CN107937442A - 一种永生化人脂肪间充质干细胞系及其建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种永生化人脂肪间充质干细胞系及其建立方法，包括以下步骤：重组慢病毒载体的构建；病毒包装；病毒收集；病毒感染间充质细胞；对感染了病毒的人脂肪间充质干细胞进行抗性筛选；将筛选出的细胞进行永生化及生物学鉴定，从而利用慢病毒作为载体，将人端粒酶逆转录酶hTERT基因整合至人脂肪间充质干细胞的基因组中，整合效率高，过程简单易于操作，减少对细胞本身基因组的影响，并且充分利用自身脂肪组织间充质干细胞，实现脂肪间充质干细胞的再利用。

Description

一种永生化人脂肪间充质干细胞系及其建立方法
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及到一种永生化人脂肪间充质干细胞系及其建立方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)最初是在骨髓中发现的，随后发现存在于人体发生发育过程中的许多组织中。目前，我们能够从骨髓、脂肪、骨骼、肌肉等组织及羊水、脐带血、脐带中分离和制备间充质干细胞。间充质干细胞具有多向分化潜能，可以分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、胰岛细胞等，并且主动归巢、免疫源性较低，具有免疫调节作用，还能够分泌多种细胞因子。细胞回输后，间充质干细胞能主动归巢到身体受损伤的部位对组织器官进行修复，如修复损伤的心肌细胞、肝脏细胞、胰岛细胞等。同时间充质干细胞与移植细胞联合使用，能通过免疫调节作用提高移植成功的可能性。其培养上清液因富含多种细胞因子及有效成分，也可以辅助伤口愈合或者疾病的治疗。因此其在临床上及医美行业具有广阔的应用前景。
目前临床上使用的间充质干细胞主要是脐带来源或者骨髓来源，但是骨髓来源的间充质干细胞来源有限，不易获取，增殖能力受供体年龄和健康状况的影响；脐带来源的间充干细胞虽然弥补了骨髓来源间充质干细胞的不足，但是两者多是异体来源，有引入外源致病微生物的危险，如HIV病毒、肝炎病毒等，并且间充质干细胞传代次数有限，一般体外传十几代就开始生长缓慢，形态异常，直至静息生长，而且分离培养比较繁琐，所以实现间充质干细胞的永生化具有非常重要的意义。
众所周知，端粒是是位于染色体末端一段特殊的结构，由TTAGGG的重复序列组成，具有保护染色体末端的完整性及防止染色体末端之间的融合等重要作用。正常情况下随着染色体DNA的复制，即细胞的分裂传代增值，端粒会变的越来越短，直到染色体DNA被暴露，细胞分裂停止及生物学上的复制衰老。但是在胚胎干细胞及癌细胞中端粒的长度保持不变或者变化不明显，所以它们能够无限传代，进一步研究表明端粒的长度与端粒酶的活性有密切的关系，在胚胎干细胞及癌细胞中都具有较高的端粒酶活性，而在成体细胞中几乎没有端粒酶的活性，部分成体干细胞中有较低的端粒酶活性。活性端粒酶由三部分组成：端粒酶RNA(telomerase RNA,TR),端粒酶相关蛋白(telomerase-associated protein,TAP)和端粒酶逆转录酶hTERT或称端粒酶催化亚基(telomerase catalytic subunit,TCS)，端粒酶逆转录酶hTERT是端粒酶的一种核心亚基蛋白，其表达量的高低对端粒酶活性起决定性的作用。有研究指出在一些病毒引发的肿瘤中细胞通过表达TERT抑制细胞的死亡，而且抑制TERT的表达能够提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感度，更容易被杀死。因此，如果将端粒酶基因整合至间充质干细胞的基因组中，则有望实现间充质干细胞的永生化。
目前，越来越多的人选择做吸脂术，废弃的脂肪成为间充质干细胞的重要来源，实现废物再利用。利用患者自身的细胞进行相关疾病的治疗更提高了安全性，而且也可以利用自身的间充质干细胞制作私属定制的美容抗衰老产品。脂肪间充质干细胞永生化技术为间充质干细胞的无限可能提供了技术支持。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种永生化人脂肪间充质干细胞系及其建立方法，从而克服间充质干细胞的来源及传代次数有限和容易引入外源微生物的缺陷，利用慢病毒作为载体，将人端粒酶逆转录酶hTERT基因整合至人脂肪间充质干细胞的基因组中，整合效率高，过程简单易于操作，减少对细胞本身基因组的影响，并且充分利用自身脂肪组织间充质干细胞，实现脂肪间充质干细胞的再利用。
