CN105647872A - 一种肝损伤靶向间充质干细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝损伤靶向间充质干细胞及其制备方法与应用，由间充质干细胞转染或感染核酸制备得到，其高表达miR-26b，具体制备为将人间充质干细胞转染miR-26b？mimic或感染表达miR-26b的病毒制备得到；为了进一步提高MSCs靶向肝损伤部位的效率，改善肝功能和组织结构恢复的效果，可以利用碱性成纤维细胞生长因子处理间充质干细胞。本发明的肝损伤靶向间充质干细胞对肝损伤有高效的靶向性，有助于减轻肝纤维化、改善肝功能，稳定性高，便于保存和运输，使用安全，可为肝病患者带来福音。

Description

一种肝损伤靶向间充质干细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肝损伤靶向间充质干细胞及其制备方法与应用。

背景技术

肝脏是人体最大的消化器官，担负着繁重而复杂的任务，除物质代谢外，还具有内分泌和免疫调节等功能。肝脏所担负的物质代谢功能也决定了它是最易遭受外界因素损伤的器官之一，许多毒害物质的靶器官都是肝脏。各种原因如病毒、寄生虫感染、乙醇、药物或化学毒害以及免疫功能紊乱等均能引起急、慢性肝损伤，长期或反复作用还可能导致肝硬化甚至发展到肝衰竭、终末期肝病。肝病一旦发展到终末期，常规治疗仅能缓解患者的临床症状，且疗效不佳。肝移植被认为是治疗终末期肝病的唯一有效手段，但由于供肝严重缺乏、术后免疫抑制剂长期使用、围手术期风险以及高额费用等问题，限制了肝移植的广泛应用，每年有大量的肝病患者因肝功能衰竭而死亡。

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞。MSCs最初在骨髓中发现，因其具有自我复制、多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控、异体移植不易发生免疫排斥等特点而日益受到人们的关注。如MSCs在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。因其处于未分化状态，增殖能力活跃，可以在体外大量培养、扩增，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。国内外已有学者将不同来源的MSCs应用于肝病动物模型、临床前及临床肝病的治疗，取得了一些有意义的发现和可喜的治疗效果。研究显示，MSCs在体外可被诱导分化成具有肝细胞的形态、表型和功能特征的细胞，此类细胞能表达白蛋白(albumin)、甲胎蛋白(alpha-fetalprotein,AFP)、细胞角蛋白(cytokeratins,CK)CK8、CK18等肝系细胞和胆管细胞的特异性标志物；大鼠MSCs移植到体内后能转分化为肝细胞样细胞，表达肝细胞特异性标志物白蛋白；动物实验和临床研究结果显示，自体骨髓来源MSCs移植能够显著改善肝功能，减轻肝纤维化、肝腹水等症状。

但MSCs移植治疗肝病仅处于理论阶段，在临床应用中仍存在许多亟待解决的问题。虽然大多数实验表明MSCs对肝损伤有修复作用，但疗效并不稳定，个体差异较大；更有研究显示MSCs移植对肝功能、组织结构的修复无作用，甚至有负面的影响。究其原因，一方面，移植的MSCs只有定植/归巢到病变部位，才能有效地发挥治疗和修复作用，但体内研究发现只有少量的移植细胞富集到了损伤或病变部位；其次，移植的MSCs定植到肝损伤部位，有的分化为肝巨噬细胞(kupffercell)，而肝巨噬细胞对于肝星形细胞(hepaticstellatecell)的活化、增殖、迁移、存活等有促进作用，不利于炎症和纤维化的修复；有的召集肌成纤维细胞(myofibroblast)而促进其分泌胶原产生纤维化；有的可以转分化为功能性的肝星形细胞和肌成纤维细胞，更多地分泌胶原等细胞外基质，从而进一步增强了肝脏的纤维化损伤（参见：ZhaoQ,RenH,ZhuD,HanZ.Stem/progenitorcellsinliverinjuryrepairandregeneration.BiolCell,2009,101(10):557-571；JiJ,HeBP,DheenST,TaySS.Interactionsofchemokinesandchemokinereceptorsmediatethemigrationofmesenchymalstemcellstotheimpairedsiteinthebrainafterhypoglossalnerveinjury.StemCells,2004,22(3):415-427）。因此，提高MSCs在病变组织的定植能力，增加归巢至损伤部位的细胞数量将有助于改善移植治疗效果，并且，改善MSCs移植治疗肝损伤的效果，还需要减轻或避免其促炎、促纤维化等副作用。从而很有必要对移植的MSCs种子细胞进行修饰和质量控制。

