CN104622902A - 一种用于治疗肝纤维化的干细胞制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于治疗肝纤维化的干细胞制剂及其制备方法，所述的治疗肝纤维化的干细胞制剂，是由人经血间充质干细胞与趋化因子CXCL8和生理盐水配制而成，该经血间充质干细胞获取方法简单，不受伦理限制，且其细胞活力高，增殖力强，具有多向分化潜能，制备简便；本发明的经血间充质干细胞制剂输注技术操作简单方便，利用经血间充质干细胞治疗肝纤维化，开发用于治疗组织损伤的干细胞制剂街制备方法具有非常重要的临床意义和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种干细胞在疾病治疗中的应用，特别涉及经血来源的间充质干细胞在治疗肝纤维化中的应用。
背景技术
肝纤维化是多数终末期肝病的病理特征之一，肝纤维化若得不到有效治疗，最终将会发展为肝硬化、肝癌，严重威胁患者生命。肝纤维化的本质是细胞外基质中胶原合成增多、降解减少，致使细胞外基质过多沉积于肝内，影响肝脏的正常功能。目前认为肝纤维化形成的机制在于，肝细胞损伤和肝组织炎症，激活了枯否氏(Kupffer)细胞、肝细胞、血小板或窦内皮细胞分泌细胞因子、脂质过氧化物等，这些化学递质共同作用于肝星状细胞，使之转变为肌纤维母细胞，合成大量的胶原和蛋白多糖等细胞外基质沉积引起肝纤维化。
肝纤维化的治疗主要集中在纤维化过程的延缓和逆转，以及阻止功能性肝细胞减少两个方面。肝脏移植被认为是目前治疗肝纤维化的有效方法之一，但由于肝源不足、移植费用昂贵、手术风险高以及移植后并发症严重等原因的限制，肝脏移植难以大范围推广。生物人工肝虽然能够在一定程度上替代肝脏的部分代谢功能，但同样存在人工肝解毒能力有限、异体排斥反应、体外细胞培养受限等问题，并不能根除功能性肝细胞减少造成的病理症状。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一类具有多分化潜能、免疫调节功能的成体干细胞，间充质干细胞容易分离培养，便于体外扩增，能分泌多种细胞因子，研究表明间充质干细胞在一定程度上可以延缓和逆转肝纤维化，再生肝细胞，为肝纤维化的临床治疗提供新思路。在已分离培养的各类间充质干细胞中，骨髓间充质干细胞因其数量和增殖分化潜能随供体年龄增大而下降，且在分离培养过程中易受病毒感染，直接影响其安全性，制约了大规模使用。尽管脐带血间充质干细胞的安全性可以得到保证，但其数量少，频率低，培养方案不统一，传代培养困难，不易大量获得。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种数量多，频率高，培养方案统一，传代培养容易，能大量获得的人经血间充质干细胞的制剂。
为实现发明目的，本发明所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂，是由人经血间充质干细胞与趋化因子CXCL8和生理盐水配制而成。
优选的，所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂，其人经血间充质干细胞的浓度为(1～3)×106/ml，趋化因子CXCL8的浓度为(0.1～0.2)ng/ml，所述生理盐水为150～250ml。
优选的，所述的趋化因子CXCL8的体积含量为0.1％。
优选的，所述人经血间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞，该细胞表达CD29，CD44，CD73和CD 90，不表达CD34，CD45，CD117和HLA-DR。
本发明的另一目的还在于一种用于治疗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)单核细胞分离：将收集到的经血样品进行常规微生物和传染病病原体安全检测，采用1.0779/ml的Ficoll进行密度梯度离心，分离合格样品的单核细胞；
(2)间充质干细胞分离培养：用PBS将分离到的单核细胞洗涤3次，调节细胞密度至(3～5)×106个细胞/ml，接种于培养瓶中置37℃、5％CO2培养箱中培养，用细胞培养液孵育细胞；细胞培养48小时后，胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗涤细胞，间充质干细胞重新接种于新的培养瓶，每周传代2次，直至细胞达到所需要细胞浓度，即终止传代培养。
(3)经血间充质干细胞制剂配制：将收集的经血干细胞用150～250ml的生理盐水调节细胞数目为(1～3)×106/ml并加入浓度为(0.1～0.2)ng/ml体积含量为0.1的趋化因子CXCL8配制成经血干细胞注射液。
优选的，所述的步骤2)中用到的细胞培养液包括DMEM培养基，双抗培养基，两性霉素B，谷氨酰胺和胎牛血清混合物。