为实现上述目的，本发明提供了一种永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，包括步骤：
1)重组慢病毒载体的构建：构建携带人端粒酶逆转录酶hTERT基因的重组慢病毒载体；
2)病毒包装：将包含病毒包装质粒以及重组慢病毒载体的转染混合物转染239T细胞；所述293T细胞是由293细胞派生，表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系，被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白，或是用以包装病毒；
3)病毒收集：收集步骤2)经过转染后的239T细胞所分泌的病毒；
4)病毒感染间充质细胞：将步骤3)收集的病毒感染人脂肪间充质干细胞；
5)对步骤4)感染了病毒的人脂肪间充质干细胞进行抗性筛选；
6)将通过步骤5)筛选出的细胞进行永生化及生物学鉴定。
上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法在另一种实施方式中，步骤1)中，重组慢病毒载体的构建包括如下步骤：
(1)从供体质粒pBABE-hygro-hTERT中酶切hTERT基因，具体地，酶切1-3μg供体质粒，然后通过琼脂糖凝胶电泳条带观察酶切下来的hTERT基因条带大小是否正确，hTERT基因条带约3400bp，胶回收酶切下来的hTERT基因；
(2)对载体质粒pLX302进行酶切，具体地，酶切2-4μg载体质粒，电泳观察载体骨架大小是否正确，避免质粒污染，胶回收酶切完成的载体质粒；
(3)把步骤(1)中从供体质粒中酶切下来的hTERT基因通过DNA连接酶连接至酶切完成的载体质粒，转化感受态细胞(TRAN，CD501)，获得阳性克隆，菌液PCR再次挑选阳性克隆，将最后选取的阳性克隆测序验证hTERT基因已经成功连接到载体上；
(4)将抗性基因-杀稻瘟菌素(blasticidin)基因连接至上述载体上，其中hTERT基因和杀稻瘟菌素基因需要连接在不同位点上，由不同的启动子启动。
上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法在另一种实施方式中，步骤2)中，所述293T细胞以1.9×105-2.5×105个/ml的细胞密度生长在6孔板中，待293T细胞融合度为80-90％时，开始准备转染混合物，
所述转染混合物的制备及转染过程包括：
(1)准备病毒包装质粒：pLX302载体质粒，pCMV-VSVG载体质粒和psPAX2载体质粒；
(2)将400-600ng重组慢病毒载体溶解在20-40ul无血清细胞培养基中；
(3)将2-3ul转染试剂溶解在20-40ul无血清细胞培养基中，待所述转染试剂在无血清细胞培养基中孵育3-7min后将400-600ng pLX302载体质粒，40-60ng pCMV-VSVG载体质粒、300-600ng psPAX2载体质粒以及步骤(2)中溶解在无血清细胞培养基中的重组慢病毒载体加入到转染试剂中以组成转染混合物，室温放置15-25min后，将所述转染混合物全部加入到每孔已经铺好的293T细胞中，震荡使均匀。
上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法在另一种实施方式中，病毒收集包括如下步骤：
(1)培养经过转染后的239T细胞4-8小时后用含8-12％胎牛血清的细胞培养基换液,转染22-26小时后再次换液；
(2)分别在转染62-66小时和70-74小时时收集病毒；
(3)使用病毒检测卡测病毒滴度，所述病毒滴度在72小时能够达到1.5×106-2.5×106。
上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法在另一种实施方式中，所述人脂肪间充质干细胞的获取包括如下步骤：