发明内容

本发明目的是提供一种高效肝损伤靶向间充质干细胞及其制备方法，增加归巢到病灶部位的MSCs数量，提高间充质干细胞在病灶部位的定植能力；有助于提高MSCs对肝损伤的靶向性，改善MSCs对肝功能和肝组织结构的治疗和修复效果。

本发明采用以下技术方案实现本发明目的：

一种肝损伤靶向间充质干细胞，由间充质干细胞转染或感染核酸制备得到；所述核酸为miR-26b。优选的所述肝损伤靶向间充质干细胞由间充质干细胞转染或感染核酸后，再经过碱性成纤维细胞生长因子处理得到。

上述技术方案中，所述间充质干细胞来源于骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带、脐带血、羊水或者胎盘。本发明中的间充质干细胞来源广泛，可以是自体的，也可以是异体的，来源充足，细胞的增殖、存活、分化、迁移、合成与分泌因子等各方面能力优良，无伦理问题、免疫原性低，应用前景广阔。

本发明还公开了上述肝损伤靶向间充质干细胞的制备方法，通过转染试剂将miR-26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞；或者通过病毒载体将miR-26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞。本发明使MSCs高表达miR-26b的方法，包括利用各种转染试剂，包括脂质体转染试剂，如Lipofectamine2000等，转染miR-26b；也包括利用临床上证实安全有效的病毒，如腺相关病毒AAV、腺病毒Adenovirus、逆转录病毒、慢病毒等，构建表达miR-26b前体的重组病毒，感染MSCs。转染或感染24～48h后，RT-qPCR检测miR-26b显著高表达，得到肝损伤靶向的间充质干细胞。

上述技术方案中，通过转染试剂将miR-26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞的步骤为将miR-26b模拟物与转染试剂分别用L-DMEM稀释后混合，室温静置得到转染混合液；然后将培养至第4～8代、汇合度达80%～90%的间充质干细胞经PBS洗涤，再加入转染混合液和L-DMEM；然后于37℃培养箱中孵育5～6h，接着将转染混合液更换为完全培养基，继续培养36～48h即可得到肝损伤靶向间充质干细胞；通过病毒载体将miR-26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞的步骤为将培养至第4～8代、汇合度达80%～90%的间充质干细胞经PBS洗涤，然后加入表达miR-26b的病毒上清液，37℃感染90min后，病毒上清液更换为完全培养基继续培养24～48h即可得到肝损伤靶向间充质干细胞。比如将50nMmiR-26bmimic与5μlLipofectamine2000以250μlL-DMEM分别稀释，室温静置10min后将二者合并，室温静置30min。将培养至第4～8代、汇合度达80%～90%的MSCsPBS洗2次，加入转染混合液和500μlL-DMEM，37℃培养箱中孵育6h，更换为完全培养基，继续培养48h即可。或者选择培养至第4～8代、汇合度达80%～90%的MSCs，PBS洗2次，加入表达miR-26b的病毒上清液，37℃感染90min后，更换为完全培养基继续培养24～48h，RT-qPCR检测miR-26b显著高表达且细胞状态良好，即可得到肝损伤靶向的间充质干细胞。

上述技术方案中，通过转染试剂将miR-26b转入间充质干细胞，然后再经过碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)处理得到肝损伤靶向间充质干细胞；或者通过病毒载体将miR-26b转入间充质干细胞，然后再经过碱性成纤维细胞生长因子处理得到肝损伤靶向间充质干细胞。比如将转入miR-26b的间充质干细胞置入带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，处理0.5～24h得到肝损伤靶向间充质干细胞；所述带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5～20ng/mL；使用bFGF处理MSCs，可进一步提高MSCs靶向肝损伤部位的效率，改善肝功能和组织结构恢复的效果。

MicroRNAs(miRNAs)是一种小的、类似于siRNA的核酸分子，由基因组编码，在不同的组织细胞类型中miRNAs分子的表达谱和表达量有很大差异，因此不同miRNA的功能不同，即便是同一种miRNA在不同的组织细胞类型中所发挥的功能可能也有很大差异。不同修饰状态的间充质干细胞与体内细胞因子的亲和力不同，使得趋化、定植数量不同，定植于肝脏的间充质干细胞数量不同，分化、转分化效率及旁分泌等作用强弱就不同，其发挥的生物学效应也不同，对疾病的改善亦有所差异。