优选的，所述的细胞培养液为DMEM培养基，体积含量为1％的双抗培养基，体积含量为1％两性霉素B，体积含量为1％谷氨酰胺和体积含量为20％胎牛血清的混合物。
本发明关于用于治疗肝纤维化的干细胞制剂采用人经血间充质干细胞与趋化因子CXCL8和生理盐水配制而成的源自：经血间充质干细胞(menstrual bloodmesenchyme stem cells,MBMSC)是源自健康女性经血中的间充质干细胞，这种细胞扩增能力强，分泌细胞因子种类多；具有多向分化潜能，可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经细胞等多种细胞；免疫原性低，无侵入性；获取方法简单、安全，不受伦理限制。MBMSC由于其具有以上这些优点，已经应用于帕金森综合征、脑中风、糖尿病、肝硬化等疾病的治疗研究中，并取得了良好的治疗效果。已有研究表明，MSC体内移植后能够分化为肝实质细胞，抑制星状细胞形成，因此经血MSC具有治疗肝纤维化的潜能。MSC体内移植一般采取静脉输注的方式，因此提高经血MSC在体内的活性及定向迁移能力是临床应用的关键。
研究表明趋化因子CXCL8对中性粒细胞有趋化作用，参与组织炎症反应。肝纤维化中CXCL8的表达显著升高，在肝硬化阶段仍维持高水平状态。CXCL8既可以直接的趋化骨髓来源的MSC，又可以增强基质细胞衍生因子l对BMMSC的趋化作用。因此本发明利用趋化因子CXCL8制备经血干细胞注射液，促进MBMSC向纤维化肝组织聚集，提高损伤修复的能力。
本发明的有益效果主要体现在：经血间充质干细胞获取方法简单，不受伦理限制，且其细胞活力高，增殖力强，具有多向分化潜能，制备简便；将人经血间充质干细胞移植到肝纤维化模型的小鼠和患者体内，能显著调理受损肝脏组织的微环境，改善肝功能状态，促进肝脏病理恢复；本发明的经血间充质干细胞制剂输注技术操作简单方便，利用经血间充质干细胞治疗肝纤维化，开发用于治疗组织损伤的的干细胞制剂街制备方法具有非常重要的临床意义和广阔的应用前景。
附图说明
图1为肝脏组织病理切片检查结果(HE染色，放大200倍)；
图2为实施定量PCR检测各处理组的脯肽酶基因表达水平的改变；
图3为经血干细胞移植入肝脏后的免疫荧光失踪图。
(一)具体实施方式
下面以小鼠肝纤维化模型为例，结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：经血干细胞注射液的制备
收集供者的经血样品，进行常规微生物和传染病病原体安全检测，采用1.0779/ml的Ficoll进行密度梯度离心，分离合格样品的单核细胞，用PBS将分离到的单个核细胞洗涤3次，调节细胞密度至(3-5)×106个细胞/ml，接种于底面积为75cm2的培养瓶中置37℃、5％CO2培养箱中扩增培养，用DMEM培养基，体积含量为1％的双抗培养基，体积含量为1％两性霉素B，体积含量为1％谷氨酰胺和体积含量为20％胎牛血清的细胞培养液孵育细胞；细胞培养48小时后，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化5min，加入适当体积完全培养基中和胰蛋白酶活性，并用吸管轻轻吹打，悬浮贴壁细胞。PBS洗涤细胞，间充质干细胞重新接种于新的培养瓶，每周传代2次，直至细胞达到所需要细胞浓度，即终止传代培养。
将收集的经血干细胞分三组，用生理盐水调节细胞数目为l×106个细胞/ml、2×106个细胞/ml和4×106个细胞/ml，每组中分别加入(0.1～0.2)ng/ml趋化因子CXCL8，配制成经血干细胞注射液。
上述的经血干细胞呈成纤维样贴壁生长，流式细胞仪检测显示该细胞大多数表达CD29，CD44，CD73和CD90，不表达CD34，CD45，CD117和HLA-DR。体外可以诱导为成骨细胞和成脂细胞，体内移植可以快速达到肝脏组织。
实施例2：小鼠肝纤维化模型建立
ICR小鼠腹腔注射CCl4(以l ml CCl4/kg的剂量注射含10％CCl4的橄榄油)建立肝纤维化模型，每周注射2次，连续注射4周。
实施例3：经血干细胞的移植试验
尾静脉注射移植实验：肝纤维化模型小鼠分为3组，分别通过尾静脉注射移植l×106个细胞/100μl、2×106个细胞/100μl和4×106个细胞/100μl的细胞剂量，另注射100μl PBS作为对照，均为1次注射。移植期间保持CCl4注射直至小鼠麻醉处死取样。
小鼠生活状况评价：对照组小鼠活动活跃，皮毛有光泽，饮食量正常。模型组小鼠活动减少，皮毛干涩，饮食量也减少。治疗组小鼠活动逐渐活跃，皮毛干涩程度降低，饮食量有所增加。
肝功能指标：细胞移植后第28天，将模型组、对照组和移植组小鼠乙醚麻醉后眼眶取血，采用放射免疫法测定血清III型前胶原、IV型胶原、层黏连蛋白和透明质酸酶水平，详见表1.。采用全自动生物化学分析仪测定ALT、AST和总胆红素。详见表2.
