CN108165526A - 酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：先取脐带组织，然后分离出华通氏胶，接下来将华通氏胶切割成组织匀浆并转入离心管中，按体积比1：1的比例加入预温的0.1％胶原酶I，放入到CO2培养箱中在37℃条件下进行恒温酶解，每隔20min剧烈震荡一次，当组织块已被酶解成糊状时停止酶解，抽取酶解液贴着400目细胞筛进行过滤，向滤液中补加PBS重悬细胞，离心去上清，再用PBS重悬细胞并离心洗涤，最后用细胞培养液将细胞重悬并转移至T75培养瓶中培养。本发明的有益之处在于：采用较低浓度(0.1％)的胶原酶I进行酶解，不仅减小了对细胞的损伤，同时降低了提取及培养的成本。

Description

酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法
技术领域
本发明涉及提取及培养细胞的方法，具体涉及酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是具有自我更新、多向分化、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性的细胞。MSC在连续传代培养和冷冻保存后，仍有多向分化潜能，因此可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤的修复。MSC能分泌产生多种促进生长分化的细胞因子，例如：HGF、IL-6、IGF-1、TGF-α、TGF-β、BDNF、EGF、FGF、SDF-1、和VEGF等，具有免于调控功能。因此，MSC在再生医学领域有重要作用。
MSC最初是在骨髓中发现的，后来发现脐带、脐血、胎盘和其他一些组织中也存在。脐带间充质干细胞(UCMSC)是存在于脐带华尔通胶(Wharton'sjelly)和血管周围组织中的一种干细胞。来源于脐带的间充质干细胞具有取材方便、来源丰富、易于采集和运输、生物学特性稳定、免疫原性低、无异体排斥反应、成本低、对捐献者无损害及不涉及伦理问题等优势，所以在未来医疗应用方面具有很大的潜力。
目前，UCMSC的原代分离方法主要有：组织块培养法、酶解法。
组织块培养法的培养周期长，从而加大了培养过程中污染的几率，并且加大了成本。此外，组织块培养法占用空间大，不适于大规模批量化的生产。
酶解法的培养周期短，占用空间小，适用于大规模培养。
但是，现在多数酶解法都是采用较高浓度(0.2％～1％)的胶原酶进行酶解，或者采用胶原酶与胰酶联合进行酶解，都对细胞有损伤。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可减小细胞损伤的提取及培养人脐带间充质干细胞的方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：取健康产妇39周～40周正常分娩或剖腹产脐带组织；
Step2：从脐带组织中分离出华通氏胶；
Step3：将华通氏胶置于培养皿中，切割成组织匀浆，然后转入离心管中，按体积比1：1的比例加入预温的0.1％胶原酶I，放入到CO2培养箱中在37℃条件下进行恒温酶解，每隔20min剧烈震荡一次，酶解2h左右观察酶解效果，当组织块已被酶解成糊状时停止酶解，用注射器抽取酶解液贴着400目细胞筛进行过滤，向滤液中补加PBS重悬细胞，300G离心5min，去掉上清，再次用PBS重悬细胞并离心洗涤，最后用细胞培养液将细胞重悬并转移至T75培养瓶中；
Step4：将装有UCMSC的T75培养瓶放置于CO2培养箱中，在37℃条件下恒温培养，每天观察UCMSC的生长情况，当细胞融合度达到80％时，执行P0～P1传代操作；
Step5：用移液器移去T75培养瓶内的细胞培养液，用PBS洗两遍，然后向T75培养瓶中加入4倍稀释的Accutase酶液2ml，消化1min～2min，1000rpm×5min收集细胞，弃去上清液，收集的细胞用D-PBS 1000rpm×5min洗涤一次，弃去上清液，用传代培养液重悬，传代。
前述的方法，其特征在于，在Step1中，前述脐带组织的保存方法为：在手术室洁净条件下，将脐带组织放入预先加注有100ml组织保护液的T75培养瓶中，密封，2℃～8℃条件下保存。
前述的方法，其特征在于，前述组织保护液的成分为：肝素2500IU、庆大霉素16000IU、0.9％生理盐水100ml。
