CN106554939A - 人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种用于增强免疫抑制能的人脐带间充质干细胞分离、培养、保存的试剂盒。由脐带运输/保存液、脐带洗涤液、脐带间充质干细胞分离液、细胞免疫抑制能增强无血清培养液、细胞消化液、细胞保存液几个主要组成部分构成。适用于人脐带间充质干细胞的分离至培养以及后续的保存一系列流程。经实验证明本发明试剂盒具有安全、高效、便捷的优点，可增强间充质干细胞的免疫抑制能力，对于应用人脐带间充质干细胞进行临床自身免疫性疾病的研究和治疗具有重要意义。

Description

人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养的试剂盒，可高效安全地用于人脐带来源间充质干细胞的分离及培养，能够增强间充质干细胞的免疫抑制能力，可应用于临床自身免疫性疾病的研究和治疗。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是广泛存在于结缔组织和器官间质中的多能干细胞，具有多向分化潜能及强大的免疫调节功能，在移植中具有低免疫原性的特点，在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病治疗中具有广阔的应用前景。

间充质干细胞主要来源于骨髓、脐带、脂肪等，但由于随着年龄增长，自体组织中的MSCs的数目会显著降低、且增殖能力也会大幅衰退，因此，自体骨髓和脂肪来源的间充质干细胞数量和活性受到一定影响，同时，且获取骨髓和和脂肪均有创，造成供体痛苦，还可能导致感染、出血和慢性疼痛等。对MSCs的采集技术要求严格，配套仪器精密、成本高，不宜应用推广。因此，对于自体骨髓和脂肪以外来源的MSCs的研究越来越被重视。

目前，异体来源MSCs的研究已经从围产期的胎盘、脐带、脐带血，抽脂术来源的脂肪以及流产胎儿中分离获得增殖能力好、低免疫原性的MSCs。而这些组织中，脐带属于医疗废弃物，具有易于获得、来源稳定可控、无伦理争议问题的特点，具有良好的研究价值和应用前景。

人脐带间充质干细胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，hUC-MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种具有自我更新、多向分化潜能的干细胞，能分化为心脏、肝、肾、肺、胰腺、神经、骨骼、肌肉、脂肪等多种组织细胞，分化能力几乎涵盖了人体的所有组织细胞。

hUC-MSCs具有以下功能和用途：修复损伤或病变的组织器官，用于治疗心脑血管疾病、肝病、骨和肌肉衰退性疾病、脑及脊髓神经损伤和老年痴呆等；具有较强的免疫调节作用，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率；促进造血恢复功能，与单一造血干细胞移植比较，间充质干细胞和造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果。

hUC-MSCs具有以下优势：1)取材十分方便，对产妇及新生儿无任何危害及损伤；2)易于保存和运输，伦理学争议少；3)干细胞更易于分离，纯度高，且绝无肿瘤细胞污染危险；4)潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率更低；5)脐带中的间充质干细胞含量更为丰富；6)干细胞更原始，更强的增殖能力和分化能力；7)具有更强的体外扩增能力，为临床治疗提供大量的种子细胞，足以满足治疗需要，且扩增时培养体系能统一，便于质控；8)冷冻后细胞损失较其他组织来源间充质干细胞更小，因此重复使用率更高；9)具有更强的免疫调节作用；10)更低的免疫原性低，其免疫细胞较为幼稚，功能活性极低，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病；11)更广泛的临床应用和巨大的医疗前景，对心肌梗死、糖尿病、肝硬化、红斑狼疮、帕金森综合症、老年痴呆、脊髓损伤等多种疾病具有一定治疗效果，并可用于组织和器官的修复和再造。

如上所述，hUC-MSCs更具有其他组织来源MSCs所不具备的优势，研发并生产专门针对hUC-MSCs从提取到保存整套流程的试剂盒，具有技术上的迫切要求。

发明内容

为满足上述对人间充质干细胞的应用需求，鉴于hUC-MSCs具有极其广阔的临床应用前景，本发明开发一种简单、快速、高新、低成本、安全获得大量脐带间充质干细胞的方法，提供一种人脐带间充质干细胞分离培养试剂盒，该试剂盒能用于人脐带间充质干细胞的分离培养。

