JP2023524976A

JP2023524976A - 必須遺伝子ノックインによる選択

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Publication number: JP2023524976A
Application number: JP2022567268A
Authority: JP
Inventors: ジョンアンソニーズリス; キャリーマリーマーギュリーズ; チュウ－リソー; ピータートン; マークジェイムズトミシマ; コーナーブライアンマコーリフ; クラウディオモネッティ
Original assignee: エディタス・メディシン、インコーポレイテッド; ブルーロックセラピューティクスエルピー
Priority date: 2020-05-04
Filing date: 2021-05-04
Publication date: 2023-06-14
Also published as: US20240117383A1; MX2022013879A; WO2021226151A3; US20230227856A1; CA3182286A1; KR20230029603A; WO2021226151A2; EP4146813A2; CN115916968A; BR112022022384A2; IL297881A; AU2021267334A1

Abstract

レポーター遺伝子なしでのノックイン細胞性クローンの効率的な作製のための戦略、システム、組成物及び方法。必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列（又は「カーゴ配列」）を含むノックインカセットを用いて必須遺伝子が標的化される。望ましくない標的化イベントは、非機能性バージョンの必須遺伝子、本質的にノックアウトを作り出し、これは、必須遺伝子コード領域を修復するノックインカセットの正しい組み込みによって「救助」され、それにより、機能性遺伝子産物が生じ、カーゴ配列を必須遺伝子コード配列とインフレームで且つその下流に位置付ける。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年５月４日に出願された米国仮特許出願第６３／０１９，９５０号明細書の利益を主張するものであり、その内容は、全体として本明細書に援用される。

遺伝子操作された細胞の作成のための標的化組み込み戦略に伴う大きい問題の１つは、標的化組み込みイベントの成功が稀であり得ることであり、特に二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を鋳型として使用するとき、多くの場合にノックイン効率が５％を下回る。従って、典型的には、組み込みが成功したアレル又は遺伝子を有する細胞性クローンを濃縮するスクリーニング又は選択戦略が要求される。例えば、蛍光、抗生物質耐性等を付与するレポーター遺伝子の同時組み込みによるなど、正しく標的化されたクローンを同定する多くの選択戦略が考案されている。しかしながら、これらの選択戦略は、時間がかかり、非効率であり、治療に関連する使用に望ましくない。実際、単一の標的化組み込みであっても、組み込みが成功したクローンを同定するには、数百個、ときに数千個のクローンをスクリーニングする必要があり得る。複数箇所の編集が所望される状況では、数万個のクローン又は更に多くをスクリーニングする必要があり得る。

本開示は、蛍光マーカー又は抗生物質耐性マーカーなどの外部的な選択マーカーが不要でありながら、正しく標的化されたクローンを高頻度に生じる標的化組み込みによって細胞を遺伝子操作するための戦略、システム、組成物及び方法を提供する。一般に、本明細書に提供される標的化組み込みによって細胞を遺伝子操作するための戦略、システム、組成物及び方法は、ヌクレアーゼによって媒介される必須遺伝子における標的化された切断と、正しく挿入された場合に必須遺伝子の機能変異体をもたらすと共に、カーゴ配列を有する発現構築物も含む外因性ノックインカセットの組み込みとを特徴とする。

一態様において、本開示は、細胞（例えば、細胞集団中の細胞）のゲノムを編集する方法であって、細胞（又は細胞集団）を、（ｉ）細胞における必須遺伝子であって、細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする必須遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び（ｉｉ）必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触させることを含む方法を特徴とし、ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によって細胞のゲノムに組み込まれ、その結果、ゲノム編集された細胞は、（ａ）目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。

一部の実施形態において、接触させるステップ後、細胞集団の生存細胞の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものが、ゲノム編集された細胞であり、及び／又は組み込まれたノックインカセットを欠く細胞集団の約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下又は約５％以下が生存細胞である。一部の実施形態において、接触させるステップ後、細胞集団の生存細胞の少なくとも約８０％が、ゲノム編集された細胞であり、及び組み込まれたノックインカセットを欠く細胞集団の約２０％以下が生存細胞である。一部の実施形態において、接触させるステップ後、細胞集団の生存細胞の少なくとも約６０％が、ゲノム編集された細胞であり、及び組み込まれたノックインカセットを欠く細胞集団の約４０％以下が生存細胞である。一部の実施形態において、接触させるステップ後、細胞集団の生存細胞の少なくとも約９０％が、ゲノム編集された細胞であり、及び組み込まれたノックインカセットを欠く細胞集団の約１０％以下が生存細胞である。一部の実施形態において、接触させるステップ後、細胞集団の生存細胞の少なくとも約９５％が、ゲノム編集された細胞であり、及び組み込まれたノックインカセットを欠く細胞集団の約５％以下が生存細胞である。

一部の実施形態において、ノックインカセットが相同組換え修復（ＨＤＲ）によって細胞のゲノムに正しい位置又は向きで組み込まれない場合、その細胞は、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体をもはや発現しない。

一部の実施形態において、切断は、二本鎖切断である。

一部の実施形態において、切断は、必須遺伝子の内因性コード配列の最後の２０００、１５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対内に位置する。一部の実施形態において、切断は、必須遺伝子の最後のエクソン内に位置する。一部の実施形態において、切断は、必須遺伝子の最後から２番目のエクソン内に位置する。

一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、極めて効率が高く、例えばヌクレアーゼと接触した細胞の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものを編集する能力を有する。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼと接触した細胞の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものにインデル（挿入又は欠失）を導入する能力を有する。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はメガヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、及び本方法は、細胞（又は細胞集団）をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのためのガイド分子と接触させることを更に含む。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａヌクレアーゼ又はその変異体（例えば、配列番号５８～６６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むヌクレアーゼ）である。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、表５から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ガイド分子は、必須遺伝子の内因性コード配列の一部分と相補的なターゲティングドメイン配列を含む。一部の実施形態において、ガイド分子は、必須遺伝子の内因性コード配列の一部分と相補的な配列と３ヌクレオチドを超えて異ならないターゲティングドメイン配列を含む。一部の実施形態において、ガイド分子は、必須遺伝子の内因性コード配列のその一部分に特異的に結合する。一部の実施形態において、ガイド分子は、別の遺伝子、例えば異なる必須遺伝子の内因性コード配列に結合しない。一部の実施形態において、ガイド分子は、必須遺伝子の範囲内において機能（例えば、機能遺伝子発現又はタンパク質機能）に不可欠な座位に結合し、そこでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断を媒介する。一部の実施形態において、ガイドは、配列番号９４～１５７及び２２５～１８８５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ドナーＤＮＡ鋳型であり、任意選択で、ドナーＤＮＡ鋳型は、二本鎖である。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ鋳型は、プラスミドであり、任意選択で、プラスミドは、線状化されていない。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ノックインカセットの両側に相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、細胞のゲノムにおいて切断の５’側に位置する配列と相同な配列を含む５’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、細胞のゲノムにおいて切断の３’側に位置する配列と相同な配列を含む３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、細胞のゲノムにおいて切断の５’側に位置する配列と相同な配列を含む５’相同性アームを含み、及びドナー鋳型は、細胞のゲノムにおいて切断の３’側に位置する配列と相同な配列を含む３’相同性アームを含む。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物と目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、これらの遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び調節エレメントは、このタンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする。一部の実施形態において、ノックインカセットは、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列と、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む。一部の実施形態において、２Ａエレメントは、Ｔ２Ａエレメント（例えば、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｐ２Ａエレメント（例えば、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｅ２Ａエレメント（例えば、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）又はＦ２Ａエレメント（例えば、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）である。一部の実施形態において、ノックインカセットは、２Ａエレメントの上流において、リンカーペプチドをコードする配列を更に含む。一部の実施形態において、リンカーペプチドは、アミノ酸配列ＧＳＧを含む。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、及び３’ＵＴＲ配列が存在する場合、その３’ＵＴＲ配列は、外因性コード配列の３’側且つポリアデニル化配列の５’側に位置する。

一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、必須遺伝子の内因性コード配列のうち、切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性、例えば細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列と９９％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満又は８０％未満の同一性である。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列と８０％～９９％の同一性、例えば細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列と８５％～９５％又は９０％～９９％の同一性である。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼの標的部位を除去するか、ノックインカセットが細胞のゲノムに組み込まれた後の相同組換えの可能性を低下させるか、又はノックインカセットが細胞のゲノムに組み込まれた後に必須遺伝子の遺伝子産物及び／若しくは目的の遺伝子産物の発現を増加させるようにコドン最適化されている。

一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａ）であり、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、Ｃａｓのための少なくとも１つのＰＡＭ部位を含み、この少なくとも１つのＰＡＭ部位（又は全てのＰＡＭ部位）は、コドン最適化されているか、又はサイレント及び／若しくはミスセンス突然変異で飽和している。

一部の実施形態において、必須遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、ＴＢＰ、Ｅ２Ｆ４、Ｇ６ＰＤ又はＫＩＦ１１である。一部の実施形態において、必須遺伝子は、表３、表４又は表１７から選択される遺伝子である。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、２つ以上の目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含む多シストロン性（例えば、２シストロン性）ノックインカセットである。一部の実施形態において、ノックインカセットは、第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列と、リンカー（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ及び／又はＩＲＥＳ）と、第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列とを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、必須遺伝子の一方又は両方のアレルにノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、（ａ）必須遺伝子の同じアレルからの第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、（ａ）必須遺伝子の異なるアレルからの第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。

一部の実施形態において、本方法は、細胞（又は細胞集団）を、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、且つ必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型と接触させることを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、必須遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセットを含み、必須遺伝子の第２のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。

一部の実施形態において、本方法は、細胞（又は細胞集団）を、第１の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、且つ第２の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型と接触させることを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、第１の必須遺伝子の一方又は両方のアレルに第１のノックインカセットを含み、第２の必須遺伝子の一方又は両方のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要な第１及び第２の必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はそれらの機能変異体を発現する。

別の態様において、本開示は、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列が必須遺伝子のコード配列とインフレームであり、且つその下流（３’側）にあるゲノムを含む遺伝子修飾された細胞を特徴とし、必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードし、必須遺伝子のコード配列の少なくとも一部は、外因性コード配列を含む。

一部の実施形態において、必須遺伝子の外因性コード配列は、必須遺伝子のコード配列の約２０００、１５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対を含む。

一部の実施形態において、必須遺伝子の外因性コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、必須遺伝子の内因性コード配列のうち、切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、必須遺伝子の外因性コード配列は、細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である。一部の実施形態において、必須遺伝子の外因性コード配列は、細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓの標的部位を除去するようにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａ）であり、必須遺伝子の外因性コード配列は、Ｃａｓのための少なくとも１つのＰＡＭ部位を含み、この少なくとも１つのＰＡＭ部位（又は全てのＰＡＭ部位）は、コドン最適化されているか、又はサイレント及び／若しくはミスセンス突然変異で飽和している。

一部の実施形態において、必須遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、ＴＢＰ、Ｅ２Ｆ４、Ｇ６ＰＤ又はＫＩＦ１１である。

一部の実施形態において、細胞のゲノムは、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物と目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、これらの遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び調節エレメントは、このタンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする。一部の実施形態において、細胞のゲノムは、必須遺伝子のコード配列と、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む。

一部の実施形態において、細胞のゲノムは、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、及び３’ＵＴＲ配列が存在する場合、その３’ＵＴＲ配列は、外因性コード配列の３’側且つポリアデニル化配列の５’側に位置する。

一部の実施形態において、細胞のゲノムは、レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない。

別の態様において、本開示は、ゲノム修飾を含む操作された細胞を特徴とし、ゲノム修飾は、細胞のゲノムにおける必須遺伝子の内因性コード配列内への外因性ノックインカセットの挿入を含み、必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードし、ノックインカセットは、必須遺伝子の遺伝子産物又はその機能変異体をコードする外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含み、細胞は、目的の遺伝子産物と、細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体とを発現し、任意選択で、目的の遺伝子産物及び必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物は、必須遺伝子の内因性プロモーターから発現される。

一部の実施形態において、必須遺伝子の遺伝子産物をコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、必須遺伝子のコード配列の約２０００、１５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対を含む。

一部の実施形態において、必須遺伝子の遺伝子産物をコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、必須遺伝子の内因性コード配列のうち、切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、必須遺伝子の遺伝子産物をコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である。一部の実施形態において、必須遺伝子の遺伝子産物をコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓの標的部位を除去するようにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａ）であり、必須遺伝子の遺伝子産物をコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、Ｃａｓのための少なくとも１つのＰＡＭ部位を含み、この少なくとも１つのＰＡＭ部位（又は全てのＰＡＭ部位）は、コドン最適化されているか、又はサイレント及び／若しくはミスセンス突然変異で飽和している。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、２つ以上の目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含む多シストロン性（例えば、２シストロン性）ノックインカセットである。一部の実施形態において、ノックインカセットは、第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列と、リンカー（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ及び／又はＩＲＥＳ）と、第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列とを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、必須遺伝子の一方又は両方のアレルにノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。

一部の実施形態において、操作された細胞は、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットと、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型とを含む。一部の実施形態において、操作された細胞は、必須遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセット及び第２のノックインカセットを含み、任意選択で操作された細胞は、必須遺伝子の第２のアレルにも第１のノックインカセット及び第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、操作された細胞は、必須遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセットを含み、必須遺伝子の第２のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、操作された細胞は、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。

一部の実施形態において、操作された細胞は、第１の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットと、第２の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型とを含む。一部の実施形態において、操作された細胞は、第１の必須遺伝子の一方又は両方のアレルに第１のノックインカセットを含み、第２の必須遺伝子の一方又は両方のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要な第１及び第２の必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はそれらの機能変異体を発現する。

別の態様において、本開示は、医薬としての使用のための、及び／又は疾患、障害若しくは病態、例えば本明細書に記載される疾患、障害若しくは病態、例えば癌、例えば本明細書に記載される癌の治療における使用のための、本明細書に記載される細胞のいずれかを特徴とする。

別の態様において、本開示は、本明細書に記載される方法のいずれかによって作製される細胞若しくは細胞集団又はその子孫を特徴とする。

別の態様において、本開示は、細胞（又は細胞集団中の細胞）のゲノムを編集するためのシステムであって、細胞（又は細胞集団）と、細胞の必須遺伝子であって、細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする必須遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼと、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型とを含むシステムを特徴とする。

一部の実施形態において、細胞集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、細胞集団の生存細胞の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものが、ゲノム編集された細胞であり、及び／又は組み込まれたノックインカセットを欠く細胞集団の約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下又は約５％以下が生存細胞である。一部の実施形態において、細胞集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、細胞集団の生存細胞の少なくとも約８０％が、ゲノム編集された細胞であり、及び組み込まれたノックインカセットを欠く細胞集団の約２０％以下が生存細胞である。一部の実施形態において、細胞集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、細胞集団の生存細胞の少なくとも約６０％が、ゲノム編集された細胞であり、及び組み込まれたノックインカセットを欠く細胞集団の約４０％以下が生存細胞である。一部の実施形態において、細胞集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、細胞集団の生存細胞の少なくとも約９０％が、ゲノム編集された細胞であり、及び組み込まれたノックインカセットを欠く細胞集団の約１０％以下が生存細胞である。一部の実施形態において、細胞集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、細胞集団の生存細胞の少なくとも約９５％が、ゲノム編集された細胞であり、及び組み込まれたノックインカセットを欠く細胞集団の約５％以下が生存細胞である。

一部の実施形態において、細胞又は細胞集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ノックインカセットが相同組換え修復（ＨＤＲ）によって細胞のゲノムに正しい位置又は向きで組み込まれない場合、その細胞は、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体をもはや発現しない。

一部の実施形態において、切断は、二本鎖切断である。

一部の実施形態において、切断は、必須遺伝子の内因性コード配列の最後の２０００、１５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対内に位置する。一部の実施形態において、切断は、必須遺伝子の最後のエクソン内に位置する。

一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、極めて効率が高く、例えばヌクレアーゼと接触した細胞の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものを編集する能力を有する。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はメガヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、及び本方法は、細胞（又は細胞集団）をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのためのガイド分子と接触させることを更に含む。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａヌクレアーゼ又はその変異体（例えば、配列番号５８～６６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むヌクレアーゼ）である。一部の実施形態において、ガイド分子は、必須遺伝子の内因性コード配列の一部分と相補的なターゲティングドメイン配列を含む。一部の実施形態において、ガイド分子は、必須遺伝子の内因性コード配列の一部分と相補的な配列と３ヌクレオチドを超えて異ならないターゲティングドメイン配列を含む。一部の実施形態において、ガイド分子は、必須遺伝子の内因性コード配列のその一部分に特異的に結合する。一部の実施形態において、ガイド分子は、別の遺伝子、例えば異なる必須遺伝子の内因性コード配列に結合しない。一部の実施形態において、ガイドは、配列番号９４～１５７及び２２５～１８８５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼの標的部位を除去するか、ノックインカセットが細胞のゲノムに組み込まれた後の相同組換えの可能性を低下させるか、又はノックインカセットが細胞のゲノムに組み込まれた後に必須遺伝子の遺伝子産物及び／若しくは目的の遺伝子産物の発現を増加させるようにコドン最適化されている。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、２つ以上の目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含む多シストロン性（例えば、２シストロン性）ノックインカセットである。一部の実施形態において、ノックインカセットは、第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列と、リンカー（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ及び／又はＩＲＥＳ）と、第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列とを含む。一部の実施形態において、細胞集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ゲノム編集された細胞は、必須遺伝子の一方又は両方のアレルにノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。

一部の実施形態において、本システムは、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型とを含む。一部の実施形態において、細胞集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ゲノム編集された細胞は、必須遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセットを含み、必須遺伝子の第２のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。

一部の実施形態において、本システムは、第１の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、第２の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型とを含む。一部の実施形態において、細胞集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ゲノム編集された細胞は、第１の必須遺伝子の一方又は両方のアレルに第１のノックインカセットを含み、第２の必須遺伝子の一方又は両方のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要な第１及び第２の必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はそれらの機能変異体を発現する。

別の態様において、本開示は、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列が必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームであり、且つその下流（３’側）にあるノックインカセットを含むドナー鋳型を特徴とし、必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、相同組換え修復（ＨＤＲ）による細胞のゲノムの編集における使用のためのものである。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ノックインカセットの両側に相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、細胞のゲノムにおいて標的部位の５’側に位置する配列と相同な配列を含む５’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、細胞のゲノムにおいて標的部位の３’側に位置する配列と相同な配列を含む３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、細胞のゲノムにおいて標的部位の５’側に位置する配列と相同な配列を含む５’相同性アームを含み、及びドナー鋳型は、細胞のゲノムにおいて標的部位の３’側に位置する配列と相同な配列を含む３’相同性アームを含む。

一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、必須遺伝子の内因性コード配列のある領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

一態様において、本開示は、修飾された細胞の集団を作製する方法であって、細胞を、（ｉ）複数の細胞における必須遺伝子であって、細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする必須遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び（ｉｉ）必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触させることを含む方法を特徴とし、ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によって複数の細胞のゲノムに組み込まれ、その結果、ゲノム編集された細胞は、（ａ）目的の遺伝子産物、及び（ｂ）複数の細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現し、及び接触させるステップ後、生存細胞の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものが、ゲノム編集された細胞であり、及び／又は組み込まれたノックインカセットを欠く細胞の約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下又は約５％以下が生存細胞であり、それにより修飾された細胞の集団が作製される。一部の実施形態において、接触させるステップ後、生存細胞の少なくとも約８０％が、ゲノム編集された細胞であり、及び組み込まれたノックインカセットを欠く細胞の約２０％以下が生存細胞である。一部の実施形態において、接触させるステップ後、生存細胞の少なくとも約６０％が、ゲノム編集された細胞であり、及び組み込まれたノックインカセットを欠く細胞の約４０％以下が生存細胞である。一部の実施形態において、接触させるステップ後、生存細胞の少なくとも約９０％が、ゲノム編集された細胞であり、及び組み込まれたノックインカセットを欠く細胞の約１０％以下が生存細胞である。一部の実施形態において、接触させるステップ後、生存細胞の少なくとも約９５％が、ゲノム編集された細胞であり、及び組み込まれたノックインカセットを欠く細胞の約５％以下が生存細胞である。

一部の実施形態において、切断は、二本鎖切断である。

別の態様において、本開示は、細胞における必須遺伝子の内因性コード配列内に目的の遺伝子産物のノックインを含む細胞を選択及び／又は同定する方法であって、細胞集団を、（ｉ）複数の細胞における必須遺伝子であって、細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする必須遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び（ｉｉ）必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触させることであって、ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によって複数の細胞のゲノムに組み込まれる、接触させることと、細胞集団において、（ａ）目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現するゲノム編集された細胞を同定することとを含む方法を特徴とする。

一部の実施形態において、切断は、二本鎖切断である。

一部の実施形態において、本方法は、細胞集団を、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、且つ必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型と接触させることを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、必須遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセットを含み、必須遺伝子の第２のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。

一部の実施形態において、本方法は、細胞集団を、第１の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、且つ第２の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型と接触させることを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、第１の必須遺伝子の一方又は両方のアレルに第１のノックインカセットを含み、第２の必須遺伝子の一方又は両方のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）細胞の生存及び／又は増殖に必要な第１及び第２の必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はそれらの機能変異体を発現する。

別の態様において、本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（例えば、ｉＰＳＣ集団中のｉＰＳＣ）のゲノムを編集する方法であって、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団）を、（ｉ）ｉＰＳＣにおけるグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び（ｉｉ）ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触させることを含む方法を特徴とし、ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によってｉＰＳＣのゲノムに組み込まれ、その結果、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

一部の実施形態において、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものが、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び／又は組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下又は約５％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約８０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約２０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約４０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約９０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約１０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約９５％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約５％以下が生存ｉＰＳＣである。

一部の実施形態において、ノックインカセットが相同組換え修復（ＨＤＲ）によってｉＰＳＣのゲノムに正しい位置又は向きで組み込まれない場合、そのｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体をもはや発現しない。

一部の実施形態において、切断は、二本鎖切断である。

一部の実施形態において、切断は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列の最後の２０００、１５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対内に位置する。一部の実施形態において、切断は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列の最後の２００塩基対内に位置する。一部の実施形態において、切断は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の最後のエクソン内に位置する。

一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、極めて効率が高く、例えばヌクレアーゼと接触したｉＰＳＣの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものを編集する能力を有する。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はメガヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、及び本方法は、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団）をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのためのガイド分子と接触させることを更に含む。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａヌクレアーゼ又はその変異体（例えば、配列番号５８～６６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むヌクレアーゼ）である。一部の実施形態において、ガイド分子は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列の一部分と相補的なターゲティングドメイン配列を含む。一部の実施形態において、ガイド分子は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列の一部分と相補的な配列と３ヌクレオチドを超えて異ならないターゲティングドメイン配列を含む。一部の実施形態において、ガイド分子は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列のその一部分に特異的に結合する。一部の実施形態において、ガイド分子は、別の遺伝子、例えば異なる必須遺伝子の内因性コード配列に結合しない。一部の実施形態において、ガイドは、配列番号９４～１５７及び２２５～１８８５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ノックインカセットの両側に相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノムにおいて切断の５’側に位置する配列と相同な配列を含む５’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノムにおいて切断の３’側に位置する配列と相同な配列を含む３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノムにおいて切断の５’側に位置する配列と相同な配列を含む５’相同性アームを含み、及びドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノムにおいて切断の３’側に位置する配列と相同な配列を含む３’相同性アームを含む。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、ＧＡＰＤＨと目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、これらの遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び調節エレメントは、このタンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする。一部の実施形態において、ノックインカセットは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列と、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む。一部の実施形態において、２Ａエレメントは、Ｔ２Ａエレメント（例えば、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｐ２Ａエレメント（例えば、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｅ２Ａエレメント（例えば、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）又はＦ２Ａエレメント（例えば、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）である。一部の実施形態において、ノックインカセットは、２Ａエレメントの上流において、リンカーペプチドをコードする配列を更に含む。一部の実施形態において、リンカーペプチドは、アミノ酸配列ＧＳＧを含む。

一部の実施形態において、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性部分コード配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約２５アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列のうち、切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である。一部の実施形態において、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼの標的部位を除去するか、ノックインカセットがｉＰＳＣのゲノムに組み込まれた後の相同組換えの可能性を低下させるか、又はノックインカセットがｉＰＳＣのゲノムに組み込まれた後にＧＡＰＤＨ及び／又は目的の遺伝子産物の発現を増加させるようにコドン最適化されている。

一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａ）であり、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、Ｃａｓのための少なくとも１つのＰＡＭ部位を含み、この少なくとも１つのＰＡＭ部位（又は全てのＰＡＭ部位）は、コドン最適化されているか、又はサイレント及び／若しくはミスセンス突然変異で飽和している。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、２つ以上の目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含む多シストロン性（例えば、２シストロン性）ノックインカセットである。一部の実施形態において、ノックインカセットは、第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列と、リンカー（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ及び／又はＩＲＥＳ）と、第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列とを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルにノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

一部の実施形態において、本方法は、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団）を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、且つＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型と接触させることを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセットを含み、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

別の態様において、本開示は、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列がＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列とインフレームであり、且つその下流（３’側）にあるゲノムを含む遺伝子修飾されたｉＰＳＣを特徴とし、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列の少なくとも一部は、外因性コード配列を含む。

一部の実施形態において、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列の約２０００、１５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対を含む。一部の実施形態において、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列の約２００塩基対を含む。

一部の実施形態において、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約２５アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列のうち、切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である。一部の実施形態において、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓの標的部位を除去するようにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａ）であり、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列は、Ｃａｓのための少なくとも１つのＰＡＭ部位を含み、この少なくとも１つのＰＡＭ部位（又は全てのＰＡＭ部位）は、コドン最適化されているか、又はサイレント及び／若しくはミスセンス突然変異で飽和している。

一部の実施形態において、ｉＰＳＣのゲノムは、ＧＡＰＤＨ遺伝子によってコードされる遺伝子産物と目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、これらの遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び調節エレメントは、このタンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする。一部の実施形態において、ｉＰＳＣのゲノムは、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列と、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む。

一部の実施形態において、ｉＰＳＣのゲノムは、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、及び３’ＵＴＲ配列が存在する場合、その３’ＵＴＲ配列は、外因性コード配列の３’側且つポリアデニル化配列の５’側に位置する。

一部の実施形態において、ｉＰＳＣのゲノムは、レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない。

別の態様において、本開示は、ゲノム修飾を含む操作されたｉＰＳＣを特徴とし、ゲノム修飾は、ｉＰＳＣのゲノムにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内への外因性ノックインカセットの挿入を含み、ノックインカセットは、ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体をコードする外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含み、ｉＰＳＣは、目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現し、任意選択で、目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨは、内因性ＧＡＰＤＨプロモーターから発現される。

一部の実施形態において、ＧＡＰＤＨをコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列の約２０００、１５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対を含む。一部の実施形態において、ＧＡＰＤＨをコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列の約２００塩基対を含む。

一部の実施形態において、ＧＡＰＤＨをコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、ＧＡＰＤＨのＣ末端断片をコードする。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約２５アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列のうち、切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、ＧＡＰＤＨをコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である。一部の実施形態において、ＧＡＰＤＨをコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓの標的部位を除去するようにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａ）であり、ＧＡＰＤＨをコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、Ｃａｓのための少なくとも１つのＰＡＭ部位を含み、この少なくとも１つのＰＡＭ部位（又は全てのＰＡＭ部位）は、コドン最適化されているか、又はサイレント及び／若しくはミスセンス突然変異で飽和している。

一部の実施形態において、操作されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットと、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型とを含む。一部の実施形態において、操作されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセットを含み、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、操作されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるｉＰＳＣから分化した免疫細胞（例えば、ｉＮＫ細胞又はＴ細胞）を特徴とする。

別の態様において、本開示は、医薬としての使用のための、及び／又は疾患、障害若しくは病態、例えば本明細書に記載される疾患、障害若しくは病態、例えば癌、例えば本明細書に記載される癌の治療における使用のための、本明細書に記載されるｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣから分化したｉＮＫ又はＴ細胞）のいずれかを特徴とする。

別の態様において、本開示は、本明細書に記載される方法のいずれかによって作製されるｉＰＳＣ若しくはｉＰＳＣ集団又はその子孫を特徴とする。

別の態様において、本開示は、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団中のｉＰＳＣ）のゲノムを編集するためのシステムであって、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団）と、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼと、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型とを含むシステムを特徴とする。

一部の実施形態において、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものが、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び／又は組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下又は約５％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約８０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約２０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約４０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約９０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約１０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約９５％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約５％以下が生存ｉＰＳＣである。

一部の実施形態において、ｉＰＳＣ又はｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ノックインカセットが相同組換え修復（ＨＤＲ）によってｉＰＳＣのゲノムに正しい位置又は向きで組み込まれない場合、そのｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体をもはや発現しない。

一部の実施形態において、切断は、二本鎖切断である。

一部の実施形態において、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性部分コード配列は、ＧＡＰＤＨのＣ末端断片をコードする。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約２５アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列のうち、切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、２つ以上の目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含む多シストロン性（例えば、２シストロン性）ノックインカセットである。一部の実施形態において、ノックインカセットは、第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列と、リンカー（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ及び／又はＩＲＥＳ）と、第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列とを含む。一部の実施形態において、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルにノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

一部の実施形態において、本システムは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型とを含む。一部の実施形態において、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセットを含み、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

別の態様において、本開示は、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列がＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームであり、且つその下流（３’側）にあるノックインカセットを含むドナー鋳型を特徴とする。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、相同組換え修復（ＨＤＲ）によるｉＰＳＣのゲノムの編集における使用のためのものである。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ノックインカセットの両側に相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノムにおいて標的部位の５’側に位置する配列と相同な配列を含む５’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノムにおいて標的部位の３’側に位置する配列と相同な配列を含む３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノムにおいて標的部位の５’側に位置する配列と相同な配列を含む５’相同性アームを含み、及びドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノムにおいて標的部位の３’側に位置する配列と相同な配列を含む３’相同性アームを含む。

一部の実施形態において、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性部分コード配列は、ＧＡＰＤＨのＣ末端断片をコードする。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、約２５１０アミノ酸長未満である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列の一領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

別の態様において、本開示は、修飾されたｉＰＳＣの集団を作製する方法であって、ｉＰＳＣを、（ｉ）複数のｉＰＳＣにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び（ｉｉ）ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触させることを含む方法を特徴とし、ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によって複数のｉＰＳＣのゲノムに組み込まれ、その結果、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現し、及び接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものが、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び／又は組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣの約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下又は約５％以下が生存ｉＰＳＣであり、それにより修飾されたｉＰＳＣの集団が作製される。一部の実施形態において、接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約８０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣの約２０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣの約４０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約９０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣの約１０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約９５％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣの約５％以下が生存ｉＰＳＣである。

一部の実施形態において、切断は、二本鎖切断である。

別の態様において、本開示は、ｉＰＳＣにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内に目的の遺伝子産物のノックインを含むｉＰＳＣを選択及び／又は同定する方法であって、ｉＰＳＣ集団を、（ｉ）複数のｉＰＳＣにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び（ｉｉ）ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触させることであって、ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によって複数のｉＰＳＣのゲノムに組み込まれる、接触させることと、ｉＰＳＣ集団において、（ａ）目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現するゲノム編集されたｉＰＳＣを同定することとを含む方法を特徴とする。

一部の実施形態において、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものが、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び／又は組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下又は約５％以下がｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約８０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約２０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約４０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約９０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約１０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約９５％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣ集団の約５％以下が生存ｉＰＳＣである。

一部の実施形態において、切断は、二本鎖切断である。

一部の実施形態において、本方法は、ｉＰＳＣ集団を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、且つＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型と接触させることを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセットを含み、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

別の態様において、本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（例えば、ｉＰＳＣ集団中のｉＰＳＣ）のゲノムを編集する方法であって、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団）を、（ｉ）ｉＰＳＣにおけるグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び（ｉｉ）ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触させることを含む方法を特徴とし、ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によってｉＰＳＣのゲノムに組み込まれ、その結果、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現し、目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである。

一部の実施形態において、切断は、二本鎖切断である。

一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、２つ以上の目的の遺伝子産物、例えば以下の目的の遺伝子産物、順番に：ＣＤ１６＋ＩＬ１５；ＩＬ１５＋ＣＤ１６；ＣＤ１６＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＩＬ１５；ＣＤ１６＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＩＬ１５；ＣＡＲ＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＡＲの１つ以上の多シストロン性ノックインを（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルに）含む。一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、以下のような目的の遺伝子産物の対：ＣＤ１６＋ＩＬ１５；ＩＬ１５＋ＣＤ１６；ＣＤ１６＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＩＬ１５；ＣＤ１６＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＩＬ１５；ＣＡＲ＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＡＲの両アレルノックイン（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１の目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２の目的の遺伝子産物）を含む。

一部の実施形態において、本方法は、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団）をＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、且つ第２の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型と接触させることを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルに第１のノックインカセットを含み、第２の必須遺伝子の一方又は両方のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、（ｂ）ＧＡＰＤＨ、及び（ｃ）ｉＰＳＣの生存及び／又は増殖に必要な第２の必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。一部の実施形態において、第２の必須遺伝子は、表３又は表４に掲載される遺伝子である。一部の実施形態において、第２の必須遺伝子は、ＴＢＰである。

別の態様において、本開示は、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列がＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列とインフレームであり、且つその下流（３’側）にあるゲノムを含む遺伝子修飾されたｉＰＳＣを特徴とし、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列の少なくとも一部は、外因性コード配列を含み、及び目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである。

別の態様において、本開示は、ゲノム修飾を含む操作されたｉＰＳＣを特徴とし、ゲノム修飾は、ｉＰＳＣのゲノムにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内への外因性ノックインカセットの挿入を含み、ノックインカセットは、ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体をコードする外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含み、ｉＰＳＣは、目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現し、任意選択で目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨは、内因性ＧＡＰＤＨプロモーターから発現し、及び目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである。

一部の実施形態において、操作されたｉＰＳＣは、２つ以上の目的の遺伝子産物、例えば以下の目的の遺伝子産物、順番に：ＣＤ１６＋ＩＬ１５；ＩＬ１５＋ＣＤ１６；ＣＤ１６＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＩＬ１５；ＣＤ１６＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＩＬ１５；ＣＡＲ＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＡＲの１つ以上の多シストロン性ノックインを（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルに）含む。一部の実施形態において、操作されたｉＰＳＣは、以下のような目的の遺伝子産物の対：ＣＤ１６＋ＩＬ１５；ＩＬ１５＋ＣＤ１６；ＣＤ１６＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＩＬ１５；ＣＤ１６＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＩＬ１５；ＣＡＲ＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＡＲの両アレルノックイン（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１の目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２の目的の遺伝子産物）を含む。

一部の実施形態において、操作されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルに第１のノックインカセットを含み、第２の必須遺伝子の一方又は両方のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、（ｂ）ＧＡＰＤＨ、及び（ｃ）ｉＰＳＣの生存及び／又は増殖に必要な第２の必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。一部の実施形態において、第２の必須遺伝子は、表３又は表４に掲載される遺伝子である。一部の実施形態において、第２の必須遺伝子は、ＴＢＰである。

別の態様において、本開示は、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団中のｉＰＳＣ）のゲノムを編集するためのシステムであって、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団）と、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼと、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型とを含むシステムを特徴し、目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである。

一部の実施形態において、切断は、二本鎖切断である。

一部の実施形態において、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及び１つ又は複数のドナー鋳型と接触させた後、ｉＰＳＣは、２つ以上の目的の遺伝子産物、例えば以下の目的の遺伝子産物、順番に：ＣＤ１６＋ＩＬ１５；ＩＬ１５＋ＣＤ１６；ＣＤ１６＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＩＬ１５；ＣＤ１６＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＩＬ１５；ＣＡＲ＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＡＲの１つ以上の多シストロン性ノックインを（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルに）含む。一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、以下のような目的の遺伝子産物の対：ＣＤ１６＋ＩＬ１５；ＩＬ１５＋ＣＤ１６；ＣＤ１６＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＩＬ１５；ＣＤ１６＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＩＬ１５；ＣＡＲ＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＡＲの両アレルノックイン（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１の目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２の目的の遺伝子産物）を含む。

一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルに第１のノックインカセットを含み、第２の必須遺伝子の一方又は両方のアレルに第２のノックインカセットを含む。一部の実施形態において、ＩＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、（ｂ）ＧＡＰＤＨ、及び（ｃ）ｉＰＳＣの生存及び／又は増殖に必要な第２の必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。一部の実施形態において、第２の必須遺伝子は、表３又は表４に掲載される遺伝子である。一部の実施形態において、第２の必須遺伝子は、ＴＢＰである。

別の態様において、本開示は、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列がＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームであり、且つその下流（３’側）にあるノックインカセットを含むドナー鋳型を特徴とし、目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである。

別の態様において、本開示は、修飾されたｉＰＳＣの集団を作製する方法であって、ｉＰＳＣを、（ｉ）複数のｉＰＳＣにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び（ｉｉ）ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触させることを含む方法を特徴とし、ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によって複数のｉＰＳＣのゲノムに組み込まれ、その結果、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現し、目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせであり、及び接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものが、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び／又は組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣの約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下又は約５％以下が生存ｉＰＳＣであり、それにより修飾されたｉＰＳＣの集団が作製される。一部の実施形態において、接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約８０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣの約２０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣの約４０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約９０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣの約１０％以下が生存ｉＰＳＣである。一部の実施形態において、接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約９５％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、及び組み込まれたノックインカセットを欠くｉＰＳＣの約５％以下が生存ｉＰＳＣである。

一部の実施形態において、ノックインカセットが相同組換え修復（ＨＤＲ）によってｉＰＳＣのゲノムに正しい位置又は向きで組み込まれない場合、そのｉＰＳＣは、ＡＰＤＨ又はその機能変異体をもはや発現しない。

一部の実施形態において、切断は、二本鎖切断である。

いくつかの実施形態では、ノックインカセットは、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、及び３’ＵＴＲ配列が存在する場合、その３’ＵＴＲ配列は、外因性コード配列の３’側且つポリアデニル化配列の５’側に位置する。

いくつかの実施形態では、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性部分コード配列は、ＧＡＰＤＨのＣ末端断片をコードする。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、約５００、約２５０、約１５０、約１２５、約１００、約７５、約５０、約２５、約２０、約１５又は約１０アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、約２５アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列のうち、切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である。いくつかの実施形態では、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼの標的部位を除去するか、ノックインカセットがｉＰＳＣのゲノムに組み込まれた後の相同組換えの可能性を低下させるか、又はノックインカセットがｉＰＳＣのゲノムに組み込み後にＧＡＰＤＨ及び／若しくは目的の遺伝子産物の発現を増加させるようにコドン最適化されている。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａ）であり、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、Ｃａｓにおける少なくとも１つのＰＡＭ部位を含み、少なくとも１つのＰＡＭ部位（又は全てのＰＡＭ部位）は、コドン最適化されているか、又はサイレント及び／若しくはミスセンス突然変異で飽和している。

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない。

いくつかの実施形態では、ノックインカセットは、２つ以上の目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含む多シストロン性（例えば、２シストロン性）ノックインカセットである。いくつかの実施形態では、ノックインカセットは、第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列、リンカー（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ及び／又はＩＲＥＳ）及び第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルにノックインカセットを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

いくつかの実施形態では、本方法は、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団）を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、且つＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセット及びＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２のノックインカセットを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、２つ以上の目的の遺伝子産物、例えば以下の目的の遺伝子産物：ＣＤ１６＋ＩＬ１５；ＩＬ１５＋ＣＤ１６；ＣＤ１６＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＩＬ１５；ＣＤ１６＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＩＬ１５；ＣＡＲ＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＡＲの順序での１つ以上の多シストロン性ノックインを（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルに）含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、以下のような目的の遺伝子産物の対：ＣＤ１６＋ＩＬ１５；ＩＬ１５＋ＣＤ１６；ＣＤ１６＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋ＣＡＲ；ＣＡＲ＋ＩＬ１５；ＣＤ１６＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＤ１６；ＩＬ１５＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＩＬ１５；ＣＡＲ＋（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）；（ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ４７）＋ＣＡＲの両アレルノックイン（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１の目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２の目的の遺伝子産物）を含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団）を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、且つ第２の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルに第１のノックインカセット及び第２の必須遺伝子の一方又は両方のアレルに第２のノックインカセットを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、（ｂ）ＧＡＰＤＨ、及び（ｃ）ｉＰＳＣの生存及び／又は増殖に必要である、第２の必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はその機能変異体を発現する。いくつかの実施形態では、第２の必須遺伝子は、表３又は表４に掲載される遺伝子である。いくつかの実施形態では、第２の必須遺伝子は、ＴＢＰである。

別の態様では、本開示は、ｉＰＳＣにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内に目的の遺伝子産物のノックインを含むｉＰＳＣを選択及び／又は同定する方法であって、ｉＰＳＣ集団を、（ｉ）複数のｉＰＳＣにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び（ｉｉ）ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触させることと、（ａ）目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現するｉＰＳＣ集団内のゲノム編集されたｉＰＳＣを同定することとを含み、ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によって複数のｉＰＳＣのゲノムに組み込まれ、目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）又はその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）又はその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである、方法を特徴とする。

いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％若しくはそれを超えるものが、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ／又は組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下若しくは約５％以下がｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約８０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約２０％以下が生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約４０％以下が生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約９０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約１０％以下が生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約９５％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約５％以下が生存ｉＰＳＣである。

いくつかの実施形態では、ノックインカセットが相同組換え修復（ＨＤＲ）によって正確な位置又は向きでｉＰＳＣのゲノムに組み込まれない場合、ｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体をもはや発現しない。

いくつかの実施形態では、切断は、二本鎖切断である。

いくつかの実施形態では、切断は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列の最後の２０００、１５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、切断は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列の最後の２００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、切断は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の最後のエクソン内に位置する。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、極めて効率的であり、例えばヌクレアーゼと接触されたｉＰＳＣの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものを編集する能力がある。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、及び本方法は、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団）をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのガイド分子と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９若しくはＣａｓ１２ａヌクレアーゼ又はその変異体（例えば、配列番号５８～６６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むヌクレアーゼ）である。いくつかの実施形態では、ガイド分子は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列の一部に相補的である標的ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイド分子は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列の一部に相補的である配列と３ヌクレオチドを超えて異ならない標的ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイド分子は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列の一部に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ガイド分子は、別の遺伝子、例えば異なる必須遺伝子の内因性コード配列に結合しない。いくつかの実施形態では、ガイドは、配列番号９４～１５７及び２２５～１８８５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ドナーＤＮＡ鋳型であり、任意選択で、ドナーＤＮＡ鋳型は、二本鎖である。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ鋳型は、プラスミドであり、任意選択で、プラスミドは、線状化されていない。

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ノックインカセットの両側に相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノム内の切断の５’側に位置する配列と相同な配列を含む５’相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノム内の切断の３’側に位置する配列と相同な配列を含む３’相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノム内の切断の５’側に位置する配列と相同な配列を含む５’相同性アームを含み、且つドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノム内の切断の３’側に位置する配列と相同な配列を含む３’相同性アームを含む。

いくつかの実施形態では、ノックインカセットは、ＧＡＰＤＨと目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、遺伝子産物の少なくとも１つは、タンパク質であり、及び調節エレメントは、そのタンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする。いくつかの実施形態では、ノックインカセットは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列と、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む。いくつかの実施形態では、２Ａエレメントは、Ｔ２Ａエレメント（例えば、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｐ２Ａエレメント（例えば、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｅ２Ａエレメント（例えば、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）又はＦ２Ａエレメント（例えば、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）である。いくつかの実施形態では、ノックインカセットは、２Ａエレメントの上流において、リンカーペプチドをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、アミノ酸配列ＧＳＧを含む。

いくつかの実施形態では、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である。いくつかの実施形態では、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼの標的部位を除去するか、ノックインカセットがｉＰＳＣのゲノムに組み込まれた後の相同組換えの可能性を低下させるか、又はノックインカセットがｉＰＳＣのゲノムに組み込まれた後にＧＡＰＤＨ及び／若しくは目的の遺伝子産物の発現を増加させるようにコドン最適化されている。

いくつかの実施形態では、本方法は、ｉＰＳＣ集団を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型と、且つＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセット及びＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２のノックインカセットを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

別の態様では、本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（例えば、ｉＰＳＣ集団内のｉＰＳＣ）のゲノムを編集する方法であって、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団）を、（ｉ）ｉＰＳＣにおけるグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び（ｉｉ）ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触させることを含み、ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によってｉＰＳＣのゲノムに組み込まれ、その結果、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現し、目的の遺伝子産物は、ＰＤ－Ｌ１又は白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）である、方法を特徴とする。

いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％若しくはそれを超えるものが、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ／又は組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下若しくは約５％以下が生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約８０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約２０％以下が生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約４０％以下が生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約９０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約１０％以下が生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約９５％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約５％以下が生存ｉＰＳＣである。

いくつかの実施形態では、切断は、二本鎖切断である。

いくつかの実施形態では、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性部分コード配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、約５００、約２５０、約１５０、約１２５、約１００、約７５、約５０、約２５、約２０、約１５又は約１０アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、約２５アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列のうち、切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、２つ以上の目的の遺伝子産物、例えば以下の目的の遺伝子産物：ＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ４７；又はＣＤ４７＋ＰＤ－Ｌ１の順序での１つ以上の多シストロン性ノックインを（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルに）含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、以下のような目的の遺伝子産物の対：ＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ４７の両アレルノックイン（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１の目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２の目的の遺伝子産物）を含む。

別の態様では、本開示は、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列がＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列とインフレームであり、且つその下流（３’側）にあるゲノムを含む遺伝子組換えｉＰＳＣを特徴とし、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列の少なくとも一部は、外因性コード配列を含み、目的の遺伝子産物は、ＰＤ－Ｌ１又は白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）である。

いくつかの実施形態では、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列の約２０００、約１５００、約１０００、約７５０、約５００、約４００、約３００、約２００、約１００又は約５０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列の約２００塩基対を含む。

いくつかの実施形態では、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、約５００、約２５０、約１５０、約１２５、約１００、約７５、約５０、約２５、約２０、約１５又は約１０アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、約２５アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列のうち、切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である。いくつかの実施形態では、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓの標的部位を除去するようにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａ）であり、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列は、Ｃａｓにおける少なくとも１つのＰＡＭ部位を含み、少なくとも１つのＰＡＭ部位（又は全てのＰＡＭ部位）は、コドン最適化されているか、又はサイレント及び／若しくはミスセンス突然変異で飽和している。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣのゲノムは、ＧＡＰＤＨ遺伝子によってコードされる遺伝子産物と目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、遺伝子産物の少なくとも１つは、タンパク質であり、及び調節エレメントは、そのタンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣのゲノムは、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列と、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣのゲノムは、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、及び３’ＵＴＲ配列が存在する場合、その３’ＵＴＲ配列は、外因性コード配列の３’側且つポリアデニル化配列の５’側に位置する。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣのゲノムは、レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない。

別の態様では、本開示は、ゲノム修飾を含む改変されたｉＰＳＣを特徴とし、ゲノム修飾は、ｉＰＳＣのゲノムにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内への外因性ノックインカセットの挿入を含み、ノックインカセットは、ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体をコードする外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含み、ｉＰＳＣは、目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現し、任意選択で、目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨは、内因性ＧＡＰＤＨプロモーターから発現され、目的の遺伝子産物は、ＰＤ－Ｌ１又は白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）である。

いくつかの実施形態では、ＧＡＰＤＨをコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列の約２０００、約１５００、約１０００、約７５０、約５００、約４００、約３００、約２００、約１００又は約５０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＰＤＨをコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列の約２００塩基対を含む。

いくつかの実施形態では、ＧＡＰＤＨをコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、ＧＡＰＤＨのＣ末端断片をコードする。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、約５００、約２５０、約１５０、約１２５、約１００、約７５、約５０、約２５、約２０、約１５又は約１０アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、約２５アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列のうち、切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＧＡＰＤＨをコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である。いくつかの実施形態では、ＧＡＰＤＨをコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓの標的部位を除去するようにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａ）であり、ＧＡＰＤＨをコードする外因性コード配列又は部分コード配列は、Ｃａｓにおける少なくとも１つのＰＡＭ部位を含み、少なくとも１つのＰＡＭ部位（又は全てのＰＡＭ部位）は、コドン最適化されているか、又はサイレント及び／若しくはミスセンス突然変異で飽和している。

いくつかの実施形態では、改変されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含むと共に、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型を有する。いくつかの実施形態では、改変されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセット及びＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２のノックインカセットを含む。いくつかの実施形態では、改変されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

いくつかの実施形態では、改変されたｉＰＳＣは、２つ以上の目的の遺伝子産物、例えば以下の目的の遺伝子産物：ＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ４７；ＣＤ４７＋ＰＤ－Ｌ１の順序での１つ以上の多シストロン性ノックインを（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルに）含む。いくつかの実施形態では、改変されたｉＰＳＣは、ＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ４７の両アレルノックイン（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１の目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２の目的の遺伝子産物）を含む。

別の態様では、本開示は、本明細書に記載のｉＰＳＣから分化した免疫細胞（例えば、ｉＮＫ細胞又はＴ細胞）を特徴とする。

別の態様では、本開示は、疾患、障害又は病態、例えば本明細書に記載の疾患、障害又は病態、例えば癌、例えば本明細書に記載の癌の薬剤としての使用及び／又は治療における使用のための、本明細書に記載のｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣから分化したｉＮＫ若しくはＴ細胞）のいずれかを特徴とする。

別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかによって生成されるｉＰＳＣ若しくはｉＰＳＣ集団又はその子孫を特徴とする。

別の態様では、本開示は、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団内のｉＰＳＣ）のゲノムを編集するためのシステムであって、ｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣ集団）、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ及びＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型を含み、目的の遺伝子産物がＰＤ－Ｌ１又は白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）である、システムを特徴とする。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％若しくはそれを超えるものは、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ／又は組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下若しくは約５％以下は、生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約８０％は、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約２０％以下は、生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％は、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約４０％以下は、生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約９０％は、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約１０％以下は、生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ｉＰＳＣ集団の生存ｉＰＳＣの少なくとも約９５％は、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣ集団の約５％以下は、生存ｉＰＳＣである。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ又はｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ノックインカセットが相同組換え修復（ＨＤＲ）によって正確な位置又は向きでｉＰＳＣのゲノムに組み込まれない場合、ｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体をもはや発現しない。

いくつかの実施形態では、切断は、二本鎖切断である。

いくつかの実施形態では、ノックインカセットは、２つ以上の目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含む多シストロン性（例えば、２シストロン性）ノックインカセットである。いくつかの実施形態では、ノックインカセットは、第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列、リンカー（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ及び／又はＩＲＥＳ）及び第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルにノックインカセットを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

いくつかの実施形態では、システムは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第１の目的の遺伝子産物のための第１の外因性コード配列を含む第１のノックインカセットを含む第１のドナー鋳型を含むと共に、ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に第２の目的の遺伝子産物のための第２の外因性コード配列を含む第２のノックインカセットを含む第２のドナー鋳型を有する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の第１のアレルに第１のノックインカセット及びＧＡＰＤＨ遺伝子の第２のアレルに第２のノックインカセットを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）第１及び第２の目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ集団をヌクレアーゼ及び１つ又は複数のドナー鋳型と接触させた後、ｉＰＳＣは、２つ以上の目的の遺伝子産物、例えば以下の目的の遺伝子産物：ＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ４７；ＣＤ４７＋ＰＤ－Ｌ１の順序での１つ以上の多シストロン性ノックインを（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルに）含む。

別の態様では、本開示は、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列がＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームであり、且つその下流（３’側）にあるノックインカセットを含むドナー鋳型であって、目的の遺伝子産物がＰＤ－Ｌ１又は白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）である、ドナー鋳型を特徴とする。

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、相同組換え修復（ＨＤＲ）によるｉＰＳＣのゲノム編集における使用が意図される。

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ノックインカセットの両側に相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノム内の標的部位の５’側に位置する配列と相同な配列を含む５’相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノム内の標的部位の３’側に位置する配列と相同な配列を含む３’相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノム内の標的部位の５’側に位置する配列と相同な配列を含む５’相同性アームを含み、且つドナー鋳型は、ｉＰＳＣのゲノム内の標的部位の３’側に位置する配列と相同な配列を含む３’相同性アームを含む。

いくつかの実施形態では、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性部分コード配列は、ＧＡＰＤＨのＣ末端断片をコードする。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、約５００、約２５０、約１５０、約１２５、約１００、約７５、約５０、約２５、約２０、約１５又は約１０アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、約２５１０アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端断片は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である。いくつかの実施形態では、ノックインカセット中のＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼの標的部位を除去するか、ノックインカセットのｉＰＳＣのゲノムが組み込まれた後の相同組換えの可能性を低下させるか、又はノックインカセットがｉＰＳＣのゲノムに組み込まれた後にＧＡＰＤＨ及び／若しくは目的の遺伝子産物の発現を増加させるようにコドン最適化されている。

別の態様では、本開示は、修飾されたｉＰＳＣの集団を作製する方法であって、ｉＰＳＣを、（ｉ）複数のｉＰＳＣにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び（ｉｉ）ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触させ、それにより修飾されたｉＰＳＣの集団を生成することを含み、ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によって複数のｉＰＳＣのゲノムに組み込まれ、その結果、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、（ａ）目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現し、目的の遺伝子産物は、ＰＤ－Ｌ１若しくは白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）であり、且つ接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％若しくはそれを超えるものが、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ／又は組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣの約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下若しくは約５％以下が生存ｉＰＳＣである、方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約８０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣの約２０％以下が生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約６０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣの約４０％以下が生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約９０％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣの約１０％以下が生存ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、接触させるステップ後、生存ｉＰＳＣの少なくとも約９５％が、ゲノム編集されたｉＰＳＣであり、且つ組み込みノックインカセットを欠いているｉＰＳＣの約５％以下が生存ｉＰＳＣである。

いくつかの実施形態では、切断は、二本鎖切断である。

いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、２つ以上の目的の遺伝子産物、例えば以下の目的の遺伝子産物：ＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ４７；ＣＤ４７＋ＰＤ－Ｌ１の順序での１つ以上の多シストロン性ノックインを（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の一方又は両方のアレルに）含む。

別の態様では、本開示は、ｉＰＳＣにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内への目的の遺伝子産物のノックインを含む、ｉＰＳＣを選択及び／又は同定する方法であって、ｉＰＳＣ集団を、（ｉ）複数のｉＰＳＣにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び（ｉｉ）ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触させることと、（ａ）目的の遺伝子産物、及び（ｂ）ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現する、ｉＰＳＣ集団内のゲノム編集されたｉＰＳＣを同定することとを含み、ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によって複数のｉＰＳＣのゲノムに組み込まれ、目的の遺伝子産物は、ＰＤ－Ｌ１又は白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）である、方法を特徴とする。

いくつかの実施形態では、切断は、二本鎖切断である。

別の態様では、本開示は、所定のゲノム位置に目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む遺伝子組換え哺乳動物細胞を作製する方法であって、第１の相同性アーム及び第２の相同性アームによってフランキングされている、目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む少なくとも１つのドナー鋳型を提供することと；所定のゲノム位置に標的化されるヌクレアーゼを含む遺伝子編集システムを提供することと；少なくとも１つのドナー鋳型及び遺伝子編集システムを哺乳動物細胞集団に導入することと；哺乳動物細胞集団を培養することと；目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む生存細胞を同定することとを含み、第１及び第２の相同性アームは、本質的に、それぞれ第１ゲノム領域（ＧＲ）及び第２のＧＲと相同であり、第１のＧＲ及び第２のＧＲは、哺乳動物細胞内の必須遺伝子のエクソン内の所定のゲノム位置に隣接及びフランキングしており、エクソンが切断される場合、細胞が生存不能になり、同定された生存細胞は、所定のゲノム位置に目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む遺伝子組換え哺乳動物細胞である、方法を特徴とする。別の態様では、本開示は、所定のゲノム位置に正確に組み込まれている目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む哺乳動物細胞を選択する方法であって、第１の相同性アーム及び第２の相同性アームによってフランキングされている、目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む少なくとも１つのドナー鋳型を提供することと；所定のゲノム位置に標的化されるヌクレアーゼを含む遺伝子編集システムを提供することと；ドナー鋳型及び遺伝子編集システムを哺乳動物細胞集団に導入することと；哺乳動物細胞集団を培養することと；目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む生存細胞を同定することとを含み、第１及び第２の相同性アームは、本質的に、それぞれ第１ゲノム領域（ＧＲ）及び第２のＧＲと相同であり、第１のＧＲ及び第２のＧＲは、哺乳動物細胞内の必須遺伝子のエクソン内の所定のゲノム位置に隣接及びフランキングしており、エクソンが切断される場合、細胞が生存不能になり、同定された生存細胞は、所定のゲノム位置に正確に組み込まれた目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む、方法を特徴とする。

いくつかの実施形態では、エクソンは、必須遺伝子が２つ以上のエクソンを有する場合、必須遺伝子の最後又は最後から２番目のエクソンである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子のエクソン内の所定のゲノム位置は、必須遺伝子の、停止コドンの上流の約２００ｂｐ以内又は開始コドンの下流の約２００ｂｐ以内である。

いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、メガヌクレアーゼに基づくシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に基づくシステム、転写アクチベーター様エフェクターに基づくヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、ＣＲＩＳＰＲに基づくシステム又はＮｇＡｇｏに基づくシステムである。

いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ若しくはＤＮＡ及び所定のゲノム位置を標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、ＣＲＩＳＰＲに基づくシステムであり、任意選択で、遺伝子編集システムは、ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ９（任意選択でｓａＣａｓ９又はｓｐＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ又はＣｓｍ１である。

いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、表３又は表４に掲載される遺伝子座から選択される。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ７又はＲＰＬＰ０遺伝子である。

いくつかの実施形態では、第１の相同性アーム及び／又は第２の相同性アームは、サイレントＰＡＭ遮断突然変異又はコドン修飾であって、必須遺伝子座が修飾されるとヌクレアーゼによって切断されないように、ヌクレアーゼによるドナー鋳型の切断を阻止するものを含む。

いくつかの実施形態では、目的の遺伝子産物のためのコード配列は、自己切断ペプチドのためのコード配列を通じて、必須遺伝子配列にインフレームで連結されるか、又は目的の遺伝子産物のためのコード配列は、５’末端に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。

いくつかの実施形態では、目的の遺伝子産物は、治療用タンパク質（任意選択で抗体、改変された抗原受容体又はその抗原結合断片）、免疫調節タンパク質、レポータータンパク質又は安全スイッチシグナルである。

いくつかの実施形態では、本方法は、哺乳動物細胞集団を非相同末端結合の阻害剤と接触させることを更に含む。

いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞集団は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞集団は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、胚性幹細胞又は誘導ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）である。

いくつかの実施形態では、本方法は、２つ以上のドナー鋳型を提供することを含む。いくつかの実施形態では、各ドナー鋳型は、必須遺伝子に標的化される。いくつかの実施形態では、各ドナー鋳型は、異なるゲノム配列を含む。いくつかの実施形態では、各ドナー鋳型は、２つ以上の目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む。

いくつかの実施形態では、１つのドナー鋳型からのゲノム配列は、必須遺伝子の一方のアレルに組み込まれ、他のドナー鋳型からのゲノム配列は、必須遺伝子の他方のアレルに組み込まれる。いくつかの実施形態では、各ドナー鋳型は、２つ以上の目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む。

いくつかの実施形態では、各ドナー鋳型は、少なくとも１つの安全スイッチを含む。いくつかの実施形態では、各ドナー鋳型は、安全スイッチの少なくとも１つの成分を含む。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、自殺スイッチとして機能するために二量体化を必要とする。

いくつかの実施形態では、本方法は、生存細胞に、所定のゲノム位置に標的化されるヌクレアーゼを含む遺伝子編集システムを提供する追加的なステップと；任意選択で、少なくとも１つのドナー鋳型を再導入して第２の哺乳動物細胞集団を得る追加的なステップと；第２の哺乳動物細胞集団を培養する追加的なステップと；ドナー鋳型からの目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む第２の哺乳動物細胞集団から生存細胞を同定する追加的なステップとを更に含み、第２の哺乳動物細胞集団から同定された生存細胞は、所定のゲノム位置にドナー鋳型からの目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む遺伝子組換え哺乳動物細胞である。

いくつかの実施形態では、目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む、第２の培養するステップからの生存細胞の割合は、目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む、第１の培養するステップからの生存細胞から少なくとも４倍富化される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型からの目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む、第２の培養するステップからの生存細胞の割合は、少なくとも２％である。

いくつかの実施形態では、本方法は、目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む哺乳動物細胞をドナー鋳型から分離することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ドナー鋳型からの目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む哺乳動物細胞を、ドナー鋳型からの目的の遺伝子産物のためのコード配列を含む複数の細胞に増殖させることを更に含む。

いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞集団は、ＰＳＣである。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、胚性幹細胞又はｉＰＳＣである。

別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかによって入手可能な遺伝子改変細胞を特徴とする。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＰＳＣである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、ｉＰＳＣである。

別の態様では、本開示は、分化細胞を得る方法であって、本明細書に記載の方法のいずれかによって入手可能な遺伝子改変ｉＰＳＣ又はそのような方法によって得られた遺伝子組換え分化細胞を、ｉＰＳＣの分化細胞への分化を可能にする培地中で培養することを含む、方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、分化細胞は、任意選択で、Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、骨髄系細胞、樹状細胞及び免疫抑制性マクロファージから選択される免疫細胞；任意選択で、ドーパミン作動性ニューロン、ミクログリア細胞、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、皮質ニューロン、脊髄若しくは動眼ニューロン、腸ニューロン、プラコード由来細胞、シュワン細胞及び三叉神経若しくは感覚ニューロンから選択される、神経系の細胞；任意選択で、網膜色素上皮細胞、光受容体錐体細胞、光受容体桿体細胞、双極細胞及び神経節細胞から選択される、視覚系の細胞；任意選択で、心筋細胞、内皮細胞及び結節性細胞から選択される、心血管系の細胞；又は任意選択で、肝細胞、胆管細胞及び膵β細胞から選択される、代謝系の細胞である。いくつかの実施形態では、分化細胞は、ヒト細胞である。

別の態様では、本開示は、本明細書に記載の細胞のいずれかを含む医薬組成物を特徴とする。別の態様では、本開示は、それを必要とするヒト患者を治療する方法であって、医薬組成物を患者に導入するステップを含み、医薬組成物が分化したヒト細胞を含む、方法を特徴とする。別の態様では、本開示は、それを必要とするヒト患者の治療における使用のための医薬組成物であって、分化したヒト細胞を含む、医薬組成物を特徴とする。別の態様では、本開示は、それを必要とするヒト患者の治療における薬剤の製造のための医薬組成物であって、分化したヒト細胞を含む、医薬組成物の使用を特徴とする。いくつかの実施形態では、分化したヒト細胞は、自家又は同種細胞である。

別の態様では、本開示は、哺乳動物細胞のゲノムを編集するためのシステムであって、哺乳動物細胞集団、哺乳動物細胞の必須遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ及び複数のドナー鋳型であって、それぞれが必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含む複数のドナー鋳型を含み、哺乳動物細胞集団をヌクレアーゼ及びドナー鋳型と接触させた後且つ任意選択で哺乳動物細胞集団をヌクレアーゼ及び任意選択でドナー鋳型と２回接触させた後、哺乳動物細胞集団の生細胞の少なくとも約２％が、複数のドナー鋳型から目的の遺伝子産物を発現するゲノム編集された細胞である、システムを特徴とする。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、ＧＡＰＤＨである。

いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ＰＳＣである。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ｉＰＳＣである。

いくつかの実施形態では、切断は、二本鎖切断である。いくつかの実施形態では、切断は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列の最後の１０００、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、切断は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の最後のエクソン内に位置する。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、及びシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのガイド分子を更に含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はメガヌクレアーゼである。

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ドナーＤＮＡ鋳型であり、任意選択で、ドナーＤＮＡ鋳型は、二本鎖である。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、外因性コード配列の両側に相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、相同性アームは、哺乳動物細胞のゲノムの切断の両側に位置する配列に対応する。

本明細書に記載の教示は、添付図面と一緒に読解されるとき、様々な例示的実施形態の以下の説明からより十分に理解されるであろう。下記の図面があくまで例示を目的とし、決して本教示の範囲を限定することを意図されないことが理解されるべきである。

例示的なＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡが結合するＧＡＰＤＨ遺伝子上の位置及びトランスフェクションから３日後の、ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にする例示的なガイドＲＮＡのスクリーニング結果を示す。結果は、生細胞由来のｇＤＮＡから得られる。トランスフェクションから３日後の、ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にする例示的なＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡのスクリーニング結果を示す。結果は、生細胞由来のｇＤＮＡから得られる。本開示の特定の実施形態に従う、必須遺伝子を標的にする例示的な組み込み戦略を示す。特定の実施形態では、二本鎖切断を、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を用いて（例えば、Ｃａｓ１２ａ又はＣａｓ９により）、末端エクソン内（例えば、必須遺伝子の停止コドンの上流（５’側）の約５００ｂｐ以内）に導入し、切断部位での相同組換え修復（ＨＤＲ）を媒介するように設計された相同性アームを有するドナープラスミドを投与することにより、必須遺伝子座で組み込まれた目的のカーゴを保有する生細胞の集団が得られる。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによる編集がなされても、必須遺伝子座でカーゴの組み込みを経なかった細胞は、生存しない。本開示の特定の実施形態に従う、ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にする例示的な組み込み戦略を示す。図３Ｂは、ＧＡＰＤＨ遺伝子が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）内で修飾される場合の戦略を示すが、この方法は、初代細胞、幹細胞及びｉＰＳＣから分化された細胞を含む、種々の細胞型に適用可能である。本開示の特定の実施形態に従う、ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にする例示的な組み込み戦略を示す。図面は、時間経過と共に生存する必要がある細胞が、ＧＡＰＤＨ遺伝子座を修復し、目的のカーゴを含むカセットの標的化組み込みを経た細胞及び未編集細胞に限られることを示す。ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが必須遺伝子標的部位の切断時に高度に有効であり、必須遺伝子産物の機能を有意に低下させるインデルを導入する場合、ＣＲＩＳＰＲ編集後の未編集細胞の集団は、小さいはずである。本開示の特定の実施形態に従う、必須遺伝子を標的にする例示的な組み込み戦略を示す。特定の実施形態では、二本鎖切断を、５’エクソン（例えば、必須遺伝子の開始コドンの下流（３’側）の約５００ｂｐ以内）を標的にするように、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を用いて（例えば、Ｃａｓ１２ａ又はＣａｓ９により）導入し、切断部位での相同組換え修復（ＨＤＲ）を媒介するように設計された相同性アームを有するドナープラスミドを投与することにより、必須遺伝子座で組み込まれた目的のカーゴを保有する生細胞の集団が得られる。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによる編集がなされても、必須遺伝子座でカーゴの組み込みを経なかった細胞は、生存しない。ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にする例示的なＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡの異なる濃度（０．６２５μＭ～４μＭ）での編集効率を示す。ｄｓＤＮＡプラスミド（「ＰＬＡ」）も存在したときのエレクトロポレーションの４日後の、ＧＡＰＤＨ遺伝子へのＣＤ４７をコードする「カーゴ」のノックイン（ＫＩ）効率を示す。ノックイン効率は、２つの異なる濃度のプラスミドを用いて測定された。ノックインは、ノックイン「カーゴ」の３’位置を標的にするｄｄＰＣＲを用いて測定された。ｄｓＤＮＡプラスミドも存在したときのエレクトロポレーションの９日後の、ＧＡＰＤＨ遺伝子へのＣＤ４７をコードする「カーゴ」のノックイン効率を示す。ノックインは、ノックイン「カーゴ」の５’及び３’位置の両方を標的にするｄｄＰＣＲを用いて測定され、結果の信頼度が高められた。ＲＰＬＰ０遺伝子の末端エクソンを標的にするＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡをマッピングする。ＲＰＬＰ０遺伝子の末端エクソンを標的にするＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡをマッピングする。ＲＰＬ１３Ａ遺伝子の末端エクソンを標的にするＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡをマッピングする。ＲＰＬ１３Ａ遺伝子の末端エクソンを標的にするＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡをマッピングする。ＲＰＬ７遺伝子の末端エクソンを標的にするＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡをマッピングする。ＲＰＬ７遺伝子の末端エクソンを標的にするＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡをマッピングする。トランスフェクションの７日後に測定された、ＧＦＰタンパク質をコードする「カーゴ」配列を含むノックインカセットの、ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子座への組み込み効率を示す。（Ａ）は、例示的な顕微鏡（明視野及び蛍光）画像を表し、（Ｂ）は、例示的なフローサイトメトリーデータを表す。画像及びフローサイトメトリーデータは、カーゴ及びガイドＲＮＡのトランスフェクション（ＲＳＱ２２３３７＋ＰＬＡ１５９３又はＲＳＱ２４５７０＋ＰＬＡ１６５１）と比較した、カーゴのトランスフェクション単独（ＰＬＡ１５９３又はＰＬＡ１６５１）における挿入率を表し、加えて、ガイドＲＮＡと共に適切なカーゴ（ＲＳＱ２２３３７＋ＰＬＡ１５９３）を標的にする例示的なエクソンコード領域での挿入率が、ガイドＲＮＡと共に適切なカーゴ（ＲＳＱ２４５７０＋ＰＬＡ１６５１）を標的にするイントロンでの挿入率と比較される。ＧＡＰＤＨ遺伝子座への挿入のための２シストロン性ノックインカセット（例えば、リンカーによって分離された２つのシストロンを含む）の概略図を表し、主要なＧＡＰＤＨエクソン９コード領域及び目的のタンパク質をコードする外因性配列は、リンカー配列によって分離され、第２のＧＡＰＤＨアレルは、標的ノックインカセットの挿入、インデルを含み得るか、又は野生型（ＷＴ）である。ＧＡＰＤＨ遺伝子座への挿入のための両アレルノックインカセットの概略図を表す。目的のタンパク質をコードする外因性「カーゴ」配列は、異なるノックインカセット上に位置し、各構築物において、主要なＧＡＰＤＨエクソン９コード領域は、リンカー配列により、目的のタンパク質をコードする外因性配列から分離される。主要なＧＡＰＤＨエクソン９コード領域並びにリンカー配列Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ及び／又はＩＲＥＳによって分離された、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙをコードする外因性配列を伴う、ＧＡＰＤＨ遺伝子座への挿入のための２シストロン性ノックインカセットの概略図を表す。ＧＡＰＤＨを標的にするＲＳＱ２２３３７（配列番号９５）及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含むＲＮＰ並びにＧＡＰＤＨ遺伝子座に挿入されたＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ分子をコードする「カーゴ」配列を含む２シストロン性ノックインカセットのヌクレオフェクションの９日後のｉＰＳＣの例示的な顕微鏡画像（明視野及び蛍光）のパネルである。リンカーＰ２Ａ及びＴ２Ａを伴う例示的な「カーゴ」分子ＰＬＡ１５８２（ドナー鋳型配列番号４１を含む）、リンカーＴ２Ａ及びＰ２Ａを伴うＰＬＡ１５８３（ドナー鋳型配列番号４２を含む）並びにリンカーＴ２Ａ及びＩＲＥＳを伴うＰＬＡ１５８４（ドナー鋳型配列番号４３を含む）を含むｉＰＳＣが示される。結果は、少なくとも２つの異なるカーゴが２シストロン性に挿入可能であり、使用されたリンカータイプと無関係に発現が検出可能であることを示す。全ての画像が、キーエンス顕微鏡で、２倍の１００μｍで取得された。記載のリンカー対（Ｘ軸）を含む様々な２シストロン性分子からの例示的な「カーゴ」分子ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの発現定量化（Ｙ軸）を表す。唯一の「カーゴ」タンパク質としてのｍＣｈｅｒｒｙは、比較対照として利用された。ＧＡＰＤＨ遺伝子での両アレルのＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙのノックインについての例示的なフローサイトメトリーデータを表す。ＧＡＰＤＨ遺伝子での両アレルのＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙのノックイン後のフローサイトメトリー分析前の細胞集団の蛍光イメージングを表す。ＧＡＰＤＨ遺伝子での両アレルのＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙのノックインについての例示的なフローサイトメトリー分析データを表すヒストグラムである。細胞に、Ｃａｓ１２ａ（配列番号６２）及びＲＳＱ２２３３７（配列番号９５）を含む０．５μＭのＲＮＰ並びに２．５μｇ（５試験）又は５μｇ（１試験）のＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙのドナー鋳型がヌクレオフェクトされた。ｇＲＮＡ及び様々な遺伝子座に組み換えられたＧＦＰをコードする「カーゴ」配列を有するノックインカセットを含む適切なドナー鋳型がトランスフェクトされて７日後の、ｉＰＳＣにおけるＧＦＰ発現についての例示的なフローサイトメトリーデータを表す。記載のｇＲＮＡがトランスフェクトされて４８時間後、ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩＣＥ）アッセイによって測定された、編集事象を有する細胞の百分率を表す。記載の例示的なｇＲＮＡ及びノックインカセットの組み合わせがトランスフェクトされたｉＰＳＣにおけるＧＦＰシグナルを選別するため、ＦＩＴＣチャネルを用いて実行されたフローサイトメトリーによって測定された、組み込まれた「カーゴ」（ＧＦＰ）の発現強度を表す。ＧＦＰタンパク質をコードする「カーゴ」配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型の、ｉＰＳＣのＴＢＰ遺伝子座への組み込み効率を強調する例示的なフローサイトメトリーデータを表す。ｉＰＳＣ集団内のＧＡＰＤＨ又はＴＢＰアレルにおけるノックインカセットの組み込み比を記述する例示的なｄｄＰＣＲ結果である。エレクトロポレーション及び形質導入の７日後に測定された、ＲＮＰの様々な濃度及び様々なＡＡＶ６感染多重度（ＭＯＩ）率（ｖｇ／細胞）での、ＧＡＰＤＨを標的にするＲＳＱ２２３３７及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含むＲＮＰを用いる、ＧＦＰのＴ細胞へのＡＡＶ６媒介ノックインについての例示的なフローサイトメトリーデータのヒストグラム表現である。Ｙ軸は、ＧＦＰを発現する細胞集団の百分率を表す一方で、Ｘ軸は、ＡＡＶ６ＭＯＩを表す。分化細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子でのＧＦＰのＡＡＶ６媒介ノックイン後の細胞生存度を表す、例示的なフローサイトメトリーデータのヒストグラム表現である。ＧＦＰカーゴのＡＡＶ６媒介形質導入並びにＲＳＱ２２３３７及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含む１μＭのＲＮＰのエレクトロポレートから４日後のＴ細胞生存度が表され；Ｙ軸は、全細胞集団の関数としての細胞生存度を記述する一方で、Ｘ軸は、細胞を形質導入するために使用される様々なＭＯＩを列記する。５Ｅ４ＭＯＩでＧＡＰＤＨを標的にするノックインＧＦＰカーゴを含むＡＡＶ６によって形質導入され、Ｃａｓ１２ａ（配列番号６２）及びＲＳＱ２２３３７を含む４μＭのＲＮＰで形質転換されたＴ細胞の集団についての例示的なフローサイトメトリーチャートを表す。ＡＡＶ６によって形質導入されず、単にＣａｓ１２ａ（配列番号６２）及びＲＳＱ２２３３７を含む４μＭのＲＮＰで形質転換されたＴ細胞についての例示的な対照実験のフローサイトメトリーチャートを表す。ＲＳＱ２２３３７及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含むＲＮＰを用いて、ＧＡＰＤＨ遺伝子座又はＴＲＡＣ遺伝子座のいずれかでの、ＧＦＰのＴ細胞へのＡＡＶ６媒介ノックインについての例示的なフローサイトメトリーデータを表すヒストグラムである。組み込み構築物は、それぞれ約５００ｂｐ長の相同性アームを含み、Ｔ細胞は、同じ濃度のＲＮＰ及びＡＡＶＭＯＩで形質導入された。３つの独立した生物学的複製の平均及び標準偏差が示され、標的化組み込みにおける有意差が認められた（独立ｔ検定を用いて、ｐ＝０．００２２）。ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子に組み込まれたＣＤ１６をコードする「カーゴ」のノックイン効率を表すヒストグラムである。標的化組み込み（ＴＩ）は、ノックインカーゴの５’（５’アッセイ）及び３’（３’アッセイ）位置を標的にするｄｄＰＣＲを用いてバルク編集された細胞集団の０日目及び１９日目に測定された。ノックインカーゴの５’（５’ＣＤＮプローブ）及び３’（３’ポリＡプローブ）位置を標的にするｄｄＰＣＲを用いて測定された、ＧＡＰＤＨ遺伝子に組み込まれたＣＤ１６をコードする「カーゴ」を有するｉＰＳＣクローンの遺伝子型を表すヒストグラムである。４つの例示的な細胞株についての結果が示され、２つの株が、ホモ接合性ノックインとして分類され、標的化組み込み（ＴＩ）率がそれぞれ、８８．５％（クローン１）及び９０．５％（クローン２）であり、２つの株が、ヘテロ接合性ノックインとして分類され、ＴＩ率がそれぞれ、４５．６％（クローン１）及び４６．５％（クローン２）であった。ホモ接合性クローン１のＣＤ１６ノックインｉＰＳＣのｉＮＫへの分化の３２日目からの例示的なフローサイトメトリーデータを表す。データは、ＣＤ１６タンパク質をコードする「カーゴ」配列を含むノックインカセットのｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子への組み込み及び高発現の効率（例えば、約９８％）を強調する。更に、データは、高いＣＤ５６＋ＣＤ４５＋集団の比率によって表される通り、ＧＡＤＰＨ遺伝子での「カーゴ」のノックインが分化プロセスを阻害しないことを示す。ホモ接合性クローン２のＣＤ１６ノックインｉＰＳＣのｉＮＫへの分化の３２日目からの例示的なフローサイトメトリーデータを表す。データは、ＣＤ１６タンパク質をコードする「カーゴ」配列を含むノックインカセットのｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子への組み込み及び発現の効率を強調する。ヘテロ接合性クローン１のＣＤ１６ノックインｉＰＳＣのｉＮＫへの分化の３２日目からの例示的なフローサイトメトリーデータを表す。データは、ＣＤ１６タンパク質をコードする「カーゴ」配列を含むノックインカセットのｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子への組み込み及び高発現の効率（例えば、約９７．８％）を強調する。ヘテロ接合性クローン２のＣＤ１６ノックインｉＰＳＣのｉＮＫへの分化の３２日目からの例示的なフローサイトメトリーデータを表す。データは、ＣＤ１６タンパク質をコードする「カーゴ」配列を含むノックインカセットのｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子への組み込み及び発現の効率を強調する。癌細胞株（例えば、ＳＫ－ＯＶ－３卵巣癌細胞）から作出された３Ｄスフェロイドを殺傷するための、ｉＮＫ細胞に分化されるノックインｉＰＳＣの使用を表す、例示的な固形腫瘍細胞殺傷アッセイの概略図である。抗体及び／又はサイトカインは、任意選択で、３Ｄスフェロイド殺傷段階中に添加され得る。図２６に記載の通りの固形腫瘍殺傷アッセイの結果を示す。ＧＡＰＤＨ遺伝子にＣＤ１６ノックインを含むホモ接合性クローンが、特に、抗体、例えば、１０μｇ／ｍＬのトラスツズマブの添加後、ｉＮＫ細胞に分化され、腫瘍細胞のスフェロイドサイズを低減するように機能させたことで；抗体の添加は、ｉＮＫによる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び腫瘍細胞殺傷を促進する。対照「ＷＴＰＣＳ」細胞は、ＲＮＰ又はプラスミドを伴わずにエレクトロポレートされる、バルク編集されていない親クローンであり、それは試験細胞としてのｉＮＫ細胞分化と同じ段階であった。Ｙ軸は、腫瘍細胞存在量の代理として、正規化された全ての組み込まれた赤色オブジェクト強度を表す一方で、Ｘ軸は、エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比を表す。図２６に記載の通りの固形腫瘍殺傷アッセイの結果を示す。ＧＡＰＤＨ遺伝子にＣＤ１６ノックインを含むヘテロ接合性クローンが、特に、抗体、例えば、１０μｇ／ｍＬのトラスツズマブの添加後、ｉＮＫ細胞に分化され、腫瘍細胞のスフェロイドサイズを低減するように機能させたことで；抗体の添加は、ｉＮＫによるＡＤＣＣ及び腫瘍細胞殺傷を促進する。対照「ＷＴＰＣＳ」細胞は、ＲＮＰ又はプラスミドを伴わずにエレクトロポレートされる、バルク編集されていない親クローンであり、それは試験細胞としてのｉＮＫ細胞分化と同じ段階であった。Ｙ軸は、腫瘍細胞存在量の代理として、正規化された全ての組み込まれた赤色オブジェクト強度を表す一方で、Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ比を表す。インビトロ連続殺傷アッセイの結果を示し、ここではＧＡＰＤＨ遺伝子にＣＤ１６ノックインを含む、ホモ接合性又はヘテロ接合性クローンが、０．１μｇ／ｍＬのリツキシマブの抗体添加の存在下又は不在下で、ｉＮＫ細胞に分化され、血液癌細胞（例えば、Ｒａｊｉ細胞）で連続的に負荷された。Ｘ軸は、追加的な腫瘍細胞のボーラス（５，０００細胞）が約４８時間ごとに添加される場合の時間（０～５９８ｈｒ．）を表し、Ｙ軸は、正規化された全ての赤色オブジェクト面積（例えば、腫瘍細胞の存在）によって測定された、殺傷有効性を表す。星印（^＊）は、以前のリツキシマブ不在試験における０．１μｇ／ｍＬのリツキシマブの添加開始を意味する。データは、編集されたｉＮＫ細胞（ＧＡＰＤＨ遺伝子でのＣＤ１６ノックイン；クローン「Ｈｏｍｏ＿Ｃ１」、「Ｈｏｍｏ＿Ｃ２」、「Ｈｅｔ＿Ｃ１」及び「Ｈｅｔ＿Ｃ２」）が血液癌細胞を殺傷し続ける一方で、親ｉＰＳＣ由来の未編集（「ＰＣＳ」）又は対照の編集ｉＮＫ（「ＧＦＰバルク」）が同じ時点でこの機能を失うことを示す。ＣＤ１６発現と３．１６：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比での腫瘍スフェロイドサイズの減少との間の相関（０．７６８のＲ^２）を表す。バルク編集されたｉＰＳＣ細胞又はＧＡＰＤＨ遺伝子にＣＤ１６ノックインを有するｉＰＳＣ個別クローンのいずれかに由来する分化したｉＮＫ細胞が示される。Ｙ軸は、正規化された腫瘍細胞殺傷値を表す一方で、Ｘ軸は、ＣＤ１６を発現する細胞集団の百分率を表す。ＣＤ１６カーゴ、ＣＡＲカーゴ又は両アレルのＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙカーゴのＧＡＰＤＨ遺伝子へのノックインのため、ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にするＲＳＱ２２３３７及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含むプラスミド及び２μＭのＲＮＰの２つの異なるｉＰＳＣ株へのヌクレオフェクション後の９日目に測定された、例示的なｄｄＰＣＲデータを表すヒストグラムである。ＣＸＣＲ２カーゴのＧＡＰＤＨ遺伝子（ＧＡＰＤＨ：：ＣＸＣＲ２）へのノックインのため、ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にするＲＳＱ２２３３７及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含むプラスミド及び２μＭのＲＮＰで編集されたｉＰＳＣ株又はＲＮＰのみを用いて形質転換された対照ｉＰＳＣ（野生型）からの例示的なフローサイトメトリーデータを表す。ＣＸＣＲ２発現はＸ軸上に記され、ＣＸＣＲ２を発現する編集された細胞は、バルク編集された細胞集団の２９．２％であった一方で、ＣＸＣＲ２の表面発現は、バルク編集された細胞集団の８．５３％であった。ノックイン「カーゴ」の５’（５’ＣＤＮプローブ）及び３’（３’ポリＡプローブ）位置を標的にするｄｄＰＣＲを用いて測定されたエレクトロポレーション後の０日目に測定された、ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にするＲＳＱ２２３３７及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含むＲＮＰを用いる、ＣＤ１６－Ｐ２Ａ－ＣＡＲ、ＣＤ１６－ＩＲＥＳ－ＣＡＲ、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６、ＣＡＲ－ＩＲＥＳ－ＣＤ１６及びｍｂＩＬ－１５などの一連のノックインカセットカーゴ配列のＧＡＰＤＨ遺伝子へのノックイン効率を表すヒストグラムである。本明細書に記載のようなノックインカーゴ配列として利用可能である、膜結合型ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒα（ｍｂＩＬ－１５）構築物を表す。バルク編集された集団の百分率として測定されるときの、ＧＡＰＤＨ遺伝子へのｍｂＩＬ－１５の経時的なＴＩを表すヒストグラムである。ｉＮＫ細胞プロセスへの分化の２８日目の、ｉＰＳＣからのＴＩ率が示される。ｉＮＫへの分化の３９日目のバルク編集されたｍｂＩＬ－１５のＧＡＰＤＨ遺伝子ノックインのｉＰＳＣ集団からの例示的なフローサイトメトリーデータを表す。ｉＮＫへの分化の３９日目のバルク編集されたｍｂＩＬ－１５のＧＡＰＤＨ遺伝子ノックインのｉＰＳＣ集団からの例示的なフローサイトメトリーデータを表す。ｉＰＳＣ分化の３２日目、３９日目、４２日目及び４９日目、バルク編集されたｍｂＩＬ－１５のＧＡＰＤＨ遺伝子ノックインのｉＰＳＣ集団がｉＮＫ細胞へ分化されている（集団の百分率として測定された）表面発現表現型を、やはりｉＮＫ細胞へ分化されている親クローン細胞（「ＷＴ」）と比較して示す。２つのインビトロ腫瘍細胞殺傷アッセイからの結果を示す。ＧＡＰＤＨ遺伝子にｍｂＩＬ－１５ノックインを含む、バルク編集されたｉＰＳＣ集団の２つの生物学的複製（Ｓ１及びＳ２）が、ｉＮＫ細胞に分化され（Ｓ２の場合、分化の５６日目、Ｓ１の場合、分化の６３日目）、やはりｉＮＫ細胞に分化されるＷＴ親細胞と比較すると、血液癌細胞（例えば、Ｒａｊｉ細胞）の蛍光シグナルを低下させるように機能させたが、それは１０μｇ／ｍＬのリツキシマブの不在下又は存在下、１（Ａ）又は２．５（Ｂ）のＥ：Ｔ比で測定された；（実験は、Ｒ１及びＲ２の２通りに実施された）。図２６に記載の通りの固形腫瘍殺傷アッセイの結果を示す。ＧＡＰＤＨ遺伝子にｍｂＩＬ－１５ノックインを含む、バルク編集されたｉＰＳＣ集団の２つの生物学的複製（Ｓ１及びＳ２）が、ｉＮＫ細胞に分化され（ｉＰＳＣ分化の３９日目）、やはりｉＮＫ細胞に分化されるＷＴ親細胞と比較すると、腫瘍細胞スフェロイドサイズを減少させるように機能させた。５ｎｇ／ｍＬの外因性ＩＬ－１５の添加により、ｉＮＫによる腫瘍細胞殺傷が増強された。Ｙ軸は、腫瘍細胞存在量の代理として、正規化された全ての組み込まれた赤色オブジェクト強度を表す一方で、Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ比を表す。図２６に記載の通りの固形腫瘍殺傷アッセイの結果を示す。ＧＡＰＤＨ遺伝子にｍｂＩＬ－１５ノックインを含む、バルク編集されたｉＰＳＣ集団の２つの生物学的複製（Ｓ１及びＳ２）が、ｉＮＫ細胞に分化され（Ｓ１の場合、ｉＰＳＣ分化の６３日目及びＳ２の場合、ｉＰＳＣ分化の５６日目）、腫瘍細胞スフェロイドサイズを減少させるように機能させた。Ｙ軸は、正規化された全ての赤色オブジェクト面積（例えば、腫瘍細胞の存在）によって測定された、殺傷有効性を表す一方で、Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ細胞比を表し；実験は、Ｒ１、Ｒ２及びＲ２．１として、２通り又は３通りに実施された。３７Ａに記載の通りであるが、ＡＤＣＣ腫瘍細胞殺傷を引き起こす添加として、１０μｇ／ｍＬのハーセプチン抗体の添加を伴う、固形腫瘍殺傷アッセイの結果を示す。３７Ａに記載の通りであるが、５ｎｇ／ｍＬの外因性ＩＬ－１５の添加を伴う、固形腫瘍殺傷アッセイの結果を示す。３７Ａに記載の通りであるが、ＡＤＣＣ腫瘍細胞殺傷を引き起こす添加として、５ｎｇ／ｍＬの外因性ＩＬ－１５及び１０μｇ／ｍＬのハーセプチン抗体の添加を伴う、固形腫瘍殺傷アッセイの結果を示す。２つの独立した細胞セット及び図２６に記載の通りの固形腫瘍殺傷アッセイの３～５回反復の累積的結果を表す。ＧＡＰＤＨ遺伝子にｍｂＩＬ－１５ノックインを含む２つの独立したバルク編集された集団（Ｓ１及びＳ２）が、ｉＮＫ細胞に分化され（セット１の場合、ｉＰＳＣ分化の３９及び４９日目、Ｓ２の場合、ｉＰＳＣ分化の４２日目）、外因性ＩＬ－１５の不在下でｉＮＫに分化されたＷＴ親細胞と比較すると、腫瘍細胞スフェロイドサイズを有意に減少させるように機能させ（Ｐ＝０．０３４、＋／－標準偏差、独立ｔ検定）；更に、分化されたノックイン細胞が、５ｎｇ／ｍＬの外因性ＩＬ－１５の存在下で、分化されたＷＴ親細胞と比較すると、腫瘍細胞スフェロイドサイズの有意な減少への傾向を示した（Ｐ＝０．０５２、＋／－標準偏差、独立ｔ検定）。本明細書に記載の通りの標的遺伝子での組み込みにおける、ＧＦＰ配列とカップリングされた膜結合型ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒα（ｍｂＩＬ－１５）を含むノックインカセットカーゴ配列を模式的に表す。本明細書に記載の通りの標的遺伝子での組み込みにおける、ＣＤ１６、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαを含むノックインカセットカーゴ配列を模式的に表す。本明細書に記載の通りの標的遺伝子での組み込みにおける、ＣＤ１６及び膜結合型ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒα（ｍｂＩＬ－１５）を含むノックインカセットカーゴ配列を模式的に表す。ｄｄＰＣＲを用いて測定された、ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にするＲＳＱ２２３３７及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含むＲＮＰを用いる、ＧＡＰＤＨ遺伝子内に挿入されるＧＦＰ配列とカップリングされた膜結合型ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒα（ｍｂＩＬ－１５）のカーゴ配列を含むＰＬＡ１８２９（図３９Ａを参照）の形質転換から７日後のバルク編集されたｉＰＳＣ集団又はＲＮＰのみを用いて形質転換された対照ＷＴ細胞からの例示的なフローサイトメトリーデータを表す。Ｙ軸上にＩＬ－１５Ｒα発現が示される一方で、ＧＦＰ発現はＸ軸上に示される。ｄｄＰＣＲを用いて測定された、ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にするＲＳＱ２２３３７及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含むＲＮＰを用いる、ＧＡＰＤＨ遺伝子内に挿入される、ＣＤ１６、ＩＬ－１５及びＩＬ１５Ｒαのカーゴ配列を含むか、又はＣＤ１６及び膜結合型ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒα（ｍｂＩＬ－１５）のカーゴ配列を含む、ＰＬＡ１８３２又はＰＬＡ１８３４（図３９Ｂ及び図３９Ｃを参照）の形質転換から７日後のバルク編集されたｉＰＳＣ集団からの例示的なフローサイトメトリーデータを表す。Ｙ軸上にＩＬ－１５Ｒα発現が示される一方で、Ｘ軸はＧＦＰ発現である。ｄｄＰＣＲを用いて測定された、ＰＬＡ１８２９（５μｇ）並びにＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にするＲＳＱ２２３３７及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含む２μＭのＲＮＰを用いる、図４０Ａに記載のような形質転換後の、個別コロニーの遺伝子型を表すヒストグラムである。個別のホモ接合性（約１００％のＴＩ）、ヘテロ接合性（約５０％のＴＩ）又は野生型（約０％のＴＩ）細胞が示される。ｄｄＰＣＲを用いて測定された、ＰＬＡ１８３２（５μｇ）並びにＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にするＲＳＱ２２３３７及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含む２μＭのＲＮＰを用いる、図４０Ｂに記載のような形質転換後の、個別コロニーの遺伝子型を表すヒストグラムである。個別のホモ接合性（約１００％のＴＩ）、ヘテロ接合性（約５０％のＴＩ）又は野生型（約０％のＴＩ）細胞が示される。ｄｄＰＣＲを用いて測定された、ＰＬＡ１８３４（５μｇ）並びにＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にするＲＳＱ２２３３７及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含む２μＭのＲＮＰを用いる、図４０Ｂに記載の通りの形質転換後の、個別のコロニーの遺伝子型を表すヒストグラムである。個別のホモ接合性（約１００％のＴＩ）、ヘテロ接合性（約５０％のＴＩ）又は野生型（約０％のＴＩ）細胞が示される。ｉＮＫへの分化の３２日目に測定された、（図４０Ａ～４０Ｃに記載の通り）ＧＡＰＤＨ遺伝子にＰＬＡ１８２９、ＰＬＡ１８３２又はＰＬＡ１８３４からのノックインカーゴ配列を含む細胞からの例示的なフローサイトメトリーデータを表し；「ＷＴ」細胞は、ＲＮＰのみを用いて形質転換され、それもｉＮＫへの分化の３２日目であった。データは、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質をコードする「カーゴ」配列を含むノックインカセットの組み込み及び発現の効率を強調する。Ｙ軸は、ＩＬ－１５Ｒαを発現していることが記録された集団からの細胞の百分率を定量化する一方で、Ｘ軸は、コロニー遺伝子型を表す。ｉＮＫへの分化の３２日目に測定された、（図４０Ａ～４０Ｃに記載の通り）ＧＡＰＤＨ遺伝子にＰＬＡ１８２９、ＰＬＡ１８３２又はＰＬＡ１８３４からのノックインカーゴ配列を含む細胞からの例示的なフローサイトメトリーデータを表し；「ＷＴ」細胞は、ＲＮＰのみを用いて形質転換され、それもｉＮＫへの分化の３２日目であった。データは、ＣＤ１６タンパク質をコードする「カーゴ」配列を含むノックインカセットの組み込み及び発現の効率を強調する。Ｙ軸は、ＣＤ１６を発現していることが記録された集団からの細胞の百分率を定量化する一方で、Ｘ軸は、コロニー遺伝子型を表す。ｉＮＫへの分化の３２日目に測定された、（図４０Ａ～４０Ｃに記載の通り）ＧＡＰＤＨ遺伝子にＰＬＡ１８２９、ＰＬＡ１８３２又はＰＬＡ１８３４からのノックインカーゴ配列を含む細胞からの例示的なフローサイトメトリーデータを表し；「ＷＴ」細胞は、ＲＮＰのみを用いて形質転換され、それもｉＮＫへの分化の３２日目であった。データは、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質をコードする「カーゴ」配列を含むノックインカセットの組み込み及び発現の効率を強調する。Ｙ軸は、ＩＬ－１５Ｒαを発現する細胞集団の中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を定量化する一方で、Ｘ軸は、コロニー遺伝子型を表す。ｉＮＫへの分化の３２日目に測定された、（図４０Ａ～４０Ｃに記載の通り）ＧＡＰＤＨ遺伝子にＰＬＡ１８２９、ＰＬＡ１８３２又はＰＬＡ１８３４からのノックインカーゴ配列を含む細胞からの例示的なフローサイトメトリーデータを表し；「ＷＴ」細胞は、ＲＮＰのみを用いて形質転換され、それもｉＮＫへの分化の３２日目であった。データは、ＣＤ１６タンパク質をコードする「カーゴ」配列を含むノックインカセットの組み込み及び発現の効率を強調する。Ｙ軸は、ＣＤ１６を発現する細胞集団の中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を定量化する一方で、Ｘ軸は、コロニー遺伝子型を表す。リボ核タンパク質（「ＲＮＰ」）及びＰＤＬ１に基づく及びＣＤ４７に基づくドナー構築物又はＲＮＰ単独を用いる編集の２回目以後の、ＧＡＰＤＨ遺伝子座に標的化される、ＰＤＬ１に基づく導入遺伝子に対して編集されている、ＣＤ４７に基づく導入遺伝子に対して編集されているか、又はＰＤＬ１に基づく導入遺伝子及びＣＤ４７に基づく導入遺伝子に対して両アレル性に編集されているＰＳＣの更なる富化を示す、細胞数測定ドットプロットのパネルである。ＲＮＰ単独を用いる編集の２回目以後の、ＧＡＰＤＨ遺伝子に標的化される、ＰＤＬ１に基づく導入遺伝子に対して編集されているＰＳＣの更なる富化を示す、細胞数測定ドットプロットのパネルである。未編集ＰＳＣ又は２つの異なるドナー鋳型を用いてＧＡＰＤＨ遺伝子座で編集されているＰＳＣの富化を示す、２つの細胞数測定ドットプロットを表し、その一方は、ＰＤＬ１に基づき、他方は、ＣＤ４７に基づく。２つの異なるドナー構築物を用いて編集する場合、細胞は、１つの固有のドナー構築物（ＰＤＬ１に基づくもの又はＣＤ４７に基づくもののいずれか）で編集されるか、又はＧＡＰＤＨ遺伝子に標的化される、ＰＤＬ１に基づく導入遺伝子及びＣＤ４７に基づく導入遺伝子の両方に対して両アレル性に編集されるかのいずれかであることを認めることができる。