本发明公开的肝损伤靶向间充质干细胞可以高效定植于肝损伤部位，避免血流冲刷或者自然脱落，增加归巢细胞量，并且低表达smad蛋白，避免移植MSCs存在的促纤维化风险，从而不仅有效发挥间充质干细胞修复肝损伤部位的组织结构与功能的作用，更降低了现有MSCs存在的促纤维化风险，真正实现移植间充质干细胞的肝损伤修复。因此本发明还公开了上述肝损伤靶向间充质干细胞在制备治疗肝损伤的靶向药物中的应用；引起肝损伤的途径主要为病毒感染、寄生虫感染、乙醇毒害、药物毒害、化学毒害或者免疫功能紊乱等，动物体内肝损伤主要表现为病灶部位细胞凋落、组织坏死等，对于肝损伤的修复主要是通过各种方法稳定保护受损的肝细胞，促进病变细胞恢复，刺激正常肝细胞DNA合成，促进肝细胞再生，减轻肝纤维化，以重建正常的肝组织结构，修复肝功能。间充质干细胞药物一般为注射型，通过血管输入，随着血液循环，到达病灶部位。与体外相比，动物体内的血液环境复杂，存在各种物质与因子，而且不同部位的微环境差别大，对间充质干细胞的输送有明显影响；并且肝损伤部位为活性组织，具有自身新陈代谢，还受血流、免疫系统的影响，不利于外来细胞的定植和存活。这也是现有技术中，体外效果不错（增殖、迁移能力强）的间充质干细胞在体内肝损伤部位定植能力差、归巢细胞数量少的主要原因。

本发明公开的间充质干细胞能显著提高归巢于肝脏损伤部位的移植细胞数量，提高细胞定植能力，为有效进行肝损伤修复提供良好的基础；本发明公开的间充质干细胞可以减轻肝纤维化程度，改善肝功能指标，提高免疫功能，降低炎性细胞因子分泌的能力，减轻炎症反应，抑制肝星状细胞活化、阻止细胞外基质的生成，激活卵原细胞，促进肝细胞再生；因此，基于本发明间充质干细胞的靶向药物可以有效修复肝损伤。

本发明中microRNA-26b(miR-26b)调节MSCs的定向富集，在MSCs中表达miR-26b，显著促进了MSCs趋向肝损伤部位的能力；尤其是5～20ng/mL（优选10ng/ml）的bFGF处理后显著促进了表达miR-26b的MSCs趋向肝损伤部位的能力，修复损伤部位的组织结构和功能；并且表达miR-26b的MSCs下调其表达smad蛋白，降低移植MSCs的促纤维化风险，从而有利于肝损伤的修复。根据本发明的实施例，构建了表达miR-26b的重组腺病毒(Ad-26b)，MSCs感染Ad-26b48h后，移植到急、慢性肝损伤模型小鼠体内，移植前一天细胞用含bFGF的培养基处理24h，移植7d、14d后收集小鼠血液分析肝功能，处死小鼠取肝脏组织做冷冻切片和石蜡切片，进行免疫荧光染色、HE染色或Masson染色，观察移植细胞在肝组织中的数量及分布，分析肝组织炎症、纤维化等病理修复情况；结果显示，高表达miR-26b的MSCs移植对肝损伤具有良好的治疗和修复效果，为临床应用提供理论和实验依据。

附图说明

图1为实施例一制备的高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞的表达图；

图2为实施例一的高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞通过尾静脉注射移植到CCl4诱导的急性肝损伤小鼠中7d、14d后肝脏冷冻切片图；

图3为实施例一间充质干细胞肝损伤部位的数量图；

图4为实施例二的高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞通过尾静脉注射移植到CCl4诱导的慢性肝损伤小鼠中7d、14d后肝脏冷冻切片图；

图5为实施例二间充质干细胞肝损伤部位的数量图；

图6为实施例二的高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞通过尾静脉注射移植到CCl4诱导的慢性肝损伤小鼠中7d、14d后肝脏石蜡切片Masson染色图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述。

实施例一高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞移植到急性肝损伤小鼠模型

1.急性肝损伤实验动物模型的准备

昆明种小鼠，40只，雄性。随机数字表法分为正常对照组（10只）和模型组（50只）。模型组均按照5ml/kg剂量一次性皮下注射CCl4与橄榄油等体积(1:1)混合液，正常对照组皮下注射等剂量橄榄油。建模24h后，进行移植实验。