本发明尤其为满足临床上对自身免疫性疾病的治疗需求，应用本发明开发的人脐带间充质干细胞分离培养试剂盒培养干细胞时，具有使干细胞免疫抑制能增强的作用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明由以下几个主要组成部分构成：脐带运输/保存液、脐带洗涤液、脐带间充质干细胞分离液、脐带间充质干细胞洗涤液、脐带间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液、脐带间充质干细胞消化液、细胞保存液。

本发明人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其组分中含有脐带运输/储存液。

优选地，上述脐带运输/储存液的成分为0.9％生理盐水添加1％抗生素(盘尼西林/链霉素)及1％两性霉素B。

本发明人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其组分中含有脐带洗涤液；

优选地，上述脐带洗涤液成分为Ham’s F12、DMEM、RPMI-1640中的一种或多种混合。

本发明人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其组分中含有脐带间充质干细胞分离液；

优选地，上述脐带间充质干细胞分离液成分为胶原酶II 1g，脱氧核糖核酸酶I 0.1g添加入上述基础培养液中组成。

本发明人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其组分中含有脐带间充质干细胞洗涤液。

优选地，上述脐带间充质干细胞洗涤液成分为PBS溶液。

本发明人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其组分中含有脐带间充质干细胞培养液。

优选地，上述脐带间充质干细胞培养液成分为基础培养液中添加增殖因子和特定添加物构成。

本发明人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其组分中含有脐带间充质干细胞消化液。

优选地，上述脐带间充质干细胞消化液成分为PBS中添加accutase组成。

本发明人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其组分中含有细胞保存液；

优选地，上述脐带间充质干细胞保存液成分为成分为30％DMSO+70％上述脐带间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液。

本发明的有益效果是：

从分离、培养至传代、至保存，本试剂盒可完成全部工作；

可减少各环节因试剂来源不同造成的实验误差，增强实验稳定性及可溯性。

可在较短时间(2周内)获得大量脐带间充质干细胞(细胞数量可达10¹⁰数量级)，且细胞的免疫抑制能得到增强。

使用方便，成本低廉，无血清，减少动物来源的病原体感染风险更安全。

附图说明

图1为应用本发明脐带运输/保存液保存中的脐带实物图片。

图2-a为应用本发明脐带间充质干细胞分离液分离处理脐带组织块后，再应用本发明脐带间充质干细胞培养液培养脐带间充质干细胞第0天的肉眼图片。

图2-b为应用本发明脐带间充质干细胞培养液培养脐带间充质干细胞第2天的显微镜图片(×10倍)。

图2-c为应用本发明脐带间充质干细胞培养液培养脐带间充质干细胞第5天的显微镜图片(×10倍)。

图2-d为应用本发明脐带间充质干细胞培养液培养脐带间充质干细胞第8天的显微镜图片(×10倍)。

图3为应用流式细胞仪检测本发明脐带间充质干细胞培养液培养的脐带间充质干细胞表面标志物的结果。

图4-a、4-b、4-c、4-d、4-e为将本发明脐带间充质干细胞培养液培养的脐带间充质干细胞诱导为骨、软骨、脂肪细胞鉴定结果。

图4-a显示向成骨细胞诱导第21天可见红色钙化基质沉积。

图4-b显示向软骨细胞诱导14天甲苯胺蓝染色结果。

图4-c显示向软骨细胞诱导后II型胶原免疫组织化学染色。

图4-d显示向脂肪细胞诱导第21天胞浆内脂肪滴。

图4-e显示向脂肪细胞诱导第21天油红0染色结果。

图5为经本发明细胞保存液保存3个月后复苏的脐带间充质干细胞增殖效果图。

图6-a、6-b为本发明脐带间充质干细胞培养液培养的脐带间充质干细胞的免疫抑制效果。

图6-a显示针对鼠淋巴混合反应刺激的T细胞增殖反应，人脐带间充质干细胞培养第3天的免疫抑制效果。

图6-b显示针对鼠淋巴混合反应刺激的T细胞增殖反应，人脐带间充质干细胞培养第4天的免疫抑制效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。

实施例1：

新收集脐带运输保存：获取足月妊娠分娩新生儿脐带Wharton’s Jelly段约10cm左右，将脐带放置于本发明中的脐带运输/保存液中保存。2小时后，观察脐带未见有任何不良现象(图1)。