定義及び略称
特に指定されない限り、以下の用語のそれぞれは、このセクション中に記載される意味を有する。

「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という不定冠詞は、付随する名詞の少なくとも１つを指し、「少なくとも１つ」及び「１つ又は複数」という用語と互換可能に用いられる。「又は」及び「及び／又は」という接続詞は、非排他的選言として互換可能に用いられる。

「癌」という用語（「新生物」という用語とも互換可能に用いられる）は、本明細書で用いられるとき、自律的増殖の能力、即ち、細胞増殖を迅速に促進することを特徴とする異常な状態又は病態を有する細胞を指す。癌性病態は、病理学的なもの、即ち病態を特徴付けるか又は構成する例えば悪性腫瘍増殖としてカテゴリー化され得るか、又は非病理学的なもの、即ち正常からの逸脱があるが、病態を伴わない、例えば創傷修復に関連する細胞増殖としてカテゴリー化され得る。

「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ」という用語は、本明細書で用いられるとき、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有する任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、例として、細胞内のゲノム配列内のＤＮＡ標的部位へのガイド分子の存在下での特異的な会合（又は「標的化」）を示す、Ｃａｓ９若しくはＣａｓ１２タンパク質を指す。本明細書で開示される戦略、システム及び方法では、本明細書で開示されるか又は当業者に公知であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのいずれかの組み合わせを使用することができる。当業者は、本開示との関連での使用に適した更なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及び変異体について理解するであろうし、本開示がこの観点において限定されないことは理解されるであろう。

「分化」という用語は、本明細書で用いられるとき、特殊化されていない（「コミットされていない」）又はあまり特異化されていない細胞が、例えば、血球などの特殊化細胞の特徴を得る場合のプロセスである。いくつかの実施形態では、分化又は分化誘導細胞は、細胞系統内でより特殊化された（「コミットされた」）位置を得ているものである。例えば、ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）は、細胞培地中の好適な分化因子による処置時、様々なより分化した細胞型、例えば、造血幹細胞、リンパ球及び他の細胞型へ分化され得る。多能性及び多分化性細胞型のより分化した細胞型への分化に適した方法、分化因子及び細胞培地は、当業者に周知である。いくつかの実施形態では、「コミットされた」という用語は、正常な環境下で、細胞が特定の細胞型又は細胞型のサブセットに分化し続けることになるであろうし、且つ正常な環境下で、（特定の細胞型又は細胞型のサブセット以外の）異なる細胞型に分化できないばかりか、大して分化していない細胞型に戻ることができないようなポイントに、分化経路を通じて進行している細胞を指すような分化のプロセスに適用される。

「分化マーカー」、「分化マーカー遺伝子」又は「分化遺伝子」という用語は、本明細書で用いられるとき、発現が、細胞、例えば、多能性細胞内で生じている細胞分化を示すような遺伝子又はタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、分化マーカー遺伝子として、限定はされないが、以下の遺伝子：ＣＤ３４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ４９、ＣＤ４５、ＮＫ細胞受容体（表面抗原分類１６（ＣＤ１６））、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ６９、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１５８ｂ、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１ＤＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔｇｅｎｅ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、ＺＩＣ１、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ４、ＰＡＸ５、ＲＢＰＪ、ＲＵＮＸ１、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３が挙げられる。

「分化マーカー遺伝子特性」又は「分化遺伝子特性」、「分化遺伝子発現特性」、「分化遺伝子発現シグネチャー」、「分化遺伝子発現パネル」、「分化遺伝子パネル」又は「分化遺伝子シグネチャー」という用語は、本明細書で用いられるとき、複数の分化マーカー遺伝子の発現又は発現のレベルを指す。

「ヌクレアーゼ」という用語は、本明細書で用いられるとき、リン酸ジエステル結合の切断を触媒する任意のタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＤＮＡヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、細胞内の二本鎖ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡを切断するとき、一本鎖切断を引き起こす「ニッカーゼ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、細胞内の二本鎖ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡを切断するとき、二本鎖切断を引き起こす。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、得られた切断の位置と重複するか又はそれに隣接する二本鎖ＤＮＡ内部の特定の標的部位に結合する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、３’及び５’方向の両方において０（平滑末端）から２２ヌクレオチドの範囲のオーバーハングを含む二本鎖切断を引き起こす。本明細書で考察の通り、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びメガヌクレアーゼは、本開示の戦略、システム及び方法に従って使用可能である例示的なヌクレアーゼである。

「胚性幹細胞」という用語は、本明細書で用いられるとき、胚性胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞を指す。いくつかの実施形態では、胚性幹細胞は、多能性であり、３つの一次胚葉：外胚葉、内胚葉及び中胚葉の全ての誘導体の発生中に生じる。いくつかのそのような実施形態では、胚性幹細胞は、胚体外膜又は胎盤に寄与することがない、即ち、全能性でない。

「内因性」という用語は、本明細書で核酸と関連して用いられるとき、その天然位置における、例えば、細胞のゲノム内の天然核酸（例えば、遺伝子、タンパク質コード配列）を指す。

「必須遺伝子」という用語は、本明細書で細胞と関連して用いられるとき、細胞の生存及び／又は増殖にとって必要とされる少なくとも１つの遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。必須遺伝子は、例えば、ｉＰＳ若しくはＥＳ細胞の適切な分化又はｉＰＳ若しくはＥＳ由来細胞の拡大のため、全ての細胞型の生存に必須であるハウスキーピング遺伝子又は生存及び／若しくは増殖に対する特定の細胞型において特定の培養条件下で発現されることが求められる遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、必須遺伝子の機能喪失は、例えば、必須遺伝子の機能喪失を特徴とする細胞が、同じ細胞型であるが、同じ必須遺伝子の機能喪失を伴わない細胞と比較して生存する時間での、細胞生存の有意な減少をもたらす。いくつかの実施形態では、必須遺伝子の機能喪失は、病的細胞の殺傷をもたらす。いくつかの実施形態では、必須遺伝子の機能喪失は、例えば、細胞が細胞周期を完了するのに必要とする有意な期間内に顕在化し得る、細胞が分裂する能力における、細胞増殖の有意な低下をもたらすか、又は一部の好ましい実施形態では、細胞周期を完了し、従って絶えず増殖する細胞の能力の喪失をもたらす。

「外因性」という用語は、本明細書で核酸と関連して用いられるとき、人工構築物（例えば、ノックインカセット又はドナー鋳型）又は細胞のゲノムに、例えば、遺伝子編集又は遺伝子工学技術、例えば、ＨＤＲに基づく組み込み技術を用いて人工的に導入されている（天然又は非天然にかかわらない）核酸を指す。

「ガイド分子」又は「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに関連して用いられるとき、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９若しくはＣａｓ１２タンパク質の、細胞内のゲノム配列内などのＤＮＡ標的部位への特異的な会合（又は「標的化」）を促進する任意の核酸である。ガイド分子が、典型的に、ＲＮＡ分子である一方で、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を含む化学修飾ＲＮＡ分子がガイド分子として使用可能であることは、当技術分野で周知である。

「造血幹細胞」又は「決定的造血幹細胞」という用語は、本明細書で用いられるとき、ＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）幹細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４陽性幹細胞は、成熟骨髄系及び／又はリンパ系細胞型を生じさせる能力がある。いくつかの実施形態では、骨髄系及び／又はリンパ系細胞型は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び／又はＢ細胞を含む。

「人工多能性幹細胞」、「ｉＰＳ細胞」又は「ｉＰＳＣ」という用語は、本明細書で用いられるとき、再プログラム化（例えば、脱分化）と称されるプロセスにより、分化した体細胞（例えば、成体細胞、新生児細胞又は胎児細胞）から得られる幹細胞を指す。いくつかの実施形態では、再プログラム化細胞は、３つ全ての胚葉又は皮層の組織：中胚葉、内胚葉及び外胚葉に分化する能力がある。ｉＰＳＣは、天然に見出されない。

「ｉＰＳ由来ＮＫ細胞」又は「ｉＮＫ細胞」という用語は、本明細書で用いられるとき、ｉＰＳ細胞を分化させることによって産生されているナチュラルキラー細胞を指し、ｉＰＳ細胞は、遺伝子修飾を有するか否かは問われない。

「ｉＰＳ由来Ｔ細胞」又は「ｉＴ細胞」という用語は、本明細書で用いられるとき、ｉＰＳ細胞を分化させることによって産生されているＴを指し、ｉＰＳ細胞は、遺伝子修飾を有するか否かは問われない。

「多分化性幹細胞」という用語は、本明細書で用いられるとき、３つ全ての胚葉ではなく、１つ又は複数の胚葉（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）の細胞に分化する発生能を有する細胞を指す。従って、いくつかの実施形態では、多分化性細胞は、「部分分化細胞」とも称され得る。多能性細胞は、当技術分野で周知であり、多分化性細胞の例として、例えば、造血幹細胞及び神経幹細胞などの成体幹細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、「多分化性」は、細胞が、他の系統の細胞でない、多くの所与の系統の細胞型を形成し得ることを示す。例えば、多分化性造血細胞は、多くの異なる血液細胞型（赤血球、白血球、血小板など）を形成しうるが、ニューロンを形成することができない。従って、いくつかの実施形態では、「多分化能」は、全能性及び多能性に至らない程度の発生能を有する細胞の状態を指す。

「多能性」という用語は、本明細書で用いられるとき、身体若しくは細胞体（即ち、胚本体）又は所与の生物（例えば、ヒト）の全ての系統を形成する細胞の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉といった３つの胚葉のそれぞれから細胞を形成することができる多能性幹細胞型である。一般に、多能性は、完全な生物を生成することができない、不完全又は部分多能性細胞（例えば、胚盤葉上層幹細胞又はＥｐｉＳＣ）から、完全な生物を生成することができる、より未分化でより多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞）に至る、発生能の連続体として説明され得る。

「多能性」という用語は、本明細書で用いられるとき、３つ全ての胚葉（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）の細胞に分化する発生能を有する細胞を指す。いくつかの実施形態では、多能性は、部分的に、細胞の多能性特徴を評価することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、多能性特徴として、限定はされないが、（ｉ）多能性幹細胞形態；（ｉｉ）無制限の自己再生の潜在力；（ｉｉｉ）限定はされないが、ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡｌ－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１としても公知）、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０及び／又はＣＤ５０を含む、多能性幹細胞マーカーの発現；（ｉｖ）３つ全ての体細胞系統（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）に分化する能力；（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫形成；並びに（ｖｉ）３つの体細胞系統由来の細胞からなる胚様体の形成が挙げられる。

「多能性幹細胞形態」という用語は、本明細書で用いられるとき、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴を指す。いくつかの実施形態では、正常な胚性幹細胞形態は、高い核対細胞質比、核小体の顕著な存在及び典型的な細胞間空間を有する、形状が小さくて丸いものとして特徴付けられる。

「ポリシストロン性」又は「多シストロン性」という用語は、本明細書でノックインカセットに関連して用いられるとき、ノックインカセットが２つ以上のタンパク質を同じｍＲＮＡ転写物から発現させることができるという事実を指す。同様に、「２シストロン性」ノックインカセットは、２つのタンパク質を同じｍＲＮＡ転写物から発現させることができるノックインカセットである。

（限定はされないが、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」及び「オリゴヌクレオチド」を含む）「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で用いられるとき、ＤＮＡ及びＲＮＡにおける一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも称される）を指し、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、核酸などは、一本鎖又は二本鎖の、キメラ混合物若しくは誘導体又はその修飾バージョンであり得る。いくつかのそのような実施形態では、修飾は、塩基部分、糖部分又はリン酸塩骨格で起こり、例えば、分子の安定性、そのハイブリダイゼーションパラメータなどを改善し得る。一般に、ヌクレオチド配列は、典型的に、限定はされないが、タンパク質及び酵素を作るための細胞機構によって使用される情報を含む、遺伝子情報を保有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列及び／又は遺伝子情報は、二本鎖又は一本鎖のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成の及び遺伝子操作されたポリヌクレオチド並びに／又はセンス及び／若しくはアンチセンスポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、修飾塩基を含む。

以下の表１に示される通り、本明細書で提示されるヌクレオチド配列において、通常のＩＵＰＡＣ核酸記号が使用される（参照により本明細書中に援用される、Ｃｏｒｎｉｓｈ－Ｂｏｗｄｅｎ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８５；１３（９）：３０２１－３０も参照されたい）。しかし、例えば、特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド分子の標的化ドメインにおいて、配列がＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかによってコードされ得る場合、「Ｔ」が「チミン又はウラシル」を意味することは認められるべきである。

「能力」又は「発生能」という用語は、本明細書で用いられるとき、特に、例えば、細胞の発生能と関連して、細胞に到達可能な全ての発生選択肢の総和（即ち、発生能）を指す。いくつかの実施形態では、細胞能力の連続体として、限定はされないが、全能性細胞、多能性細胞、多分化性細胞、寡能性細胞、単能性細胞及び高分化型細胞が挙げられる。

「予防する」、「予防すること」及び「予防」という用語は、本明細書で用いられるとき、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患の予防を指し、（ａ）疾患を回避若しくは防止すること；（ｂ）疾患への素因に作用すること；又は（ｃ）疾患の少なくとも１つの症状の発症を予防するか若しくは遅延させることを含む。

本明細書中で用いられる用語「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して一緒に連結されたアミノ酸の連続鎖を指すのに互換的に用いられる。この用語は、個々のタンパク質、一緒に結合するタンパク質の群又は複合体並びにそのようなタンパク質の断片又は部分、変異体、誘導体及び類似体を含む。特に明記しない限り、ペプチド配列は、本明細書中で、左側のアミノ又はＮ末端から始めて、右側のカルボキシル又はＣ末端に進む従来の表記を用いて示される。標準的な１文字又は３文字略語が用いられ得る。

本明細書中で用いられる用語「目的の遺伝子産物」は、あらゆるポリヌクレオチド又はポリペプチドが挙げられる、遺伝子によってコードされるあらゆる生成物を指し得る。一部の実施形態において、遺伝子産物は、本開示の標的細胞によって天然に発現されないタンパク質である。一部の実施形態において、遺伝子産物は、新しい治療活性を細胞に付与するタンパク質、例えば、以下に限定されないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）若しくはその抗原結合断片、Ｔ細胞受容体若しくはその抗原結合部分、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、分化ＣＤ４７（ＣＤ４７）の白血球表面抗原分化クラスター又はそれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである。本開示の方法及び細胞は、注目する特定のあらゆる遺伝子産物に限定されないこと、目的の遺伝子産物の選択は、細胞の型及び細胞の最終的な使用によって決まることとなることが理解されるべきである。

本明細書中で用いられる用語「レポーター遺伝子」は、人工選択に適した形質を付与する、細胞中に導入された、例えば細胞のゲノム中に組み込まれた外因性遺伝子を指す。一般的なレポーター遺伝子として、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする蛍光レポーター遺伝子及び抗生物質耐性を細胞に付与する抗生物質耐性遺伝子がある。

本明細書中で用いられる用語「再プログラム化」又は「脱分化」又は「細胞能力の増大」又は「発生能力の増大」は、細胞の能力を増大させるか、又は細胞を、より分化していない状態に脱分化させる方法を指す。例えば、一部の実施形態において、細胞力が増大した細胞は、非再プログラム化状態の同じ細胞と比較して、より発生的な可塑性を有する（即ちより多くの細胞型に分化することができる）。即ち、一部の実施形態において、再プログラム化された細胞は、非再プログラム化状態の同じ細胞よりも分化していない状態にあるものである。一部の実施形態において、「再プログラム化」は、体細胞又は多分化能幹細胞を多能性幹細胞（人工多能性幹細胞又はｉＰＳＣとも称される）に脱分化させることを指す。体細胞又は多分化能幹細胞からのｉＰＳＣの生成に適した方法が、当業者に周知である。

本明細書中で用いられる用語「対象」は、ヒト又は非ヒト動物を意味する。一部の実施形態において、ヒト対象は、あらゆる年齢（例えば、胎児、乳児、小児、若年成人又は成人）であり得る。一部の実施形態において、ヒト対象は、疾患のリスクがあるか、疾患を患っているか、又は遺伝子若しくは特定の遺伝子の組み合わせの変更が必要な場合がある。これ以外にも、一部の実施形態において、対象は、非ヒト動物であり得、哺乳動物が挙げられ得るが、これに限定されない。一部の実施形態において、非ヒト動物は、非ヒト霊長類、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、その他）、ウサギ、イヌ、ネコ等である。本開示の特定の実施形態において、非ヒト動物対象は、家畜、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、その他である。特定の実施形態において、非ヒト動物対象は、家禽、例えばニワトリ、シチメンチョウ、カモ、その他である。

本明細書中で用いられる用語「処置」、「処置する」及び「処置すること」は、本明細書中に記載される疾患、障害若しくは症状又はそれらの１つ若しくは複数の病徴の発症を回復に向かわせるか、軽減するか、遅らせるか又は進行を阻害するか、寛解させるか、重症度を引き下げるか、再発を予防するか若しくは遅らせ、且つ／又は疾患、障害若しくは症状の１つ若しくは複数の病徴を向上させることが意図される臨床干渉を指す。一部の実施形態において、症状は傷害を含む。一部の実施形態において、傷害は、急性的又は慢性的であり得る（例えば、例えば組織傷害等の二次損傷を引き起こす、基礎をなす疾患又は障害由来の組織損傷）。一部の実施形態において、処置が、例えば、本明細書中に記載されるｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞又はｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の集団の形態で、１つ若しくは複数の病徴が発生した後及び／又は疾患が診断された後の対象に施され得る。処置は、病徴の不在下で例えば病徴の発症を予防するか若しくは遅らせるか、又は疾患の発症若しくは進行を阻害するために施され得る。例えば、一部の実施形態において、処置は、感受性の対象に、病徴の発症前に（例えば、遺伝的因子又は他の感受性因子を考慮して）施され得る。一部の実施形態において、処置は、病徴が寛解された後、例えばその再発を予防するか又は遅らせるためにも続けられ得る。一部の実施形態において、処置は、疾患、障害又は症状の１つ又は複数の病徴の改善及び／又は寛解をもたらす。

本明細書中で用いられる用語「変異体」は、基準実体とのかなりの構造同一性を示すが、基準実体と比較して、１つ又は複数の化学部分の存在又はレベルが基準実体と構造的に異なる実体、例えばポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。多くの実施形態において、変異体は、その基準実体と機能的にも異なる。一般に、特定の実体が、適切に、基準実体の「変異体」であると考えられるかは、基準実体との構造同一性の程度に基づく。本明細書中で用いられる用語「機能変異体」は、基準実体と同じ機能を付与する変異体を指し、例えば、必須遺伝子の遺伝子産物の機能変異体は、細胞の生存及び／又は増殖を促進する変異体である。機能変異体は、基準実体と同じ機能を付与する限り、基準実体に機能的に同等である必要がないと理解されるべきである。

細胞のゲノムを編集する方法
一態様において、本開示は、細胞のゲノムを編集する方法を提供する。特定の実施形態において、方法は、細胞を、細胞内の必須遺伝子の内因性コード配列内での切断を生じさせるヌクレアーゼと接触させることを含み、必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖に必要とされる少なくとも１つの遺伝子産物をコードする。また、細胞は、（ｉ）必須遺伝子の外因性コード配列若しくは部分コード配列を有するフレーム内、且つその下流側（３’側）に、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型、及び／又は（ｉｉ）必須遺伝子の外因性コード配列若しくは部分コード配列を有するフレーム内、且つその上流側（５’側）に、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触する（図３Ｄ）。ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）によって細胞のゲノム中に組み込まれて、目的の遺伝子産物を発現するゲノム編集された細胞並びに細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はそれらの機能変異体が生じる。遺伝的に修飾された「ノックイン」細胞は、生存且つ増殖して、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列も含むゲノムを有する後代細胞を生成する。これは、例示的な方法について、図３Ａに示されている。

ノックインカセットが、細胞のゲノム中に適切に組み込まれなければ、切断に起因する不所望の編集事象、例えばインデルのＮＨＥＪ媒介創出が、機能しない、例えばフレーム外の、必須遺伝子のバージョンを生成し得る。これは、ヌクレアーゼの編集効率が、両方のアレルを破壊するほど十分に高い場合、「ノックアウト」細胞を生成する。特定の実施形態において、これは、ヌクレアーゼの編集効率が、一方のアレルを破壊するほど十分に高い場合、「ノックアウト」細胞を生成する。必須遺伝子の十分な機能コピーなしで、これらの「ノックアウト」細胞は生存することができずに、いかなる後代細胞も生成しない。

「ノックイン」細胞が生存して「ノックアウト」細胞が生存しないため、方法は、出発細胞の集団に使用される場合、自動的に「ノックイン」細胞を選択する。重要なことに、特定の実施形態において、方法は、この自動選択態様のため、高いノックイン効率を必要としない。従って、ドナー鋳型がｄｓＤＮＡ（例えばプラスミド）であり、ノックイン効率が多くの場合５％未満である方法に特に適している。図３Ｃの例示的な方法において注目されるように、一部の実施形態において、出発細胞の集団内の細胞の一部が、未編集のまま、即ちヌクレアーゼによって影響されないままであり得る。また、この細胞は、生存して、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含まないゲノムを有する後代を生成する。ヌクレアーゼ編集効率が高い、例えば約６０～９０％又はそれを超える場合、未編集細胞のパーセンテージは、遺伝的に修飾された細胞のパーセンテージと比較して、比較的低くなる。一部の実施形態において、高いヌクレアーゼ編集効率（例えば、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超又は９５％超）が、有効な集団の広い導入遺伝子組み込みを促進する。というのも、未編集細胞のパーセンテージは、遺伝的に修飾された細胞のパーセンテージと比較して、比較的低くなるからである。本明細書中で開示される方法の一部の実施形態において、細胞の少なくとも約６５％（例えば、細胞の約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％）が、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ１２ａ又はＣａｓ９によって編集されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａ）を含有するＲＮＰ及びガイドが、細胞の集団内の細胞の少なくとも６５％（例えば、細胞の集団内の細胞の少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）において、必須遺伝子の遺伝子座（例えば、表３に提供されるあらゆる必須遺伝子の遺伝子座内の末端エクソン）を切断することができる。一部の実施形態において、編集効率は、標的細胞が死に絶える前に、例えば、形質移入又は形質導入後１日目及び／又は２日目に判定される。一部の実施形態において、形質移入又は形質導入後１日目及び／又は２日目に測定される編集効率は、編集が起こった細胞の完璧な割合を捕捉し得ない。というのも、一部の実施形態において、特定の編集事象が、ほとんど即時の、且つ／又は迅速な細胞死をもたらし得るからである。一部の実施形態において、ほとんど即時の、且つ／又は迅速な細胞死は、形質移入又は形質導入後４８時間未満のあらゆる期間、例えば、形質移入又は形質導入後４８時間未満、４４時間未満、４０時間未満、３６時間未満、３２時間未満、２８時間未満、２４時間未満、２０時間未満、１６時間未満、１５時間未満、１４時間未満、１３時間未満、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満又は１時間未満であり得る。

一部の実施形態において、ヌクレアーゼは二本鎖切断を引き起こす。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは一本鎖切断を引き起こし、例えば、一部の実施形態において、ヌクレアーゼはニッカーゼである。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、逆転写酵素ドメインに融合したニッカーゼドメインを含むプライムエディターである。一部の実施形態において、ヌクレアーゼはＲＮＡガイドプライムエディタであり、ｇＲＮＡはドナー鋳型を含む。一部の実施形態において、細胞の二本鎖ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡの対向する鎖上の２つの一本鎖切断を介した二本鎖切断を引き起こすデュアルニッカーゼ系が用いられる。

一部の実施形態において、本開示は、主な製造課題を克服する、高効率ノックインに適した方法（例えば、高い割合の細胞集団が、ノックインアレルを含む）を提供する。歴史的に、プラスミドベクターを用いた目的の遺伝子のノックインは、典型的には０．１～５％の効率に終わり（例えば、Ｚｈｕｅｔａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＭｅｄｉａｔｅｄＳｅｌｅｃｔｉｏｎ－ｆｒｅｅＫｎｏｃｋｉｎＳｔｒａｔｅｇｙｉｎＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ．２０１５；４（６）：１１０３－１１１１参照）、この低いノックイン効率は、潜在的に編集されたクローンのスクリーニングに充てられる多くの時間及び資源を必要とし得る。

一部の実施形態において、細胞にノックインされる目的の遺伝子は、エフェクター機能、特異性、ステルス、持続性、ホーミング／走化性及び／又は特定の化学物質への耐性における役割を有し得る（例えば、Ｓａｅｔｅｒｓｍｏｅｎｅｔａｌ．，ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１９参照）。

特定の実施形態において、本開示は、年齢に関係のない発現、分化状況及び／又は外生条件の高いレベルを維持するノックイン細胞の創出方法を提供する。例えば、一部の実施形態において、組み込まれたカーゴが、挿入部位に応じた所望の細胞内局在化により、最適なレベルで発現される。一部の実施形態において、本開示は、そのような細胞を提供する。

細胞のゲノムを編集する系
一態様において、本開示は、細胞のゲノムを編集するための系を提供する。一部の実施形態において、系は、細胞、細胞の必須遺伝子の内因性コード配列内で切断を生じさせるヌクレアーゼ（必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする）及び必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列を有するフレーム内、且つその下流側（３’側）に、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型を含む。

一部の実施形態において、ヌクレアーゼは二本鎖切断を引き起こす。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは一本鎖切断を引き起こし、例えば、一部の実施形態において、ヌクレアーゼはニッカーゼである。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、逆転写酵素ドメインに融合したニッカーゼドメインを含むプライムエディターである。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＲＮＡガイドプライムエディタであり、ｇＲＮＡはドナー鋳型を含む。一部の実施形態において、細胞の二本鎖ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡの対向する鎖上の２つの一本鎖切断を介した二本鎖切断を引き起こすデュアルニッカーゼ系が用いられる。