(1)将人通过抽脂术废弃的脂肪组织使用加入双抗的磷酸盐缓冲液洗3遍，洗最后一遍时把下层液体弃去，所述双抗为青霉素和链霉素，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100U/ml；
(2)在脂肪组织中加入等体积的0.8％的胶原酶I，37℃孵育1h；离心并弃上层脂肪层及中间层液体，用高糖细胞培养基重悬底层细胞，过滤，离心，弃上清，用无血清细胞培养基和血清替代物重悬细胞后均匀的平铺在培养瓶中；观察细胞融合度达到60-90％，用胰酶消化细胞，传代培养或者暂时冻存备用；所述高糖细胞培养基中的葡萄糖含量为4500mg/L。
上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法在另一种实施方式中，病毒感染人脂肪间充质干细胞包括如下步骤：
(1)培养人脂肪间充质干细胞需要永生化的细胞系：用无血清细胞培养基培养人脂肪间充质干细胞，当细胞密度60％～70％时用于后续的感染实验；
(2)用收集的病毒感染人脂肪间充质干细胞：取富集的病毒液与培养有人脂肪间充质干细胞的细胞培养液混合，并加入终浓度为6～10ng/ml的聚凝胺感染22-26h后，将液体弃去，更换新的无血清细胞培养基。
上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法在另一种实施方式中，步骤5)中，用抗性筛选感染了病毒的人脂肪间充质干细胞包括步骤：
病毒感染人脂肪间充质干细胞46-50h后换成含有7-9μg/mL杀稻瘟菌素的含血清替代物的全细胞培养基，对感染后的细胞进行抗性筛选并将没有进行病毒感染的人脂肪间充质干细胞设置为对照组，以后每隔3天换液，直至观察到对照组全部死亡，实验组留下有相应的抗性并持续增殖的细胞，不具有抗性的细胞会死亡或者静息。
本发明还提供了根据上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法所建立出的永生化人脂肪间充质干细胞系，所述永生化人脂肪间充质干细胞系的细胞以1:2～3传代，平均1～2天传代一次，可传50代以上，并且保持较好的增殖能力，1～30代细胞的增殖较快，30～50代细胞增殖能力稍微降低。
上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法或永生化人脂肪间充质干细胞系在另一种实施方式中，所述永生化脂肪间充质干细胞系传至P20和P30时细胞表型正常，均表达CD73，CD90，CD105，阳性率＞95％，不表达CD34，CD45，HLA-DR，由表型分析可排除间充质干细胞是造血干细胞的可能。
上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法或永生化人脂肪间充质干细胞系在另一种实施方式中，所述永生化间充质干细胞系在不同诱导条件下可分别诱导生成脂肪细胞，成骨细胞和软骨细胞，并且，所述永生化间充质干细胞系的基因组中表达了hTERT基因。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本申请所涉及的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法利用慢病毒作为载体，将人端粒酶逆转录酶hTERT基因整合至人脂肪间充质干细胞的基因组中，整合效率高，过程简单易于操作，减少对细胞本身基因组的影响，并且经PCR鉴定结果永生化间充质干细胞系的基因组中表达了hTERT基因；
2.通过本申请所涉及的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法所获得的永生化间充质干细胞系的细胞可传50代以上，并且保持较好的增殖能力，传至P20和P30时细胞表型正常，均表达CD73，CD90，CD105，不表达CD34，CD45，HLA-DR，在不同诱导条件下可分别诱导生成脂肪细胞，成骨细胞和软骨细胞；
3.本申请所涉及的永生化人脂肪间充质干细胞系及其建立方法还充分利用人体废弃的脂肪组织中所富含的间充质干细胞，从而实现脂肪间充质干细胞的再利用，临床上，细胞回输可以辅助治疗各种炎症及器官损伤疾病，医美方面，可以私属定制美容抗衰老产品，全方位提高生活质量。