实施例2：

将上例中保存脐带用本发明中脐带洗涤液清洗干净后，用本发明脐带间充质干细胞分离液对脐带间充质干细胞进行分离处理，处理后的脐带组织块置于6cm dish中，应用本发明脐带间充质干细胞培养液进行培养(图2-a)。

应用本发明脐带间充质干细胞培养液培养第2天时，显微镜下(×10倍)观察可见脐带组织块周围明显的细胞增殖(图2-b)。

应用本发明脐带间充质干细胞培养液培养第5天时，显微镜下(×10倍)观察可见脐带组织块周围纤维样细胞增殖(图2-c)。

应用本发明脐带间充质干细胞培养液培养第8天时，显微镜下(×10倍)观察可见脐带组织块周围增殖的纤维样细胞融合，最靠近组织块的密度较大区域细胞融合状态可达90％以上(图2-d)。

实施例3：

将上述制得人脐带间充质干细胞，用本发明中细胞培养液进行传代培养。培养至第三代时，对所得细胞进行脐带间充质干细胞表面标志物流式检测，所检测脐带间充质干细胞均高度表达CD105、CD90、CD49、CD29和HLA-1，不表达或低表达CD34、CD45、CD31(图3)。

实施例4：

将上述脐带间充质干细胞进行多能性诱导分化。成功将所培养人脐带间充质干细胞分别诱导为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。

上述脐带间充质干细胞诱导为成骨细胞，第21天茜素红染色可见红色的钙化基质沉积(图4-a)。

上述脐带间充质干细胞诱导为软骨细胞，诱导培养14天后细胞甲苯胺蓝染色呈阳性(图4-b)。

上述脐带间充质干细胞诱导为软骨细胞，诱导培养14天后细胞经II型胶原免疫组织化学染色，说明表达了软骨细胞的特异性II型胶原蛋白(图4-c)。

上述脐带间充质干细胞向脂肪细胞诱导21天后，显微镜下观察能发现细胞浆内有大量脂肪滴形成(图4-d)。

上述脐带间充质干细胞向脂肪细胞诱导21天进行油红0染色，染色细胞呈强阳性(图4-e)。

实施例5：

将实施例3所培养脐带间充质干细胞用本发明细胞保存液进行保存，保存时间为3个月，然后对人脐带间充质细胞进行复苏，经检查，复苏的细胞存活率＞85％，且增殖能力未受影响(图5)。

实施例6：

将实施例5复苏培养后的人脐带间充质细胞对鼠淋巴细胞混合反应(M L R)下的T细胞增殖的免疫抑制进行检测，针对鼠淋巴混合反应刺激的T细胞增殖反应，人脐带间充质细胞培养第3天的免疫抑制效果(图6-a)。

上述针对鼠淋巴混合反应刺激的T细胞增殖反应，人脐带间充质细胞培养第4天的免疫抑制效果(图6-b)。

Claims (8)

1.一种人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养的试剂盒，其特征在于本发明试剂盒能够高效安全地用于人脐带来源间充质干细胞的分离及培养，且在培养过程中能够增强间充质干细胞的免疫抑制能力，对于应用人脐带间充质干细胞进行临床自身免疫性疾病的研究和治疗具有重要意义。

2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其特征在于所述组分中含有脐带运输/保存液，成分为0.9％生理盐水添加1％抗生素(盘尼西林/链霉素)及1％两性霉素B。

3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其特征在于所述组分中含有脐带洗涤液，洗涤液成分为Ham’s F12、DMEM、RPMI-1640中的一种或多种混合。

4.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其特征在于所述组分中含有脐带间充质干细胞分离液，为胶原酶II 1g，脱氧核糖核酸酶I 0.1g添加入上述基础培养液中组成。

5.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其特征在于所述组分中含有脐带间充质干细胞洗涤液，成分为PBS溶液。

6.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其特征在于所述组分中含有脐带间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液，成分为上述基础培养液中添加增殖因子和特定添加物构成。

7.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其特征在于所述组分中含有脐带间充质干细胞消化液，成分为PBS中添加accutase组成。

8.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞分离及免疫抑制能增强培养试剂盒，其特征在于所述组分中含有细胞保存液，成分为30％DMSO+70％上述脐带间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液。