ゲノム編集系は、種々の方法で実行され得（例えば、細胞又は対象に投与又は送達される）、異なる実施は、異なった用途に適し得る。例えば、ゲノム編集系は、特定の実施形態において、タンパク質／ＲＮＡ複合体（リボ核タンパク又はＲＮＰ）として実施される。特定の実施形態において、ゲノム編集系は、本明細書中に記載されるＲＮＡガイドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ構成要素を（場合により１つ又は複数の追加の構成要素と共に）コードする１つ又は複数の核酸として実施される；特定の実施形態において、ゲノム編集系は、そのような核酸を含む１つ又は複数のベクター、例えばウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルスとして実施され；特定の実施形態において、ゲノム編集系は、前述のいずれかの組み合わせとして実施される。本明細書中で示される原理に従って作動する追加の又は修飾された実施が当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。

一部の実施形態において、本明細書中に記載される方法は、少なくとも二反復で特定の工程を実行することを含む。例えば、一部の実施形態において、特に、注目する同義遺伝子又は多数の外因性遺伝子配列が挙げられる、注目する特定の遺伝子産物の組み込みが、標的とされる組み込みの所望のレベルよりも低くなる最初の選択ラウンドを生じさせ得る。特定の実施形態において、ヌクレアーゼ活性及び／又はノックインカセットにより標的とされる組み込みの所望のレベルが低いほど、生存細胞及び／又はノックインカセットを含む細胞の所望のパーセンテージが低くなり得る；これにより、遺伝的ペイロードを有する細胞を同定することが困難となり得る。一部の実施形態において、編集された細胞の集団を更に富化するために、ＲＮＰ及びドナー鋳型の両方（例えば、１つ又は複数の遺伝子座を標的とする１つ又は複数のＲＮＰ粒子及び１つ又は複数の遺伝子座での標的とされる組み込みのために設計された１つ又は複数のドナー鋳型）又はＲＮＰ単独（例えば、残留ドナー鋳型を利用する１つ又は複数のＲＮＰ）のいずれかを有する編集された細胞のプールを用意することにより、細胞が場合により増殖してから再編集された。

ＲＮＰ及び／又はドナー鋳型編集の複数ラウンドが実行される一部の実施形態において、富化は：ｉ）遺伝的ペイロードを組み込まなかった細胞を除去し、且つ／又はｉｉ）組み込まれたノックインカセットを有する細胞をより多く創出することによって影響される。一部の実施形態において、追加の富化工程の有効性は、カーゴ（複数の構築物が用いられるかに依存する）、必須遺伝子内の標的又は他の因子に応じて、ドナー鋳型由来のノックインカセットを組み込んでいる細胞のパーセンテージの、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍又はより高い向上に至り得る。一部の実施形態において、そのような富化は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％を超える哺乳動物細胞の必須遺伝子内の「カーゴ」の吸収に至り得る。

一部の実施形態において、ドナー鋳型（例えばドナー核酸構築物）は、細胞の必須遺伝子内に、第１の相同領域（ＨＲ）、例えば相同性アーム並びに第１のゲノム領域（ＧＲ）及び第２のＧＲにアニールするように設計された第２のＨＲ、例えば第２の相同性アームが側面に位置する導入遺伝子を含む。アニールすることができるように、ＨＲ及びＧＲは、完全に相同である必要はない。一部の実施形態において、例として、ノックインカセット中の導入遺伝子のＰＡＭ５’内での少数（６つ未満且つわずか１つ）の非阻害突然変異が挙げられる。一部の実施形態において、他の非阻害変化として、野生型エクソンにおける不必要なヌクレオチドが、ノックインカセット中のヌクレオチド配列から除去されるコドン最適化が挙げられる。一部の実施形態において、ヌクレアーゼによるドナー核酸構築物の切断を妨げる突然変異又はコドン修飾をブロックするような他のサイレントＰＡＭが更に意図される。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の相同性が、本明細書中の例の目的のための機能的アニーリングに十分である。一部の実施形態において、ＨＲとＧＲ間の相同性のレベルは、９０％超、９２％超、９４％超、９６％超、９８％超又は９９％超である。この段落において示される他の実施形態及び概念は、用語「本質的に相同」において意図且つ包括される。

遺伝的に修飾された細胞
一態様において、本開示は、そのような細胞及びそのような細胞の後代の集団を含む、遺伝的に修飾された細胞又は操作された細胞を提供する。

一部の実施形態において、細胞は、本開示の方法、例えば、細胞を、細胞内の必須遺伝子（必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖に必要とされる少なくとも１つの遺伝子産物をコードする）の内因性コード配列内の切断を生じさせるヌクレアーゼと接触させることを含む方法によって生成される。また、細胞は、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列を有するフレーム内、且つその下流側（３’側）に、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触する。ノックインカセットは、切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によって細胞のゲノム中に組み込まれて、目的の遺伝子産物を発現するゲノム編集された細胞並びに細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はそれらの機能変異体が生じる。これは、例示的な方法について、図３に示されている。一部の実施形態において、細胞が、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列を有するフレーム内、且つその上流側（５’側）に、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型と接触する。

一部の実施形態において、細胞は、必須遺伝子のコード配列を有するフレーム内、且つその下流側（３’側）に、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を有するゲノムを含み、必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする。

一部の実施形態において、細胞は、必須遺伝子（必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする）のコード配列を有するフレーム内、且つその上流側（５’側）に、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を有するゲノムを含む。

一部の実施形態において、細胞は、ゲノム修飾を含み、ゲノム修飾は、細胞のゲノム内の必須遺伝子の内因性コード配列内の外因性ノックインカセットの挿入を含み、必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖に必要とされる遺伝子産物をコードし、ノックインカセットは、必須遺伝子の遺伝子産物又はその機能変異体をコードする外因性コード配列又は部分コード配列を有するフレーム内、且つその下流側（３’側）に、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含み、細胞は、目的の遺伝子産物並びに細胞の生存及び／又は増殖に必要である、必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物又はそれらの機能変異体を発現する。一部の実施形態において、目的の遺伝子産物及び必須遺伝子によってコードされる遺伝子産物は、必須遺伝子の内因性プロモーターから発現される。

ドナー鋳型
一態様において、本開示は、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列を有するフレーム内、且つその下流側（３’側）に、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を有するノックインカセットを含むドナー鋳型を提供し、必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする。

一態様において、本開示は、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列を有するフレーム内、且つその上流側（５’側）に、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を有するノックインカセットを含むドナー鋳型を設計する推進力を提供し、必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする；例えば、図３Ｄ参照。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって細胞のゲノムを編集するのに用いられる。

ドナー鋳型設計は、文献、例えば国際公開第２０１６／０７３９９０Ａ１号パンフレットに詳述されている。ドナー鋳型は、一本鎖又は二本鎖であり得、二本鎖切断（ＤＳＢ）のＨＤＲベースの修復を促進するのに用いられ得、新しい配列を標的配列中に挿入するか又は標的配列を全体で置換するのに特に有用である。一部の実施形態において、ドナー鋳型はドナーＤＮＡ鋳型である。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ鋳型は二本鎖である。

一本鎖であるか二本鎖であるかに拘わらず、ドナー鋳型は、一般に、切断されることとなる標的配列内又はその近くの（例えば、側面に位置するか又は隣接している）ＤＮＡの領域に相同である領域を含む。この相同領域は、本明細書中で「相同性アーム」と称され、ノックインカセットに対して以下で概略的に示される（示されない追加のスペーサー配列により、相同性アームの一方又は両方から分離され得る）：
［５’相同性アーム］－［ノックインカセット］－［３’相同性アーム］。

相同性アームは、適切なあらゆる長さを有し得（１つの相同性アームのみが用いられる場合、０ヌクレオチドを含む）、５’及び３’相同性アームは、同じ長さを有し得るか、又は長さが異なり得る。適切な相同性アーム長の選択は、種々の要因、例えば、Ａｌｕ反復等の特定の配列との相同性若しくはマイクロ相同性を回避したいという希望又は他の非常に一般的な要素によって影響され得る。例えば、５’相同性アームは、配列反復要素を回避するように短くされ得る。他の実施形態において、３’相同性アームは、配列反復要素を回避するように短くされ得る。一部の実施形態において、５’及び３’相同性アームの両方は、特定の配列反復要素を含むことを回避するように短くされ得る。

一部の実施形態において、複数のドナー鋳型が細胞集団に投与され得る。一部の実施形態において、複数のドナー鋳型は異なっており、例えば、各ドナー鋳型が、注目する異なる遺伝子産物をコードする「カーゴ」配列のノックインを促進する。一部の実施形態において、複数のドナー鋳型は、同時に提供され得、それらのペイロードは、同じ必須遺伝子中に組み込まれる（例えば、一方のペイロードが一方のアレルに組み込まれ、他方のペイロードが他方のアレルに組み込まれる）。一部の実施形態において、これは、注目する特定の導入遺伝子系及び／又は遺伝子産物が、必須遺伝子の異なるアレルに分離されることが必要とされる機能配列を有する場合、特に有利であり得る。更に、一部の実施形態において、異なるが、類似の目標、例えば安全スイッチのコピーを達成する、目的の遺伝子標的の複数のコピーを有することは、機能性及び対応する表現型の創出を確実にするのに有益であり得る。一部の実施形態において、安全スイッチの複数のコピーは、必要に応じて、細胞の除去を確実にし得る。更に、一部の実施形態において、特定の安全スイッチは、自殺スイッチ系（例えば、本明細書中に記載される）として機能するのに二量体化を必要とする。一部の実施形態において、複数のドナー鋳型が細胞集団に投与される場合、そのようなドナー鋳型は、同じ遺伝子座又は異なる遺伝子座において組み込まれるように設計され得る。

ドナー鋳型は、核酸ベクター、例えば、ウイルスゲノム又は環状二本鎖ＤＮＡ、例えばプラスミドであり得る。ドナー鋳型を含む核酸ベクターは、他のコード要素又は非コード要素を含み得る。例えば、ドナー鋳型核酸は、特定のゲノム骨格要素（例えば、ＡＡＶゲノムの場合、逆末端反復）を含むウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、センダイウイルス又はレンチウイルスゲノム）の一部として送達され得る。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、線状化されていないプラスミド内に含まれる。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、線状化されているプラスミド内に含まれる。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、直鎖状ｄｓＤＮＡ断片内に含まれる。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は、ＡＡＶゲノムの一部として送達され得る。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は、一本鎖オリゴドナー（ｓｓＯＤＮ）として、例えば、ｍ１３ファージ合成に由来する長いマルチｋｂのｓｓＯＤＮ又は代わりに例えば注目する小遺伝子、タグ及び／若しくはプローブを含む短ｓｓＯＤＮとして送達され得る。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は、Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））鋳型として送達され得る。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は、ＤＮＡミニサークルとして送達され得る。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は、組み込み欠損レンチウイルス粒子（ＩＤＬＶ）として送達され得る。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は、ＭＭＬＶ由来レトロウイルスとして送達され得る。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）配列として送達され得る。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は、複製ＥＢＮＡ１エピソームとして送達され得る。

特定の実施形態において、５’相同性アームは、約２５～約１，０００塩基対長、例えば少なくとも約１００、２００、４００、６００又は８００塩基対長であり得る。特定の実施形態において、５’相同性アームは、約５０～８００の塩基対、例えば、１００～８００、２００～８００、４００～８００、４００～６００又は６００～８００塩基対を含む。特定の実施形態において、３’相同性アームは、約２５～約１，０００塩基対長、例えば少なくとも約１００、２００、４００、６００又は８００塩基対長であり得る。特定の実施形態において、３’相同性アームは、約５０～８００塩基対、例えば１００～８００、２００～８００、４００～８００、４００～６００又は６００～８００塩基対を含む。特定の実施形態において、５’相同性アームと３’相同性アームは、長さが対称である。特定の実施形態において、５’相同性アームと３’相同性アームは、長さが非対称である。

特定の実施形態において、５’相同性アームは、約３，０００塩基対未満、約２，９００塩基対未満、約２，８００塩基対未満、約２，７００塩基対未満、約２，６００塩基対未満、約２，５００塩基対未満、約２，４００塩基対未満、約２，３００塩基対未満、約２，２００塩基対未満、約２，１００塩基対未満、約２，０００塩基対未満、約１，９００塩基対未満、約１，８００塩基対未満、約１，７００塩基対未満、約１，６００塩基対未満、約１，５００塩基対未満、約１，４００塩基対未満、約１，３００塩基対未満、約１，２００塩基対未満、約１，１００塩基対未満、約１，０００塩基対未満、約９００塩基対未満、約８００塩基対未満、約７００塩基対未満、約６００塩基対未満、約５００塩基対未満又は約４００塩基対未満である。

例えば、ウイルスベクターが、本明細書中に記載される方法によってノックインカセットを導入するのに利用される、特定の実施形態において、５’相同性アームは、約１，０００塩基対未満、約９００塩基対未満、約８００塩基対未満、約７００塩基対未満、約６００塩基対未満、約５００塩基対未満、約４００塩基対未満又は約３００塩基対未満である。例えば、ウイルスベクターが、本明細書中に記載される方法によってノックインカセットを導入するのに利用される、特定の実施形態において、５’相同性アームは、約４００～６００塩基対、例えば約５００塩基対である。

特定の実施形態において、３’相同性アームは、約３，０００塩基対未満、約２，９００塩基対未満、約２，８００塩基対未満、約２，７００塩基対未満、約２，６００塩基対未満、約２，５００塩基対未満、約２，４００塩基対未満、約２，３００塩基対未満、約２，２００塩基対未満、約２，１００塩基対未満、約２，０００塩基対未満、約１，９００塩基対未満、約１，８００塩基対未満、約１，７００塩基対未満、約１，６００塩基対未満、約１，５００塩基対未満、約１，４００塩基対未満、約１，３００塩基対未満、約１，２００塩基対未満、約１，１００塩基対未満、１，０００塩基対未満、約９００塩基対未満、約８００塩基対未満、約７００塩基対未満、約６００塩基対未満、約５００塩基対未満又は約４００塩基対未満である。

例えば、ウイルスベクターが、本明細書中に記載される方法によってノックインカセットを導入するのに利用される、特定の実施形態において、３’相同性アームは、約１，０００塩基対未満、約９００塩基対未満、約８００塩基対未満、約７００塩基対未満、約６００塩基対未満、約５００塩基対未満、約４００塩基対未満又は約３００塩基対未満である。例えば、ウイルスベクターが、本明細書中に記載される方法によってノックインカセットを導入するのに利用される、特定の実施形態において、３’相同性アームは、約４００～６００塩基対、例えば約５００の塩基対である。

特定の実施形態において、５’相同性アーム及び３’相同性アームは、切断の側面に位置して、切断の端部から１００、７５、５０、２５、１５、１０又は５塩基対未満離れている。特定の実施形態において、５’相同性アーム及び３’相同性アームは、内因性終止コドンの側面に位置する。特定の実施形態において、５’相同性アーム及び３’相同性アームは、内因性終止コドン、例えば必須遺伝子の終止コドンの上流側（５’側）の約５００塩基対（例えば、約５００塩基対、約４５０塩基対、約４００塩基対、約３５０塩基対、約３００塩基対、約２５０塩基対、約２００塩基対、約１５０塩基対、約１００塩基対、約５０塩基対又は約２５塩基対）の範囲内に位置決めされた切断の側面に位置する。特定の実施形態において、５’相同性アームは、切断の端部を包含する。

ノックインカセット
一部の実施形態において、ドナー鋳型内のノックインカセットは、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列を有するフレーム内、且つその下流側（３’側）に、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型内のノックインカセットは、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列を有するフレーム内、且つその上流側（５’側）に、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含む。一部の実施形態において、ノックインカセットは、多シストロン性ノックインカセットである。一部の実施形態において、ノックインカセットは、２シストロン性ノックインカセットである。一部の実施形態において、ノックインカセットは、レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない。

一部の実施形態において、単一の必須遺伝子座が、異なる「カーゴ」配列を含む２つのノックインカセットによって標的とされることとなる。一部の実施形態において、一方のアレルが、一方のノックインカセットを組み込むこととなり、他方のアレルが、他方のノックインカセットを組み込むこととなる。一部の実施形態において、適切なＤＮＡ切断を生成するのに利用されるｇＲＮＡが、２つの異なるノックインカセット毎に同じであり得る。一部の実施形態において、２つの異なるノックインカセット毎に適切なＤＮＡ切断を生成するのに利用されるｇＲＮＡは、「カーゴ」配列がアレル毎に異なる位置に組み込まれるように異なり得る。一部の実施形態において、アレル毎のそのような異なる位置はなお、最終的なエクソンコード領域内にあり得る。一部の実施形態において、アレル毎のそのような異なる位置は、最後から２番目のエクソン（最後に対して２番目）及び／又は最終的な（最後の）エクソンコード領域内にあり得る。一部の実施形態において、アレルの少なくとも１つについてのそのような異なる位置は、第１のエクソン内にあり得る。一部の実施形態において、アレルの少なくとも１つについてのそのような異なる位置は、第１のエクソン又は第２のエクソン内にあり得る。

必須遺伝子コード領域を、遺伝的に修飾された細胞内で（機能的遺伝子産物が生成されるように）適切に回復させるのに、ノックインカセットは、必須遺伝子のコード配列全体に対応する外因性コード配列を含む必要はない。実際に、必須遺伝子の内因性コード配列内の切断の位置に応じて、必須遺伝子の部分コード配列を含み、例えば切断及び切断の下流側の領域全体（終止コドンなし）にまたがる必須遺伝子の内因性コード配列の一部に対応し、且つ／又は切断及び切断の上流側の領域全体（開始コドンに達し、場合により開始コドンを含む）にまたがる必須遺伝子の内因性コード配列の一部に対応するノックインカセットを提供することにより、必須遺伝子を回復させることが可能であり得る。

ノックインカセットのサイズを最小にするために、実際、一部の実施形態において、必須遺伝子の内因性コード配列の最後の、即ちコード配列の３’末端に向かう１，５００、１，０００、７５０、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対内に切断が位置決めされることが有利であり得る。一部の実施形態において、コード配列内の塩基対の位置は、内因性翻訳終止シグナル（例えば終止コドン）から３’～５’に定義され得る。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる「内因性コード配列」は、エクソン塩基対及びイントロン塩基対の両方を含み得、５’側から内因性機能翻訳終止シグナルに向けて出現する遺伝子配列を指す。一部の実施形態において、内因性コード配列内の切断は、一方のＤＮＡ鎖内の切断を含む。一部の実施形態において、内因性コード配列内の切断は、両方のＤＮＡ鎖内の切断を含む。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の１０００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の７５０塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の６００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の５００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の４００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の３００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の２５０塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の２００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の１５０塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の１００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の７５塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の５０塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最後の２１塩基対内に位置決めされる。

一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片、例えば、５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満の断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、少なくとも１つのＰＡＭ部位を除去するようにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、複数のＰＡＭ部位を除去するようにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、全ての関連ヌクレアーゼ特異的ＰＡＭ部位を除去するようにコドン最適化されている。一部の実施形態において、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片は、約１４０アミノ酸長である。一部の実施形態において、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片は、約１３０アミノ酸長である。一部の実施形態において、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片は、約１２０アミノ酸長である。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、切断にまたがる必須遺伝子の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、必須遺伝子の１つのエクソン内の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、必須遺伝子の２つのエクソン内の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、必須遺伝子の３つのエクソン内の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、必須遺伝子の４つのエクソン内の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｃ末端断片は、必須遺伝子の５つのエクソン内の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片、例えば、５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８又は７アミノ酸長未満の断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の２０アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１９アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１８アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１７アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１６アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。

例えば、必須遺伝子が図３Ａの例示的な方法に示される多くのエクソンを含む、一部の実施形態において、必須遺伝子の最後のエクソン内に切断を有することが有利であり得る。例えば、必須遺伝子が図３Ａの例示的な方法に示される多くのエクソンを含む、一部の実施形態において、必須遺伝子の最後から２番目のエクソン内に切断を有することが有利であり得る。しかしながら、本開示は、切断のために特定のいかなる位置にも限定されないこと、利用可能な位置は、必須遺伝子の性質及び長さ並びに目的の遺伝子産物のための外因性コード配列の長さに応じて変動することとなることが理解されるべきである。例えば、少数のエクソンを含む必須遺伝子について又は目的の遺伝子産物が小さい場合、上流のエクソン内の切断を位置決めすることが可能であり得る。

ノックインカセットのサイズを最小にするために、実際、一部の実施形態において、必須遺伝子の内因性コード配列の最初の、即ちコード配列の５’末端から始まる１５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対内に切断が位置決めされることが有利であり得る。一部の実施形態において、コード配列内の塩基対の位置は、内因性翻訳開始シグナル（例えば開始コドン）から５’～３’に定義され得る。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる「内因性コード配列」は、エクソン塩基対及びイントロン塩基対の両方を含み得、３’側から内因性機能翻訳開始シグナルに向けて出現する遺伝子配列を指す。一部の実施形態において、内因性コード配列内の切断は、一方のＤＮＡ鎖内の切断を含む。一部の実施形態において、内因性コード配列内の切断は、両方のＤＮＡ鎖内の切断を含む。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の１０００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の７５０塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の６００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の５００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の４００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の３００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の２５０塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の２００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の１５０塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の１００塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の７５塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の５０塩基対内に位置決めされる。一部の実施形態において、切断は、内因性コード配列の最初の２１塩基対内に位置決めされる。

一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＮ末端断片、例えば、５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満の断片をコードする。一部の実施形態において、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＮ末端断片は、約１４０アミノ酸長である。一部の実施形態において、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＮ末端断片は、約１３０アミノ酸長である。一部の実施形態において、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＮ末端断片は、約１２０アミノ酸長である。一部の実施形態において、Ｎ末端断片は、切断にまたがる必須遺伝子の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｎ末端断片は、必須遺伝子の１つのエクソン内の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｎ末端断片は、必須遺伝子の２つのエクソン内の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｎ末端断片は、必須遺伝子の３つのエクソン内の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｎ末端断片は、必須遺伝子の４つのエクソン内の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｎ末端断片は、必須遺伝子の５つのエクソン内の内因性コード配列の領域によってコードされるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＮ末端断片、例えば、５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８又は７アミノ酸長未満の断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の２０アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１９アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１８アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１７アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１６アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。

一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列と１００％未満、例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％又は５０％未満の同一性である（即ち、２つの配列が、対応する配列間でのアラインメントを最大にする標準的なペアワイズ配列アラインメントツールを用いてアラインされた場合）。例えば、一部の実施形態において、ノックインカセット中の必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列は、細胞の必須遺伝子の対応する内因性コード配列に対して、例えば標的部位へのヌクレアーゼの更なる結合を妨げるように、コドン最適化されている。代わりに又は加えて、細胞のゲノム中へのノックインカセットの組み込み後の組換えの尤度を引き下げるように、且つ／又は必須遺伝子の遺伝子産物及び／若しくは細胞のゲノム中へのノックインカセットの組み込み後の目的の遺伝子産物の発現を増大させるようにコドン最適化され得る。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、内因性ノックイン部位に対して異なる（例えば、突然変異である）１つ又は複数のヌクレオチド又は塩基対を含む。一部の実施形態において、ノックインカセット中のそのような突然変異は、ヌクレアーゼによる切断に対する耐性を提供する。一部の実施形態において、ノックインカセット中のそのような突然変異は、相同組換え後にヌクレアーゼが標的遺伝子座を切るのを妨げる。一部の実施形態において、ノックインカセット中のそのような突然変異は、標的遺伝子の１つ又は複数のコード領域及び／又は非コード領域内に出現する。一部の実施形態において、ノックインカセット中のそのような突然変異は、サイレント突然変異である。一部の実施形態において、ノックインカセット中のそのような突然変異は、サイレント突然変異及び／又はミスセンス突然変異である。

一部の実施形態において、ノックインカセット中のそのような突然変異は、標的プロトスペーサモチーフ及び／又は標的プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位内に出現する。一部の実施形態において、ノックインカセットは、サイレント突然変異で飽和する標的プロトスペーサモチーフ及び／又はＰＡＭ部位を含む。一部の実施形態において、ノックインカセットは、サイレント突然変異でおよそ３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％飽和する標的プロトスペーサモチーフ及び／又はＰＡＭ部位を含む。一部の実施形態において、ノックインカセットは、サイレント突然変異及び／又はミスセンス突然変異で飽和する標的プロトスペーサモチーフ及び／又はＰＡＭ部位を含む。一部の実施形態において、ノックインカセットは、少なくとも１つの突然変異、少なくとも２つの突然変異、少なくとも３つの突然変異、少なくとも４つの突然変異、少なくとも５つの突然変異、少なくとも６つの突然変異、少なくとも７つの突然変異、少なくとも８つの突然変異、少なくとも９つの突然変異、少なくとも１０個の突然変異、少なくとも１１個の突然変異、少なくとも１２個の突然変異、少なくとも１３個の突然変異、少なくとも１４個の突然変異又は少なくとも１５個の突然変異を含む標的プロトスペーサモチーフ及び／又はＰＡＭ部位を含む。

一部の実施形態において、標的部位内の特定のアミノ酸をコードする特定のコドンは、内因性タンパク質の天然の機能の一部を失うことなく、コドン最適化により突然変異することができない。一部の実施形態において、標的部位内の特定のアミノ酸をコードする特定のコドンは、コドン最適化により突然変異することができない。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、コード配列の一部のみにおいてコドン最適化されている。例えば、一部の実施形態において、ノックインカセットは、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片、例えば、５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８又は７アミノ酸長未満の断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の２０アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１９アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１８アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１７アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１６アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１５アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１４アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１３アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１２アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１１アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１０アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の９アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の８アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の７アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の６アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の５アミノ酸Ｃ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の、５アミノ酸未満のアミノ酸Ｃ末端断片をコードする。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、コード配列の一部のみにおいてコドン最適化されている。例えば、一部の実施形態において、ノックインカセットは、必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＮ末端断片、例えば、５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８又は７アミノ酸長未満の断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の２０アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１９アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１８アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１７アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１６アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１５アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１４アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１３アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１２アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１１アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の１０アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の９アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の８アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の７アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の６アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の５アミノ酸Ｎ末端断片をコードする。一部の実施形態において、コドン最適化されたノックインカセット中の必須遺伝子の外因性部分コード配列は、必須遺伝子によってコードされるタンパク質の、５アミノ酸未満のアミノ酸Ｎ末端断片をコードする。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、例えば、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列と、本明細書中に記載される「カーゴ」配列及び／又は調節要素との間において、リンカーペプチドをコードする１つ又は複数の配列を含む。そのようなリンカーペプチドは、当技術分野において知られており、そのいずれも、本明細書中に記載されるノックインカセット内に含まれ得る。一部の実施形態において、リンカーペプチドは、アミノ酸配列ＧＳＧを含む。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、他の調節要素、例えばポリアデニル化配列及び場合により３’ＵＴＲ配列を、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列の下流側に含む。３’ＵＴＲ配列が存在する場合、３’ＵＴＲ配列は、外因性コード配列の３’側且つポリアデニル化配列の５’側に位置する。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、他の調節要素、例えば５’ＵＴＲ及び開始コドンを、目的の遺伝子産物のための外因性コード配列の上流側に含む。５’ＵＴＲ配列が存在する場合、５’ＵＴＲ配列は、「カーゴ」配列及び／又は外因性コード配列の５’側に配置される。

例示的な相同性アーム（ＨＡ）
特定の実施形態において、ドナー鋳型は、ＧＡＰＤＨ遺伝子座の領域に相同な５’及び／又は３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号１、２又は３の配列を含むか又はそれからなる５’相同性アームを含む。一部の実施形態において、５’相同性アームは、配列番号１、２又は３の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号４又は５の配列を含むか又はそれからなる３’相同性アームを含む。特定の実施形態において、３’相同性アームは、配列番号４又は５の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一の配列を含むか又はそれからなる。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号１を含む５’相同性アーム及び配列番号４を含む３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号２を含む５’相同性アーム及び配列番号４を含む３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号３を含む５’相同性アーム及び配列番号５を含む３’相同性アームを含む。

一部の実施形態において、ヌクレアーゼ切断部位の側面に位置する配列の広がりは、５’及び３’相同性アームの両方において重複し得る。一部の実施形態において、そのような重複は、ＨＤＲ効率を最適化するように設計されている。一部の実施形態において、重複配列の一方がコドン最適化され得るが、他方の配列がコドン最適化されていない。一部の実施形態において、重複配列は、両方ともコドン最適化され得る。一部の実施形態において、コドン最適化は、標的ＰＡＭ部位を除去し得る。一部の実施形態において、重複配列は：１００ｂｐ長、９０ｂｐ長、８０ｂｐ長、７０ｂｐ長、６０ｂｐ長、５０ｂｐ長、４０ｂｐ長、３０ｂｐ長又は２０ｂｐ長以下であり得る。

配列番号１－ＧＡＰＤＨ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号２－ＧＡＰＤＨ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号３－ＧＡＰＤＨ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号４－ＧＡＰＤＨ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な３’ＨＡ

配列番号５－ＧＡＰＤＨ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な３’ＨＡ

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ＴＢＰ遺伝子座の領域に相同な５’及び／又は３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号６、７又は８の配列を含むか又はそれからなる５’相同性アームを含む。一部の実施形態において、５’相同性アームは、配列番号６、７又は８の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号９、１０又は１１の配列を含むか又はそれからなる３’相同性アームを含む。特定の実施形態において、３’相同性アームは、配列番号９、１０又は１１の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一の配列を含むか又はそれからなる。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号６を含む５’相同性アーム及び配列番号９を含む３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号７を含む５’相同性アーム及び配列番号１０を含む３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号８を含む５’相同性アーム及び配列番号１１を含む３’相同性アームを含む。

配列番号６－ＴＢＰ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号７－ＴＢＰ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号８－ＴＢＰ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号９－ＴＢＰ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な３’ＨＡ

配列番号１０－ＴＢＰ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な３’ＨＡ

配列番号１１－ＴＢＰ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な３’ＨＡ

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、Ｇ６ＰＤ遺伝子座の領域に相同な５’及び／又は３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号１２の配列を含むか又はそれからなる５’相同性アームを含む。一部の実施形態において、５’相同性アームは、配列番号１２の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号１３の配列を含むか又はそれからなる３’相同性アームを含む。特定の実施形態において、３’相同性アームは、配列番号１３の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一の配列を含むか又はそれからなる。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号１２を含む５’相同性アーム及び配列番号１３を含む３’相同性アームを含む。

配列番号１２－Ｇ６ＰＤ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号１３－Ｇ６ＰＤ遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な３’ＨＡ

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、Ｅ２Ｆ４遺伝子座の領域に相同な５’及び／又は３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号１４、１５又は１６の配列を含むか又はそれからなる５’相同性アームを含む。一部の実施形態において、５’相同性アームは、配列番号１４、１５又は１６の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号１７、１８又は１９の配列を含むか又はそれからなる３’相同性アームを含む。特定の実施形態において、３’相同性アームは、配列番号１７、１８又は１９の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一の配列を含むか又はそれからなる。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号１４を含む５’相同性アーム及び配列番号１７を含む３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号１５を含む５’相同性アーム及び配列番号１８を含む３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号１６を含む５’相同性アーム及び配列番号１９を含む３’相同性アームを含む。

配列番号１４－Ｅ２Ｆ４遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号１５－Ｅ２Ｆ４遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号１６－Ｅ２Ｆ４遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号１７－Ｅ２Ｆ４遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な３’ＨＡ

配列番号１８－Ｅ２Ｆ４遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な３’ＨＡ

配列番号１９－Ｅ２Ｆ４遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な３’ＨＡ

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ＫＩＦ１１遺伝子座の領域に相同な５’及び／又は３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号２０、２１又は２２の配列を含むか又はそれからなる５’相同性アームを含む。一部の実施形態において、５’相同性アームは、配列番号２０、２１又は２２の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号２３、２４又は２５の配列を含むか又はそれからなる３’相同性アームを含む。特定の実施形態において、３’相同性アームは、配列番号２３、２４又は２５の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一の配列を含むか又はそれからなる。

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号２０を含む５’相同性アーム及び配列番号２３を含む３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号２１を含む５’相同性アーム及び配列番号２４を含む３’相同性アームを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号２２を含む５’相同性アーム及び配列番号２５を含む３’相同性アームを含む。

配列番号２０－ＫＩＦ１１遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号２１－ＫＩＦ１１遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号２２－ＫＩＦ１１遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な５’ＨＡ

配列番号２３－ＫＩＦ１１遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な３’ＨＡ

配列番号２４－ＫＩＦ１１遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な３’ＨＡ

配列番号２５－ＫＩＦ１１遺伝子座でのノックインカセット挿入のための例示的な３’ＨＡ

逆方向末端反復（ＩＴＲ）
特定の実施形態において、ドナー鋳型は、ＡＡＶ由来配列を含む。特定の実施形態において、ドナー鋳型は、シス作用性５’及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）等の、ＡＡＶ構築物で典型的なＡＡＶ由来配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５１６８（１９９０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。通常、ＩＴＲは、ヘアピンを形成することができる。ヘアピンを形成する能力は、自己プライムして、第２のＤＮＡ鎖の、プライマーゼ非依存性合成を可能にするＩＴＲ能力に寄与し得る。また、ＩＴＲは、標的細胞のゲノム中へのＡＡＶ構築物（例えばコード配列）の組み込みにおいて役割を果たす。また、ＩＴＲは、ＡＡＶ粒子内でのＡＡＶ構築物の有効なキャプシド形成を補助することができる。

一部の実施形態において、本明細書中に記載されるドナー鋳型は、ｒＡＡＶ粒子（例えばＡＡＶ６粒子）内に含まれる。一部の実施形態において、ＩＴＲは、約１４５個の核酸であるか又はそれを含む。一部の実施形態において、ＩＴＲをコードする配列の全て又は実質的に全てが用いられる。一部の実施形態において、ＡＡＶＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物ＡＡＶ型が挙げられる、知られているあらゆるＡＡＶから得られ得る。一部の実施形態において、ＩＴＲはＡＡＶ６ＩＴＲである。

本開示において使用されるＡＡＶ構築物の例として、カーゴ配列（例えば、本明細書中に記載されるドナー鋳型）を含有する「シス作用性」構築物があり、ドナー鋳型は、５’側又は「左側」の及び３’側又は「右側」のＡＡＶＩＴＲ配列の側面に位置する。５’側及び左側の表示は、構築物全体に対するＩＴＲ配列の位置を指す（センス方向に、左側から右側に読む）。例えば、一部の実施形態において、５’側又は左側のＩＴＲは、構築物がセンス方向に直線的に示される場合、所与の構築物のための標的遺伝子座プロモーター（ポリアデニル化配列に対向する）に最も近いＩＴＲである。同時に、３’側及び右側の表示は、構築物全体に対するＩＴＲ配列の位置を指す（センス方向に、左側から右側に読む）。例えば、一部の実施形態において、３’側又は右側のＩＴＲは、構築物がセンス方向に直線的に示される場合、所与の構築物のための標的遺伝子座内のポリアデニル化配列（プロモーター配列に対向する）に最も近いＩＴＲである。本明細書中で提供されるＩＴＲは、センス鎖に従って５’～３’の順に示される。従って、当業者であれば、５’側又は「左側」からの方向のＩＴＲも、センス方向からアンチセンス方向に変わる場合、３’側又は「右側」のＩＴＲとして示され得ることを認識するであろう。更に、所与のセンスＩＴＲ配列（例えば、５’／左側のＡＡＶＩＴＲ）を、アンチセンス配列（例えば３’／右側のＩＴＲ配列）に変換することは、十分、当業者の能力の範囲内である。当業者であれば、５’／左側若しくは３’／右側のＩＴＲ又はそのアンチセンスバージョンとして用いられる所与のＩＴＲ配列を修飾する方法を理解するであろう。

例えば、一部の実施形態において、ＩＴＲ（例えば５’ＩＴＲ）は、配列番号１５８に従う配列を有し得る。一部の実施形態において、ＩＴＲ（例えば３’ＩＴＲ）は、配列番号１５９に従う配列を有し得る。一部の実施形態において、ＩＴＲは、１つ又は複数の修飾、例えば当技術分野において知られているトランケーション、欠失、置換又は挿入を含む。一部の実施形態において、ＩＴＲは、１４５個未満のヌクレオチド、例えば、１２７、１３０、１３４又は１４１個のヌクレオチドを含む。例えば、一部の実施形態において、ＩＴＲは、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４又は１４５個のヌクレオチドを含む。

５’ＡＡＶＩＴＲ配列の非限定的な例として、配列番号１５８が挙げられる。３’ＡＡＶＩＴＲ配列の非限定的な例として、配列番号１５９が挙げられる。一部の実施形態において、５’ＡＡＶＩＴＲ及び３’ＡＡＶＩＴＲ（例えば、配列番号１５８及び１５９）は、本明細書中に記載されるドナー鋳型（例えば、５’ＨＡ、ノックインカセット及び３’ＨＡを含むドナー鋳型）の側面に位置する。ＩＴＲ配列を修飾する能力は、当技術分野の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，２ｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）；及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ．，７０：５２０５３２（１９９６）等のテキスト（各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。一部の実施形態において、５’ＩＴＲ配列は、配列番号１５８によって表される５’ＩＴＲ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一である。一部の実施形態において、３’ＩＴＲ配列は、配列番号１５９によって表される３’ＩＴＲ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一である。

配列番号１５８－ノックインカセット挿入のための例示的な５’ＩＴＲ

配列番号１５９－ノックインカセット挿入のための例示的な３’ＩＴＲ

フランキング非翻訳領域、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるノックインカセットは、非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲの全て又は一部を含む。遺伝子のＵＴＲは、転写されるが翻訳されない。５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まって、開始コドンに続くが、開始コドンを含まない。３’ＵＴＲは、終止コドンの直ぐ後に始まって、転写終結シグナルまで続く。ＵＴＲの調節及び／又は制御の特徴は、本明細書中に記載されるノックインカセットのいずれにも組み込まれて、必須標的遺伝子座及び／又はカーゴ配列の発現を増強又は他に調節することができる。

天然の５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす配列を含む。一部の実施形態において、５’ＵＴＲは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られている、Ｋｏｚａｋ配列のような配列を含む。Ｋｏｚａｋ配列は、コンセンサス配列ＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の上流側のプリン（Ａ又はＧ）３塩基であり、開始コドンの後に別の「Ｇ」が後に続く。また、５’ＵＴＲは、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することが知られている。５’ＵＴＲの非限定的な例として、以下の遺伝子由来のものが挙げられる：アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリトロポイエチン及びＶＩＩＩ因子。

一部の実施形態において、ＵＴＲは、非内因性調節領域を含み得る。一部の実施形態において、非内因性調節領域を含むＵＴＲは、３’ＵＴＲである。一部の実施形態において、非内因性調節領域を含むＵＴＲは、５’ＵＴＲである。一部の実施形態において、非内因性調節領域は、少なくとも１つの阻害核酸の標的であり得る。一部の実施形態において、阻害核酸は、標的遺伝子の発現及び／又は活性を阻害する。一部の実施形態において、阻害核酸は、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はリボザイムである。一部の実施形態において、阻害核酸は内因性分子である。一部の実施形態において、阻害核酸は非内因性分子である。一部の実施形態において、阻害核酸は、組織特異的発現パターンを提示する。一部の実施形態において、阻害核酸は、細胞特異的発現パターンを提示する。

一部の実施形態において、ノックインカセットは、複数の非内因性調節領域、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の調節領域を含み得る。一部の実施形態において、ノックインカセットは、４つの非内因性調節領域を含み得る。一部の実施形態において、構築物は、複数の非内因性調節領域を含み得、複数の非内因性調節領域の少なくとも１つが他の非内因性調節領域の少なくとも１つと同じでない。

一部の実施形態において、３’ＵＴＲは、目的の遺伝子の終止コドンに対して直ぐ３’側に見出される。一部の実施形態において、標的細胞によって転写されるｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、本明細書中に記載されるあらゆるノックインカセット内に含まれ得る。一部の実施形態において、３’ＵＴＲは、内因性標的遺伝子座に由来し、内因性配列の全て又は一部を含み得る。一部の実施形態において、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２６の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９８％同一である。

配列番号２６－ノックインカセット挿入のための例示的な３’ＵＴＲ
ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡ

ポリアデニル化配列
一部の実施形態において、本明細書中で提供されるノックインカセット構築物は、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））シグナル配列を含み得る。最も初期の真核生物ｍＲＮＡは、その３’末端にポリ（Ａ）尾部を有し、これは、一次転写産物及び共役ポリアデニル化反応の、ポリ（Ａ）シグナル配列によって駆動される切断を含む複雑なプロセス中に加えられる（例えば、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１０８：５０１－５１２，２００２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。ポリ（Ａ）尾部は、ｍＲＮＡ安定性及びトランスフェラビリティを付与する（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＣｅｌｌ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎｂｙＢ．Ａｌｂｅｒｔｓｅｔａｌ．，ＧａｒｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９４、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）シグナル配列は、コード配列に対して３’側に配置される。

本明細書中で用いられる「ポリアデニル化」は、メッセンジャーＲＮＡ分子への、ポリアデニリル部分又はその修飾変異体の共有結合を指す。真核生物において、殆どのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端においてポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）尾部は、酵素ポリアデニル化ポリメラーゼの作用によりプレｍＲＮＡに加えられる長い配列のアデニンヌクレオチド（例えば、５０、６０、７０、１００、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００又は５０００個）である。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部は、特定の配列、例えばポリアデニル化（又はポリ（Ａ））シグナルを含有する転写産物上に加えられる。ポリ（Ａ）尾部及び関連タンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのを補助する。また、ポリアデニル化は、転写終結、核からのｍＲＮＡの搬出及び翻訳において役割を果たす。ポリアデニル化は、典型的に、ＤＮＡの、ＲＮＡへの転写の直後に核内で起こるが、後に細胞質内でも起こり得る。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用により切断される。切断部位は、通常、切断部位の近くの塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基は、切断部位の自由３’末端に加えられる。