前述的方法，其特征在于，在Step3、Step4和Step5中，所用到的细胞培养液的成分为：α-MEM液体培养基475ml、UltraGRO细胞营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU。
前述的方法，其特征在于，在Step4中，在培养的过程中：
培养的前2d，静置，不要摇动T75培养瓶，让单细胞充分贴壁；
培养的第3d开始，每2d进行一次半量换液。
前述的方法，其特征在于，在Step5中，传代密度为10000个细胞/cm2～15000个细胞/cm2。
本发明的有益之处在于：
1、采用较低浓度(0.1％)的胶原酶I进行酶解，不仅减小了对细胞的损伤，同时降低了提取及培养的成本；
2、整个培养过程不使用血清，提升了人脐带间充质干细胞的安全性。
附图说明
图1(a)是在培养的第3d实施例1中UCMSC的贴壁情况；
图1(b)是在培养的第3d实施例2中UCMSC的贴壁情况；
图2(a)是在培养的第3d实施例1中UCMSC的生长情况；
图2(b)是在培养的第3d实施例3中UCMSC的生长情况；
图3(a)是在培养的第5d实施例1中UCMSC的生长情况；
图3(b)是在培养的第5d实施例3中UCMSC的生长情况；
图4(a)是在培养的第7d实施例1中UCMSC的生长情况；
图4(b)是在培养的第7d实施例3中UCMSC的生长情况；
图5(a)是在培养的第10d实施例1中UCMSC的生长情况；
图5(b)是在培养的第10d实施例3中UCMSC的生长情况；
图6(a)是在培养的第13d实施例1中UCMSC的生长情况；
图6(b)是在培养的第13d实施例3中UCMSC的生长情况；
图7(a)至图7(e)是实施例1中P3代UCMSC的流式检测结果；
图8(a)至图8(e)是实施例3中P3代UCMSC的流式检测结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1
1、获取脐带组织
取健康产妇39周～40周正常分娩(或剖腹产)脐带组织，在手术室洁净条件下将脐带组织放入预先加注有100ml组织保护液的T75培养瓶中，密封，2℃～8℃条件下保存。
组织保护液的成分为：肝素2500IU、庆大霉素16000IU、0.9％生理盐水100ml。
2、分离华通氏胶
将脐带组织置于百级超净台环境下的培养皿中，用PBS将组织表面血污清洗干净，然后将脐带剪成小段，并去除脐带内2条动脉和1条静脉以及脐带表面羊膜，剩余部分即为华通氏胶，最后用镊子和手术刀分离出华通氏胶。
3、分离UCMSC
将分离出的华通氏胶置于15cm培养皿中，用手术刀将华通氏胶切割成1mm3左右大小的组织匀浆。将组织匀浆转入50ml离心管中，按体积比1：1的比例加入预温的0.1％胶原酶I，放入到CO2培养箱中在37℃条件下进行恒温酶解，每隔20min剧烈震荡一次，酶解2h左右观察酶解效果，当组织块已被酶解成“糊”状时停止酶解，用注射器抽取酶解液贴着400目细胞筛进行过滤，向滤液中补加PBS重悬细胞，300G离心5min，去掉上清，再次用PBS重悬细胞并离心洗涤，最后用细胞培养液将细胞重悬后转移至T75培养瓶中。
细胞培养液的成分：α-MEM液体培养基475ml、UltraGRO细胞营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU。
4、原代培养UCMSC
将装有UCMSC的T75培养瓶放置于CO2培养箱中，在37℃条件下恒温培养，每天观察UCMSC的生长情况。
培养的前2d，静置，不要摇动T75培养瓶，让单细胞充分贴壁。
培养的第3d开始，每2d进行一次半量换液，当细胞融合度达到80％时，执行P0～P1传代操作。
细胞培养液的成分：α-MEM液体培养基475ml、UltraGRO细胞营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU。
5、传代培养UCMSC
用移液器移去T75培养瓶内的细胞培养液，用PBS洗两遍，然后向T75培养瓶中加入4倍稀释的Accutase酶液2ml，消化1min～2min，1000rpm×5min收集细胞，弃去上清液，收集的细胞用D-PBS1000rpm×5min洗涤一次，弃去上清液，用细胞培养液重悬，传代，传代密度为10000个细胞/cm2～15000个细胞/cm2。
细胞培养液的成分：α-MEM液体培养基475ml、UltraGRO细胞营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU。