2.MSCs的分离、培养及鉴定

采用人脐带来源的间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，HUCMSCs)。采集新生儿脐带约10cm，去除脐带外膜层和脐带内动静脉，保留华尔通胶，机械法消化，剪碎至约1mm×1mm×1mm，平铺接种于75cm2培养瓶，10%FBS+L-DMEM，37℃，饱和湿度下，5%CO2培养箱培养，倒置相差显微镜下逐日观察，3~5d后半量换液，以后每3d用含10%FBS的L-DMEM全量换液，待细胞融合至50%后去除组织块，继续培养，待细胞融合至80%~90%后传代。取1~5代传代细胞，制成单细胞悬液，以0.4%台盼蓝作为染色剂，用细胞计数板计数活细胞和死细胞，共3次，取3次平均值，计算细胞活率：活细胞率（%）=（未染色细胞数/观察细胞总数）×100%。活率在90%以上。

不同生长周期的HUCMSCs其形态学有其不同特点，利用倒置相差显微镜和荧光显微镜观察细胞的生长情况及形态学特点。

贴壁细胞常规0.25%胰蛋白酶消化，含l0%胎牛血清的L-DMEM液终止，加入含1%FBS的PBS液洗涤后，以FITC标记的CD105(SH2)、CD44抗体及其相应同型对照标记细胞，流式细胞仪检测。

细胞表面CD分子检测：收集培养第1~8代细胞，分成每EP管(1.5ml)1×105细胞，洗涤后重悬于20μl的PBS，分别加入小鼠抗人直标PE或FITC单抗CD90、CD44、CD105、CD73，设立阴性对照。流式细胞仪检测，CellQuest软件分析结果。

3.miR-26b重组腺病毒表达载体(Ad-26b)的构建

利用带有BglⅡ和XhoⅠ酶切位点的rno-miR-26b引物(SEQIDNo.1:5'-CATAGATCTCCCCACATATAACACTG-3';SEQIDNo.2:5'-GGACTCGAGATAGTGAAGGAGGAAGGG-3')，以大鼠间充质干细胞基因组DNA为模版PCR得到目的基因片段，回收目的基因片段，与pMD-19-T载体连接后转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆过夜摇培扩增，提取质粒，BglⅡ和XhoⅠ双酶切鉴定，鉴定正确的阳性克隆送上海生工测序鉴定。测序鉴定完全正确的目的基因片段与腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV利用预设的BglⅡ和XhoⅠ进行双酶切定向克隆，产物转化Top10感受态细胞，单克隆过夜摇培扩增，提取质粒，BglⅡ和XhoⅠ双酶切鉴定，鉴定正确的重组穿梭载体命名为pAdTrack-26b。随后将重组穿梭载体(pAdTrack-26b)与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在BJ5183感受态细胞中的同源重组，从而将目的基因连接到腺病毒表达载体上。先将腺病毒骨架载体pAdEasy-1转化至DNA重组活跃的BJ5183菌株中，在Amp+抗性下培养及摇培重组菌株，制作感受态细胞。将重组穿梭载体pAdTrack-26b用PmeI限制性内切酶线性化以暴露其同源重组位点，将酶切产物转化含pAdEasy-1载体的BJ5183感受态细胞，在Kan+抗性的LB平板上培养，挑取单克隆，摇培、提质粒、琼脂糖凝胶电泳检测提取的质粒，电泳条带的带型、大小与pAdEasy-1类似和相近的可能为重组正确的阳性克隆，进一步将这些质粒用PacI单酶切鉴定，鉴定完全正确即为表达miR-26b的重组腺病毒，命名为pAdEasy-26b，将质粒、菌液分别在-80℃保种。

将上述构建的重组腺病毒骨架质粒pAdEasy-26b，用PacI单酶切，取少量电泳检测，完全酶切的产物以Lipofectamine2000按试剂说明书步骤转染70%汇合的293A细胞中包装。第一轮包装经7~10d收获细胞，反复冻融三次以释放细胞中的病毒，4℃、5000rpm离心5min，收集上清。将长至70%汇合的293A细胞吸尽培养液，PBS洗2遍，加入上述收集的病毒上清夜进行第一轮感染，待50%以上的细胞变圆脱落后，收获细胞，反复冻融三次后收集病毒上清液，按上述步骤进行下一轮感染。如此经3~5轮感染后可得到高滴度病毒液，接下来可感染放大培养的293A细胞以扩增病毒，产生更多更高滴度的表达miR-26b的重组腺病毒，命名为Ad-26b。稀释法或qPCR法检测病毒滴度，达到107pfu/ml即可用于感染宿主细胞，使宿主细胞高表达miR-26b。