本明細書中で用いられる「ポリ（Ａ）シグナル配列」又は「ポリアデニル化シグナル配列」は、ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断及び切断されたｍＲＮＡの３’末端への一連のアデノシンの追加をトリガーする配列である。

用いられ得るいくつかのポリ（Ａ）シグナル配列が存在し、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）（Ｗｏｙｃｈｉｋｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳ．Ａ．８１（１３）：３９４４－３９４８，１９８４；米国特許第５，１２２，４５８号明細書（各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、マウス－β－グロビン、マウス－α－グロビン（Ｏｒｋｉｎｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ４（２）：４５３－４５６，１９８５；Ｔｈｅｉｎｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ７１（２）：３１３－３１９，１９８８（各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、ヒトコラーゲン、ポリオーマウイルス（Ｂａｔｔｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５（９）：４７８３－４７９０，１９９５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶＴＫ）、ＩｇＧ重鎖遺伝子ポリアデニル化シグナル（米国特許出願公開第２００６／００４０３５４号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ１５（７）：１３４０－１３４７，２００７（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位、例えばＳＶ４０ｌａｔｅ及びｅａｒｌｙポリ（Ａ）部位を含む群（Ｓｃｈｅｋｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２（１２）：５３８６－５３９３，１９９２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））に由来するものが挙げられる。

ポリ（Ａ）シグナル配列は、ＡＡＴＡＡＡであり得る。ＡＡＴＡＡＡ配列は、ＡＡＴＡＡＡに対して相同性を有し、且つポリアデニル化をシグナル伝達することができる他のヘキサヌクレオチド配列（ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ、ＣＡＴＡＡＡ、ＴＡＴＡＡＡ、ＧＡＴＡＡＡ、ＡＣＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＴＡ、ＡＡＧＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＡＡＡＡ、ＡＡＴＧＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＡＣＡＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＡＴＡＡＣ、ＡＡＴＡＧＡ、ＡＡＴＴＡＡ又はＡＡＴＡＡＧが挙げられる）で置換され得る（例えば、国際公開第０６／１２４１４号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。

一部の実施形態において、ポリ（Ａ）シグナル配列は、合成ポリアデニル化部位であり得る（例えば、Ｌｅｖｉｔｔｅｌａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．３（７）：１０１９－１０２５，１９８９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に基づくＰｒｏｍｅｇａのｐＣｌネオ発現構築物参照）。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）シグナル配列は、可溶性ニューロピリン－１（ｓＮＲＰ）（ＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＡＴＧ）のポリアデニル化シグナルである（例えば、国際公開第０５／０７３３８４号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）シグナル配列は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）シグナル配列は、配列番号２７を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）シグナル配列は、ｂＧＨｐＡを含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）シグナル配列は、配列番号２８を含むか又はそれからなる。ポリ（Ａ）シグナル配列の追加の例は、当技術分野において知られている。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）配列は、配列番号２７又は２８の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一である。

配列番号２７－例示的なＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列
ＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡ
配列番号２８－例示的なＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列

ＩＲＥＳ及び２Ａエレメント
いくつかの実施形態において、ノックインカセットは、別個の遺伝子産物として必須遺伝子によってコード化される遺伝子産物及び目的の遺伝子産物の発現を可能にする調節エレメント、例えば、必須遺伝子の外因性コード配列又は部分的なコード配列と、目的の遺伝子産物についての外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む。

いくつかの実施形態において、ノックインカセットは、複数の目的の遺伝子産物（例えば、少なくとも２つの目的の遺伝子産物）を含み得る。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、２つ以上の遺伝子産物として少なくとも２つの目的の遺伝子産物の発現を可能にする調節エレメント、例えば少なくとも２つのコード配列間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントによって隔てられ、少なくとも２つのペプチド産物の生成を促し得る。

配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントは、この目的のために一般的に使用される、調節エレメントの１つのタイプである。当技術分野においてよく知られているように、ＩＲＥＳエレメントは、ｍＲＮＡの内部領域からの翻訳の開始及び従って、同じｍＲＮＡ転写物からの２つの別個のタンパク質の発現を可能にする。ＩＲＥＳは、もともと、ポリオウイルスＲＮＡにおいて発見されたものであり、ＩＲＥＳは、真核細胞においてウイルスゲノムの翻訳を促進する。それ以来、種々のＩＲＥＳ配列が、発見されてきた－多くはウイルスに由来するが、細胞性ｍＲＮＡに由来するものもあり、例えばＭｏｋｒｅｊｓｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００６；３４（Ｄａｔａｂａｓｅｉｓｓｕｅ）：Ｄ１２５－Ｄ１３０を参照されたい。

２Ａエレメントは、この目的のために一般的に使用される別のタイプの調節エレメントである。これらの２Ａエレメントは、ピコルナウイルスにおいて最初に発見された短いペプチド（約２０アミノ酸）である、いわゆる「自己切断」２Ａペプチドをコード化する。用語「自己切断」は、完全に正確であるわけではなく、これらのペプチドは、リボソームに、２ＡエレメントのＣ末端に結合したペプチドの合成をスキップさせることによって機能し、結果として、２Ａ配列の端と下流の次のペプチドとの間で分離されると考えられている。「切断」は、Ｃ末端上に見つけられるグリシン（Ｇ）とプロリン（Ｐ）残基との間で生じ、上流のシストロン、即ち必須遺伝子によってコード化されるタンパク質は、２Ａペプチドに由来する少数の追加の残基が端に追加されており、一方、下流のシストロン、即ち目的の遺伝子産物は、プロリン（Ｐ）で始まることになる。

下記の表２は、一般的に使用される４つの２Ａペプチドを掲げる（任意選択となるＧＳＧ配列は、切断効率を改善するために、ペプチドのＮ末端部にときに追加される）。本明細書において記載される方法及び組成物に適し得る多くの有望な２Ａペプチドがある（例えば、Ｌｕｋｅｅｔａｌ．，Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｏｒｉｇｉｎｓｏｆ‘２Ａ－ｌｉｋｅ’ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅｓ．ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．２００８を参照されたい）。当業者は、特定のノックインカセットについての特異的な２Ａペプチドの選択が、結局、細胞型又は実験条件などの多くの要因によって決まることを知っている。当業者は、望ましい切断イベントを誘導するのに適したペプチドをなおコード化しながら、特異的な２Ａペプチドをコード化するヌクレオチド配列を変えることができることを認識するであろう。

必須遺伝子
必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖にとって必須である任意の遺伝子であり得る。いくつかの実施形態において、必須遺伝子は、全ての細胞型の生存にとって必須であるハウスキーピング遺伝子、例えば表３において掲げられる遺伝子である。Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎ．２０１４；３０（３）：１１９－２０及びＭｏｅｉｎｅｔａｌ．，Ａｄｖ．ＢｉｏｍｅｄＲｅｓ．２０１７；６：１５において述べられる他のハウスキーピング遺伝子も参照されたい。ｉＰＳＣ／ＥＳＣを含む、様々な細胞型にとって必須である追加の遺伝子を、表４に掲げる（内容全体が参照によって本明細書に援用されるＹｉｌｍａｚｅｔａｌ．，Ｎａｔ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．２０１８；２０：６１０－６１９において述べられる必須遺伝子も参照されたい）。

いくつかの実施形態において、必須遺伝子は、ＧＡＰＤＨであり、ＤＮＡヌクレアーゼは、エクソン９における破壊、例えば二本鎖破壊を引き起こす。いくつかの実施形態において、必須遺伝子は、ＴＢＰであり、ＤＮＡヌクレアーゼは、エクソン７又はエクソン８における破壊、例えば二本鎖破壊を引き起こす。いくつかの実施形態において、必須遺伝子は、Ｅ２Ｆ４であり、ＤＮＡヌクレアーゼは、エクソン１０における破壊、例えば二本鎖破壊を引き起こす。いくつかの実施形態において、必須遺伝子は、Ｇ６ＰＤであり、ＤＮＡヌクレアーゼは、エクソン１３における破壊、例えば二本鎖破壊を引き起こす。いくつかの実施形態において、必須遺伝子は、ＫＩＦ１１であり、ＤＮＡヌクレアーゼは、エクソン２２における破壊、例えば二本鎖破壊を引き起こす。

本明細書において使用される遺伝子記号（表３及び４を含む）は、ワールドワイドウェブ上でｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇで検索可能であるＨｕｍａｎＧｅｎｅＮａｍｉｎｇＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）において見つけられる遺伝子記号に基づく。ＥｎｓｅｍｂｌＩＤは、遺伝子記号ごとに提供され、ワールドワイドウェブでｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇで検索可能である。

表３及び４において提供される遺伝子は、必須遺伝子の非限定的な例である。追加の必須遺伝子は、当技術分野における知識に基づいて当業者に明らかであろうが、本開示に従う使用のための特定の遺伝子の適性は、例えば本明細書において述べられるように決定することができる。例えば、いくつかの実施形態において、特定の必須遺伝子は、ゲノムの他のどこかにある有望なオフターゲット部位の分析によって選択することができる。いくつかの実施形態において、ヒトゲノムにおいて他と重複しない１つ以上のｇＲＮＡ標的部位を有する必須遺伝子のみが、本明細書において記載される方法に選択される。いくつかの実施形態において、ヒトゲノムにおいて他の１つのみの遺伝子座において見つけられる１つ以上のｇＲＮＡ標的部位を有する必須遺伝子のみが、本明細書において記載される方法に選択される。いくつかの実施形態において、ヒトゲノムにおいて他の２つのみの遺伝子座において見つけられる１つ以上のｇＲＮＡ標的部位を有する必須遺伝子のみが、本明細書において記載される方法に選択される。

目的の遺伝子産物
本開示の方法、システム及び細胞は、細胞の必須遺伝子の場所での、目的の遺伝子の統合を可能にする。目的の遺伝子は、任意の目的の遺伝子産物をコード化することができる。ある実施形態において、目的の遺伝子産物は、抗体、抗原、酵素、成長因子、受容体（例えば、細胞表面、細胞質若しくは核内）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、ケモカイン、レポーター、上記のいずれかの機能的断片又は上記のいずれかの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物の配列は、原核生物の配列、真核生物ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）ＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列を含むことができるが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然のポリペチド（即ち自然界で見つけられるポリペチド）又はその断片；変異ポリペプチド（即ち天然のポリペチドと１００％未満の配列同一性を有する天然のポリペチドの突然変異体）又はその断片；操作されたポリペチド又はペプチド断片、治療用ペプチド又はポリペチド、画像診断マーカー、選択マーカー、分解シグナル及び他の同種のものをコード化し得る。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、望ましい特徴を修飾された細胞に付与する治療用タンパク質又は遺伝子産物であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、蛍光タンパク質（例えば、本明細書において記載される）並びに酵素（例えば、ルシフェラーゼ及びｌａｃＺ）などのレポータータンパク質をコード化する。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子は、治療用細胞が対象に導入されると、治療用細胞の追跡を促進し得る。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、患者において欠損しているタンパク質などの治療用タンパク質であり得る、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、例えば、治療用タンパク質は、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アリルスルファターゼＡ、ベータ－グルコセレブロシダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ並びにアルファ－及びベータ－ガラクトシダーゼなど、リソソーム蓄積症において欠損しているもの；並びに第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子などの血友病において欠損しているものを含むが、これらに限定されない。治療用タンパク質の他の例は、病原性タンパク質（例えば、タウ、アルファ－シヌクレイン及びベータ－アミロイドタンパク質）を標的にするもの並びに癌細胞を標的にするもの（例えば、本明細書において記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））などの抗体又は抗体断片（例えばｓｃＦｖ）を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、免疫調節に関与するタンパク質、即ち免疫調節タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、例えば、このようなタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＴＧＦ－β１及びその様々なアイソフォームである。一例として、いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、ＨＬＡ－Ｇ（例えば、ＨＬＡ－Ｇ１、－Ｇ２、－Ｇ３、－Ｇ４、－Ｇ５、－Ｇ６若しくは－Ｇ７）又はＨＬＡ－Ｅのアイソフォームであり得；このような非古典的ＭＨＣクラスＩ分子を発現している同種細胞は、細胞の供給元ではないヒト患者に移植される場合、それほど免疫原性ではなく、忍容性が優れており、「万能」細胞療法を可能にし得る。

いくつかの実施形態において、例示的な目的の遺伝子産物は、治療的価値、例えば、細胞に対して新しい治療活性を付与するものである。いくつかの実施形態において、例示的な目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）若しくはその抗原結合性断片、Ｔ細胞受容体若しくはその抗原結合断片、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面分化抗原群ＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせなどのポリペチドである。本開示の方法及び細胞が、いかなる特定の目的の遺伝子産物にも限定されないこと及び目的の遺伝子産物の選択が、細胞の型及び細胞の最終的な使用によって決まるであろうということが理解されるべきである。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、サイトカインであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法を使用して作製される修飾された細胞からのサイトカインの発現は、インビボにおけるサイトカインの局所的な投薬を可能にする（例えば、それを必要とする対象の体内で）及び／又は高用量のサイトカインを、それを必要とする対象に全身投与する必要を回避する（例えば、低用量のサイトカインが投与され得る）。いくつかの実施形態において、サイトカインを投与することに関連する用量制限毒性の危険が低下し、同時にサイトカインが媒介する細胞機能が維持される。いくつかの実施形態において、高用量の可溶性サイトカインを追加的に投与する必要なく細胞機能を促すために、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β及び／又はそれらのそれぞれの受容体の１つ以上の部分的な又は完全なペプチドは、サイトカイン自体の発現の有無にかかわらずサイトカインシグナル伝達を可能にするために細胞に導入され、それによりサイトカイン毒性の危険の低下と共に細胞成長、増殖、増大及び／又はエフェクター機能を維持又は改善する。いくつかの実施形態において、サイトカインシグナル伝達のための導入されたサイトカイン及び／又はそのそれぞれの天然の若しくは修飾された受容体は、細胞表面上に発現される。いくつかの実施形態において、サイトカインシグナル伝達は、恒常的に活性化される。いくつかの実施形態において、サイトカインシグナル伝達の活性化は、誘導性である。いくつかの実施形態において、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性及び／又は一時的である。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－ｂ、ＩＦＮ－ｇ、エリスロポイエチン及び／又はそれぞれのサイトカイン受容体であり得る。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、ＣＣＬ３、ＴＮＦα、ＣＣＬ２３、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ１２ＲＢ２又はＩＲＦ７であり得る。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、ケモカイン及び／又はそれぞれのケモカイン受容体であり得る。いくつかの実施形態において、ケモカイン受容体は、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＸ３Ｃ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３Ａ、ＣＸＣＲ３Ｂ又はＣＸＣＲ２であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ケモカインは、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１９又はＣＸＬ１４であり得るが、これらに限定されない。

本明細書において使用されるように、用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、ＣＡＲを発現する細胞に、特異的なタンパク質を標的にする新しい能力を与えるために修飾された受容体タンパク質を指す。本開示に関連して、ＣＡＲ又は抗原結合断片を含むように修飾された細胞は、疾患又は障害に関連する細胞、例えば癌細胞を標的にして、破壊するための免疫療法に使用され得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、目的の任意の抗原に結合することができる。

目的のＣＡＲは、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及び／又はＭＩＣＡ／Ｂを標的にするＣＡＲを含むことができるが、これらに限定されない。現在までのところ、メソテリン標的ＣＡＲＴ細胞療法は、中皮腫、非小細胞肺癌及び乳癌を有する対象の第Ｉ相臨床試験において有効性について初期のエビデンスを示した（ＮＣＴ０２４１４２６９）。同様に、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＭＩＣＡ／Ｂを標的にするＣＡＲは、初期の研究において、望みがあることを示した（例えばＬｉｅｔａｌ．（２０１８），ＣｅｌｌＤｅａｔｈ＆Ｄｉｓｅａｓｅ，９（１７７）；Ｈａｎｅｔａｌ．（２０１８）Ａｍ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，８（１）：１０６－１１９；及びＤｅｍｏｕｌｉｎ２０１７）ＦｕｔｕｒｅＯｎｃｏｌｏｇｙ，１３（８）を参照されたい；これらのそれぞれの内容全体が、完全に参照によって本明細書に明確に援用される）。

ＣＡＲは、当業者によく知られており、例えば国際公開第１３／０６３４１９号パンフレット（メソテリン）、国際公開第１５／１６４５９４号パンフレット（ＥＧＦＲ）、国際公開第１３／０６３４１９号パンフレット（ＨＥＲ２）、国際公開第１６／１５４５８５号パンフレット（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）において記載されるものを含み、これらのそれぞれの内容全体が、完全に参照によって本明細書に明確に援用される。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、細胞、例えば、疾患又は障害に関連する細胞を標的にするための、任意の適したＣＡＲ、ＮＫ細胞に特異的なＣＡＲ（ＮＫ－ＣＡＲ）、Ｔ細胞に特異的なＣＡＲ又は細胞、例えばＮＫ細胞を標的にする他のバインダーであり、本明細書において提供される修飾された細胞において発現され得る。例示的なＣＡＲ及びバインダーは、二重特異性抗原結合ＣＡＲ、切換可能なＣＡＲ、二量体化可能なＣＡＲ、分割ＣＡＲ、多連鎖ＣＡＲ、誘導性ＣＡＲ、ＢＣＭＡ、アンドロゲン受容体、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｍｕｃ１、ＨＰＶウイルスペプチド（即ちＥ７）、ＥＢＶウイルスペプチド、ＷＴ１、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ１３Ｒα２、ＧＤ２、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ、Ｍｕｃ１６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３８ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ９２、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２６１、ＣＤ３６２、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＤＭ２、ＣＹＰ１Ｂ、リビン、サイクリン１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１、ＮＫｐ４４、ＣＡ９、ＰＤ１、ＰＤＬ１、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の抗原、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、ＧＰＲＣ５Ｄ、受容体型チロシンキナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒａ２）、Ｋ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（ＬＩ－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、メラノーマ抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａｌ）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、癌－精巣抗原ＮＹＥＳ０－１、腫瘍胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、病原体抗原又はその任意の適した組み合わせに結合するＣＡＲ及びバインダーを含むが、これらに限定されない。本明細書において提供される修飾された細胞における使用のための追加の適したＣＡＲ及びバインダーは、本開示及び当技術分野における一般的な知識に基づいて当業者に明らかであろう。このような追加の適したＣＡＲは、ＤａｖｉｅｓａｎｄＭａｈｅｒ，ＡｄｏｐｔｉｖｅＴ－ｃｅｌｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｏｆＣａｎｃｅｒＵｓｉｎｇＣｈｉｍｅｒｉｃＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒ－ＧｒａｆｔｅｄＴＣｅｌｌｓ，ＡｒｃｈｉｖｕｍＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅｅｔＴｈｅｒａｐｉａｅＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ５８（３）：１６５－７８（２０１０）の図３において記載されるものを含み、この内容全体が、参照によって本明細書に援用される。本明細書において記載される方法に適した追加のＣＡＲは、以下を含む：ＣＤ１７１に特異的なＣＡＲ（Ｐａｒｋｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ（２００７）ｌ５（４）：８２５－８３３）。ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的なＣＡＲ（Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ（２０１２）２３（１０）：１０４３－１０５３）、ＥＧＦ－Ｒに特異的なＣＡＲ（Ｋｏｂｏｌｄｅｔａｌ，ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ（２０１４）ｌ０７（ｌ）：３６４）、炭酸脱水酵素Ｋに特異的なＣＡＲ（Ｌａｍｅｒｓｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＳｏｃＴｒａｎｓ（２０１６）４４（３）：９５１－９５９）、ＦＲ－ａに特異的なＣＡＲ（Ｋｅｒｓｈａｗｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ（２００６）１２（２０）：６１０６－６０１５）、ＨＥＲ２に特異的なＣＡＲ（Ａｈｍｅｄｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ（２０１５）３３（１５）１６８８－ｌ６９６；Ｎａｋａｚａｗａｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ（２０１１）１９（１２）：２１３３－２１４３；Ａｈｍｅｄｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ（２００９）１７（１０）：１７７９－１７８７；Ｌｕｏｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＲｅｓ（２０１６）２６（７）：８５０－８５３；Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ（２０１０）ｌ８（４）：８４３－８５ｌ；Ｇｒａｄａｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ（２０１３）９（２）：３２）、ＣＥＡに特異的なＣＡＲ（Ｋａｔｚｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ（２０１５）２１（１４）：３１４９－３１５９）、ＩＬｌ３Ｒａ２に特異的なＣＡＲ（Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ（２０１５）２ｌ（ｌ８）：４０６２－４０７２）、ＧＤ２に特異的なＣＡＲ（Ｌｏｕｉｓｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１８（２３）：６０５０－６０５６；Ｃａｒｕａｎａｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｄ（２０１５）２ｌ（５）：５２４－５２９）、ＥｒｂＢ２に特異的なＣＡＲ（Ｗｉｌｋｉｅｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ（２０１２）３２（５）：１０５９－１０７０）、ＶＥＧＦ－Ｒに特異的なＣＡＲ（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ（２０１６）２２（２）：４３６－４４７）、ＦＡＰに特異的なＣＡＲ（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ（２０１４）２（２）：１５４－１６６）、ＭＳＬＮに特異的なＣＡＲ（Ｍｏｏｎｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ（２０１１）１７（１４）：４７１９－３０）、ＣＤｌ９に特異的なＣＡＲ（アキシカブタジンシロルーセル（Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標））及びチサゲンレクルユーセル（Ｋｙｍｒｉａｈ（登録商標））。腫瘍特異性ＣＡＲの治験について概説するＬｉｅｔａｌ．，ＪＨｅｍａｔｏｌａｎｄＯｎｃｏｌ（２０１８）１１（２２）も参照されたい。

本明細書において使用されるように、用語「ＣＤ１６」は、免疫グロブリンＧのＦｃ部分に対する受容体（ＦｃγＲＩＩＩ）を指し、ＣＤ１６は、血液循環からの抗原抗体複合体の除去及び他の抗体依存性の反応に関与する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１６タンパク質は、ｈＣＤ１６変異体である。いくつかの実施形態において、ｈＣＤ１６変異体は、高親和性Ｆ１５８Ｖ変異体である。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、高親和性非切断型ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）又はその変異体を含む。いくつかの実施形態において、高親和性非切断型ＣＤ１６又はその変異体は、下記の少なくともいずれか１つを含む：（ａ）ＣＤ１６の外部ドメインのドメインにおけるＦｌ７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ（例えばＪｉｎｇｅｔａｌ．，ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎＡＤＡＭ１７ＣｌｅａｖａｇｅＲｅｇｉｏｎｉｎＨｕｍａｎＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）ａｎｄｔｈｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆａＮｏｎ－ＣｌｅａｖａｂｌｅＶｅｒｓｉｏｎｏｆｔｈｅＲｅｃｅｐｔｏｒｉｎＮＫＣｅｌｌｓ；ＰＬＯＳＯｎｅ，２０１５を参照されたい）；（ｂ）ＣＤ６４に起源を発する完全な又は部分的な外部ドメイン；（ｃ）非天然（又は非ＣＤ１６）膜貫通ドメイン；（ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）細胞内ドメイン；（ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）シグナル伝達ドメイン；（ｆ）非天然刺激性ドメイン；並びに（ｇ）ＣＤ１６に起源を発するものではなく、同じ又は異なるポリペチドに起源を発する膜貫通、シグナル伝達及び刺激性ドメイン。いくつかの実施形態において、非天然膜貫通ドメインは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ｓ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ５ａ、ＣＤ５ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２Ｓ、ＣＤ４０、ＣＤＳ４、ＣＤ１６６、４－ｌＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペチドに起源を有する。いくつかの実施形態において、非天然刺激性ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２Ｓ、４－ｌＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰｌＯ、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４又はＮＫＧ２Ｄポリペチドに起源を有する。いくつかの他の実施形態において、非天然シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｓ、２Ｂ４、ＤＡＰｌＯ、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭｌ、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ又はＮＫＧ２Ｄポリペチドに起源を有する。ｈｎＣＤ１６変異体のいくつかの特定の実施形態において、非天然膜貫通ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに起源を有し、非天然刺激性ドメインは、２Ｂ４に起源を有し、非天然シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｓに起源を有する。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、高親和性切断型ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）又はその変異体を含む。いくつかの実施形態において、高親和性切断型ＣＤ１６又はその変異体は、少なくともＦ１７６Ｖを含む。いくつかの実施形態において、高親和性切断型ＣＤ１６又はその変異体は、Ｓ１９７Ｐアミノ酸置換を含まない。

本明細書において使用されるように、用語「ＩＬ－１５／ＩＬ１５ＲＡ」又は「インターロイキン－１５」（ＩＬ－１５）は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）と構造的な類似性を有するサイトカインを指す。ＩＬ－２のように、ＩＬ－１５は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２）及び共通のガンマ鎖（ガンマ－Ｃ、ＣＤ１３２）から構成される複合体に結合し、それを通してシグナル伝達する。ＩＬ－１５は、ウイルスによる感染後に単核食細胞（及び他のいくつかの細胞）によって分泌される。このサイトカインは、ナチュラルキラー細胞の細胞増殖を誘導する。ＩＬ－１５受容体アルファ（ＩＬ１５ＲＡ）は、非常に高い親和性でＩＬ－１５に特異的に結合し、他のサブユニットから独立してＩＬ－１５に結合する能力がある（例えばＭｉｓｈｒａｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｈｗａｙｓ：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５ｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｈｅａｌｔｈａｎｄｉｎｃａｎｃｅｒ，ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１４を参照されたい）。この特性により、ＩＬ－１５がある細胞によって産生され、別の細胞によってエンドサイトーシスされ、次に第三者の細胞に提示されるのを可能にすることが示唆される。ＩＬ１５ＲＡは、細胞増殖並びにアポトーシス阻害因子ＢＣＬ２Ｌ１／ＢＣＬ２－ＸＬ及びＢＣＬ２の発現を増強することが報告されている。ＩＬ－１５の例示的な配列は、ＮＧ＿０２９６０５．２において提供され、ＩＬ－１５ＲＡの例示的な配列は、ＮＭ＿００２１８９．４において提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５Ｒ変異体は、恒常的に活性なＩＬ－１５Ｒ変異体である。いくつかの実施形態において、恒常的に活性なＩＬ－１５Ｒ変異体は、ＩＬ－１５ＲとＩＬ－１５Ｒアゴニスト、例えばＩＬ－１５タンパク質又はそのＩＬ－１５Ｒ結合断片との間の融合物である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５Ｒアゴニストは、ＩＬ－１５又はそのＩＬ－１５Ｒ結合変異体である。例示的な適したＩＬ－１５Ｒ変異体は、限定を伴うことなく、例えばＭｏｒｔｉｅｒＥｅｔａｌ，２００６；ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２００６２８１：１６１２－１６１９；又はＢｅｓｓａｒｄ－Ａｅｔａｌ．，ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ．２００９Ｓｅｐ；８（９）：２７３６－４５において記載されるものを含み、これらのそれぞれの内容全体が、本明細書において参照によって援用される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５の膜結合トランスプレゼンテーションは、可溶性のＩＬ－１５よりも有力な活性化経路である（例えばＩｍａｍｕｒａｅｔａｌ．，Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｇｒｏｗｔｈａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５，Ｂｌｏｏｄ，２０１４を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５Ｒ発現は、以下を含む：自己切断ペプチドを使用するＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒａの発現；ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒａの融合タンパク質；ＩＬ１５Ｒａの細胞内ドメインが切り詰められたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合タンパク質；ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒａの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質；ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒβの融合タンパク質；ＩＬ１５及び共通の受容体γＣの融合タンパク質、共通の受容体γＣは、天然であるか若しくは修飾されている；並びに／又はＩＬ１５Ｒβのホモ二量体。

本明細書において使用されるように、用語「ＩＬ－１２」は、インターロイキン－１２、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞に作用するサイトカインを指す。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された幹細胞及び／又は子孫細胞は、結果として、１つ以上のインターロイキン１２（ＩＬ１２）経路のアゴニスト、例えばＩＬ－１２、インターロイキン１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）又はその変異体（例えば、ＩＬ－１２Ｒの恒常的に活性な変異体、例えば、ＩＬ－１２Ｒアゴニスト（ＩＬ－１２ＲＡ）に融合されたＩＬ－１２Ｒを発現する遺伝子修飾を含む。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、タンパク質又はポリペチドを含み、細胞、例えば、本明細書において記載されるように修飾された細胞内でのこの発現は、細胞が対象への移植又は生着後に免疫拒絶を阻害するか又は逃れることを可能にする。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬ４、ＣＤ４７又は関連するリガンドである。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はその抗原結合性断片、例えば組換えＴＣＲである。いくつかの実施形態において、組換えＴＣＲは、目的の抗原、例えば、これらに限定されないが、ＣＤ２７９、ＣＤ２、ＣＤ９５、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３ＣＤ２７２、ＴＩＭ３、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＳＩＲＰａ、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３００、ＬＰＡ５、ＮＹ－ＥＳＯ、ＰＤ１、ＰＤＬ１又はＭＡＧＥ－Ａ３／Ａ６から選択される抗原に結合することができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ又はその抗原結合性断片は、ウイルス抗原、例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（例えばＨＰＶ－１６（ＨＰＶ－１６Ｅ６若しくはＨＰＶ－１６Ｅ７など）、ＨＰＶ－１８、ＨＰＶ－３１、ＨＰＶ－３３又はＨＰＶ－３５）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス０１（ＨＴＬＶ－１）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス－２（ＨＴＬＶ－２）又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原に結合することができる。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、ＣＤ４７、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ及びそのリガンドに結合することができる単鎖可変断片を含む。

本明細書において使用されるように、用語「ＨＬＡ－Ｇ」は、ＨＬＡ非古典的クラスＩ重鎖パラログを指す。このクラスＩ分子は、重鎖及び軽鎖（ベータ－２ミクログロブリン）からなるヘテロ二量体である。重鎖は、膜に固定されている。ＨＬＡ－Ｇは、胎児由来胎盤細胞上に発現される。ＨＬＡ－Ｇは、ＮＫ細胞阻害性受容体ＫＩＲ２ＤＬ４のためのリガンドであり、そのため、栄養膜によるこのＨＬＡの発現は、胎盤細胞をＮＫ細胞媒介性の死から守る。例えば、内容全体が、参照によって本明細書に援用されるＦａｖｉｅｒｅｔａｌ．，ＴｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆＤｉｍｅｒｉｃＦｏｒｍｓｏｆＨＬＡ－ＧＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｒｏｔｅｉｎｓ：ＡＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＳｔｕｄｙＩｎＶｉｖｏＰＬＯＳＯｎｅ２０１１を参照されたい。ＨＬＡ－Ｇの例示的な配列は、ＮＧ＿０２９０３９．１として記載される。

本明細書において使用されるように、用語「ＨＬＡ－Ｅ」は、ときにＭＨＣクラスＩ抗原Ｅと称されるＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｅを指す。ヒトにおけるＨＬＡ－Ｅタンパク質は、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子によってコード化される。ヒトＨＬＡ－Ｅは、多型性が乏しいこと及びその古典的パラログよりも細胞表面発現が低いことによって特徴付けられる非古典的ＭＨＣクラスＩ分子である。このクラスＩ分子は、重鎖及び軽鎖（ベータ－２ミクログロブリン）からなるヘテロ二量体である。重鎖は、膜に固定されている。ＨＬＡ－Ｅは、他のクラスＩ分子のリーダーペプチドに起源を有するペプチドの限られたサブセットに結合する。ＨＬＡ－Ｅ発現細胞は、ＮＫ細胞による同種反応及び溶解を逃れる。例えば、内容全体が、参照によって本明細書に援用されるＧｅｏｒｎａｌｕｓｓｅ－Ｇｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１７３５（８）を参照されたい。ＨＬＡ－Ｅタンパク質の例示的な配列は、ＮＭ＿００５５１６．６において提供される。

本明細書において使用されるように、ときに「インテグリン関連タンパク質」（ＩＡＰ）とも称される用語「ＣＤ４７」は、ヒトにおいてＣＤ４７遺伝子によってコード化される膜貫通タンパク質を指す。ＣＤ４７は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、膜インテグリンと組んで、リガンドであるトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）及びシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）に更に結合する。ＣＤ４７は、ＣＤ４７発現細胞が、マクロファージによる攻撃を逃れるのを可能にする、マクロファージに対するシグナルとして作用する。例えば、内容全体が、参照によって本明細書に援用されるＤｅｕｓｅ－Ｔ，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１９３７：２５２－２５８を参照されたい。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、キメラスイッチ受容体を含む（例えば国際公開第２０１８０９４２４４Ａ１号パンフレット－ＴＧＦＢｅｔａＳｉｇｎａｌＣｏｎｖｅｒｔｅｒ；Ａｎｋｒｉｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＴｃｅｌｌｓＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄｔｏｅｘｐｒｅｓｓａｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ１／２８ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅｄｉｓｐｌａｙｅｎｈａｎｃｅｄａｎｔｉｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｏｃｔｏｂｅｒ１５，２０１３，１９１；Ｒｏｔｈｅｔａｌ．，Ｐｏｏｌｅｄｋｎｏｃｋｉｎｔａｒｇｅｔｉｎｇｆｏｒｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｃｅｌｌ．２０２０Ａｐｒ３０；１８１（３）：７２８－７４４．ｅ２１；及びＢｏｙｅｒｉｎａｓｅｔａｌ．，ＡＮｏｖｅｌＴＧＦ－β２／ＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎＲｅｃｅｐｔｏｒＳｉｇｎａｌＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎＰｌａｔｆｏｒｍＴｈａｔＰｒｏｔｅｃｔｓＣＡＲ／ＴＣＲＴＣｅｌｌｓｆｒｏｍＴＧＦ－β２－ＭｅｄｉａｔｅｄＩｍｍｕｎｅＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＩｎｄｕｃｅｓＴＣｅｌｌＳｕｐｐｏｒｔｉｖｅＳｉｇｎａｌｉｎｇＮｅｔｗｏｒｋｓ，Ｂｌｏｏｄ，２０１７を参照されたい）。いくつかの実施形態において、キメラスイッチ受容体は、内因性細胞表面受容体に由来する細胞外ドメイン及び異種細胞内シグナル伝達ドメインを含む、操作された細胞表面受容体であり、そのため、細胞外ドメインによるリガンド認識は、細胞表面受容体の野生型形態によって活性化されるものと比べて、異なるシグナル伝達カスケードの活性化をもたらす。いくつかの実施形態において、キメラスイッチ受容体は、結果として、阻害性細胞表面受容体によって通常伝達される阻害性シグナルではなく、活性化シグナルを伝える細胞内ドメインに融合された阻害性細胞表面受容体の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞の活性化を阻害することが知られている細胞表面受容体に起源を有する細胞外ドメインは、活性化細胞内ドメインに融合することができる。このような実施形態において、対応するリガンドが結びつくと、次に、免疫エフェクター細胞の活性化を阻害するのではなく、増加させるシグナル伝達カスケードが活性化され得る。例えば、いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、ＰＤ１－ＣＤ２８スイッチ受容体であり、ＰＤ１の細胞外ドメインは、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインに融合される（例えばＬｉｕｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７６：６（２０１６），１５７８－１５９０及びＭｏｏｎｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２２（２０１４），Ｓ２０１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、目的のコード化遺伝子産物は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン及びＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインであるか又はそれを含む（Ｏｄａｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１３０：２２（２０１７），２４１０－２４１９を参照されたい）。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、レポーター遺伝子（例えばＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）である。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子は、ノックインカセットの発現量の適性を確認するために利用される。ある実施形態において、目的の遺伝子産物は、青色／ＵＶタンパク質、例えばＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａｌ、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ；青緑色タンパク質、例えばＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、単量体Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰｌ；緑色タンパク質、例えばＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＳｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒＧＦＰ、ＭｏｎｏｍｅｒｉｃＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ；黄色タンパク質、例えばＥＹＦＰ，Ｃｉｔｒｉｎｅ，Ｖｅｎｕｓ，ＳＹＦＰ２，ＴａｇＹＦＰ；橙黄色タンパク質、例えばＭｏｎｏｍｅｒｉｃＫｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯＫ、ｍＫ０２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍ０ｒａｎｇｅ２；赤色タンパク質、例えばｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２；遠赤色タンパク質、例えばｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ；近赤外タンパク質、例えばＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰｌ．４、ｉＲＦＰ；ストークスシフトが長いタンパク質、例えばｍＫｅｉｍａＲｅｄ、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅｌ、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ２、ｍＢｅＲＦＰ；光励起タンパク質、例えばＰＡ－ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙｌ、ＰＡＴａｇＲＦＰ；光変換タンパク質、例えばＫａｅｄｅ（緑色）、Ｋａｅｄｅ（赤色）、ＫｉｋＧＲｌ（緑色）、ＫｉｋＧＲｌ（赤色）、ＰＳ－ＣＦＰ２、ＰＳ－ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（緑色）、ｍＥｏｓ２（赤色）、ｍＥｏｓ３．２（緑色）、ｍＥｏｓ３．２（赤色）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、光切換可能なタンパク質、例えばＤｒｏｎｐａ及びその組み合わせなどの有色又は蛍光タンパク質であり得る。

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される目的の遺伝子は、任意選択で、タンパク質発現の一時的な及び／又は空間的なコントロールのために、不安定化ドメインをコード化する配列（「不安定化配列」）を含むことができる。不安定化配列の非限定的な例は、ＦＫ５０６配列、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）配列をコード化する配列又は他の例示的な不安定化配列を含む。

安定化リガンドの非存在下において、不安定化配列が作動可能に連結したタンパク質配列は、ユビキチン化によって分解される。対照的に、安定化リガンドの存在下において、タンパク質分解は、阻害され、それにより不安定化配列が作動可能に連結したタンパク質配列が活発に発現されるのを可能にする。タンパク質発現の安定化についてのポジティブコントロールとして、タンパク質発現は、酵素、ラジオグラフィック、比色、蛍光又は他の分光アッセイ；蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイ；免疫学的アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び免疫組織化学的検査）を含む従来の手段によって検出することができる。

不安定化配列の追加の例は、当技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、不安定化配列は、ＦＫ５０６及びラパマイシン結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）配列であり、安定化リガンドは、Ｓｈｉｅｌｄ－１（Ｓｈｌｄ１）である（参照によって本明細書においてその全体が援用されるＢａｎａｓｚｙｎｓｋｉｅｔａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ１２６（５）：９９５－１００４）。いくつかの実施形態において、不安定化配列は、ＤＨＦＲ配列であり、安定化リガンドは、トリメトプリム（ＴＭＰ）である（参照によって本明細書においてその全体が援用されるＩｗａｍｏｔｏｅｔａｌ．（２０１０）ＣｈｅｍＢｉｏｌ１７：９８１－９８８）。いくつかの実施形態において、不安定化ドメインは、小分子支援シャットオフ（ＳＭＡＳｈ）であり、Ｃ型肝炎ウイルスに起源を有するプロテアーゼ及びその対応する切断部位と恒常的なデグロンが、組み合わせられている。いくつかの実施形態において、不安定化ドメインは、ＨａｌｏＴａｇシステム、ｄＴａｇシステム及び／又はナノボディを含む（例えばＬｕｈｅｔａｌ．，Ｐｒｅｙｆｏｒｔｈｅｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ：ｔａｒｇｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ－ａｍｅｄｉｃｉｎａｌｃｈｅｍｉｓｔ’ｓｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ；ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅ，２０２０を参照されたい）。