实施例2
1、获取脐带组织
取健康产妇39周～40周正常分娩(或剖腹产)脐带组织，在手术室洁净条件下将脐带组织放入预先加注有100ml组织保护液的T75培养瓶中，密封，2℃～8℃条件下保存。
组织保护液的成分为：肝素2500IU、庆大霉素16000IU、0.9％生理盐水100ml。
2、分离华通氏胶
将脐带组织置于百级超净台环境下的培养皿中，用PBS将组织表面血污清洗干净，然后将脐带剪成小段，并去除脐带内2条动脉和1条静脉以及脐带表面羊膜，剩余部分即为华通氏胶，最后用镊子和手术刀分离出华通氏胶。
3、原代培养UCMSC
将分离出的华通氏胶置于15cm培养皿中，用手术刀将华通氏胶切割成1mm3左右大小的组织匀浆。将组织匀浆转入50ml离心管中，按体积比1：1的比例加入预温的0.5％胶原酶I，放入到CO2培养箱中在37℃条件下进行恒温酶解，每隔20min剧烈震荡一次，酶解1h～2h左右观察酶解效果，当组织块已被酶解成“糊”状时停止酶解，用注射器抽取酶解液贴着400目细胞筛进行过滤，向滤液中补加PBS重悬细胞，300G离心5min，去掉上清，再次用PBS重悬细胞并离心洗涤，用细胞培养液将细胞重悬后转移至T75培养瓶中。
细胞培养液的成分：α-MEM液体培养基475ml、UltraGRO细胞营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU。
4、原代培养UCMSC
将装有UCMSC的T75培养瓶放置于CO2培养箱中，在37℃条件下恒温培养，每天观察UCMSC的生长情况。
培养的前2d，静置，不要摇动T75培养瓶，让单细胞充分贴壁。
培养的第3d开始，每2d进行一次半量换液，当细胞融合度达到80％时，执行P0～P1传代操作。
细胞培养液的成分：α-MEM液体培养基475ml、UltraGRO细胞营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU。
实施例3
1、获取脐带组织
取健康产妇39周～40周正常分娩(或剖腹产)脐带组织，手术室洁净条件下将脐带组织放入预先加注有100ml组织保护液的T75培养瓶中，密封，2℃～8℃条件下保存。
组织保护液的成分为：肝素2500IU、庆大霉素16000IU、0.9％生理盐水100ml。
2、分离华通氏胶
将脐带组织置于百级超净台环境下的培养皿中，用PBS将组织表面血污清洗干净，然后将脐带剪成小段，并去除脐带内2条动脉和1条静脉以及脐带表面羊膜，剩余部分即为华通氏胶，最后用镊子和手术刀分离出华通氏胶。
3、原代培养UCMSC
将分离出的华通氏胶置于15cm培养皿中，用手术刀将华通氏胶切割成1mm3左右大小的组织匀浆。将组织匀浆转移至T75培养瓶中，置于CO2培养箱中倒置1h，1h后加入适量细胞培养液使组织匀浆湿润，之后将T75培养瓶置于CO2培养箱中，在37℃条件下恒温培养，每天观察UCMSC的生长情况。
培养的前3d，静置，不要摇动T75培养瓶，让单细胞充分贴壁。
培养的第4d，补加细胞培养液5ml，之后每2d～3d进行一次半量换液。
培养的第8d～11d，在大部分组织块都有细胞爬出后，去掉组织块并全量换液，在细胞融合度达到80％时，进行P0～P1传代扩增。
细胞培养液的成分：α-MEM液体培养基475ml、UltraGRO细胞营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU。
4、传代培养UCMSC
用移液器移去T75培养瓶内的细胞培养液，用PBS洗两遍，然后向T75培养瓶中加入4倍稀释的Accutase酶液2ml，消化1min～2min，1000rpm×5min收集细胞，弃去上清液，收集的细胞用D-PBS1000rpm×5min洗涤一次，弃去上清液，用细胞培养液重悬，传代，传代密度为10000个细胞/cm2～15000个细胞/cm2。
细胞培养液的成分：α-MEM液体培养基475ml、UltraGRO细胞营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU。
我们将实施例1和实施例2在培养UCMSC的第3d所观察到的UCMSC的贴壁情况进行了对比，实施例1中UCMSC的贴壁情况见图1(a)，实施例2中UCMSC的贴壁情况见图1(b)。
由图1(a)和图1(b)可知，实施例1与实施例2二者的贴壁细胞量差别不大，但是实施例1的杂细胞数量较少，背景更干净。