4.绿色荧光蛋白(GFP)标记的高表达miR-26b的HUCMSCs细胞

选择培养至第4代的HUCMSCs，培养汇合度达80%~90%，弃培养基，PBS清洗2遍，加入含约20μlAd-26b病毒液（视病毒滴度而定）的L-DMEM，37℃、饱和湿度5%、CO2培养箱感染1.5~2h，去除病毒液，加入完全培养基，继续培养24~48h，荧光显微镜下观察，GFP阳性细胞达70%~80%以上且细胞状态良好可用于细胞移植。以感染空病毒Ad的HUCMSCs作为对照细胞。

图1为上述高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞及miR-26b的表达定量图；分离培养的人脐带来源间充质干细胞HUCMSCs，多次传代后，经台盼蓝染色测定，各代次细胞活率均在95%以上；流式细胞仪检测结果显示，培养至第3代以后的细胞表达CD90+、CD44+、CD105+、CD73+，而NOT-HUCMSCs阴性，符合HUCMSCs的生物学特征。感染表达miR-26b的重组腺病毒(Ad-26b)48h后，miR-26b的表达量比感染空病毒的对照组显著上调。

5.移植用细胞悬液的准备

（1）HUCMSCs感染高表达miR-26b的病毒载体(Ad-26b)及对照病毒(Ad)，继续培养48h后，得到高表达miR-26b的细胞(Ad-26b–HUCMSCs)及对照细胞(Ad-HUCMSCs)，可用于细胞移植。移植前，细胞弃原培养基，PBS洗2次，加入0.25%胰蛋白酶消化液消化，在显微镜下观察细胞短缩变形后，加入完全培养基终止消化，吹打细胞制成单细胞悬液，1000r/min，离心5min，去除上清液，再用生理盐水重悬、洗涤、离心2次，将培养液成分去除。加入生理盐水重悬细胞，细胞计数，调整细胞密度为2×106/ml，标记为Ad-26b-HUCMSCs、Ad-HUCMSCs细胞悬液，4-10℃储存备用，存储有效期为12h。

为了进一步提高MSCs靶向肝损伤部位的效率，改善肝功能和组织结构恢复的效果，Ad-26b-HUCMSCs、Ad-HUCMSCs细胞于移植前换用含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的培养基培养20h，然后按（1）所述步骤消化、洗涤、生理盐水重悬，制成2×106/ml的bFGF处理的Ad-26b-HUCMSCs、Ad-HUCMSCs细胞悬液。

6.细胞移植

急性损伤动物模型随机分为细胞治疗组（40只）和模型对照组（10只）。细胞移植治疗组分别尾静脉一次性给予Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液、bFGF处理的Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液、Ad-HUCMSCs细胞悬液、bFGF处理的Ad-HUCMSCs细胞悬液，剂量为1.0×106/kg。模型对照组尾静脉给予等剂量生理盐水。正常对照组动物尾静脉一次性给予等剂量生理盐水。

在移植细胞后的第7d和14d分别随机选择5只小鼠，乙醚麻醉后摘眼球取血，检测ALT、AST、ALB、TBIL、凝血功能等肝功能指标；取血后处死，取肝脏称重，测算脏器指数；之后以4%多聚甲醛固定，取部分肝脏冰冻切片，在荧光显微镜下观察切片中绿色荧光阳性细胞在小鼠肝脏内定植分布情况，见附图2，其中A：Ad-HUCMSCs注射7d；B：Ad-HUCMSCs注射14d；C：Ad-26b-HUCMSCs注射7d；D：Ad-26b-HUCMSCs注射14d；统计细胞数量，见附图3，与Ad-HUCMSCs组比较，*P＜0.05，***P＜0.001。结果显示，移植后7d、14d，在损伤的肝组织中高表达miR-26b的HUCMSCs数量均显著高于对照细胞，表明miR-26b能够促进HUCMSCs归巢并定植于损伤的肝组织中。