いくつかの実施形態において、不安定化配列は、本明細書において記載されるように修飾された細胞を一時的にコントロールするために使用することができる。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、自殺遺伝子であり得る（例えばＺａｒｏｇｏｕｌｉｄｉｓｅｔａｌ．，ＳｕｉｃｉｄｅＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＣａｎｃｅｒ－ＣｕｒｒｅｎｔＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ；ＪＧｅｎｅｔＳｙｎｄｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０１３を参照されたい）。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ）によるアプローチ、二量体化を誘導するアプローチ及び／又は治療用モノクローナル抗体によって媒介されるアプローチを使用することができる。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、生物学的に不活性であり、適切な生体利用効率プロファイル、適切な体内分布プロファイルを有し、且つ本来備わっている許容される毒性及び／又は毒性の不在によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、細胞レベルで、非毒性のプロドラッグを毒性の産物に変換することが可能なタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、本明細書において記載される細胞の安全性プロファイルを改善し得る（例えばＧｒｅｃｏｅｔａｌ．，ＩｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｓａｆｅｔｙｏｆｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙｗｉｔｈｔｈｅＴＫ－ｓｕｉｃｉｄｅｇｅｎｅ；ＦｒｏｎｔＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１５；Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｓａｆｅｔｙｏｆｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙｓｕｉｃｉｄｅｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦｒｏｎｔｉｅｒｓＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１４を参照されたい）。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）である。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）である。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、アポトーシス遺伝子（例えばカスパーゼ）である。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、二量体化を誘導する、例えば誘導性ＦＡＳ（ｉＦＡＳ）又は誘導性Ｃａｓｐａｓｅ９（ｉＣａｓｐ９）／ＡＰ１９０３システムを含む。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、ＣＤ２０抗原であり、このような抗原を発現する細胞は、臨床グレードの抗ＣＤ２０抗体の投与によって排除することができる。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、医薬グレードの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えばセツキシマブに対する感受性を付与する、切り詰められたヒトＥＧＦＲポリペチド（ｈｕＥＧＦＲｔ）である。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、医薬グレードの抗ｃｍｙｃ抗体に対する感受性を付与するｃ－ｍｙｃタグである。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、安全スイッチシグナルであり得る。細胞療法において、安全スイッチは、遺伝子修飾された細胞の増殖を、患者におけるそれらの存在が望ましくない場合、例えば細胞が適切に機能しない場合、予定された治療介入を変更する場合又は治療目的が達成された場合、停止させるために使用することができる。いくつかの実施形態において、安全スイッチは、例えば、いわゆる自殺遺伝子又は自殺スイッチであり得、医薬化合物の患者への投与に応じて、細胞がアポトーシスに入るように活性化又は不活性化されるであろう。ときに自殺スイッチ又は安全スイッチと呼ばれる自殺遺伝子は、細胞的事象、環境的事象又は化学薬品が引き金となり又はそれによって活性化され、自殺遺伝子がゲノムに組み込まれた細胞による細胞応答をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、安全スイッチの活性化は、細胞のアポトーシスを誘導する。いくつかの実施形態において、安全スイッチの活性化は、安全スイッチが組み込まれた細胞の成長を阻害する。いくつかの実施形態において、自殺スイッチは、ヒト細胞において無害な物質を毒性の代謝物に変換する、ヒトにおいて見つけられない酵素（例えば、細菌又はウイルスの酵素）をコード化し得る。自殺スイッチの例は、限定を伴うことなく、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、細胞内抗体、テロメラーゼ、毒素、カスパーゼ（例えばｉＣａｓｐａｓｅ９）及びＨＳＶ－ＴＫ並びにＤＮアーゼの遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に由来するチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子であり得、自殺ＴＫ遺伝子は、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ファムシクロビル又は他の同種のものの患者への投与に応じて細胞に対して毒性になる。

いくつかの実施形態において、安全スイッチは、ラパマイシン誘導性ヒトカスパーゼ９ベースの（ＲａｐａＣａｓｐ９）細胞自殺スイッチであり得、ＣＡＲＤドメインが除去されている、切り詰められたカスパーゼ９遺伝子は、ｍＴＯＲのＦＲＢ（ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合）ドメイン又はＦＫＢＰ１２（ＦＫ５０６結合タンパク質１２）の後に連結される。薬剤であるラパマイシンの追加は、ＦＲＢ及びＦＫＢＰ１２のヘテロ二量体化を可能にし、これは、続いて、切り詰められたカスパーゼ９のホモ二量体化及びアポトーシスの誘導を引き起こす。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される２つの構築物による及び／又は両アレルアプローチを使用し、ＦＲＢ及びＦＫＢＰ１２は、一方は１つ以上の導入遺伝子とＦＲＢを有し、他方は１つ以上の導入遺伝子とＦＫＢＰ１２を有する２つのドナー構築物を組み込むことにより、異なるアレル上に分けられる。本願において安全スイッチについて言及するとき、安全スイッチの機能にとって必要な全ての構成要素を含むものと解釈されなければならない（例えば、ＦＲＢドメイン及びＦＫＢＰ１２ドメイン及び切り詰められたカスパーゼ９遺伝子は、安全スイッチの全ての構成要素であり、それを構成する）。
配列番号１６０－例示的なＤＨＦＲ不安定化アミノ酸配列

配列番号１６１－例示的なＤＨＦＲ不安定化ヌクレオチド配列

配列番号１６２－例示的な不安定化ドメイン

配列番号１６３－例示的なＦＫＢＰ１２不安定化ペプチドアミノ酸配列
ＭＧＶＥＫＱＶＩＲＰＧＮＧＰＫＰＡＰＧＱＴＶＴＶＨＣＴＧＦＧＫＤＧＤＬＳＱＫＦＷＳＴＫＤＥＧＱＫＰＦＳＦＱＩＧＫＧＡＶＩＫＧＷＤＥＧＶＩＧＭＱＩＧＥＶＡＲＬＲＣＳＳＤＹＡＹＧＡＧＧＦＰＡＷＧＩＱＰＮＳＶＬＤＦＥＩＥＶＬＳＶＱ

いくつかの実施形態において、単一の目的の遺伝子産物のコード配列は、ノックインカセットに含まれ得る。いくつかの実施形態において、２つの目的の遺伝子産物のコード配列は、単一のノックインカセットに含まれ得；いくつかの実施形態において、これは、２シストロン性又は多シストロン性構築物と称され得る。いくつかの実施形態において、３つ以上の目的の遺伝子産物のコード配列は、単一のノックインカセットに含まれ得；いくつかの実施形態において、これは、多シストロン性構築物と称され得る。いくつかの実施形態において、２つ以上の目的の遺伝子産物の２つ以上のコード配列がノックインカセットに含まれるとき、これらの配列は、それらをつなぐリンカー配列を有し得る。リンカー配列は、一般に、当技術分野において知られており、例示的なリンカー配列は、配列番号１６４において同定される。いくつかの実施形態において、２つ以上の目的の遺伝子産物の２つ以上のコード配列がノックインカセットに含まれる場合、これらの配列は、リンカー配列、ＩＲＥＳ及び／又は２Ａエレメントによってつながれ得る。

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物をコード化するオリゴヌクレオチドは、配列番号１６１、１６２又は１６４～１８２のいずれか１つの配列を含む又はそれからなる。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、配列番号１６１、１６２又は１６４～１８２のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一である配列を含む又はそれからなる。
配列番号１６４－例示的なリンカー配列
ＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＣＴＧＣＡＡ
配列番号１６５－例示的なＣＤ１６ノックインカセット配列

配列番号１６６－例示的なＣＤ１６ノックインカセット配列

配列番号１６７－例示的なＣＤ４７ノックインカセット配列

配列番号１６８－例示的なＩＬ１５ノックインカセット配列

配列番号１６９－例示的なＩｇＥ－ＩＬ１５ノックインカセット配列

配列番号１７０－例示的なＩｇＥ－ＩＬ１５プロペプチドカーゴ配列

配列番号１７１－例示的なＩＬ１５Ｒαカーゴ配列

配列番号１７２－例示的なｍｂＩＬ－１５カーゴ配列

配列番号１７３－例示的なｍｂＩＬ－１５カーゴ配列

配列番号１７４－例示的な多シストロン性ＣＤ１６，ｍｂＩＬ－１５カーゴ配列

配列番号１７５－例示的なＣＤ１９ＣＡＲカーゴ配列

配列番号１７６－例示的なＥＧＦＲＣＡＲカーゴ配列

配列番号１７７－例示的なＧＦＰカーゴ配列

配列番号１７８－例示的なＣＸＣＲ１カーゴ配列

配列番号１７９－例示的なＣＸＣＲ３Ｂカーゴ配列

配列番号１８０－例示的なＣＸＣＲ３Ａカーゴ配列

配列番号１８１－例示的なＣＣＲ５カーゴ配列

配列番号１８２－例示的なＣＣＲ２カーゴ配列

いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、配列番号１６１、１６４又は１８３～２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含む又はそれからなる。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子産物は、配列番号１６１、１６４又は１８３～２００のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる。
配列番号１８３－例示的なリンカーアミノ酸配列
ＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱ
配列番号１８４－例示的なＣＤ１６アミノ酸配列

配列番号１８５－例示的なＣＤ４７アミノ酸配列

配列番号１８６－例示的なＩＬ１５アミノ酸配列
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
配列番号１８７－例示的なＩｇＥ－ＩＬ１５アミノ酸配列

配列番号１８８－例示的なＩｇＥ－ＩＬ１５プロペプチドアミノ酸配列

配列番号１８９－例示的なＩＬ１５Ｒαアミノ酸配列

配列番号１９０－例示的なｍｂＩＬ－１５アミノ酸配列

配列番号１９１－例示的なｍｂＩＬ－１５アミノ酸配列

配列番号１９２－例示的な多シストロン性ＣＤ１６，ｍｂＩＬ－１５アミノ酸配列

配列番号１９３－例示的なＣＤ１９ＣＡＲアミノ酸配列

配列番号１９４－例示的なＥＧＦＲＣＡＲアミノ酸配列

配列番号１９５－例示的なＧＦＰアミノ酸配列

配列番号１９６－例示的なＣＸＣＲ１アミノ酸配列

配列番号１９７－例示的なＣＸＣＲ３Ｂアミノ酸配列

配列番号１９８－例示的なＣＸＣＲ３Ａアミノ酸配列

配列番号１９９－例示的なＣＣＲ５アミノ酸配列

配列番号２００－例示的なＣＣＲ２カーゴ配列

ＡＡＶカプシド
いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＡＶカプシド中にパッケージされる１つ以上のポリヌクレオチド構築物（例えばノックインカセット）を提供する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０セロタイプのＡＡＶカプシド又はその１つ以上のハイブリッドに由来するか又はそれに起源を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ祖先セロタイプに由来する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、祖先（Ａｎｃ）ＡＡＶカプシドである。Ａｎｃカプシドは、見込みがある祖先配列を決定するために進化の確率及び進化モデリングを使用して構築される構築配列から生成される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、当技術分野において知られているやり方で修飾されている（例えばＢｕｅｎｉｎｇａｎｄＳｒｉｖａｓｔａｖａ，ＣａｐｓｉｄｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔａｒｇｅｔｉｎｇａｎｄｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆＡＡＶｖｅｃｔｏｒｓ，ＭｏｌＴｈｅｒＭｅｔｈｏｄｓＣｌｉｎＤｅｖ．２０１９を参照されたい）

いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるように、ＡＡＶカプシド及びＡＡＶ構築物（例えば、ＡＡＶＩＴＲを含む）のいずれかの組み合わせは、本開示の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子において使用され得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶ２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のＡＡＶＩＴＲに由来するか又はそれに起源を有する。例えば、野生型又は変異ＡＡ６ＩＴＲ及びＡＡＶ６カプシド、野生型又は変異ＡＡＶ２ＩＴＲ及びＡＡＶ６カプシドなど。本開示のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、全体として、ＡＡＶ６構成要素からなる（例えば、カプシド及びＩＴＲは、ＡＡＶ６セロタイプである）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ６／２、ＡＡＶ６／８又はＡＡＶ６／９粒子である（例えば、ＡＡＶ６ＩＴＲを有するＡＡＶ構築物を有するＡＡＶ２、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９カプシド）。

例示的なＡＡＶ構築物
いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、ＡＡＶ構築物内に含まれる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ構築配列は、配列番号２０１～２０４のいずれか１つの配列を含む又はそれからなる。いくつかの実施形態において、例示的なＡＡＶ構築物は、配列番号２０１によって表される。いくつかの実施形態において、例示的なＡＡＶ構築物は、配列番号２０２によって表される。いくつかの実施形態において、例示的なＡＡＶ構築物は、配列番号２０３によって表される。いくつかの実施形態において、例示的なＡＡＶ構築物は、配列番号２０４によって表される。いくつかの実施形態において、例示的なＡＡＶ構築物は、配列番号２０１～２０４によって表される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一である。
配列番号２０１－ＧＡＰＤＨ遺伝子座でのドナー鋳型挿入のための例示的なＡＡＶ構築物

配列番号２０２－ＧＡＰＤＨ遺伝子座でのドナー鋳型挿入のための例示的なＡＡＶ構築物

配列番号２０３－ＧＡＰＤＨ遺伝子座でのドナー鋳型挿入のための例示的なＡＡＶ構築物

配列番号２０４－ＧＡＰＤＨ遺伝子座でのドナー鋳型挿入のための例示的なＡＡＶ構築物

例示的なドナー鋳型配列
いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、５’から３’に向けて、標的配列５’相同性アーム（任意選択で、野生型配列でない最適化配列を含む）、別個の翻訳産物としてカーゴ配列の発現を可能にする第２の調節エレメント（例えば、ＩＲＥＳ配列及び／又は２Ａエレメント）、カーゴ配列（例えば、目的の遺伝子産物）、任意選択で、別個の翻訳産物としてカーゴ配列の発現を可能にする第２の調節エレメント（例えば、ＩＲＥＳ配列及び／又は２Ａエレメント）、任意選択で第２のカーゴ配列（例えば、目的の遺伝子産物）、任意選択で３’ＵＴＲ、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＢＧＨｐＡシグナル）並びに標的配列３’相同性アーム（任意選択で、野生型配列でない最適化配列を含む）を含む。

いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号３８～５７及び２０５～２１８のいずれか１つの配列を含む又はそれからなる。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号３８～５７及び２０５～２１８のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一である配列を含む又はそれからなる。
配列番号３８－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号３９－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号４０－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号４１－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号４２－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号４３－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号４４－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号４５－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号４６－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号４７－ＴＢＰ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号４９－ＴＢＰ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号５０－ＴＢＰ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号５１－Ｇ６ＰＤ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号５２－Ｅ２Ｆ４遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号５３－Ｅ２Ｆ４遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号５４－Ｅ２Ｆ４遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号５５－ＫＩＦ１１遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号５６－ＫＩＦ１１遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号５７－ＫＩＦ１１遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号４８－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２０５－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２０６－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２０７－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２０８－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２０９－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２１０－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２１１－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２１２－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２１３－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２１４－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２１５－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２１６－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２１７－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

配列番号２１８－ＧＡＰＤＨ遺伝子座での挿入のための例示的なドナー鋳型

ヌクレアーゼ
細胞の必須遺伝子の内因性コード配列内の破壊を引き起こす任意のヌクレアーゼを、本開示の方法において使用することができる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＤＮＡヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、例えば「プライム編集」システムにおいて、細胞の必須遺伝子の内因性コード配列内で、一本鎖破壊（ＳＳＢ）を引き起こす。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、細胞の必須遺伝子の内因性コード配列内で二本鎖破壊（ＤＳＢ）を引き起こす。いくつかの実施形態において、二本鎖破壊は、単一のヌクレアーゼによって引き起こされる。いくつかの実施形態において、二本鎖破壊は、それぞれが逆の鎖に対して一本鎖破壊を引き起こす２つのヌクレアーゼ、例えば、デュアル「ニッカーゼ」システムによって引き起こされる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、及び方法は、細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの１つ以上のガイド分子と接触させることを更に含む。例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及びガイド分子は、本明細書において更に詳細に記載される。ヌクレアーゼ（ニッカーゼを含む）は、一切限定されず、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ若しくは当技術分野において知られている他のヌクレアーゼ（又はその組み合わせ）でもあり得ることが理解されるべきである。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を設計するための方法は、当技術分野においてよく知られており、例えばＵｒｎｏｖｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＧｅｎｅｔｉｃｓ２０１０；１１：６３６－６４０ａｎｄＰａｓｃｈｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１９；１０（１）：１１３３及びその中で引用される参考文献を参照されたい。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を設計するための方法は、当技術分野においてよく知られており、例えばＪｏｕｎｇａｎｄＳａｎｄｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．２０１３；１４（１）：４９－５５及びその中で引用される参考文献を参照されたい。メガヌクレアーゼを設計するための方法も当技術分野においてよく知られており、例えばＳｉｌｖａｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０１１；１１（１）：１１－２７及びＲｅｄｅｌａｎｄＰｒａｔｈｅｒ，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２０１６；４４（３）：４２８－４３３を参照されたい。

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約５０％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約５５％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約６０％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約６５％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約７０％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約７５％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約８０％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約８５％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約９０％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約９５％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約９６％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約９７％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約９８％を超える編集効率を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に適したヌクレアーゼは、約９９％を超える編集効率を有することができる。

普通、ヌクレアーゼは、タンパク質又はタンパク質をコード化する核酸、例えばＤＮＡ分子又はｍＲＮＡ分子として細胞に送達することができる。タンパク質又は核酸は、他の送達剤、例えば、脂質若しくはポリマーナノ粒子中の脂質若しくはポリマー及び抗体などのターゲティング剤又は細胞に対して特異性を有する他の結合剤と組み合わせることができる。ＤＮＡ分子は、ウイルスゲノム又は環状二本鎖ＤＮＡ、例えばプラスミドなどの核酸ベクターであり得る。ヌクレアーゼをコード化する核酸ベクターは、他のコード又は非コードエレメントを含むことができる。例えば、ヌクレアーゼは、あるゲノムバックボーンエレメント（例えば、ＡＡＶゲノムの場合、逆方向末端反復）を含むウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス又はレンチウイルスゲノムにおける）の一部として送達することができる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、タンパク質又はタンパク質をコード化する核酸、例えばＤＮＡ分子又はｍＲＮＡ分子として細胞に送達することができる。ガイド分子は、ＲＮＡ分子として送達することができるか又はＤＮＡ分子によってコード化することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）としてガイド分子と共に送達し、ヌクレオフェクション（エレクトロポレーション）を介して細胞に導入することもできる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ
本開示に従うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９及びＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）などの自然発生のクラス２ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ並びに他のＣａｓ１２ヌクレアーゼ及びそれに起源を有するか又はそれから入手されるヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。機能的観点から言えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、（ａ）ｇＲＮＡと相互作用する（例えば、それと複合体を形成する）；並びに（ｂ）ｇＲＮＡと一緒に、（ｉ）ｇＲＮＡのターゲティングドメインと相補的な配列及び任意選択で、（ｉｉ）下記により詳細に記載される「プロトスペーサー隣接モチーフ」又は「ＰＡＭ」と称される追加の配列を含むＤＮＡの標的領域と合体し、任意選択で切断又は修飾するヌクレアーゼとして定義される。以下の実施例が示すように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、同じＰＡＭ特異性又は切断活性を共有する個々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ間でばらつきが存在し得るが、大まかに言えば、それらのＰＡＭ特異性及び切断活性によって定義することができる。当業者は、本開示のいくつかの態様が、あるＰＡＭ特異性及び／又は切断活性を有する任意の適したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを使用して実施することができるシステム及び方法に関することを認めるであろう。こういった理由で、特に明記しない限り、用語ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、総称として理解されるべきであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの任意の特定のタイプ（例えば、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１）、種（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又はＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））又は変形（例えば、完全長か切り詰められているか若しくは分断されているか；又は自然発生のＰＡＭ特異性か操作されたＰＡＭ特異性かなど）に限定されるべきではない。

ＰＡＭ配列は、ｇＲＮＡターゲティングドメイン（又は「スペーサー」）と相補的である「プロトスペーサー」配列とのその配列の関係性からその名をとっている。プロトスペーサー配列と一緒に、ＰＡＭ配列は、特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡの組み合わせにとっての標的領域又は配列を定める。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが違うと、ＰＡＭとプロトスペーサーとの間の異なる配列の関係性を必要とし得る。普通、Ｃａｓ９は、プロトスペーサーの３’側にあるＰＡＭ配列を認識する。他方、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）は、一般に、プロトスペーサーの５’側にあるＰＡＭ配列を認識する。

ＰＡＭ及びプロトスペーサーの特異的な配列の向きを認識することに加えて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、特異的なＰＡＭ配列を認識することもできる。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９は、例えば、ＮＮＧＲＲＴ又はＮＮＧＲＲＶのＰＡＭ配列を認識し、Ｎ残基は、ｇＲＮＡターゲティングドメインによって認識される領域の３’側すぐのところにある。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９は、ＮＧＧＰＡＭ配列を認識する。Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣｐｆ１は、ＴＴＮＰＡＭ配列を認識する。ＰＡＭ配列は、種々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼについて同定されており、新規なＰＡＭ配列を同定するための戦略は、Ｓｈｍａｋｏｖｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ２０１５；６０：３８５－３９７によって記載されている。操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、基準分子のＰＡＭ特異性と異なるＰＡＭ特異性を有し得ることにも留意されたい（例えば、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの場合、基準分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが起源を有する自然発生の変異体又は操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼに対して最も高いアミノ酸配列相同性を有する自然発生の変異体であり得る）。

それらのＰＡＭ特異性に加えて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、それらのＤＮＡ切断活性によって特徴付けることができる：自然発生のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、典型的に、標的核酸において二本鎖破壊（ＤＳＢ）を形成するが、一本鎖破壊（ＳＳＢ）のみを作製する「ニッカーゼ」と呼ばれる操作された変異体、例えば、Ｒａｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ２０１３；１５４（６）：１３８０－１３８９（“Ｒａｎ”）において述べられるもの又は全くカットしないものが、産生されている。

Ｃａｓ９
結晶構造が、一分子ガイドＲＮＡ及び標的ＤＮＡと複合体を形成したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９について（Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１４；３４３（６１７６）：１２４７９９７（“Ｊｉｎｅｋ２０１４”）及びＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９について決定されている。Ｎｉｓｈｉｍａｓｕｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１０２４；１５６：９３５－９４９（“Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ２０１４”）；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ２０１５；１６２：１１１３－１１２６（“Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ２０１５”）；及びＡｎｄｅｒｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２０１４；５１３（７５１９）：５６９－７３（“Ａｎｄｅｒｓ２０１４”）を参照されたい。

自然発生のＣａｓ９タンパク質は、２つのローブ：認識（ＲＥＣ）ローブ及びヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含む；これらのそれぞれは、特定の構造及び／又は機能ドメインを含む。ＲＥＣローブは、アルギニンリッチブリッジヘリックス（ＢＨ）ドメイン及び少なくとも１つのＲＥＣドメイン（例えば、ＲＥＣ１ドメイン及び任意選択で、ＲＥＣ２ドメイン）を含む。ＲＥＣローブは、他の知られているタンパク質と構造の類似性を共有せず、それが他と重複しない機能ドメインであることを示す。いかなる理論によっても束縛されることを望まないが、突然変異解析は、ＢＨ及びＲＥＣドメインについて、特異的な機能的役割を示唆する：ＢＨドメインは、ｇＲＮＡ：ＤＮＡの認識において役割を果たすと思われるが、ＲＥＣドメインは、ｇＲＮＡのリピート：アンチリピート二重鎖と相互作用し、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を媒介すると考えられる。

ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン及びＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーメンバーと構造の類似性を共有し、標的核酸の非相補（即ち下の）鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、２つ以上の分断ＲｕｖＣモチーフから形成され得る（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）においてＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ及びＲｕｖＣＩＩＩなど）。ＨＮＨドメインは、一方、ＨＮＮエンドヌクレアーゼモチーフと構造的に類似しており、標的核酸の相補（即ち上の）鎖を切断する。ＰＩドメインは、その名が示唆するように、ＰＡＭ特異性の一因となる。

Ｃａｓ９のある機能は、上記に記載される特異的なドメインに関連付けられる（それにより必ずしも完全に決定されるわけではないが）が、これらの及び他の機能は、他のＣａｓ９ドメイン又はいずれかのローブ上の複数のドメインによって媒介又は影響され得る。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９において、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ２０１４において記載されるように、ｇＲＮＡのリピート：アンチリピート二重鎖は、ＲＥＣとＮＵＣローブとの間の溝にはまり、二重鎖中のヌクレオチドは、ＢＨ、ＰＩ及びＲＥＣドメイン中のアミノ酸と相互作用する。第２及び第３のステムループ中のいくつかのヌクレオチド（ＲｕｖＣ及びＰＩドメイン）のように、第１のステムループ構造中のいくつかのヌクレオチドも複数のドメイン（ＰＩ、ＢＨ及びＲＥＣ１）中のアミノ酸と相互作用する。

Ｃｐｆ１
ｃｒＲＮＡ及びＴＴＴＮＰＡＭ配列を含むｄｓＤＮＡ標的と複合体を形成したアシダミノコッカス種Ｃｐｆ１の結晶構造は、Ｙａｍａｎｏｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１６；１６５（４）：９４９－９６２（“Ｙａｍａｎｏ”）によって解かれた。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のように、２つのローブ：ＲＥＣ（認識）ローブ及びＮＵＣ（ヌクレアーゼ）ローブを有する。ＲＥＣローブは、ＲＥＣ１及びＲＥＣ２ドメインを含み、いかなる知られているタンパク質構造とも類似性を欠く。ＮＵＣローブは、一方、３つのＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ－Ｉ、－ＩＩ及び－ＩＩＩ）並びにＢＨドメインを含む。しかしながら、Ｃａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１ＲＥＣローブは、ＨＮＨドメインを欠き、知られているタンパク質構造との類似性をまた欠く他のドメイン：構造的に他と重複しないＰＩドメイン、３つのＷｅｄｇｅ（ＷＥＤ）ドメイン（ＷＥＤ－Ｉ、－ＩＩ及び－ＩＩＩ）並びにヌクレアーゼ（Ｎｕｃ）ドメインを含む。

Ｃａｓ９及びＣｐｆ１は、構造及び機能において類似性を共有するが、あるＣｐｆ１活性は、いかなるＣａｓ９ドメインにも似ていない構造ドメインによって媒介されることが認められるべきである。例えば、標的ＤＮＡの相補鎖の切断は、Ｎｕｃドメインによって媒介されるように思われ、これは、配列も場所も、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインと異なる。加えて、Ｃｐｆ１ｇＲＮＡの非ターゲティング部分（ハンドル）は、Ｃａｓ９ｇＲＮＡにおけるリピート：アンチリピート二重鎖によって形成されるステムループ構造の代わりに、シュードノット構造をとる。

ヌクレアーゼ変異体
本明細書において記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、種々の用途において有用となり得る活性及び特性を有するが、当業者は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが、ある例では、切断活性、ＰＡＭ特異性又は他の構造的若しくは機能的特徴を改変するために修飾することもできることを認めるであろう。

最初に、切断活性を改変する修飾に目を向けると、ＮＵＣローブ内のドメインの活性を低下させるか又は排除する突然変異は、上記に記載した。ＲｕｖＣドメイン、Ｃａｓ９ＨＮＨドメイン又はＣｐｆ１Ｎｕｃドメインにおいてなされ得る例示的な突然変異は、Ｒａｎ、Ｙａｍａｎｏ及び国際公開第２０１６／０７３９９０Ａ１号パンフレットにおいて記載されており、これらのそれぞれの全内容は、参照によって本明細書において援用される。普通、２つのヌクレアーゼドメインの１つの活性を低下させるか又は排除する突然変異は、ニッカーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをもたらすが、ニッカーゼ活性のタイプは、どのドメインが不活性化されるかに依存して変わることに留意されたい。一例として、ＲｕｖＣドメインの又はＣａｓ９ＨＮＨドメインの不活性化は、ニッカーゼをもたらす。例示的なニッカーゼ変異体は、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ及びＣａｓ９Ｈ８４０Ａを含む（ＳｐＣａｓ９野生型配列に従う付番方式）。Ｃａｓ１２ａ変異体を含む追加の適したニッカーゼ変異体は、本開示及び当技術分野における知識に基づいて当業者に明らかであろう。本開示は、この点で限定されない。いくつかの実施形態において、ニッカーゼは、例えば、内容全体が、参照によって本明細書に援用されるＡｎｚａｌｏｎｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２０１９；５７６：１４９－１５７において記載されるように、プライムエディター（ＰＥ）を産生するために逆転写酵素に融合され得る。

自然発生のＣａｓ９基準分子に関するＰＡＭ特異性の修飾は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２０１５；５２３（７５６１）：４８１－５）；及びＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３３（１２）：１２９３－１２９８）の両方において記載される。Ｃａｓ９のターゲティング忠実度を改善する修飾も記載される（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２０１６；５２９：４９０－４９５）。これらの参考文献のそれぞれは、本明細書において参照によって援用される。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、参照によって援用されるＺｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３３（２）：１３９－４２によって及び参照によって援用されるＦｉｎｅｅｔａｌ．，ＳｃｉＲｅｐ．２０１５；５：１０７７７によって記載されるように、２つ以上の部分にも分割される。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ある実施形態において、ｇＲＮＡとの関連、標的及びＰＡＭの認識並びに切断活性をなお保持しながら、例えば、ヌクレアーゼのサイズを低下させる１つ以上の欠失を介して、サイズを最適化するか又は切り詰めることができる。ある実施形態において、ＲＮＡによって導かれるヌクレアーゼは、別のポリペチド、ヌクレオチド又は他の構造に、任意選択でリンカーを用いて共有結合又は非共有結合される。例示的な結合されるヌクレアーゼ及びリンカーは、Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２０１４；３２：５７７－５８２によって記載され、これは、本明細書において参照によって援用される。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、任意選択で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼタンパク質の核中への移動を促すために、これに限定されないが、核移行シグナルなどのタグも含む。ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃ－及び／又はＮ－末端核移行シグナルを組み込むことができる。核移行配列は、当技術分野において知られている。

修飾の前述のリストは、事実上、例示的なものであることが意図され、当業者は、本開示を考慮して、他の修飾がある用途において可能であるか又は望ましい場合があることを認めるであろう。簡潔にするために、そのため、本開示の例示的なシステム、方法及び組成物は、特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼに関して提示されるが、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、それらの作動原理を改変しない方法で修飾され得ることが理解されるべきである。このような修飾は、本開示の範囲内にある。

例示的な適したヌクレアーゼ変異体は、Ｍ５３７Ｒ置換、Ｈ８００Ａ置換及び／若しくはＦ８７０Ｌ置換又はそのいずれかの組み合わせを含むＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）変異体を含むが、これらに限定されない（ＡｓＣｐｆ１野生型配列に従う付番方式）。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ変異体は、Ｃａｓ１２ａ変異体、例えば、Ｍ５３７Ｒ、Ｆ８７０Ｌ及びＨ８００Ａから選択されるアミノ酸置換の１、２又は３つを含むＣａｓ１２ａ変異体である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ａ変異体は、本明細書において記載されるＡｓＣｐｆ１配列に対して、少なくとも約９０％、９５％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ＡｓＣｐｆ１アミノ酸配列の他の適した修飾は、当業者に知られている。野生型ＡｓＣｐｆ１及びＡｓＣｐｆ１変異体のいくつかの例示的な配列は、下記に提供される：
配列番号５８－Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳＨ８００Ａアミノ酸配列

配列番号５９－Ｃｐｆ１変異体１アミノ酸配列

配列番号６０－Ｃｐｆ１変異体２アミノ酸配列

配列番号６１－Ｃｐｆ１変異体３アミノ酸配列

配列番号６２－Ｃｐｆ１変異体４アミノ酸配列

配列番号６３－Ｃｐｆ１変異体５アミノ酸配列

配列番号６４－Ｃｐｆ１変異体６アミノ酸配列

配列番号６５－Ｃｐｆ１変異体７アミノ酸配列

配列番号６６－例示的なＡｓＣｐｆ１野生型アミノ酸配列

追加の適したヌクレアーゼ及びヌクレアーゼ変異体は、当技術分野における知識を考慮し、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。例示的な適したヌクレアーゼは、表５において提供されるものを含むが、これらに限定されない。

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子
本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、一分子（単一のＲＮＡ分子を含み、代わりにキメラと称される）又はモジュラー（例えば二重鎖を形成することによって通常、互いに合体する、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡなどの２つ以上、典型的には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）である。ｇＲＮＡ及びそれらの構成部分は、文献の全体にわたって、例えばＢｒｉｎｅｒｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ２０１４；５６（２）：３３３－３３９（“Ｂｒｉｎｅｒ”）において及び国際公開第２０１６／０７３９９０Ａ１号パンフレットにおいて記載される。

細菌及び古細菌において、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、一般に、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼタンパク質、外因性配列と相補的である５’領域を含むＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｃｒＲＮＡの３’領域と相補的である５’領域を含み、ｃｒＲＮＡの３’領域と二重鎖を形成するトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。いかなる理論によっても束縛されることを意図するものではないが、この二重鎖が、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を促し、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の活性に必要であると考えられる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムが遺伝子編集において使用するために改良されたように、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、１つの非限定的な例において、ｃｒＲＮＡ（その３’端で）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（その５’端で）の相補領域をブリッジする４つのヌクレオチド（例えばＧＡＡＡ）の「テトラループ」又は「リンカー」配列を用いて合わせ、単一の一分子又はキメラガイドＲＮＡにすることができることが発見された。Ｍａｌｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１３；３３９（６１２１）：８２３－８２６（“Ｍａｌｉ”）；Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１（３）：２３３－２３９（“Ｊｉａｎｇ”）；及びＪｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１２；３３７（６０９６）：８１６－８２１（“Ｊｉｎｅｋ２０１２”）を参照されたい。

ガイドＲＮＡは、一分子であるかモジュラーであるかにかかわらず、編集が望ましい細胞のゲノム中のＤＮＡ配列などの標的配列内の標的ドメインと完全に又は部分的に相補的である「ターゲティングドメイン」を含む。ターゲティングドメインは、文献において様々な名で称され、限定を伴うことなく、「ガイド配列」（Ｈｓｕｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１（９）：８２７－８３２，（“Ｈｓｕ”））、「相補性領域」（国際公開第２０１６／０７３９９０Ａ１号パンフレット）、「スペーサー」（Ｂｒｉｎｅｒ）を含み、一般的に「ｃｒＲＮＡ」（Ｊｉａｎｇ）と称される。付けられる名に関係なく、ターゲティングドメインは、典型的に、長さが１０～３０ヌクレオチドであり、ある実施形態において、長さが１６～２４ヌクレオチド（例えば、長さが１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチド）であり、Ｃａｓ９ｇＲＮＡの場合、５’末端に又はその近くにあり、Ｃｐｆ１ｇＲＮＡの場合、３’末端に又はその近くにある。

ターゲティングドメインに加えて、ｇＲＮＡは、典型的に（下記に述べられるように、必ずしもではないが）、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の形成又は活性に影響を与え得る複数のドメインを含む。例えば、前述のように、ｇＲＮＡの第１及び第２の相補性ドメインによって形成される二重鎖構造（リピート：アンチリピート二重鎖とも称される）は、Ｃａｓ９の認識（ＲＥＣ）ローブと相互作用し、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を媒介することができる。Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ２０１４及び２０１５を参照されたい。第１及び／又は第２の相補性ドメインは、終結シグナルとしてＲＮＡポリメラーゼによって認識することができる１つ以上のポリＡトラクトを含有し得ることに留意されたい。第１及び第２の相補性ドメインの配列は、そのため、任意選択で、例えば、Ｂｒｉｎｅｒにおいて記載されるようにＡ－Ｇ交換又はＡ－Ｕ交換を使用することにより、これらのトラクトを排除し、ｇＲＮＡの完全なインビトロ転写を促進するように修飾される。第１及び第２の相補性ドメインに対するこれらの及び他の類似の修飾は、本開示の範囲内にある。

第１及び第２の相補性ドメインの他に、Ｃａｓ９ｇＲＮＡは、典型的に、必ずしもインビトロにおいてではないが、インビボにおいてヌクレアーゼ活性に関与する２つ以上の追加の二重鎖領域を含む。Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ２０１５を参照されたい。第２の相補性ドメインの３’部分の近くにある第１のステムループワンは、「近位ドメイン」（国際公開第２０１６／０７３９９０Ａ１号パンフレット）、「ステムループ１」（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ２０１４及び２０１５）並びに「ネクサス」（Ｂｒｉｎｅｒ）と様々に称される。１つ以上の追加のステムループ構造は、一般に、ｇＲＮＡの３’端の近くに存在し、その数は種によって変わる：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のｇＲＮＡは、典型的に、２つの３’ステムループを含み（リピート：アンチリピート二重鎖を含め、合計４つのステムループ構造）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及び他の種は、１つのみを有する（合計３つのステムループ構造）。種ごとに構成される保存ステムループ構造（より広く言えば、ｇＲＮＡ構造）の説明は、Ｂｒｉｎｅｒにおいて提供される。

前述の説明は、Ｃａｓ９と使用するためのｇＲＮＡに重点を置いたが、これまでに記載されたものといくつかの点で異なるｇＲＮＡを利用する他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが発見又は発明されている（又は将来的に発明され得る）ことが認められるべきである。例えば、Ｃａｓ１２ａとも呼ばれるＣｐｆ１（「プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ）１に由来するＣＲＩＳＰＲ」）は、ｔｒａｃｒＲＮＡが機能する必要がないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである（Ｚｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ２０１５；１６３：７５９－７７１（“ＺｅｔｓｃｈｅＩ”）を参照されたい）。Ｃｐｆ１ゲノム編集システムに用いられるｇＲＮＡは、一般に、ターゲティングドメイン及び相補性ドメイン（その代わりに「ハンドル」と呼ばれる）を含む。Ｃｐｆ１と使用するためのｇＲＮＡにおいて、ターゲティングドメインは、通常、Ｃａｓ９ｇＲＮＡに関連して上記に記載されるように５’端の代わりに、３’端に又はその近くに存在することにも留意されたい（ハンドルは、Ｃｐｆ１ｇＲＮＡの５’端に又はその近くにある）。

当業者は、しかしながら、構造の違いが、異なる原核生物の種に由来するｇＲＮＡ間又はＣｐｆ１ｇＲＮＡとＣａｓ９ｇＲＮＡとの間で存在し得るが、ｇＲＮＡが作動する原理は、一般に一貫していることを認めるであろう。作動のこの一貫性のために、ｇＲＮＡは、大まかに言えば、それらのターゲティングドメイン配列によって定義することができ、当業者は、与えられたターゲティングドメイン配列を、一分子若しくはキメラｇＲＮＡ又は１つ以上の化学的修飾及び／若しくは配列の修飾（置換、ヌクレオチドの追加、切り詰めなど）を含むｇＲＮＡを含む、任意の適したｇＲＮＡに組み込むことができることを認めるであろう。従って、本開示において提示する無駄を省くために、ｇＲＮＡは、単にそれらのターゲティングドメイン配列に関してのみ記載され得る。

より広く言えば、当業者は、本開示のいくつかの態様が、複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを使用して実施することができるシステム、方法及び組成物に関することを認めるであろう。こういった理由で、特に明記しない限り、ｇＲＮＡという用語は、特定の種のＣａｓ９又はＣｐｆ１と適合したｇＲＮＡだけでなく、任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼと共に使用することができる任意の適したｇＲＮＡを含むよう理解されるべきである。実例として、ｇＲＮＡという用語は、ある実施形態において、ＩＩ型若しくはＶ型のＣＲＩＳＰＲシステムなどのクラス２ＣＲＩＳＰＲシステムに存在する任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ又はそれに起源を有するか若しくはそれから改良されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼと共に使用するためのｇＲＮＡを含むことができる。

いくつかの実施形態において、本開示の方法又はシステムは、２つ以上のｇＲＮＡを使用し得る。いくつかの実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡは、細胞のゲノムにおいて２つ以上の二重鎖切断を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、２つ以上のノックインカセットにより同時に２つ以上の必須遺伝子を標的にする多重編集戦略が使用され得る。いくつかのこのような実施形態において、２つ以上のノックインカセットは、異なる外因性カーゴ配列を含み得、例えば、異なるノックインカセットは、異なる目的の遺伝子産物をコード化し得、従って、編集された細胞は、異なる遺伝子座を標的にする異なるノックインカセットから複数の目的の遺伝子産物を発現するであろう。

２つ以上のｇＲＮＡを使用するいくつかの実施形態において、二本鎖破壊は、デュアルｇＲＮＡとペアにした「ニッカーゼ」戦略によって引き起こされ得る。いずれのｇＲＮＡをデュアルｇＲＮＡとペアにした「ニッカーゼ」戦略に使用することができるのかについての決定を含め、ｇＲＮＡを選択するためのいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡのペアは、ＰＡＭが外側に面し且つＤ１０ＡＣａｓ９ニッカーゼによるカットが、５’オーバーハングをもたらすように、ＤＮＡに対して向きを合わせなければならない。

いくつかの実施形態において、本開示の方法又はシステムは、プライムエディター（ＰＥ）と併せて、プライム編集ｇＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を使用し得る。当技術分野においてよく知られているように、ｐｅｇＲＮＡは、標準的なｇＲＮＡよりも実質的に大きく、例えば、いくつかの実施形態において、例えば、内容全体が参照によって本明細書に援用されるＡｎｚａｌｏｎｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２０１９；５７６：１４９－１５７において記載されるように、５０、１００、１５０又は２５０ヌクレオチドよりも長い。ｐｅｇＲＮＡは、プライマー結合配列（ＰＢＳ）及び一方の末端、例えば３’端に追加された望ましいＲＮＡ配列を含有するドナー鋳型を有するｇＲＮＡである。ＰＥ：ｐｅｇＲＮＡ複合体は、標的ＤＮＡに結合し、プライムエディターのニッカーゼドメインは、一方の鎖のみに切れ目を入れ、フラップを作製する。ｐｅｇＲＮＡ上に位置するＰＢＳは、ＤＮＡフラップに結合し、編集されたＲＮＡ配列は、プライムエディターの逆転写酵素ドメインを使用して逆転写される。編集された鎖は、切れ目を入れたフラップの端でＤＮＡに組み込まれ、標的ＤＮＡは、新しい逆転写ＤＮＡにより修復される。元のＤＮＡセグメントは、細胞エンドヌクレアーゼによって除去される。この後、編集された一本の鎖及び編集されなかった一本の鎖が残る。最も新しいＰＥシステム、例えば、ＰＥ３及びＰＥ３ｂにおいて、編集されなかった鎖は、追加の標準的なｇＲＮＡを使用することにより、新たに編集された鎖にマッチするように修正することができる。この場合、編集されなかった鎖は、ニッカーゼによって切れ目を入れられ、新たに編集された鎖は、切れ目を修復するために鋳型として使用され、このようにして編集を完了する。