我们又将实施例1和实施例3在培养UCMSC的前13d所观察到的UCMSC的生长情况进行了对比，具体如下：
培养天数 实施例1 实施例3
3d 少量细胞贴壁 未见细胞爬出
5d 细胞融合度35％ 未见细胞爬出
7d 细胞融合度80％以上，P0～P1传代 极少量细胞爬出
10d 细胞融合度80％以上，P1～P2传代 细胞大范围爬出
13d 细胞融合度80％以上，P2～P3传代 P0～P1传代
在培养的第3d，实施例1和实施例3UCMSC的生长情况分别见图2(a)和图2(b)。
在培养的第5d，实施例1和实施例3UCMSC的生长情况分别见图3(a)和图3(b)。
在培养的第7d，实施例1和实施例3UCMSC的生长情况分别见图4(a)和图4(b)。
在培养的第10d，实施例1和实施例3UCMSC的生长情况分别见图5(a)和图5(b)。
在培养的第13d，实施例1和实施例3UCMSC的生长情况分别见图6(a)和图6(b)。
我们又对实施例1和实施例3P3代UCMSC做了流式检测，检测结果见图7(a)至图7(e)、图8(a)至图8(e)。
流式结果显示：实施例1P3代UCMSC与实施例3P3代UCMSC并无差异，并且都符合标准。
由此可见，采用本发明的方法得到的UCMSC(实施例1)与采用常规方法(实施例3)得到的UCMSC相比，二者质量无差别，但是实验组能够大大缩短细胞培养周期，更适用于大规模生产。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：取健康产妇39周～40周正常分娩或剖腹产脐带组织；
Step2：从脐带组织中分离出华通氏胶；
Step3：将华通氏胶置于培养皿中，切割成组织匀浆，然后转入离心管中，按体积比1：1的比例加入预温的0.1％胶原酶I，放入到CO2培养箱中在37℃条件下进行恒温酶解，每隔20min剧烈震荡一次，酶解2h左右观察酶解效果，当组织块已被酶解成糊状时停止酶解，用注射器抽取酶解液贴着400目细胞筛进行过滤，向滤液中补加PBS重悬细胞，300G离心5min，去掉上清，再次用PBS重悬细胞并离心洗涤，最后用细胞培养液将细胞重悬并转移至T75培养瓶中；
Step4：将装有UCMSC的T75培养瓶放置于CO2培养箱中，在37℃条件下恒温培养，每天观察UCMSC的生长情况，当细胞融合度达到80％时，执行P0～P1传代操作；
Step5：用移液器移去T75培养瓶内的细胞培养液，用PBS洗两遍，然后向T75培养瓶中加入4倍稀释的Accutase酶液2ml，消化1min～2min，1000rpm×5min收集细胞，弃去上清液，收集的细胞用D-PBS 1000rpm×5min洗涤一次，弃去上清液，用传代培养液重悬，传代。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在Step1中，所述脐带组织的保存方法为：
在手术室洁净条件下，将脐带组织放入预先加注有100ml组织保护液的T75培养瓶中，密封，2℃～8℃条件下保存。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述组织保护液的成分为：
肝素2500IU、庆大霉素16000IU、0.9％生理盐水100ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在Step3、Step4和Step5中，所用到的细胞培养液的成分为：
α-MEM液体培养基475ml、UltraGRO细胞营养添加物25ml、肝素钠1000IU、硫酸庆大霉素40000IU。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在Step4中，在培养的过程中：
培养的前2d，静置，不要摇动T75培养瓶，让单细胞充分贴壁；
培养的第3d开始，每2d进行一次半量换液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在Step5中，传代密度为10000个细胞/cm2～15000个细胞/cm2。
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尹富华等: "人脐带间充质干细胞3种分离制备方法的比较", 《临床检验杂志》 *
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