附图说明
图1是根据本发明的永生化人脂肪间充质干细胞的建立方法流程图；
图2是根据本发明的病毒滴度检测卡检测结果；
图3是根据本发明的未永生化间充质干细胞与永生化间充质干细胞系生长到20代时生长状态对比图；
图4a是根据本发明的永生化间充质干细胞系P20细胞表型鉴定图；
图4b是根据本发明的永生化间充质干细胞系P30细胞表型鉴定图；
图5是根据本发明的永生化间充质干细胞系成脂诱导分化后，油红染色前后的图片；
图6是根据本发明的永生化间充质干细胞系成骨诱导分化后，茜素红染色前后的图片；
图7a是根据本发明的永生化间充质干细胞成软骨诱导分化后形态图；
图7b是根据本发明的PCR鉴定永生化间充质干细胞成软骨诱导分化后软骨细胞中col10AI、col2AI表达情况图；
图8是根据本发明的永生化间充质干细胞系与对照组中，PCR鉴定整合基因hTERT的表达情况图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)。
以下实例中所使用的供体质粒pBABE-hygro-hTERT，pLX302载体质粒(亦可称为载体质粒pLX 302)，pCMV-VSVG载体质粒和psPAX2载体质粒均购自Addgene；转染试剂购自selleck，产品型号为B35101；病毒检测卡购自Antagen，产品型号为ATG-LT-01；胶原酶I购自Gibco，产品型号为9001-12-1；无血清细胞培养基购自Lonza，产品型号为12-725F；血清替代物购自Pall，产品型号为15950-017；杀稻瘟菌素blasticidin购自invitrogen，产品型号为R210-01。
实施例
步骤一、重组慢病毒载体的构建
(1)从供体质粒pBABE-hygro-hTERT中酶切hTERT基因，具体地，酶切2μg供体质粒，然后通过琼脂糖凝胶电泳条带观察酶切下来的hTERT基因条带大小是否正确，hTERT基因条带约3400bp，胶回收酶切下来的hTERT基因；
(2)对载体质粒pLX302进行酶切，具体地，酶切3μg载体质粒，电泳观察载体骨架大小是否正确，避免质粒污染，胶回收酶切完成的载体质粒；
(3)把步骤(1)中从供体质粒中酶切下来的hTERT基因通过DNA连接酶连接至酶切完成的载体质粒，转化感受态细胞(TRAN，CD501)，获得阳性克隆，菌液PCR再次挑选阳性克隆，将最后选取的阳性克隆测序验证hTERT基因已经成功连接到载体上；
(4)利用同样的方法将抗性基因-杀稻瘟菌素基因连接到上述载体上，其中hTERT基因和杀稻瘟菌素基因需要连接在不同位点上，由不同的启动子启动。
步骤二、病毒包装、收集
A.培养293T细胞
复苏较低代次的293T细胞，使用培养基为含有10％FBS的细胞培养基；刚复苏的293T细胞至少传一代才可用于病毒包装。
B.瞬转重组慢病毒载体和病毒包装质粒到HEK293T细胞中，包装病毒
1)用0.001％的多聚赖氨酸37℃孵育板子一个小时，用PBS洗三遍，安全柜中晾干，能让HEK293T细胞在整个病毒包装的过程中都紧密的贴附在细胞培养板上；
2)胰酶消化HEK293T细胞，以2.2×105个/ml的细胞密度铺在6孔板中，10％的CO2，培养24h；
3)细胞融合度在80-90％，准备转染混合物：将500ng重组慢病毒载体溶解在30ul无血清培养基中，将2.5ul转染试剂溶解在30ul无血清细胞培养基中，待所述转染试剂在无血清细胞培养基中孵育5min后将500ng pLX302载体质粒，50ng pCMV-VSVG载体质粒、450ngpsPAX2载体质粒以及溶解在无血清细胞培养基中的重组慢病毒载体加入到转染试剂中以组成转染混合物；室温放置20min后，将所述转染混合物全部加入到每孔已经铺好的HEK293T细胞中，震荡使均匀。
4)6小时后用含10％FBS的细胞培养基换液，转染24小时后再次换液，理论上，具有感染效力的病毒在病毒包装30-36小时开始分泌；
5)分别在转染64小时和72小时时收病毒，并用0.45um的滤器过滤，除去死细胞和细胞碎片。如果不使用病毒可以将病毒冻存在-80℃，或者4℃冰箱暂时保存，病毒在4℃放置一周仍可使用，滴度降为原来的1/4-1/5，应该避免病毒的反复冻融；