ｇＲＮＡの設計
標的配列の選択及び検証並びにオフターゲット解析のための方法は、例えばＭａｌｉ；Ｈｓｕ；Ｆｕｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１４；３２（３）：２７９－８４，Ｈｅｉｇｗｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｍｅｔｈｏｄｓ２０１４；１１（２）：１２２－３；Ｂａｅｅｔａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２０１４；３０（１０）：１４７３－５；及びＸｉａｏｅｔａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２０１４；３０（８）：１１８０－１１８２において以前に記載された。非限定的な例として、ｇＲＮＡの設計は、ユーザーの標的配列と一致する有望な標的配列の選択を最適化するために、例えば、ゲノムにわたるオフターゲット活性の総量を最小限にするために、ソフトウェアツールの使用を含み得る。オフターゲット活性は、切断に限定されないが、それぞれのオフターゲット配列の切断効率は、例えば、実験的に導き出された重み付けを使用して、予測することができる。これらの及び他のガイド選択方法は、国際公開第２０１６／０７３９９０Ａ１号パンフレットにおいて詳細に記載される。

例えば、標的配列の選択及び検証並びにオフターゲット解析のための方法は、ｃａｓ－ｏｆｆｉｎｄｅｒを使用して実行することができる（Ｂａｅｅｔａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２０１４；３０：１４７３－５）。Ｃａｓ－ｏｆｆｉｎｄｅｒは、ガイド配列に対して、指定される数以下のミスマッチを有する、ゲノム中の全ての配列を迅速に同定することができるツールである。

別の例として、与えられた配列がどれくらいオフターゲットになりそうかをスコア化するための方法（例えば、ターゲット配列候補が同定された後）を実行することができる。例示的なスコアは、Ｄｏｅｎｃｈｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６；３４：１８４－９１によって記載されるように、ＣｕｔｔｉｎｇＦｒｅｑｕｅｎｃｙＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（ＣＦＤ）スコアを含む。

ｇＲＮＡの修飾
ある実施形態において、本明細書において使用されるｇＲＮＡは、修飾又は未修飾ｇＲＮＡであり得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡは、１つ以上の修飾を含み得る。ある実施形態において、１つ以上の修飾は、ホスホロチオエート連結修飾、ホスホロジチオアート（ＰＳ２）連結修飾、２’－Ｏ－メチル修飾又はその組み合わせを含み得る。ある実施形態において、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの５’端、ｇＲＮＡの３’端又はその組み合わせであり得る。

ある実施形態において、ｇＲＮＡ修飾は、１つ以上のホスホロジチオアート（ＰＳ２）連結修飾を含み得る。

いくつかの実施形態において、本明細書において使用されるｇＲＮＡは、本明細書において「ＤＮＡ伸長」とも称される、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基の１つ以上のストレッチを含む。いくつかの実施形態において、本明細書において使用されるｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’端、ｇＲＮＡの３’端又はその組み合わせにＤＮＡ伸長を含む。ある実施形態において、ＤＮＡ伸長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ＤＮＡ塩基長であり得る。例えば、ある実施形態において、ＤＮＡ伸長は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０又は２５ＤＮＡ塩基長であり得る。ある実施形態において、ＤＮＡ伸長は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）から選択される１つ以上のＤＮＡ塩基を含み得る。ある実施形態において、ＤＮＡ伸長は、同じＤＮＡ塩基を含む。例えば、ＤＮＡ伸長は、アデニン（Ａ）塩基のストレッチを含み得る。ある実施形態において、ＤＮＡ伸長は、チミン（Ｔ）塩基のストレッチを含み得る。ある実施形態において、ＤＮＡ伸長は、様々なＤＮＡ塩基の組み合わせを含む。

Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡの例示的な適した５’伸長は、下記の表６において提供される。

ある実施形態において、本明細書において使用されるｇＲＮＡは、ＤＮＡ伸長及び化学的修飾、例えば１つ以上のホスホロチオエート連結修飾、１つ以上のホスホロジチオアート（ＰＳ２）連結修飾、１つ以上の２’－Ｏ－メチル修飾若しくは本明細書において開示される１つ以上の追加の適した化学的ｇＲＮＡ修飾又はその組み合わせを含む。ある実施形態において、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの５’端、ｇＲＮＡの３’端又はその組み合わせであり得る。

理論によって束縛されることを望むものではないが、任意のＤＮＡ伸長は、ｇＲＮＡによって標的にされている標的核酸にハイブリダイズせず且つこのようなＤＮＡ伸長を含まないｇＲＮＡと比較して、標的核酸部位での編集の増加を見せる限り、本明細書において開示される任意のｇＲＮＡと共に使用され得ることが予想される。

いくつかの実施形態において、本明細書において使用されるｇＲＮＡは、本明細書において「ＲＮＡ伸長」とも称される、リボ核酸（ＲＮＡ）塩基の１つ以上のストレッチを含む。いくつかの実施形態において、本明細書において使用されるｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’端、ｇＲＮＡの３’端又はその組み合わせにＲＮＡ伸長を含む。ある実施形態において、ＲＮＡ伸長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ＲＮＡ塩基長であり得る。例えば、ある実施形態において、ＲＮＡ伸長は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０又は２５ＲＮＡ塩基長であり得る。ある実施形態において、ＲＮＡ伸長は、アデニン（ｒＡ）、グアニン（ｒＧ）、シトシン（ｒＣ）又はウラシル（ｒＵ）から選択される１つ以上のＲＮＡ塩基を含み得、「ｒ」は、ＲＮＡ、２’－ヒドロキシを表す。ある実施形態において、ＲＮＡ伸長は、同じＲＮＡ塩基を含む。例えば、ＲＮＡ伸長は、アデニン（ｒＡ）塩基のストレッチを含み得る。ある実施形態において、ＲＮＡ伸長は、様々なＲＮＡ塩基の組み合わせを含む。ある実施形態において、本明細書において使用されるｇＲＮＡは、ＲＮＡ伸長及び１つ以上のホスホロチオエート連結修飾、１つ以上のホスホロジチオアート（ＰＳ２）連結修飾、１つ以上の２’－Ｏ－メチル修飾、１つ以上の追加の適したｇＲＮＡ修飾、例えば、本明細書において開示される化学的修飾又はその組み合わせを含む。ある実施形態において、１つ以上の修飾は、ｇＲＮＡの５’端、ｇＲＮＡの３’端又はその組み合わせであり得る。ある実施形態において、ＲＮＡ伸長を含むｇＲＮＡは、本明細書において記載される配列を含み得る。

本明細書において使用されるｇＲＮＡは、ＲＮＡ伸長及びＤＮＡ伸長も含み得ることが予想される。ある実施形態において、ＲＮＡ伸長及びＤＮＡ伸長は共に、ｇＲＮＡの５’端、ｇＲＮＡの３’端又はその組み合わせであり得る。ある実施形態において、ＲＮＡ伸長は、ｇＲＮＡの５’端にあり、ＤＮＡ伸長は、ｇＲＮＡの３’端にある。ある実施形態において、ＲＮＡ伸長は、ｇＲＮＡの３’端にあり、ＤＮＡ伸長は、ｇＲＮＡの５’端にある。

いくつかの実施形態において、修飾、例えば、本明細書において開示される５’端のＤＮＡ伸長及び／又は化学的修飾を含むｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＡｓＣｐｆ１ヌクレアーゼと複合体を形成し、ＲＮＰを形成し、これは、次に、標的細胞、例えば多能性幹細胞又はその子孫を編集するために用いられる。

この節において述べられるある例示的な修飾は、限定を伴うことなく、５’端若しくはその近く（例えば、５’端の１～１０、１～５若しくは１～２ヌクレオチド内）及び／又は３’端若しくはその近く（例えば、３’端の１～１０、１～５若しくは１～２ヌクレオチド内）を含む、ｇＲＮＡ配列内の任意の位置に含むことができる。いくつかの場合において、修飾は、Ｃａｓ９ｇＲＮＡのリピートーアンチリピート二重鎖、Ｃａｓ９若しくはＣｐｆ１ｇＲＮＡのステムループ構造及び／又はｇＲＮＡのターゲティングドメインなどの機能的モチーフ内に配置される。

一例として、ｇＲＮＡの５’端は、下記に示されるように、真核生物ｍＲＮＡキャップ構造又はキャップ類似体（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体若しくは３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇアンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ））を含むことができる：

キャップ又はキャップ類似体は、ｇＲＮＡの化学的又は酵素的合成のいずれかの間に含めることができる。

同様に、ｇＲＮＡの５’端は、５’三リン酸基を欠くことができる。例えば、インビトロ転写されたｇＲＮＡは、５’三リン酸基を除去するために、ホスファターゼ処理することができる（例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼを使用して）。

別の一般によくある修飾は、ポリＡトラクトと称される複数（例えば、１～１０、１０～２０又は２５～２００）のアデニン（Ａ）残基の、ｇＲＮＡの３’端での追加を含む。ポリＡトラクトは、ポリアデノシンポリメラーゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を使用して、化学的又は酵素的合成中にｇＲＮＡに追加することができる。

ガイドＲＮＡは、３’末端Ｕリボースで修飾することができる。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基は、下記に示されるように、アルデヒド基に酸化することができ、それに伴うリボース環の開裂により、修飾されたヌクレオシドが得られる：

「Ｕ」は、未修飾又は修飾ウリジンであり得る。

末端３’Ｕリボースは、下記に示されるように、２’３’環状リン酸により修飾することができる：

「Ｕ」は、未修飾又は修飾ウリジンであり得る。

ガイドＲＮＡは、例えば、本明細書において記載される１つ以上の修飾されたヌクレオチドを組み込むことにより、分解に対して安定化することができる３’ヌクレオチドを含有することができる。ある実施形態において、ウリジンは、修飾されたウリジン、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン及び５－ブロモウリジンにより又は本明細書において記載される修飾されたウリジンのいずれかにより置き換えることができる；アデノシン及びグアノシンは、修飾されたアデノシン及びグアノシンにより、例えば、８位での修飾、例えば８－ブロモグアノシンにより又は本明細書において記載される修飾されたアデノシン若しくはグアノシンにより置き換えることができる。

ある実施形態において、糖修飾されたリボヌクレオチドは、ｇＲＮＡに組み込むことができ、例えば、２’ＯＨ基は、Ｈ、－ＯＲ、－Ｒ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール若しくは糖であり得る）、ハロ、－ＳＨ、－ＳＲ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール若しくは糖であり得る）、アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ_２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ若しくはアミノ酸であり得る）；又はシアノ（－ＣＮ）から選択される基によって置き換えられる。ある実施形態において、リン酸バックボーンは、例えばホスホチオエート（ＰｈＴｘ）基により、本明細書において記載されるように修飾することができる。ある実施形態において、ｇＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドは、それぞれ独立して、例えば、２’－Ｆ又は２’－Ｏ－メチルアデノシン（Ａ）、２’－Ｆ又は２’－Ｏ－メチルシチジン（Ｃ）、２’－Ｆ又は２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕ）、２’－Ｆ又は２’－Ｏ－メチルチミジン（Ｔ）、２’－Ｆ又は２’－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）及びそのいずれかの組み合わせを含む２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル又は２’－フルオロ修飾などの２’－糖修飾を含むが、これらに限定されない修飾又は未修飾ヌクレオチドであり得る。

ガイドＲＮＡは、２’ＯＨ基を例えばＣ１～６アルキレン又はＣ１～６ヘテロアルキレンブリッジによって同じリボース糖の４’炭素につなぐことができる「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含むこともできる。任意の適した成分は、このようなブリッジを提供するために使用することができ、限定を伴うことなく、メチレン、プロピレン、エーテル又はアミノブリッジ；Ｏ－アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ_２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ若しくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノであり得る）及びアミノアルコキシ又はＯ（ＣＨ_２）_ｎ－アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ_２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ若しくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノであり得る）を含む。

ある実施形態において、ｇＲＮＡは、多環式（例えば、トリシクロ；及びグリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ－ＧＮＡ若しくはＳ－ＧＮＡ、リボースは、ホスホジエステル結合に付加されたグリコール単位によって置き換えられる）又はトレオース核酸（ＴＮＡ、リボースは、α－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）により置き換えられるなどの「アンロックド」形態）である修飾されたヌクレオチドを含むことができる。

一般に、ｇＲＮＡは、酸素を有する五員環である糖基リボースを含む。例示的な修飾されたｇＲＮＡは、限定を伴うことなく、リボース中の酸素の置き換え（例えば、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）又は例えばメチレン若しくはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の追加（例えば、シクロペンテニル又はシクロヘキセニルによりリボースを置き換える）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタン又はオキセタンの四員環を形成する）；リボースの環拡大（例えば、例えばアンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル及びホスホロアミデートバックボーンも有するモルホリノなど、追加の炭素又はヘテロ原子を有する六又は七員環を形成する）を含むことができる。大多数の糖類似体改変が２’位に集中しているが、４’位を含む他の部位は、修飾が可能である。ある実施形態において、ｇＲＮＡは、４’－Ｓ、４’－Ｓｅ又は４’－Ｃ－アミノメチル－２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。

ある実施形態において、デアザヌクレオチド、例えば７－デアザーアデノシンは、ｇＲＮＡに組み込むことができる。ある実施形態において、Ｏー及びＮーアルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６－メチルアデノシンは、ｇＲＮＡに組み込むことができる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ中の１つ以上又は全てのヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドである。

ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ（その３’端で）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（その５’端で）の相補領域間に１つ以上の架橋を含むこともできる（例えば、テトラループ構造内に及び／又はｇＲＮＡ内に存在する任意のステムループ構造中に配置される）。種々のリンカーは、使用に適している。例えば、ガイドＲＮＡは、限定を伴うことなく、ポリビニルエーテル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）及びそのコポリマーを含む、一般によくある連結成分を含むことができる。

いくつかの実施形態において、二官能性架橋剤は、第１のｇＲＮＡ断片の５’端及び第２のｇＲＮＡ断片の３’端を連結するために使用され、連結されるｇＲＮＡ断片の３’又は５’端は、架橋剤の反応基と反応する官能基により修飾される。普通、これらの修飾は、アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、ヒドロキシル、アルケン（例えば末端アルケン）、アジド及び／又は別の適した官能基の１つ以上を含む。多官能性（例えば二官能性）架橋剤も当技術分野において一般に知られており、ヘテロ官能性又はホモ官能性であり得、限定を伴うことなく、イソチオシアネート、イソシアネート、酸アジ化物、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、トシルエステル、トレシルエステル、アルデヒド、アミン、エポキシド、カーボネート（例えば、ビス（ｐ－ニトロフェニル）カーボネート）、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アルキル、イミドエステル、カルボキシレート、リン酸アルキル、無水物、フルオロフェニルエステル、ＨＯＢｔエステル、ヒドロキシメチルホスフィン、Ｏ－メチルイソ尿素、ＤＳＣ、ＮＨＳカルバメート、グルタルアルデヒド、活性化された二重結合、環状ヘミアセタール、ＮＨＳカーボネート、イミダゾールカルバメート、アシルイミダゾール、メチルピリジニウムエーテル、アズラクトン、シアン酸エステル、環状イミドカーボネート、クロロトリアジン、デヒドロアゼピン、６－スルホ－シトシン誘導体、マレイミド、アジリジン、ＴＮＢチオール、エルマン試薬、過酸化物、ビニルスルホン、フェニルチオエステル、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、エポキシド、ジアゾニウム、ベンゾフェノン、アントラキノン、ジアゾ誘導体、ジアジリン誘導体、ソラレン誘導体、アルケン、フェニルボロン酸などを含む、任意の適した官能基を含み得る。いくつかの実施形態において、第１のｇＲＮＡ断片は、第１の反応基を含み、第２のｇＲＮＡ断片は、第２の反応基を含む。例えば、第１及び第２の反応基は、それぞれ、アミン成分を含むことができ、これらは、カーボネート含有二官能性架橋試薬により架橋され、尿素連結を形成する。他の例において、（ａ）第１の反応基は、ブロモアセチル成分を含み、第２の反応基は、スルフヒドリル成分を含む又は（ｂ）第１の反応基は、スルフヒドリル成分を含み、第２の反応基は、ブロモアセチル成分を含む、これらは、ブロモアセチル成分をスルフヒドリル成分と反応させることによって架橋され、ブロモアセチル－チオール連結を形成する。これらの及び他の架橋化学作用は、当技術分野において知られており、ＧｒｅｇＴ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３ｒｄＥｄ．２０１３，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｂｙＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓを含む文献において概要が述べられている。

追加の適したｇＲＮＡ修飾は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。適したｇＲＮＡ修飾は、例えば、「ＭＯＤＩＦＩＥＤＣＰＦ１ＧＵＩＤＥＲＮＡ」と題する国際公開第２０１９０７０７６２Ａ１号パンフレット；「ＧＵＩＤＥＲＮＡＷＩＴＨＣＨＥＭＩＣＡＬＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ」と題する国際公開第２０１６０８９４３３Ａ１号パンフレット；「ＣＨＥＭＩＣＡＬＬＹＭＯＤＩＦＩＥＤＧＵＩＤＥＲＮＡＳＦＯＲＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ－ＭＥＤＩＡＴＥＤＧＥＮＥＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮ」と題する国際公開第２０１６１６４３５６Ａ１号パンフレット；及び「ＮＵＣＬＥＡＳＥ－ＭＥＤＩＡＴＥＤＧＥＮＯＭＥＥＤＩＴＩＮＧＯＦＰＲＩＭＡＲＹＣＥＬＬＳＡＮＤＥＮＲＩＣＨＭＥＮＴＴＨＥＲＥＯＦ」と題する国際公開第２０１７０５３７２９Ａ１号パンフレットにおいて記載されるものを含み；これらのそれぞれの全内容は、参照によって本明細書において援用される。

例示的なｇＲＮＡ
本開示によって包含されるある実施形態に適したガイドＲＮＡの非限定的な例は、本明細書において、例えば、下記の表において提供される。当業者は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列のいずれかとしてのターゲティングドメイン配列についての本開示から、特異的なヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９又はＣｐｆ１ヌクレアーゼに適したガイドＲＮＡ配列を想像することが可能である。例えば、ＲＮＡヌクレオチドからなるターゲティング配列を含むガイドＲＮＡは、ＤＮＡ配列として提供されるターゲティングドメイン配列に対応するＲＮＡ配列を含むであろうが、これは、チミジンヌクレオチドの代わりにウラシルを含有する。例えば、ＲＮＡヌクレオチドからなり、ＤＮＡ配列ＴＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＧＴＴＣＣＣＣＧＴ（配列番号８８）によって記載されるターゲティングドメイン配列を含むガイドＲＮＡは、対応するＲＮＡ配列ＵＣＵＧＣＡＧＡＡＡＵＧＵＵＣＣＣＣＧＵ（配列番号８９）のターゲティングドメインを有するであろう。当業者に明らかであろうが、このようなターゲティング配列は、適したガイドＲＮＡスキャフォールド、例えば、ｃｒＲＮＡスキャフォールド配列又はキメラｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡスキャフォールド配列に連結されるであろう。適したｇＲＮＡスキャフォールド配列は、当業者に知られている。ＡｓＣｐｆ１については、例えば、適したスキャフォールド配列は、ターゲティングドメインの５’－末端に追加された配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号９０）を含む。上記の例において、これは、配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵＵＣＵＧＣＡＧＡＡＡＵＧＵＵＣＣＣＣＧＵ（配列番号９１）のＣｐｆ１ガイドＲＮＡをもたらすであろう。当業者は、例えば、ＤＮＡ伸長を追加することにより、このようなガイドＲＮＡを修飾する方法を更に理解するであろう。（例えば、上記の例において、本明細書において記載される２５塩基長のＤＮＡ伸長の追加は、例えば、配列ＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴｒＵｒＡｒＡｒＵｒＵｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＵｒＣｒＵｒＵｒＧｒＵｒＡｒＧｒＡｒＵｒＵｒＣｒＵｒＧｒＣｒＡｒＧｒＡｒＡｒＡｒＵｒＧｒＵｒＵｒＣｒＣｒＣｒＣｒＧｒＵ（配列番号９２）のガイドＲＮＡをもたらすであろう）。本明細書において提供される例示的なターゲティング配列は、限定的なものではなく、追加の適した配列、例えば、本明細書において開示される特異的な配列の変異体は、当技術分野における一般的な知識を考慮し、本開示に基づいて当業者に明らかであろうということが理解されるであろう。

本明細書において開示される例示的なｇＲＮＡは、本開示によって包含される非限定的な実施形態を示すために提供されることが理解されるであろう。追加の適したｇＲＮＡ配列は、本開示に基づいて当業者に明らかであり、本開示は、この点で限定されない。

標的細胞
本開示の方法は、任意の細胞のゲノムを編集するために使用することができる。ある実施形態において、標的細胞は、幹細胞、例えばｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である。ある実施形態において、標的細胞は、ｉＰＳ由来細胞又はＥＳ由来細胞であり得、遺伝子修飾は、ドナー細胞からｉＰＳＣへの再プログラムプロセス中の任意の段階、ｉＰＳＣ段階中及び／又はｉＰＳＣ若しくはＥＳＣを特殊な細胞に分化させるプロセスの任意の段階或いは更に最終的な特殊な細胞状態に至るまでに又は最終的な特殊な細胞状態でなされる。ある実施形態において、標的細胞は、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞（ｉＮＫ細胞）又はｉＰＳ由来Ｔ細胞（ｉＴ細胞）であり得、遺伝子修飾は、ドナー細胞からｉＰＳＣへの再プログラムプロセス中の任意の段階、ｉＰＳＣ段階中及び／又はｉＰＳＣをｉＮＫ若しくはｉＴ状態に分化させるプロセスの任意の段階、例えば例えばｉＰＳＣ由来ＨＳＣ状態などの中間の状態或いは更に最終的なｉＮＫ若しくはｉＴ細胞状態に至るまでに又は最終的なｉＮＫ若しくはｉＴ細胞状態でなされる。

ある実施形態において、標的細胞は、長期造血幹細胞、短期造血幹細胞、多能性前駆細胞、系統を制限した前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、骨髄系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、赤血球前駆細胞、巨核球赤血球前駆細胞、網膜細胞、光受容細胞、杆体細胞、錐体細胞、網膜色素上皮細胞、小柱網細胞、蝸牛有毛細胞、外有毛細胞、内有毛細胞、肺上皮細胞、気管支上皮細胞、肺胞上皮細胞、肺上皮前駆細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、筋衛星細胞、ニューロン、ニューロン幹細胞、間葉系幹細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、繊維芽細胞、単球由来マクロファージ若しくは樹状細胞、巨核球、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、網状赤血球、Ｂ細胞、例えば、前駆Ｂ細胞、プレＢ細胞、プロＢ細胞、メモリーＢ細胞、プラズマＢ細胞、消化管上皮細胞、胆管上皮細胞、膵管上皮細胞、腸幹細胞、肝細胞、肝星細胞、クッパー細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、膵島細胞（例えば、ベータ細胞、アルファ細胞、デルタ細胞）、膵外分泌細胞、シュワン細胞又は希突起膠細胞の１つ以上である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ニューロンの前駆細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ニューロンである。

いくつかの実施形態において、標的細胞は、循環血液細胞、例えば、網状赤血球、巨核球赤血球前駆（ＭＥＰ）細胞、骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、リンパ球系前駆（ＬＰ）細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）又は内皮細胞（ＥＣ）である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、骨髄細胞（例えば、網状赤血球、赤血球細胞（例えば赤芽球）、ＭＥＰ細胞、骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、ＬＰ細胞、赤血球前駆（ＥＰ）細胞、ＨＳＣ、多能性前駆（ＭＰＰ）細胞、内皮細胞（ＥＣ）、造血性内皮（ＨＥ）細胞又は間葉系幹細胞）の１つ以上である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、骨髄系前駆細胞、（例えば、共通骨髄系前駆（ＣＭＰ）細胞又は顆粒球マクロファージ前駆（ＧＭＰ）細胞）の１つ以上である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、リンパ球系前駆細胞、例えば、共通リンパ球系前駆（ＣＬＰ）細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、赤血球前駆細胞（例えば、ＭＥＰ細胞）である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、造血幹／前駆細胞（例えば、長期ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ）、ＭＰＰ細胞又は系統を制限した前駆（ＬＲＰ）細胞）の１つ以上である。ある実施形態において、標的細胞は、ＣＤ３４^＋細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ９０^＋細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ９０^＋ＣＤ４９ｆ^＋ＣＤ３８^－ＣＤ４５ＲＡ^－細胞、ＣＤ１０５^＋細胞、ＣＤ３１^＋若しくはＣＤ１３３^＋細胞又はＣＤ３４^＋ＣＤ９０^＋ＣＤ１３３^＋細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、臍帯血ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞、羊水ＣＤ３４^＋細胞、羊水内皮細胞、胎盤内皮細胞又は胎盤造血ＣＤ３４^＋細胞の１つ以上である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、動員された末梢血造血ＣＤ３４^＋細胞（対象が動員剤、例えば、Ｇ－ＣＳＦ又はプレリキサホルにより治療された後）の１つ以上である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、末梢血内皮細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、末梢血ナチュラルキラー細胞である。

ある実施形態において、標的細胞は、初代細胞、例えば、ヒト対象から単離される細胞である。ある実施形態において、標的細胞は、免疫細胞、例えば、ヒト対象から単離される初代免疫細胞である。ある実施形態において、標的細胞は、対象、例えばヒト対象から単離される細胞の集団の一部である。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、対象から単離される免疫細胞の集団を含む。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、例えば、ヒト対象から単離されるＴＩＬを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、健康な対象、例えば健康なヒトドナーから単離される。いくつかの実施形態において、標的細胞は、疾患又は病気を有する対象、例えば、治療を必要とするヒト患者から単離される。

ある実施形態において、標的細胞は、免疫細胞、例えば初代免疫細胞、例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４^＋セントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ８^＋セントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ４^＋エフェクターメモリーＴ細胞、ＣＤ４^＋エフェクターメモリーＴ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ステムセルメモリーＴ細胞、ＣＤ８^＋ステムセルメモリーＴ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４^＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^－Ｔ細胞又はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^－Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞又はＴｒｅｇである。いくつかの実施形態において、標的細胞は、マクロファージである。いくつかの実施形態において、標的細胞は、自然リンパ球である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、樹状細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ベータ細胞、例えば膵ベータ細胞である。

いくつかの実施形態において、標的細胞は、癌を有する対象から単離される。

いくつかの実施形態において、標的細胞は、聴神経腫；腺癌；副腎癌；肛門癌；血管肉腫（例えば、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管内皮腫）；虫垂癌；良性単クローン性高ガンマグロブリン血症；胆道癌（例えば、胆管癌）；胆管癌；膀胱癌；骨癌；乳癌（例えば、乳房の腺癌、乳房の乳頭状癌、乳癌、乳房髄様癌）；脳癌（例えば、髄膜腫、膠芽腫、グリオーマ（例えば、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄芽腫）；気管支癌；カルチノイド腫瘍；心臓腫瘍；子宮頚癌（例えば、子宮頚部腺癌）；絨毛癌；脊索腫；頭蓋咽頭腫；結腸直腸癌（例えば、結腸癌、直腸癌、結腸直腸腺癌）；結合組織の癌；上皮癌；腺管上皮内癌；上衣腫；内皮肉腫（例えば、カポジ肉腫、多発性特発性出血性肉腫）；子宮内膜癌（例えば、子宮癌、子宮肉腫）；食道癌（例えば、食道の腺癌、バレットの腺癌）；ユーイング肉腫；眼癌（例えば、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫）；家族性過好酸球増加症；胆嚢癌；胃癌（例えば、胃腺癌）；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；生殖細胞癌；頭頚部癌（例えば、頭頚部扁平上皮細胞癌、口腔癌（例えば、口腔扁平上皮細胞癌）、喉の癌（例えば、喉頭癌、咽頭癌、鼻咽腔癌、中咽頭癌）；造血器癌（例えば、リンパ腫、原発性肺リンパ腫、気管支随伴リンパ組織リンパ腫、脾リンパ腫、節性濾胞辺縁帯リンパ腫、小児Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫）；血管芽細胞腫；組織球増殖症；下咽頭癌；炎症性筋線維芽腫瘍；免疫細胞性アミロイドーシス；腎臓癌（例えば、腎芽細胞腫、別名ウィルムス腫瘍、腎細胞癌）；肝臓癌（例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）、悪性肝癌）；肺癌（例えば、気管支原性肺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌）；平滑筋肉腫（ＬＭＳ）；黒色腫；正中線上の癌；多発性内分泌腫瘍症候群；筋肉の癌；中皮腫；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；神経線維腫（例えば、神経線維腫症（ＮＦ）１型若しくは２型、シュワン細胞腫症）；神経内分泌癌（例えば、膵消化管神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ－ＮＥＴ）、カルチノイド腫瘍）；骨原性肉腫（例えば、骨癌）；卵巣癌（例えば、嚢胞腺癌、卵巣胎児性癌、卵巣腺癌）；乳頭状腺癌；膵癌（例えば、膵臓腺癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、膵島細胞腫）；副甲状腺癌；乳頭状腺癌；陰茎癌（例えば、陰茎及び陰嚢のページェット病）；咽頭癌；松果体腫；下垂体癌；胸膜肺芽腫；原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＴ）；形質細胞腫瘍；腫瘍随伴症候群；上皮内腫瘍；前立腺癌（例えば、前立腺腺癌）；直腸癌；横紋筋肉腫；網膜芽細胞腫；唾液腺癌；皮膚癌（例えば、扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）、角化棘細胞腫（ＫＡ）、黒色腫、基底細胞癌（ＢＣＣ））；小腸癌（例えば、虫垂癌）；軟部組織肉腫（例えば、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、軟骨肉腫、繊維肉腫、粘液肉腫）；脂腺癌；胃癌；小腸癌；汗腺癌；滑膜腫；精巣癌（例えば、精上皮腫、精巣胎児性癌）；胸腺癌；甲状腺癌（例えば、甲状腺の乳頭状癌、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）、髄様甲状腺癌）；尿道癌；子宮癌；腟癌；外陰癌（例えば、外陰部のページェット病）又はそのいずれかの組み合わせを含むが、これらに限定されない癌を有する対象から単離される。

いくつかの実施形態において、標的細胞は、血液疾患を有する対象から単離される。いくつかの実施形態において、標的細胞は、鎌状赤血球貧血を有する対象から単離される。いくつかの実施形態において、標的細胞は、β－サラセミアを有する対象から単離される。

幹細胞
本開示の方法は、幹細胞と共に使用することができる。幹細胞は、典型的に、改変されていない娘細胞を産生する（自己複製；細胞分裂により、親細胞と同一である少なくとも１つの娘細胞を産生する）及び特殊な細胞型を生じさせる（発生能）能力を有する細胞である。細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、生殖系幹（ＧＳ）細胞、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）、脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、多能性成体生殖系幹細胞（ｍａＧＳＣ）及び非制限体性幹細胞（ＵＳＳＣ）を含むが、これらに限定されない。一般に、幹細胞は、際限なく分裂することができる。分裂後、幹細胞は、幹細胞として留まるか、前駆細胞になるか、又は最終分化に進み得る。前駆細胞は、少なくとも１つの細胞型が与えられた、完全に分化した機能的な細胞を作製することができる細胞である。一般に、前駆細胞は、分裂することができる。分裂後、前駆細胞は、前駆細胞のままであるか又は最終分化に進み得る。

多能性幹細胞は、当技術分野において一般に知られている。本開示は、多能性幹細胞に関係する技術（例えば、システム、組成物、方法など）を提供する。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植された場合に奇形腫を誘導する能力がある；（ｂ）３つ全ての胚葉の細胞型に分化する能力がある（例えば、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型に分化することができる）；並びに／又は（ｃ）胚性幹細胞の１つ以上のマーカーを発現する（例えば、ヒト胚性幹細胞は、Ｏｃｔ－４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－３表面抗原、ＳＳＥＡ－４表面抗原、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、Ｓｏｘ－２、ＲＥＸ１などを発現する）幹細胞である。いくつかの態様において、ヒト多能性幹細胞は、分化マーカーの発現を示さない。いくつかの実施形態において、本開示の方法を使用して編集されたＥＳ細胞及び／又はｉＰＳＣは、それらの多能性を維持し、例えば、（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植された場合に奇形腫を誘導する能力がある；（ｂ）３つ全ての胚葉の細胞型に分化する能力がある、例えば、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型に分化することができる；並びに／又は（ｃ）胚性幹細胞の１つ以上のマーカーを発現する。

いくつかの実施形態において、ＥＳ細胞（例えば、ヒトＥＳ細胞）は、胚盤胞又は桑実胚の内部細胞塊に起源を有することができる。いくつかの実施形態において、ＥＳ細胞は、例えば、残りの胚を破壊することなく、胚の１つ以上の割球から単離することができる。いくつかの実施形態において、ＥＳ細胞は、体細胞核移植によって産生することができる。いくつかの実施形態において、ＥＳ細胞は、精子及び卵細胞の受精又はＤＮＡ、核移植、単為発生から若しくは例えばＨＬＡ領域においてホモ接合性を有するＥＳ細胞を作製する手段によって得ることができる。いくつかの実施形態において、ヒトＥＳ細胞は、受精卵、割球若しくは精子及び卵細胞の融合によって産生される胚盤胞期の哺乳動物の胚、核移植、単為発生又はクロマチンの再プログラム及び胚性細胞を産生するための再プログラムされたクロマチンの原形質膜中への続く組み込みから産生するか又は得ることができる。例示的なヒトＥＳ細胞は、当技術分野において知られており、ＭＡＯ１、ＭＡＯ９、ＡＣＴ－４、Ｎｏ．３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４及びＡＣＴ３０ＥＳ細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ヒトＥＳ細胞は、それらの供給源又はそれらを産生するために使用される特定の方法に関係なく、例えば、（ｉ）３つ全ての胚葉の細胞に分化する能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ－４及びアルカリホスファターゼの発現、並びに／又は（ｉｉｉ）免疫不全動物に移植された場合に奇形腫を産生する能力に基づいて同定することができる。いくつかの実施形態において、ＥＳ細胞は、細胞株として連続的に継代されている。

ｉＰＳ細胞
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ある遺伝子の発現を誘導することにより、成体体細胞（例えば、線維芽細胞又は他の適した体細胞）などの非多能性細胞から人工的に得られる一種の多能性幹細胞である。ｉＰＳＣは、哺乳動物などの任意の生物から得ることができる。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、ウシ、非ヒト霊長類又はヒトから産生される。ｉＰＳＣは、ある幹細胞の遺伝子及びタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、発生能及び／又は分化可能性などの多くの点でＥＳ細胞と類似している。ｉＰＳＣを産生するための様々な適した方法は、当技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、成体繊維芽細胞などの非多能性細胞中へのある幹細胞関連遺伝子（Ｏｃｔ－３／４（Ｐｏｕｆ５１）及びＳｏｘ－２など）のトランスフェクションによって得ることができる。トランスフェクションは、レトロウイルス、レンチウイルス又はアデノウイルスなどのウイルスベクターを通して達成することができる。追加の適した再プログラム方法は、宿主細胞のゲノム中に統合されないベクター、例えばエピソームベクターの使用を含む又はコード化ＲＮＡを介して若しくはタンパク質として直接、再プログラム因子を送達することも記載されている。例えば、細胞は、レトロウイルスシステムを使用して、Ｏｃｔ－３／４、Ｓｏｘ－２、Ｋｌｆ４及び／若しくはｃ－Ｍｙｃを又はレンチウイルスシステムを使用して、Ｏｃｔ－４、Ｓｏｘ－２、ＮＡＮＯＧ及び／若しくはＬＩＮ２８をトランスフェクトすることができる。３～４週後、少数のトランスフェクト細胞は、形態学的に及び生化学的に多能性幹細胞と類似し始め、形態学的選択、倍加時間又はレポーター遺伝子及び抗生物質による選択を通して単離することができる。一実施例において、成人ヒト細胞由来のｉＰＳＣは、Ｙｕｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２００７；３１８（５８５４）：１２２４又はＴａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ２００７；１３１：８６１－７２によって記載される方法によって作製される。再プログラムのための多数の適した方法は、当業者に知られており、本開示は、この点で限定されない。

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される編集及びカーゴ統合方法のための標的細胞は、ｉＰＳＣであり、編集されたｉＰＳＣは、次に、例えば、ｉＰＳＣ由来免疫細胞に分化させる。いくつかの実施形態において、分化細胞は、ｉＰＳＣ由来免疫細胞である。いくつかの実施形態において、分化細胞は、ｉＰＳＣ由来ｉＮＫ細胞、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞（例えば、ｉＰＳＣ由来アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞）、ｉＰＳＣ由来樹状細胞又はｉＰＳＣ由来マクロファージである。いくつかの実施形態において、分化細胞は、ｉＰＳＣ由来膵ベータ細胞である。

ｉＮＫ細胞
いくつかの実施形態において、本開示は、ｉＮＫ細胞（例えば、遺伝子修飾されたｉＮＫ細胞）を作製するための方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本開示のｉＮＫ細胞において存在する遺伝子修飾は、ドナー細胞からｉＰＳＣへの再プログラムプロセス中の任意の段階、ｉＰＳＣ段階中及び／又はｉＰＳＣをｉＮＫ状態に分化させるプロセスの任意の段階、例えば、例えばｉＰＳＣ由来ＨＳＣ状態などの中間の状態或いは更に最終的なｉＮＫ細胞状態に至るまでに又は最終的なｉＮＫ細胞状態でなすことができる。

例えば、本開示の遺伝子修飾されたｉＮＫ細胞において存在する１つ以上のゲノム修飾は、１つ以上の様々な細胞段階（例えば、ドナーからｉＰＳＣへの再プログラム、ｉＰＳＣのｉＮＫへの分化）でなされ得る。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される遺伝子修飾されたｉＮＫ細胞において存在する１つ以上のゲノム修飾は、ドナー細胞をｉＰＳＣ状態に再プログラムする前になされる。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される遺伝子修飾されたｉＮＫ細胞において存在する全ての編集は、同時に、短い時間間隔で且つ／又は再プログラム／分化プロセスの同じ細胞段階、例えばドナー細胞の段階、再プログラムプロセス中、ｉＰＳＣの段階若しくは例えばｉＰＳＣからｉＮＫへの分化プロセス中になされる。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される遺伝子修飾されたｉＮＫ細胞において存在する２つ以上の編集は、異なる時間に及び／又はドナー細胞からｉＰＳＣへのｉＮＫへの再プログラム／分化プロセスの異なる細胞段階でなされる。例えば、いくつかの実施形態において、第１の編集は、ドナー細胞の段階でなされ、第２の（異なる）編集は、ｉＰＳＣの段階でなされる。いくつかの実施形態において、第１の編集は、再プログラムの段階（例えば、ドナーからｉＰＳＣへの）でなされ、第２の（異なる）編集は、ｉＰＳＣの段階でなされる。

種々の細胞型は、本明細書において記載される再プログラム、分化及び／又は遺伝子操作戦略にかけることができるドナー細胞として使用することができる。例えば、ドナー細胞は、多能性幹細胞又は分化細胞、例えば、例えば繊維芽細胞若しくはＴリンパ球などの体細胞であり得る。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、本明細書において記載されるｉＮＫ細胞を作製するために処置される（例えば、再プログラム、分化及び／又は遺伝子操作にかけられる）。

ドナー細胞は、任意の適した生物に由来することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞である。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、体細胞である。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、幹細胞又は前駆細胞である。ある実施形態において、ドナー細胞は、ヒト胚の一部でもなく、一部であったわけでもなく、その起源は、ヒト胚の破壊を伴わない。

いくつかの実施形態において、遺伝子修飾されたｉＮＫ細胞は、ｉＰＳＣから得られ、またｉＰＳＣは、ドナー体細胞から得られる。任意の適した体細胞は、ｉＰＳＣの作製において使用することができ、またｉＰＳＣは、ｉＮＫ細胞の作製において使用することができる。様々なドナー体細胞型からｉＰＳＣを得るための適した戦略は、記載されており、当技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、ドナー体細胞は、線維芽細胞である。いくつかの実施形態において、ドナー体細胞は、成熟Ｔ細胞である。

例えば、いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣが得られ、続いてｉＮＫ細胞が得られるドナー体細胞は、発生的に成熟したＴ細胞（胸腺選択を受けたＴ細胞）である。発生的に成熟したＴ細胞の１つ特徴は、Ｔ細胞受容体遺伝子座の再編成である。Ｔ細胞成熟中、ＴＣＲ遺伝子座は、Ｖ（Ｄ）Ｊ再編成を受け、完全なＶ－ドメインエクソンを作製する。これらの再編成は、Ｔ細胞のｉＰＳＣへの再プログラムを通して及び結果として生じるｉＰＳＣの体細胞への分化を通して保持される。

ある実施形態において、ドナー体細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４^＋セントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ８^＋セントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ４^＋エフェクターメモリーＴ細胞、ＣＤ４^＋エフェクターメモリーＴ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ステムセルメモリーＴ細胞、ＣＤ８^＋ステムセルメモリーＴ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４^＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^－Ｔ細胞又はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^－Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞である。