剩余部分肝组织石蜡包埋切片，行HE染色及Masson染色以及白蛋白免疫组织化学检测肝脏病理改变。表1为上述高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞通过尾静脉注射移植到CCl4诱导的急性肝损伤小鼠中7d、14d后肝功能转氨酶指标与肝脏指数。结果显示，带有miR-26b的间充质干细胞移植后谷丙转氨酶、谷草转氨酶均有好转；治疗14d较治疗7d的各组好转更为明显。

表1急性肝损伤小鼠尾静脉注射HUCMSCs细胞悬液7d、14d后转氨酶及肝脏指数

实施例二高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞移植到慢性肝损伤小鼠模型

1.慢性肝损伤实验动物模型的准备

昆明种小鼠，40只，雄性。随机数字表法分为正常对照组（10只）和模型组（50只）。模型组均按照3ml/kg剂量、每周2次（固定时间点于每周一和周五下午14:00）皮下注射CCl4与橄榄油等体积(1:1)混合液，正常对照组皮下注射等剂量橄榄油，方法同实施例一。连续注射6周后，改为每周注射1次。直到第10周。建模第10周，最后一次造模后24h，进行移植实验。

2.移植细胞的准备

Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液、bFGF处理的Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液的制备同实施例一；其中碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的浓度为10ng/ml，处理时间为24h。

3.细胞移植

慢性损伤动物模型随机分为细胞治疗组（40只）和模型对照组（10只）。细胞移植治疗组分别尾静脉一次性给予Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液、bFGF处理的Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液、Ad-HUCMSCs细胞悬液、bFGF处理的Ad-HUCMSCs细胞悬液，剂量为1.0×106/kg。模型对照组尾静脉一次性给予等剂量生理盐水。正常对照组动物尾静脉一次性给予等剂量生理盐水。在移植细胞后7d、14d分别采血检测肝功能指标、脏器指数；肝脏冰冻切片，在荧光显微镜下观察移植的GFP+细胞在小鼠肝脏内的定植分布情况；肝脏组织石蜡包埋切片，HE染色、Masson染色检测肝脏组织的病理改变。

CCl4诱导的慢性肝损伤小鼠经尾静脉注射Ad-HUCMSCs、Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液7d、14d后，取肝脏组织做冰冻切片，荧光显微镜下观察移植的GFP+细胞的分布，见附图4，A：Ad-HUCMSCs注射7d；B：Ad-HUCMSCs注射14d；C：Ad-26b-HUCMSCs注射7d；D：Ad-26b-HUCMSCs注射14d。统计细胞数量，见附图5，与Ad-HUCMSCs组比较，**P＜0.01。结果显示，移植后7d、14d，在损伤的肝组织中高表达miR-26b的HUCMSCs数量均显著高于对照细胞，表明miR-26b能够促进HUCMSCs归巢并定植于慢性损伤的肝组织中。

附图6为肝脏石蜡切片Masson染色图，A：Ad-HUCMSCs组；B：Ad-26b-HUCMSCs组；结果显示，慢性肝损伤（肝纤维化）小鼠模型移植高表达miR-26b的HUCMSCs7d、14d后，纤维组织的厚度和范围比移植对照细胞的各组显著降低，表明高表达miR-26b的HUCMSCs能够显著减轻慢性损伤肝组织的纤维化程度。

以上结果显示，与对照组相比，高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞移植显著降低了肝脏中的纤维组织间隔的宽度，说明高表达miR-26b的间充质干细胞移植对慢性肝损伤的纤维化具有显著的修复能力。

表2为慢性肝损伤小鼠尾静脉注射上述HUCMSCs细胞悬液7d、14d后肝功能及肝脏指数，检测结果显示，带有miR-26b的干细胞移植后慢性肝损伤模型小鼠的肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶均有好转，治疗14d较治疗7d组好转更为明显；各移植治疗组小鼠的体重略高于模型对照组。

表2慢性肝损伤小鼠尾静脉注射HUCMSCs细胞悬液7d、14d后转氨酶及肝脏指数

实施例三高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞移植到急性肝损伤小鼠模型

1.急性肝损伤实验动物模型的准备

急性损伤动物模型按实施例一所述方法制备。

2.移植细胞的准备

将50nMmiR-26b模拟物与5μl转染试剂Lipofectamine2000分别用250μlL-DMEM稀释，室温静置10min后将二者混合，室温静置30min，得到转染混合液；将培养至第8代的HUCMSCs，培养汇合度达80%～90%，弃培养基，PBS清洗2遍，加入转染混合液和500μlL-DMEM；然后于37℃培养箱中孵育6h，接着将转染混合液更换为完全培养基，继续培养48h，得到高表达miR-26b的细胞(26b–HUCMSCs)，可用于细胞移植。移植前按实施例一所述步骤制成2×106/ml的26b–HUCMSCs移植细胞悬液。

