看出，实验组P15代细胞形态大部分都为梭形，个体较小，而对照组P15代细胞个体变大，细胞出现明显老化。
4、流式检测
将实验组和对照组细胞一直传至P15代，分别取五万个细胞做流式检测。
实验组的流式检测结果见图4(a)至图4(e)。
对照组的流式检测结果见图5(a)至图5(e)。
由图4(a)至图4(e)、图5(a)至图5(e)可知，细胞培养到P15代时，实验组仍然高度表达间充质干细胞标志抗原，CD34、CD45、HLA-DR阴性，CD90、CD105阳性，细胞仍保持干细胞特征，而对照组则相差较多。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：取健康产妇39周～40周正常分娩或剖腹产脐带组织，手术室洁净条件下，将脐带组织放入预先加注有100ml组织保护液的T75培养瓶中，密封，2℃～8℃条件下保存；
Step2：将脐带组织置于百级超净台环境下的培养皿中，用PBS将组织表面血污清洗干净，然后将脐带剪成小段，并去除脐带内2条动脉和1条静脉以及脐带表面羊膜，剩余部分即为华通氏胶，最后用镊子和手术刀分离出华通氏胶；
Step3：配制原代培养基，成分为：α-MEM培养基90ml、UltraGRO营养添加物10ml、肝素钠200IU、硫酸庆大霉素8000IU；
Step4：配制传代培养基，成分为：α-MEM培养基475ml、UltraGRO营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU；
Step5：将分离出的华通氏胶置于培养皿中，用手术刀切割成很小的组织块，然后将组织块接种至T75培养瓶中，置于CO2培养箱中倒置1h，1h后加入适量原代培养基使组织块湿润，之后将培养瓶置于CO2培养箱中培养，前3天静置培养，第4天补加原代培养基5ml，观察生长情况，之后每2天-3天换一次液，在大部分组织块都有细胞爬出时，去掉组织块，换液，在细胞密度达到80％或以上时进行传代扩增；
Step6：用移液器移去T75培养瓶内的细胞培养液，用PBS清洗，然后向T75培养瓶中加入4倍稀释的Accutase酶液6ml，消化1min-2min，离心收集细胞，弃去上清液，收集的细胞用D-PBS离心洗涤一次，弃去上清液，用传代培养基重悬，传代，传代密度为10000个细胞/cm2-15000个细胞/cm2。
2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在Step1中，所述组织保护液的成分为：肝素2500IU、庆大霉素16000IU、0.9％生理盐水100ml。
3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在Step2中，将脐带剪成3cm～5cm长的小段。
4.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在Step5中，将华通氏胶切割成1mm3左右大小的组织块。
5.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在Step6中，离心条件为：1000rpm×5min。
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