6)收集病毒，浓缩并使用病毒检测卡测病毒滴度，通过图2可知，随着时间的推移病毒滴度不断增加，72h时病毒滴度可达到2.0×106。
步骤三病毒感染人脂肪间充质细胞
1)从脂肪组织中分离间充质干细胞
在4℃取出人抽脂术废弃的脂肪组织，用加入了双抗的PBS洗3遍，洗最后一遍时把下层液体吸干净；加入等体积的0.8％的胶原酶I，37℃孵育1h，中间不断摇动；1200g离心10min，弃上层脂肪层及中间层液体，上层主要为消化不全脂肪，中间液体层为胶原酶层，细胞沉淀在底部；用高糖细胞培养基重悬底层细胞，100μm滤网过滤；1200rpm，离心5min，弃上清，用无血清培养基和血清替代物重悬细胞后均匀的平铺在培养瓶中；观察细胞融合度达到80％，用0.25％胰酶消化细胞，传代培养或者暂时冻存备用。
2)病毒感染
(A)培养间充质干细胞需要永生化的细胞系
用无血清细胞培养基培养上述人脂肪间充质干细胞，当细胞胞体饱满有光泽，细胞密度60-70％时用于后续的感染实验。
(B)用收集的病毒感染目的细胞
取富集的病毒液与细胞培养液混合，并加入终浓度为6～10ng/ml的聚凝胺感染24h后，将含有病毒液的培养基换成新鲜培养基。
(C)抗性筛选感染后的细胞
病毒感染48h后换成含有8μg/mL杀稻瘟菌素的含血清替代物的全细胞培养基，对感染后的细胞进行抗性筛选并将没有进行病毒感染的人脂肪间充质干细胞设置为对照组，以后每隔3天换液，直至观察到对照组全部死亡，实验组留下有相应的抗性并持续增殖的细胞(不具有抗性的细胞会死亡或者静息)。
(D)筛选出永生化的细胞系并扩增冻存
将持续增殖的细胞传代记为P1，并冻存一部分，另一部分继续扩增，一方面用于扩增冻存，另一方面用于检验是否确实是永生化细胞系，通过图3可知，未永生化的间充质干细胞生长到20代(P20)时细胞处于静息老化状态，永生化的间充质干细胞仍然保持较好的生长活性。
步骤四、永生化细胞系的鉴定
1.细胞表型分析
分别检测P20和P30细胞表型表达情况，胰酶消化细胞，用加入了5％FBS的PBS，即封闭液漂洗一次，重悬细胞并将细胞均分到若干EP管中，100μL/管；向每管中加入相应的抗体(CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105)及其Iso，4℃染色30min-2h；PBS漂洗两遍，然后用400～500μLPBS重悬细胞，流式分析。通过图4a和图4b可知，P20和P30永生化的间充质干细胞具有正常间充质干细胞的细胞表型，CD34、CD45、HLA-DR显示阴性，CD73、CD90、CD105显示阳性。
2.分化能力的鉴定
1)向脂肪细胞分化，细胞培养基(高糖)+10％FBS+1μmol/L地塞米松+0.5mmolIBMX+0.2mmol消炎痛+10μg/mL insulin,诱导分化7-10天；观察到油滴时，油红染色鉴定，通过图5可知，观察到油红使油滴染色，说明间充质干细胞分化成为脂肪细胞；
2)向成骨细胞分化，细胞培养基(高糖)+10％FBS+10mmol/Lβ甘油磷酸钠+0.01umol地塞米松+50mg/L维生素C；每3天半量换液，诱导分化21天；观察可见钙结节，0.1％茜素红染色鉴定，通过图6可知，观察到茜素红使钙沉积染色，说明间充质干细胞分化成为骨细胞；
3)向软骨细胞分化，细胞培养基(高糖)+1％FBS+6.25μg/mL胰岛素+10ng/mL TGF-β1+50μg/mL维生素C；细胞贴壁培养21天后，观察细胞形态及特定基因PCR扩增结果，引物序列为COL2AI(F:TGGCCTGAGACAGCATGAC(即SEQ ID:1)，R:AGTGTTGGGAGCCAGATTGT(即SEQ ID:2))；COL10AI(F:CCCTTTTTGCTGCTAGTATCC(即SEQ ID:3)，R:CTGTTGTCCAGGTTTTCCTGGCAC(即SEQ ID:4))；
其中PCR扩增条件为：94℃4min，94℃30s，55℃30s，72℃40s，30个循环，72℃10min，结果表明分化后软骨细胞表达II型和X型胶原；通过图7a和图7b可知，永生化间充质干细胞分化成软骨细胞，分化后细胞中有col10AI和col2AI的表达，对照组中没有，说明间充质干细胞分化成软骨细胞。