为了进一步提高MSCs靶向肝损伤部位的效率，改善肝功能和组织结构恢复的效果，26b-HUCMSCs细胞于移植前换用含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的培养基培养24h，然后按实施例一所述步骤制成2×106/ml的bFGF处理的26b-HUCMSCs。

3.细胞移植

尾静脉一次性给予26b-HUCMSCs细胞悬液、bFGF处理的26b-HUCMSCs细胞悬液，剂量为1.0×106/kg。模型对照组尾静脉一次性给予等剂量生理盐水。正常对照组动物尾静脉一次性给予等剂量生理盐水。在移植细胞后7d、14d分别采血检测肝功能指标、脏器指数；肝脏组织石蜡包埋切片，HE染色、Masson染色检测肝脏组织的病理改变。结果显示，与模型对照组相比，高表达miR-26b的HUCMSCs移植后小鼠的肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶均有好转，治疗14d较治疗7d组好转更为明显。

SEQUENCELISTING

<110>苏州大学

<120>一种肝损伤靶向间充质干细胞及其制备方法与应用

<160>2

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

5'-CATAGATCTCCCCACATATAACACTG-3'26

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

5'-GGACTCGAGATAGTGAAGGAGGAAGGG-3'27

Claims (10)

1.一种肝损伤靶向间充质干细胞，其特征在于：所述肝损伤靶向间充质干细胞由间充质干细胞转染或感染核酸制备得到；所述核酸为miR-26b。

2.根据权利要求1所述肝损伤靶向间充质干细胞，其特征在于：所述肝损伤靶向间充质干细胞由间充质干细胞转染或感染核酸后，再经过碱性成纤维细胞生长因子处理得到。

3.根据权利要求1所述肝损伤靶向间充质干细胞，其特征在于：所述间充质干细胞来源于骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带、脐带血、羊水或者胎盘。

4.权利要求1所述肝损伤靶向间充质干细胞的制备方法，其特征在于：通过转染试剂将miR-26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞；或者通过病毒载体将miR-26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述肝损伤靶向间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述转染试剂为脂质体转染试剂；所述病毒为腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒或者慢病毒。

6.根据权利要求4所述肝损伤靶向间充质干细胞的制备方法，其特征在于：通过转染试剂将miR-26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞的步骤为将miR-26b模拟物与转染试剂分别用L-DMEM稀释后混合，室温静置得到转染混合液；然后将培养至第4～8代、汇合度达80%～90%的间充质干细胞经PBS洗涤，再加入转染混合液；然后于37℃培养箱中孵育5～6h，接着把转染混合液更换为完全培养基，继续培养36～48h即可得到肝损伤靶向间充质干细胞；

通过病毒载体将miR-26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞的步骤为将培养至第4～8代、汇合度达80%～90%的间充质干细胞经PBS洗涤，然后加入表达miR-26b的病毒上清液，37℃感染85～95min后，将病毒上清夜更换为完全培养基继续培养24～48h即可得到肝损伤靶向间充质干细胞。

7.根据权利要求4所述肝损伤靶向间充质干细胞的制备方法，其特征在于：通过转染试剂将miR-26b转入间充质干细胞，然后再经过碱性成纤维细胞生长因子处理得到肝损伤靶向间充质干细胞；或者通过病毒载体将miR-26b转入间充质干细胞，然后再经过碱性成纤维细胞生长因子处理得到肝损伤靶向间充质干细胞。

8.根据权利要求7所述肝损伤靶向间充质干细胞的制备方法，其特征在于：将转入miR-26b的间充质干细胞置入带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，处理0.5～24h得到肝损伤靶向间充质干细胞；所述带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5～20ng/mL。

9.权利要求1～3所述任意一种肝损伤靶向间充质干细胞在制备治疗肝损伤的靶向药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述肝损伤为病毒感染、寄生虫感染、乙醇毒害、药物毒害、化学毒害或者免疫功能紊乱引起的肝损伤。