表1：血清学检测结果
表2：肝功能检测结果
肝脏病理切片检查结果：HE染色，光学显微镜下观察，模型组显示肝组织损害严重，肝细胞明显肿胀变性，肝小叶结构紊乱，胶原纤维增生显著，且包绕干细胞形成硬化结节。移植组肝脏病理结构显示肝细胞变性减少，胶原纤维沉积较少，呈现正常肝小叶结构。详见图1，A：正常肝脏组织切片。B：诱导模型的肝脏组织切片。C：移植治疗后的肝组织切片。
PLD(脯肽酶)基因水平检测结果：采用实时定量PCR技术分析见图2，移植组小鼠肝脏PLD(脯肽酶)基因表达水平明显高于模型对照组，两组之间存在显著性差异。
经血干细胞的移植入肝脏的证据：取9只小鼠，随机分为3组，3只/组，分别示踪移植后4天，7天和14天的细胞定位，用于示踪的细胞经携带绿色荧光的慢病毒感染后，以2×106个细胞/100μl的剂量输给肝纤维化小鼠模型，移植后的4天，7天和14天采集小鼠的新鲜肝脏标本，冰冻切片结果显示携带绿色荧光的经血干细胞成功地植入小鼠肝脏。详见图3，A：植入4天的结果；B：植入7天的结果；C：植入14天的结果。
本发明的优点在于：将人经血间充质干细胞移植到肝纤维化模型的小鼠和患者体内，能显著调理受损肝脏组织的微环境，改善肝功能状态，促进肝脏病理恢复。本发明所利用的经血间充质干细胞活力高，增殖力强，具有多向分化潜能，制备简便，不受伦理限制。本发明的经血间充质干细胞制剂输注技术操作简单方便，利用经血间充质干细胞治疗肝纤维化，开发用于治疗组织损伤的的干细胞制剂街制备方法具有非常重要的临床意义和广阔的应用前景。以上实验列举的仅仅是本发明的若干具体实例，显然，本发明还有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于治疗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于所述的干细胞制剂是由人经血间充质干细胞与趋化因子CXCL8和生理盐水配制而成。
2.根据权利要求1所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于人经血间充质干细胞的浓度为(1～3)×106/ml，趋化因子CXCL8的浓度为(0.1～0.2)ng/ml，所述生理盐水为150～250ml。
3.根据权利要求1或2所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于所述的趋化因子CXCL8的体积含量为0.1％。
4.根据权利要求1或2所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于所述人经血间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞，该细胞表达CD29，CD44，CD73和CD90，不表达CD34，CD45，CD117和HLA-DR。
5.一种用于治疗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤
(1)单核细胞分离：将收集到的经血样品进行常规微生物和传染病病原体安全检测，采用1.0779/ml的Ficoll进行密度梯度离心，分离合格样品的单核细胞；
(2)间充质干细胞分离培养：用PBS将分离到的单核细胞洗涤3次，调节细胞密度至(3～5)×106个细胞/ml，接种于培养瓶中置37℃、5％CO2培养箱中培养，用细胞培养液孵育细胞；细胞培养48小时后，胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗涤细胞，间充质干细胞重新接种于新的培养瓶，每周传代2次，直至细胞达到所需要细胞浓度，即终止传代培养。
(3)经血间充质干细胞制剂配制：将收集的经血干细胞用150～250ml的生理盐水调节细胞数目为(1～3)×106/ml并加入浓度为(0.1～0.2)ng/ml体积含量为0.1的趋化因子CXCL8配制成经血干细胞注射液。
6.根据权利要求5所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤2)中用到的细胞培养液包括DMEM培养基，双抗培养基，两性霉素B，谷氨酰胺和胎牛血清混合物。
7.根据权利要求6所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，其特征在于细胞培养液为DMEM培养基，体积含量为1％的双抗培养基，体积含量为1％两性霉素B，体积含量为1％谷氨酰胺和体积含量为20％胎牛血清的混合物。
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