3.整合基因的鉴定
TRIzol裂解细胞，三氯甲烷萃取永生化细胞系与对照组RNA，异丙醇沉淀RNA；反转录试剂盒反转得cDNA；设计引物，引物序列为
引物1(F:GAGTGACCGTGGTTTCTGTGTGGT(即SEQ ID:5)，R:CTTCTTGGTGTTCCTGAGGAAGC(即SEQ ID:6))；
引物2(F:ACCGAGTGACCGTGGTTTCTGTGT(即SEQ ID:7)，R:TTCTTGGTGTTCCTGAGGAAGCG(即SEQ ID:8))；
PCR检测hTERT基因表达情况，其中PCR扩增条件为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环，72℃8min；电泳观察结果，通过图8可知，在永生化的间充质干细胞中可观察到hTERT基因的表达条带，说明hTERT基因已经成功整合到细胞基因组中。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 北京多赢时代科技有限公司
<120> 一种永生化人脂肪间充质干细胞系及其建立方法
<130> P171770DD1F
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID：1)
<400> 1
tggcctgaga cagcatgac 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID：2)
<400> 2
agtgttggga gccagattgt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID：3)
<400> 3
ccctttttgc tgctagtatc c 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID：4)
<400> 4
ctgttgtcca ggttttcctg gcac 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID：5)
<400> 5
gagtgaccgt ggtttctgtg tggt 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID：6)
<400> 6
cttcttggtg ttcctgagga agc 23
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID：7)
<400> 7
accgagtgac cgtggtttct gtgt 24
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID：8)
<400> 8
ttcttggtgt tcctgaggaa gcg 23

Claims (10)

1.一种永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
重组慢病毒载体的构建：构建携带人端粒酶逆转录酶hTERT基因的重组慢病毒载体；
病毒包装：将包含病毒包装质粒以及重组慢病毒载体的转染混合物转染239T细胞；
病毒收集：收集经过转染后的239T细胞所分泌的病毒；
病毒感染间充质细胞：将收集的病毒感染人脂肪间充质干细胞；
对感染了病毒的人脂肪间充质干细胞进行抗性筛选；
将筛选出的细胞进行永生化及生物学鉴定。
2.根据权利要求1所述的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，其特征在于，重组慢病毒载体的构建包括如下步骤：
从供体质粒pBABE-hygro-hTERT中酶切hTERT基因；
对载体质粒pLX302进行酶切；
把从供体质粒中酶切下来的hTERT基因通过DNA连接酶连接至酶切完成的载体质粒构建成为重组慢病毒载体，并进一步连接杀稻瘟菌素基因。
3.根据权利要求1所述的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，其特征在于，所述293T细胞以1.9×105-2.5×105个/ml的细胞密度生长在6孔板中，待293T细胞融合度为80-90％时，开始准备转染混合物，
所述转染混合物的制备及转染过程包括以下步骤：
准备病毒包装质粒：pLX302载体质粒，pCMV-VSVG载体质粒和psPAX2载体质粒；
将400-600ng重组慢病毒载体溶解在20-40ul无血清细胞培养基中；
将2-3ul转染试剂溶解在20-40ul无血清细胞培养基中，待所述转染试剂在无血清细胞培养基中孵育3-7min后，将400-600ng pLX302载体质粒，40-60ng pCMV-VSVG载体质粒、300-600ng psPAX2载体质粒以及溶解在无血清细胞培养基中的重组慢病毒载体加入到转染试剂中以组成转染混合物，室温放置15-25min后，将所述转染混合物全部加入到每孔已经铺好的293T细胞中，震荡使均匀。
4.根据权利要求1所述的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，其特征在于，病毒收集包括以下步骤：
培养经过转染后的239T细胞4-8小时后用含8-12％胎牛血清的细胞培养基换液，转染22-26小时后再次换液；
分别在转染62-66小时和70-74小时时收集病毒；
使用病毒检测卡测病毒滴度，所述病毒滴度在72小时能够达到1.5×106-2.5×106。
5.根据权利要求1所述的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，其特征在于，所述人脂肪间充质干细胞的获取包括以下步骤：
将人通过抽脂术废弃的脂肪组织使用加入双抗的磷酸盐缓冲液洗3遍，洗最后一遍时把下层液体弃去；
在脂肪组织中加入等体积的0.8％的胶原酶I，37℃孵育1h；离心并弃上层脂肪层及中间层液体，用高糖细胞培养基重悬底层细胞，过滤，离心，弃上清，用无血清细胞培养基和血清替代物重悬细胞后均匀的平铺在培养瓶中；观察细胞融合度达到60-90％，用胰酶消化细胞，传代培养或者暂时冻存备用。
6.根据权利要求1所述的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，其特征在于，病毒感染人脂肪间充质干细胞包括以下步骤：
培养人脂肪间充质干细胞需要永生化的细胞系：用无血清细胞培养基培养人脂肪间充质干细胞，当细胞密度60％～70％时用于后续的感染实验；
用收集的病毒感染人脂肪间充质干细胞：取富集的病毒液与培养有人脂肪间充质干细胞的细胞培养液混合，并加入终浓度为6～10ng/ml的聚凝胺感染22-26h后，将液体弃去，更换新的无血清细胞培养基。
7.根据权利要求1所述的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，其特征在于，用抗性筛选感染了病毒的人脂肪间充质干细胞包括以下步骤：
病毒感染人脂肪间充质干细胞46-50h后换成含有7-9μg/mL杀稻瘟菌素的含血清替代物的全细胞培养基，对感染后的细胞进行抗性筛选并将没有进行病毒感染的人脂肪间充质干细胞设置为对照组，以后每隔3天换液，直至观察到对照组全部死亡，实验组留下有相应的抗性并持续增殖的细胞。
8.根据权利要求1所述的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法所获得的永生化人脂肪间充质干细胞系，其特征在于，所述永生化人脂肪间充质干细胞系的细胞能够传50代以上。
9.根据权利要求1所述的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法或权利要求8所述的永生化人脂肪间充质干细胞系，其特征在于，所述永生化脂肪间充质干细胞系传至P20和P30时细胞表型正常，均表达CD73，CD90，CD105，不表达CD34，CD45，HLA-DR。
10.根据权利要求1所述的永生化人脂肪间充质干细胞系或权利要求8所述的永生化人脂肪间充质干细胞系，其特征在于，所述永生化间充质干细胞系可诱导生成脂肪细胞，成骨细胞和软骨细胞，并且，所述永生化间充质干细胞系的基因组中表达了hTERT基因。
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