Ｔ細胞は、ｉＰＳＣの作製に有利となり得る。例えば、Ｔ細胞は、比較的容易に、例えば、ＣＲＩＳＰＲベースの方法又は他の遺伝子操作方法によって編集することができる。加えて、再編成されたＴＣＲ遺伝子座は、個々の細胞及びそれらの娘細胞の遺伝子の追跡を可能にする。例えば、ＮＫ細胞の作製に関与する再プログラム、増大、培養及び／又は分化戦略が、単一の細胞のクローン増大である場合、再編成されたＴＣＲ遺伝子座は、細胞及びその娘細胞を誤解の余地なく同定する遺伝マーカーとして使用することができる。これはまた、細胞集団を真にクローンであるとして特徴付けること又はクローン集団において混ざってしまった集団若しくは混入している細胞の同定を可能にする。複数の編集を有するｉＮＫ細胞を作製することにおいてＴ細胞を使用することの別の有望な利点は、染色体転座に関連するある核型異常が、Ｔ細胞培養において淘汰されるということである。このような異常は、ＣＲＩＳＰＲ技術によって細胞を編集する場合、特に複数の編集を有する細胞を作製する場合に懸念を生じさせ得る。治療用リンパ球を得るための出発点としてＴ細胞由来ｉＰＳＣを使用することは、リンパ球における前もって選別されたＴＣＲの発現を、例えば、特異性抗原、例えば腫瘍抗原に対する結合活性についてＴ細胞を選択すること、選択されたＴ細胞をｉＰＳＣに再プログラムすること及び次にこれらのｉＰＳＣからＴＣＲを発現するリンパ球（例えばＴ細胞）を得ることを介して可能にすることができる。この戦略は、例えば、遺伝的又はエピジェネティック戦略により、他の細胞型においてＴＣＲを活性化することを可能にすることができる。加えて、Ｔ細胞は、再プログラムプロセスを通して、それらの「エピジェネティックメモリー」の少なくとも一部を保持し、従って、同じ又はｉＮＫ細胞などの密接に関係する細胞型の続く分化は、ｉＮＫを得るための出発点として、繊維芽細胞などの関係しない細胞を使用するアプローチと比較してより効率的となり得、且つ／又はより高品質な細胞集団をもたらし得る。

いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるように処置されるドナー細胞、例えば再プログラムされ、且つ／又は遺伝子操作を受ける細胞は、長期造血幹細胞、短期造血幹細胞、多能性前駆細胞、系統を制限した前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、骨髄系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、赤血球前駆細胞、巨核球赤血球前駆細胞、網膜細胞、光受容細胞、杆体細胞、錐体細胞、網膜色素上皮細胞、小柱網細胞、蝸牛有毛細胞、外有毛細胞、内有毛細胞、肺上皮細胞、気管支上皮細胞、肺胞上皮細胞、肺上皮前駆細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、筋衛星細胞、ニューロン、ニューロン幹細胞、間葉系幹細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、繊維芽細胞、単球由来マクロファージ若しくは樹状細胞、巨核球、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、網状赤血球、Ｂ細胞、例えば、前駆Ｂ細胞、プレＢ細胞、プロＢ細胞、メモリーＢ細胞、プラズマＢ細胞、消化管上皮細胞、胆管上皮細胞、膵管上皮細胞、腸幹細胞、肝細胞、肝星細胞、クッパー細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、膵島細胞（例えば、ベータ細胞、アルファ細胞、デルタ細胞）、膵外分泌細胞、シュワン細胞又は希突起膠細胞の１つ以上である。

いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、循環血液細胞、例えば、網状赤血球、巨核球赤血球前駆（ＭＥＰ）細胞、骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、リンパ球系前駆（ＬＰ）細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）又は内皮細胞（ＥＣ）の１つ以上である。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、骨髄細胞（例えば、網状赤血球、赤血球細胞（例えば赤芽球）、ＭＥＰ細胞、骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、ＬＰ細胞、赤血球前駆（ＥＰ）細胞、ＨＳＣ、多能性前駆（ＭＰＰ）細胞、内皮細胞（ＥＣ）、造血性内皮（ＨＥ）細胞又は間葉系幹細胞）の１つ以上である。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、骨髄系前駆細胞、（例えば、共通骨髄系前駆（ＣＭＰ）細胞又は顆粒球マクロファージ前駆（ＧＭＰ）細胞）の１つ以上である。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、１つ以上のリンパ球系前駆細胞、例えば、共通リンパ球系前駆（ＣＬＰ）細胞である。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、１つ以上の赤血球前駆細胞（例えば、ＭＥＰ細胞）である。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、造血幹／前駆細胞（例えば、長期ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ）、ＭＰＰ細胞又は系統を制限した前駆（ＬＲＰ）細胞）の１つ以上である。ある実施形態において、ドナー細胞は、ＣＤ３４^＋細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ９０^＋細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ９０^＋ＣＤ４９ｆ^＋ＣＤ３８^－ＣＤ４５ＲＡ^－細胞、ＣＤ１０５^＋細胞、ＣＤ３１^＋若しくはＣＤ１３３^＋細胞又はＣＤ３４^＋ＣＤ９０^＋ＣＤ１３３^＋細胞である。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、臍帯血ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞、羊水ＣＤ３４^＋細胞、羊水内皮細胞、胎盤内皮細胞又は胎盤造血ＣＤ３４^＋細胞の１つ以上である。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、１つ以上の動員された末梢血造血ＣＤ３４^＋細胞（対象が動員剤、例えば、Ｇ－ＣＳＦ又はプレリキサホルにより治療された後）である。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、末梢血内皮細胞である。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、末梢血ナチュラルキラー細胞である。

いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、分裂細胞である。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は、非分裂細胞である。

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される１つ以上の方法及び／又は戦略から結果として生じる遺伝子修飾された（例えば、編集された）ｉＮＫ細胞は、癌免疫学的治療アプローチという場面において、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態において、ドナー細胞又は本明細書において提供される再プログラム、分化及び／若しくは遺伝子操作戦略の任意の段階の任意の細胞は、例えば、続く特徴付け又はそれを必要とする対象への投与のために、培養で維持することができるか、又は当技術分野において知られている任意の適した方法を使用して保存する（例えば、液体窒素中で凍結させる）ことができる。

特徴付けの方法
細胞表現型を特徴付けることを含め、細胞を特徴付ける方法は、当業者に知られている。いくつかの実施形態において、１つ以上のこのような方法は、例えば、形態学的解析及びフローサイトメトリーを含み得るが、これらに限定されない。細胞系統及び同一性マーカーは、当業者に知られている。１つ以上のこのようなマーカーは、細胞集団の構成物又は１つ以上の細胞の表現型の同一性を決定するために、１つ以上の特徴付けの方法と組み合わされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、特定の集団の細胞は、フローサイトメトリーを使用して特徴付けられるであろう（例えば、ＹｅＬｉｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．２０１８Ａｕｇ２；２３（２）：１８１－１９２．ｅ５を参照されたい）。いくつかのこのような実施形態において、細胞の集団のサンプルは、１つ以上の細胞表面マーカー及び／又は１つ以上の細胞内マーカーの存在及び割合について評価されるであろう。当業者によって理解されるように、このような細胞表面マーカーは、様々な系統を代表するものであり得る。例えば、多能性細胞は、このような細胞に関連していることが知られている任意の多くのマーカーの１つ以上、例えばＣＤ３４によって同定され得る。更に、いくつかの実施形態において、細胞は、分化をある程度示すマーカーによって同定され得る。このようなマーカーは、当業者に知られているであろう。例えば、いくつかの実施形態において、分化細胞のマーカーは、例えばＣＤ４３、ＣＤ４５（分化造血細胞）など、分化造血細胞に関連するものを含み得る。いくつかの実施形態において、分化細胞のマーカーは、例えば、ＣＤ５６、ＮＫ細胞受容体免疫グロブリンガンマＦｃ領域受容体ＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩ、分化抗原群１６（ＣＤ１６））、ナチュラルキラー群－２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ６９、天然細胞傷害受容体など、ＮＫ細胞表現型に関連し得る。いくつかの実施形態において、マーカーは、Ｔ細胞マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８など）であり得る。

使用の方法
種々の疾患、障害及び／又は状態は、本開示によって提供される細胞の使用を通して治療され得る。例えば、いくつかの実施形態において、疾患、障害及び／又は状態は、本明細書において記載される遺伝子修飾された又は操作された細胞（例えば、遺伝子修飾されたｉＮＫ細胞）を対象に導入することによって治療され得る。治療され得る疾患の例は、癌、例えば、例えば脳、前立腺、乳房、肺、大腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭部、頚部、胃、子宮頚部、直腸、喉頭又は食道の固形腫瘍；並びに血液悪性腫瘍、例えば急性及び慢性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫並びに骨髄異形成症候群を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書において記載される細胞のいずれかを含む組成物を対象に投与することにより、それを必要とする対象を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、治療剤又は組成物は、疾患、障害又は状態（例えば、傷害を含む）の発症前、その間又はその後に投与され得る。いくつかの実施形態において、本開示は、医薬の調製において使用するために、本明細書において記載される細胞のいずれかを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、細胞療法によって治療することができる疾患、障害又は状態の治療において使用するために、本明細書において記載される細胞のいずれかを提供する。

特定の実施形態において、対象は、細胞療法によって治療することができる疾患、障害又は状態を有する。いくつかの実施形態において、細胞療法を必要とする対象は、疾患、障害及び／又は状態を有する対象であり、細胞療法、例えば療法は、本明細書において記載される細胞を含む組成物が対象に投与され、細胞療法は、疾患、障害及び／又は状態に関連する少なくとも１つの症状を治療する。いくつかの実施形態において、細胞療法を必要とする対象は、骨髄若しくは幹細胞移植の候補者、化学療法若しくは照射療法を受けたことがある対象、癌、例えば造血系の癌を有するか若しくは有する危険がある対象、腫瘍、例えば固形腫瘍を有するか若しくは発症する危険がある対象及び／又はウイルス感染若しくはウイルス感染に関連する疾患を有するか若しくは有する危険がある対象を含むが、これらに限定されない。

医薬組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の１つ以上の遺伝子改変又は操作された細胞、例えば、本明細書に記載の遺伝子改変されたｉＮＫ細胞を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤を更に含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞又はＨＳＣ、例えば、遺伝子改変（例えば、編集）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞又はＨＳＣを含む、単離された多能性幹細胞誘導造血系細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約９５％～約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞又はＨＳＣ、例えば、遺伝子改変（例えば、編集）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞又はＨＳＣを含む単離された多能性幹細胞誘導造血系統細胞を含む。

いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、多能性幹細胞誘導造血系細胞の単離された集団を含み、単離された集団は約０．１％、０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％又は３０％未満のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞又はＨＳＣ、例えば、遺伝子改変（例えば、編集）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞又はＨＳＣを有する。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞誘導造血系細胞の単離された集団は、約０．１％、０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％又は３０％以上のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞又はＨＳＣ、例えば、遺伝子改変（例えば、編集）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞又はＨＳＣを有する。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞誘導造血系細胞の単離された集団は、約０．１％～約１％、約１％～約３％、約３％～約５％、約１０％～約１５％、約１５％～２０％、約２０％～２５％、約２５％～３０％、約３０％～３５％、約３５％～４０％、約４０％～４５％、約４５％～５０％、約６０％～７０％、約７０％～８０％、約８０％～９０％、約９０％～９５％又は約９５％～約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞又はＨＳＣ、例えば、遺伝子改変（例えば、編集）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞又はＨＳＣを有する。

いくつかの実施形態では、多能性幹細胞誘導造血系細胞の単離された集団は、約０．１％、約１％、約３％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％又は約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞又はＨＳＣ、例えば、遺伝子改変（例えば、編集）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞又はＨＳＣを有する。

当業者が理解するように、自己細胞及び同種細胞の両方を養子細胞療法に使用することができる。自己細胞療法は一般に、他の細胞療法と比較して、感染の減少、ＧＶＨＤの可能性の低さ及び迅速な免疫再構成を有する。同種細胞療法は一般に、免疫媒介性の移植片対悪性腫瘍（ＧＶＭ）効果を有し、他の細胞療法と比較して再発率が低い。細胞療法を必要とする対象の特定の状態に基づいて、当業者は、どの特定のタイプの療法を投与するかを決定することができるであろう。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象に対して同種である多能性幹細胞誘導造血系細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象に対して自己である多能性幹細胞誘導造血系細胞を含む。自己移植の場合、多能性幹細胞誘導造血系細胞の単離された集団は、治療される対象との完全な又は部分的なＨＬＡ一致のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞誘導造血系細胞は、対象とＨＬＡ適合していない。

いくつかの実施形態では、多能性幹細胞誘導造血系細胞は、投与前にエクスビボ又はインビトロで増殖させることなく、対象に投与することができる。特定の実施形態では、誘導造血系細胞の単離された集団は、改善された治療可能性を有する免疫細胞を得るために、１つ以上の薬剤を使用してエクスビボで調節及び処理される。いくつかの実施形態では、誘導造血系細胞の調節された集団は、処理剤を除去するために洗浄することができ、改善された集団は、インビトロで集団を更に増殖させることなく対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、誘導造血系細胞の単離された集団は、単離された集団を１つ以上の薬剤で調節する前に増殖される。

いくつかの実施形態では、誘導造血系細胞の単離された集団は、組換えＴＣＲ、ＣＡＲ又は他の目的の遺伝子産物を発現するように、本開示の方法に従って遺伝子改変され得る。組換えＴＣＲ又はＣＡＲを発現する、遺伝子操作された誘導造血系細胞については、細胞の遺伝子改変前又は後にかかわらず、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書、同第６，５３４，０５５号明細書、同第６，９０５，６８０号明細書、同第６，６９２，９６４号明細書、同第５，８５８，３５８号明細書、同第６，８８７，４６６号明細書、同第６，９０５，６８１号明細書、同第７，１４４，５７５号明細書、同第７，０６７，３１８号明細書、同第７，１７２，８６９号明細書、同第７，２３２，５６６号明細書、同第７，１７５，８４３号明細書、同第５，８８３，２２３号明細書、同第６，９０５，８７４号明細書、同第６，７９７，５１４号明細書、同第６，８６７，０４１号明細書及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書に記載の方法を用いて細胞を活性化及び増殖させることが可能である。

癌
任意の癌は、本明細書に記載の細胞又は医薬組成物を用いて治療することができる。本開示の例示的な治療標的には、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、眼、胃腸系、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌又は子宮由来の癌細胞が含まれる。加えて、癌は、特異的に以下の非限定的な組織型のものであり得る：新生物、悪性；細胞腫；細胞腫、未分化型；巨細胞及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；石灰化上皮腫；移行上皮癌；乳頭移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ；悪性；胆管細胞癌；肝細胞癌；肝細胞癌と胆管細胞癌の併発；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；充実性癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌；乳頭腺及び濾胞状腺癌；非被包性硬化癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫；悪性；アンドロブラストーマ；悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍；悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫（ｅｘｔｒａ－ｍａｍｍａｒｙｐａｒａｇａｎｇｌｉｏｍａ）悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大疣状色素性黒色腫（ｍａｌｉｇｍｅｌａｎｏｍａｉｎｇｉａｎｔｐｉｇｍｅｎｔｅｄｎｅｖｕｓ）；類上皮細胞黒色腫；青色母斑；悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎芽性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚腫；胎芽性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫瘍；ユーイング腫瘍；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；細線維性星状細胞腫；星芽腫；膠芽腫；希突起膠腫；希突起芽腫；原始神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節神経芽腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉症；他の特定非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；多発性骨髄腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；並びに有毛細胞白血であり得る。

いくつかの実施形態では、癌は乳癌である。いくつかの実施形態では、癌は結腸癌である。いくつかの実施形態では、癌は胃癌である。いくつかの実施形態では、癌はＲＣＣである。別の実施形態では、癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。

いくつかの実施形態では、単独で又は１つ以上の追加の癌治療様式と組み合わせて、本明細書に記載の細胞（例えば、本開示の方法を使用して改変された細胞、例えば、遺伝子改変されたｉＮＫ細胞）で治療することができる固形癌の適応症は、以下を含む：膀胱癌、肝細胞癌、前立腺癌、卵巣／子宮癌、膵臓癌、中皮腫、黒色腫、神経膠芽腫、ＨＰＶ関連及び／又はＨＰＶ陽性癌、例えば、子宮頸部及びＨＰＶ＋頭頸部癌、口腔癌、咽頭の癌、甲状腺癌、胆のう癌、軟部肉腫。いくつかの実施形態では、単独で又は１つ以上の追加の癌治療様式と組み合わせて、本明細書に記載の細胞（例えば、本開示の方法を使用して改変された細胞、例えば、遺伝子改変されたｉＮＫ細胞）で治療することができる血液癌の適応症は、以下を含む：ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＮＨＬ、ＤＬＢＣＬ、ＡＭＬ、ＣＭＬ及び多発性骨髄腫（ＭＭ）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、本開示の方法を使用して改変された細胞）で治療され得る肺の細胞増殖性及び／又は分化性障害の例としては、腫瘍、例えば、気管支原性肺癌（腫瘍随伴症候群、細気管支肺胞上皮癌、神経内分泌腫瘍（例えば、気管支カルチノイド）、種々の腫瘍、転移性腫瘍及び胸膜腫瘍（孤立性線維性腫瘍（胸膜線維腫）及び悪性中皮腫を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、本開示の方法を使用して改変された細胞）で治療され得る乳房の細胞増殖性及び／又は分化性障害の例としては、増殖性乳房疾患（例えば、上皮過形成、硬化性腺腫症及び小管乳頭腫を含む）；腫瘍（例えば、間質腫瘍（例えば、線維腺腫、葉状腫瘍及び肉腫）及び上皮性腫瘍（例えば、大管乳頭腫）；乳癌（インサイチュ（非侵襲性）細胞腫（非浸潤性乳管癌（パジェット病を含む）及び非浸潤性小葉癌を含む）及び侵襲性（浸潤性）癌（以下が挙げられるが、これらに限定されない：侵襲性乳管癌、侵襲性小葉癌、髄様癌、コロイド（粘液性）癌、管状癌及び侵襲性乳頭癌）を含む）及び種々の悪性新生物）が挙げられるが、これらに限定されない。雄性の胸部における障害としては、女性化乳房及び癌腫が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞（例えば、本開示の方法を用いて改変された細胞）で治療され得る結腸を含む細胞増殖性及び／又は分化性障害の例としては、結腸の腫瘍（例えば、非腫瘍性ポリープ、腺腫、家族性症候群、結腸直腸癌形成、結腸直腸癌及びカルチノイド腫瘍）が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞（例えば、本開示の方法を用いて改変された細胞）で治療され得る上述したものに加えて、癌又は新生物状態の例としては、線維肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃癌、食道癌、直腸癌、膵癌、前立腺癌、子宮癌、頭頸部癌、皮膚癌、脳癌、扁平上皮癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、のう胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫又はカポジ肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞（例えば、本開示の方法を使用して改変された細胞）は、１つ以上の癌治療様式と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、他の癌治療様式として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：化学療法剤は、アルキル化剤（例えば、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン）；アジリジン類（例えば、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンアミン及びメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；δ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β－ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン及び９－アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；窒素マスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファニド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ））；抗生物質（例えば、エネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωｌ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９４；３３：１８３－１８６を参照））；ジネミシンＡを含むジネミシン；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標））及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンマＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ））；葉酸類似体（例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体（例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤（例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミシン；酢酸イプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド（例えば、メイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標）；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥＴ（登録商標））及びドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））のアルブミン操作ナノ粒子製剤；クロランブシル；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体（例えば、シスプラチン及びカルボプラチン）；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；シクロスポリン、シロリムス、ラパマイシン、ラパログ、イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；ＣＨＯＰ、シクロホスファミドの併用療法の略語、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロン並びにＦＯＬＦＯＸ、５－ＦＵと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標）を用いた治療レジメンの略語、ロイコボビン；抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）（例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）を含む）；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））などのエストロゲン受容体アンタゴニスト；卵巣を抑制又は閉鎖するように機能する薬剤、例えば、ロイチン化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト（例えば、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン；フルタミド、ニルタミド及びビカルタミドなどの他の抗アンドロゲン；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、ホルメスタニー、ファドロゾール、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））及びアナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））；クロドロネートなどのビスホスホネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ－５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））又はリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；トロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；例えば、米国特許第６，３４４，３２１号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているアプタマー；抗ＨＧＦモノクローナル抗体（例えば、ＡｖｅｏからのＡＶ２９９、ＡｍｇｅｎからのＡＭＧ１０２）；切断型ｍＴＯＲ変異体（例えば、ＣｏｍｐｕｇｅｎからのＣＧＥＮ２４１）；ｍＴＯＲ誘導経路を遮断するタンパク質キナーゼ阻害剤（例えば、ＡｒｑｕｌｅからのＡＲＱ１９７、ＥｘｅｌｅｘｉｓからのＸＬ８８０、ＳＧＸＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＳＧＸ５２３、ＳｕｐｅｒｇｅｎからのＭＰ４７０、ＰｆｉｚｅｒからのＰＦ２３４１０６６）；ワクチン（例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子療法ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ラパチニブジトシレート（ＥｒｂＢ－２及びＥＧＦＲデュアルチロシンキナーゼ小分子阻害剤（ＧＷ５７２０１６としても知られる））；セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）；４－（５－（４－メチルフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）ベンゼンスルホンアミドなどのＣＯＸ－２阻害剤；並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、本開示の方法を使用して改変された細胞）は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘導を促進する１つ以上の癌治療様式と組み合わせて使用される（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙｂｙＫ．ＭｕｒｐｈｙａｎｄＣ．ｗｅａｖｅｒを参照）。いくつかの実施形態では、そのような癌治療様式は抗体である。いくつかの実施形態では、そのような抗体は、トラスツズマブである。いくつかの実施形態では、そのような抗体は、リツキシマブである。いくつかの実施形態では、そのような抗体は、リツキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、オマリズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、セルトリズマブ・ペゴール、ウステキヌマブ、カナキヌマブ、ゴリムマブ、オファツムマブ、トシリズマブ、デノスマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、ペルツズマブ、トラスツズマブ・エムタンシン、オビヌツズマブ、シルツキシマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、ブリナツモマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イダルシズマブ、ネシツムマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、メポリズマブ、アリロクマブ、エボロクマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、イキセキズマブ、レスリズマブ、オララツマブ、ベズロトクスマブ、アテゾリズマブ、オビルトキサキシマブ、イノツズマブ・オゾガマイシン、ブロダルマブ、グセルクマブ、デュピルマブ、サリルマブ、アベルマブ、オクレリズマブ、エミシズマブ、ベンラリズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、デュルバルマブ、ブロスマブ、ラナデルマブ、モガムリズマブ、エレヌマブ、ガルカネズマブ、チルドラキズマブ、セミプリマブ、エマパルマブ、フレマネズマブ、イバリズマブ、モキセツモマブ・パスドドクス、ラブリズマブ、ロモソズマブ、リサンキズマブ、ポラツズマブ・ベドチン、ブロルシズマブ又はそれらのいずれかの組み合わせである（例えば、Ｌｕｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｄｉｓｅａｓｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０２０を参照）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞（例えば、本開示の方法を使用して改変された細胞）は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘導を促進する１つ以上の癌治療様式と組み合わせて使用され、癌治療様式は、ＣＤ２０、ＴＮＦα、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＩｇＥ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＩＴＧＡ４、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ３０、ＶＥＧＦＲ２、α４β７インテグリン、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＰＤ－１、ＧＤ２、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、ＰＤＧＦＲα、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＩＦＮγ、ＣＤ７９β又はそれらのいずれかの組み合わせを標的とする抗体又はその適切な断片である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用される。適切な併用療法チェックポイント阻害剤の例としては、ＰＤ－ｌ（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－ｌ（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ－３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭ及びＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ－３（Ｌａｇ３、ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ－４（Ｃｔｌａ４、ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－ｌ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体α（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅの、阻害性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１及び３ＤＬ２）アンタゴニスト又はそれらの任意の適切な組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは、抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみ抗体（ＶＮＡＲ）、ＩｇＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体又はそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｆｖ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）及び全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられ、これは、全抗体よりも製造に費用効果が高いか、より容易に使用されるか又はより感受性であり得る。いくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ又は３つ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ（抗ＰＤＬｌｍＡｂ）、アベルマブ（抗ＰＤＬｌｍＡｂ）、デュルバルマブ（抗ＰＤＬｌｍＡｂ）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂ）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂ）、ＩＰＨ４１０２（抗ＫＩＲ）、ＩＰＨ４３（抗ＭＩＣＡ）、ＩＰＨ３３（抗ＴＬＲ３）、リリムマブ（抗ＫＩＲ）、モナリズマブ（抗ＮＫＧ２Ａ）、ニボルマブ（抗ＰＤｌｍＡｂ）、ペムブロリズマブ（抗ＰＤ１ｍＡｂ）及びそれらの任意の誘導体、機能的均等物又はバイオシミラーの少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストはマイクロＲＮＡベースであり、これは多くのｍｉＲＮＡが免疫チェックポイントの発現を制御する調節因子として見出されるためである（Ｄｒａｇｏｍｉｒｅｔａｌ，ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌＭｅｄ．２０１８，１５（２）：１０３－１１５）。いくつかの実施形態では、チェックポイントアンタゴニストｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－２８、ｍｉＲ－ｌ５／ｌ６、ｍｉＲ－ｌ３８、ｍｉＲ－３４２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２ｌ、ｍｉＲ－ｌ３０ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－ｌ９７、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－２００、ｍｉＲ－ｌ７－５ｐ、ｍｉＲ－５７０、ｍｉＲ－４２４、ｍｉＲ－ｌ５５、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５ｌ３、ｍｉＲ－２９ｃ及び／又はそれらの任意の適切な組み合わせを含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、本開示の方法を使用して改変された細胞）は、外因性インターロイキン（ＩＬ）投与などの１つ以上の癌治療様式と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、患者に提供される外因性ＩＬは、ＩＬ－１５である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞と組み合わせて使用される場合の全身性ＩＬ－１５投与は、標準的な投与濃度と比較した場合に低減される（例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎｅｔａｌ．，ＩＬ－１５ｉｎｔｈｅＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｏｆＣａｎｃｅｒ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０２０）を参照）。

癌を治療するのに有効であり、追加の癌治療様式として本開示の組成物及び方法と共に使用するのに適している他の化合物は、例えば、「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ ＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃｅ，６２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ．Ｏｒａｄｅｌｌ，Ｎ．Ｊ．：ＭｅｄｉｃａｌＥｃｏｎｏｍｉｃｓＣｏ．，２００８」、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ「ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＥｌｅｖｅｎｔｈＥｄｉｔｉｏｎ．ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，２００５」、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．：ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００」及び「ＴｈｅＭｅｒｃｋＩｎｄｅｘ，ＦｏｕｒｔｅｅｎｔｈＥｄｉｔｉｏｎ．ＷｈｉｔｅｈｏｕｓｅＳｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．：ＭｅｒｃｋＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，２００６」（関連部分が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

本明細書に引用した刊行物、特許及び特許出願の全ては、上記であろうが下記であろうが、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書全体を通して、文脈が別途必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと」は、記述されたステップ又は要素又はステップ又は要素のグループの包含を意味するが、任意の他のステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素のグループの除外を意味しないと理解される。「からなる」は、「からなる」という語句に先行するものを含み、これに限定されることを意味する。「からなる」という語句は、リストされた要素が必要又は必須であることを示し、他の要素は存在し得ないことを示す。「から本質的になる」は、語句の前に列挙された要素を含み、列挙された要素の開示において明記された活動又は作用に干渉又は寄与しない他の要素に限定される。従って、「から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素は、任意ではなく、列挙された要素の活動又は作用に影響するかに応じて存在しても又はしなくてもよい。

これら及び他の変更は、上記の詳細な説明に照らして実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定するように解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲と共に、全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。従って、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。

上記の種々の実施形態は、更なる実施形態を提供するように組み合わされることが可能である。本明細書において言及され、且つ／又は出願データシートに列挙された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許刊行物の全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。データベースエントリー、例えば、本明細書に提供されるＮＣＢＩヌクレオチド又はタンパク質データベースエントリーの内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。データベースエントリーが経時的に変化する場合、本願の出願日の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、更に別の実施形態を提供するために、必要に応じて、様々な特許、出願及び刊行物の概念を使用するように修正することができる。

本開示は、以下の実施例によって更に説明される。実施例は、例示の目的のみのために提供される。それらは、決して本開示の範囲又は内容を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１：ＧＡＰＤＨのためのガイドＲＮＡのスクリーニング
この実施例は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを標的とするＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡのスクリーニングを記載する。ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードし、これは、無機リン酸及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下でグリセルアルデヒド３－リン酸の酸化的リン酸化を触媒する必須タンパク質であり、炭水化物代謝における重要なエネルギー産生工程である。この分析で使用されたガイドＲＮＡは、以下の設計：５’－ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ－［２１－ｍｅｒターゲティングドメイン配列］－３’（配列番号９０）を有する全て４１－ｍｅｒのＲＮＡ分子であった。例えば、ＲＳＱ２２３３７と示されるガイドＲＮＡは、以下の配列を有していた：

ここで、２１－ｍｅｒターゲティング配列に下線が引かれている。表７に示されるターゲティングドメイン配列を有するガイドＲＮＡを試験して、それらがＧＡＰＤＨを編集する際にどの程度有効であるかを決定した。これらのガイドＲＮＡのそれぞれを含むＣａｓ１２ａＲＮＰ（操作されたＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を有するＲＮＰ）をｉＰＳＣにトランスフェクトし、次いで、トランスフェクションの３日後に編集レベルをアッセイした（例えば、Ｗｏｎｇ，Ｋ．Ｇ．ｅｔａｌ．ＣｒｙｏＰａｕｓｅ：ＡＮｅｗＭｅｔｈｏｄｔｏＩｍｍｅｄｉａｔｅｌｙＩｎｉｔｉａｔｅＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓａｆｔｅｒＣｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ９，３５５－３６５（２０１７）を参照）。結果を図１及び図２に示す。ＲＳＱ２４５７０、ＲＳＱ２４５８２、ＲＳＱ２４５８９、ＲＳＱ２４５８５及びＲＳＱ２２３３７は、試験したＧＡＰＤＨガイドから最も高いレベルの測定可能な編集を示し、約７０％以上の細胞を編集した（それぞれ、約９２％、８９％、８８％、８７％及び７０％）。特定のエクソン領域を標的とするｇＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、イントロン領域を標的とするｇＲＮＡでトランスフェクトされた細胞と比較した場合、（トランスフェクション後３日目に）編集効率を分析するための単離可能なゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の量がはるかに少なく、特定のエクソン標的ｇＲＮＡを有するＲＮＰが細胞に対して細胞傷害性であることを示すことが観察された。これは、エクソン領域を標的とするｇＲＮＡで編集された細胞が非機能的ＧＡＰＤＨタンパク質又は機能不十分なタンパク質の発現をもたらすＧＡＰＤＨ内へのインデルの導入に起因して、有意な細胞死をもたらし得ることを示唆した。ＧＡＰＤＨ中のｇＲＮＡ媒介性切断部位を修復するためにレスキュープラスミドを使用する一方で、ＨＤＲを介して修復されたＧＡＰＤＨとインフレームで目的の遺伝子カーゴをノックインすることにより、ＧＡＰＤＨが修復され、目的のカーゴがうまく組み込まれた細胞をレスキューすることが可能であり得ると仮定された（図１及び図２に示されるように）。編集されているが（非常に効果的なＲＮＡガイド化ヌクレアーゼが使用される場合、トランスフェクトされた細胞の大部分）、ＧＡＰＤＨのＨＤＲ修復を受けず、目的のカーゴを組み込んでいないトランスフェクト細胞は、それらが機能するＧＡＰＤＨ遺伝子を有していないため経時的に死滅する。目的のカーゴを保有する細胞は、細胞が増殖及び分裂するにつれて完全に機能するＧＡＰＤＨ遺伝子のために利点を有し、これらの細胞は経時的に選択されるであろう。予想される最終結果は、ＧＡＰＤＨ遺伝子座内の非常に高い割合のカーゴノックインを有する細胞の集団であろう。

図２のデータは、ＲＳＱ２２３３７を含むＣａｓ１２ａＲＮＰがトランスフェクションの３日後に約７０％の編集レベルをもたらした一方で、他のエクソンガイド（ＲＳＱ２４５７０、ＲＳＱ２４５８２、ＲＳＱ２４５８９及びＲＳＱ２４５８５）よりもわずかに高いレベルの傷害性を引き起こしたことを示唆した（図２を参照、編集された細胞から単離されたｇＤＮＡは約３．９ｎｇ／μＬのみであった）。従って、多くの細胞が利用可能なレスキュー構築物がなく、ＮＨＥＪが傷害性インデルを形成するために、トランスフェクション後３日までにすでに死滅したため、実際の編集効率は、７０％よりも有意に高い可能性が非常に高かった。結果として、ＲＳＱ２２３３７を更なる試験のために選択した。

実施例２：標的組み込みを介したＧＡＰＤＨノックアウトのレスキュー
図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃに示す例示的な選択システムの実現可能性を試験するために、必須遺伝子ＧＡＰＤＨを、ＡｓＣｐｆ１（配列番号６２）及びガイドＲＮＡ（ＲＳＱ２２３３７）（配列番号９５）を含むＲＮＰを用いてｉＰＳＣにおいて標的化し、ＧＡＰＤＨの最後のエクソン（エクソン９）の５’末端に向かう二本鎖切断をもたらした。ｉＰＳＣをこの実験の目的のために試験したが、記載された方法は他の細胞型に適用することができる。
ＲＳＱ２２３３７はＧＡＰＤＨに対して高度に特異的であり、ゲノム中に最小のオフターゲット部位を有することが決定された（データは示さず）。従って、ＧＡＰＤＨは、少なくとも部分的には高度に効率的なＲＮＡ誘導性切断を媒介することができる末端エクソンを標的とする少なくとも１つの高度に特異的なｇＲＮＡが存在するため、本明細書に記載のカーゴ組み込み及び選択方法のための良好な例示的な候補標的遺伝子と考えられた。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを、公知の方法に従って、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）のヌクレオフェクション（エレクトロポレーション）によって細胞に導入した。また、細胞を、５’から３’の順に、長さが約５００ｂｐの５’相同性アーム（エクソン８の一部、イントロン８及びガイドＲＮＡ（ＲＳＱ２２３３７）のｇＲＮＡターゲティングドメイン配列の更なる結合を防止するために最適化されたエクソン９の５’コドン最適化コード部分を含む）、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド（「Ｐ２Ａ」）をコードするインフレーム配列、ＣＤ４７のインフレームコード配列（「カーゴ」）、終止コドン及びポリＡシグナル配列並びに長さが約５００ｂｐの３’相同性アーム（終止コドンを含むエクソン９のコード部分、エクソン９の３’エクソン領域及び下流遺伝子間配列の一部を含む）を含むノックインカセットを含む二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（例えば、ｄｓＤＮＡプラスミド）と接触させた（図３Ｂに示す）。ノックインカセットに隣接する５’及び３’相同性アームは、ＲＮＰ切断部位を取り囲む配列に対応するように設計した。

図３Ｃに概略的に示すように、ＤＮＡヌクレアーゼによって編集されるが、ＤＮＡドナー鋳型によってうまく標的化されない細胞におけるインデルのＮＨＥＪ媒介性生成は、細胞にとって致死的であるＧＡＰＤＨの非機能的バージョンを生成する。このノックアウトは、機能する遺伝子産物が産生されるようにＧＡＰＤＨコード領域を復元し、Ｐ２Ａ－カーゴ配列をＧＡＰＤＨコード配列とインフレーム及び下流（３’側）に配置するノックインカセットの正確な組み込みにより、ＤＮＡドナー鋳型によってうまく標的化される細胞において「レスキュー」される。これらの細胞は生存し、増殖し続ける。ＤＮＡヌクレアーゼによって編集されない細胞も増殖し続けるが、この場合のように、ｇＲＮＡと組み合わせたヌクレアーゼの編集効率が高い場合（実施例１参照）、細胞集団全体のごくわずかなパーセンテージを占めると予想され、非機能性タンパク質の生成をもたらす。ＲＳＱ２２３３７の編集結果は、編集された細胞の集団内の細胞死のために、ガイドの実際の編集効率を過小評価する可能性が高い。

ＲＳＱ２２３３７を含むＲＮＰの編集効率を、二本鎖ＤＮＡドナー鋳型の非存在下で、異なる濃度（４μＭ、１μＭ、０．２５μＭ又は０．０６２５μＭのＲＮＰ）で試験し、ｉＰＳＣのヌクレオフェクション後４８（ＧＡＰＤＨ遺伝子機能の喪失による細胞死前の時点）で最初に測定した。結果は、４μＭの濃度が最高の編集レベルをもたらしたことを示す。

図５及び６は、タンパク質をコードするカーゴ遺伝子が、本明細書に記載の選択システムを用いて、ＧＡＰＤＨなどのハウスキーピング遺伝子に高効率でノックされ得ることを示す。図５は、ＲＮＰが４μＭの濃度で存在し、ＣＤ４７をコードするｄｓＤＮＡプラスミド（「ＰＬＡ」）も存在した場合のエレクトロポレーション後４日目におけるＧＡＰＤＨにおけるＣＤ４７をコードする「カーゴ」のノックイン（ＫＩ）効率を示す。ノックイン効率を、２つの異なる濃度のプラスミド（０．５μｇ及び２．５μｇのプラスミド）で測定し、用量応答性であることが見出された。ノックイン「カーゴ」の３’位を標的とするｄｄＰＣＲを使用して、ノックインを測定した。ＲＮＰ単独又はＰＬＡ単独でエレクトロポレーションした対照細胞は、ＲＮＰ及びＰＬＡ（２．５μｇの濃度）のエレクトロポレーションよりもはるかに低いノックイン率を示した。

図６は、ＲＮＰ及びＣＤ４７をコードするｄｓＤＮＡプラスミドによる細胞のエレクトロポレーションの９日後のＧＡＰＤＨにおけるＣＤ４７をコードする「カーゴ」のノックイン効率を示す。カーゴの５’末端又は３’末端のいずれかを、ｇＲＮＡ標的部位の５’又はポリＡ領域の部位の３’に特異的なプライマーを用いてｄｄＰＣＲによってアッセイした場合、ノックインのパーセンテージは同様であり、結果の信頼性を増加させた。カーゴのノックイン効率は、トランスフェクション後４日目と比較して９日目で有意に高く（図５及び６を比較）、不成功のカーゴノックイン及びＧＡＰＤＨでのレスキューの結果として、機能的ＧＡＰＤＨ遺伝子を欠くＲＮＰ誘導性ＧＡＰＤＨノックアウト細胞において実質的な細胞死が存在するであろうという予想と一致する。

次に、イントロンを標的とするｇＲＮＡではなく、ＧＡＰＤＨのタンパク質をコードするエクソン部分を標的とするｇＲＮＡを使用するために、うまくノックインされたカーゴ遺伝子を含有する編集された細胞がより効率的に選択されることを確認することにより、上記の選択システムの機構を試験するために実験を行った。図１３は、イントロン内の切断を媒介するｇＲＮＡ（ＲＳＱ２４５７０（配列番号１０８）はエクソン８－イントロン９接合部に結合し、イントロン８内のＣａｓ１２ａ媒介性切断をもたらす）を使用する場合を、エクソンに特異的なｇＲＮＡ（ＲＳＱ２２３３７（配列番号９５）、イントロン８－エクソン９接合部を標的とし、エクソン９内のＣａｓ１２媒介性切断をもたらす）と比べて、ＧＡＰＤＨ遺伝子座におけるＧＦＰをコードする「カーゴ」ノックインカセットのノックイン効率を比較した。レポーター「カーゴ」ＧＦＰを含むレスキューｄｓＤＮＡプラスミドＰＬＡ１５９３を、上記のようにＧＡＰＤＨを標的とするＲＮＰ（Ｃａｓ１２ａ及びＲＳＱ２２３３７）でｉＰＳＣにヌクレオフェクトし、一方、配列番号４６に示されるドナー鋳型配列を含むｄｓＤＮＡプラスミドＰＬＡ１６５１を、Ｃａｓ１２ａ及びＲＳＱ２４５７０を含むＲＮＰでヌクレオフェクトした。各プラスミドの相同性アームは、各ｇＲＮＡの標的部位に基づいてＨＤＲを媒介するように設計された。ノックインを顕微鏡で可視化し（図１３Ａ）、フローサイトメトリーを用いて測定した（図１３Ｂ）。ノックイン効率は、イントロン領域（イントロン８）と比較した場合、エクソンコード領域（エクソン９）で切断するｇＲＮＡ及び関連するノックインカセットを使用した場合に有意に高かった。図１３Ｂは、ＲＳＱ２４５７０及びＧＦＰをコードする「カーゴ」ノックインカセット（例えば、ＰＬＡ１６５１；ドナー鋳型配列番号４６を含む）でエレクトロポレーションされた細胞のわずか２．１％と比較して、ＲＳＱ２２３３７及びＧＦＰをコードする「カーゴ」ノックインカセット（例えば、ＰＬＡ１５９３；ドナー鋳型配列番号４４を含む）でエレクトロポレーションされた細胞の９５．６％がＧＦＰを発現したことを示す。図１３に示される結果は、ＲＳＱ２４５７０の測定された編集効率（実施例１で上述したようにトランスフェクションの７２時間後のインデル生成頻度によって決定される、図２を参照）がＲＳＱ２２３３７のそれよりも高い一方で、コードエクソン領域を標的とするノックイン構築物によってレスキューされる細胞の割合が有意に高いことから、驚くべきことである。

更なる実験セットでは、ｉＰＳ細胞を、上記のように、それぞれＰＬＡ１５９３（ドナー鋳型配列番号４４を含む）又はＰＬＡ１６５１（ドナー鋳型配列番号４６を含む）二本鎖ＤＮＡドナー鋳型プラスミドと共に、ＡｓＣａｓ１２ａ（配列番号６２）及びＲＳＱ２２３３７（配列番号９５）又はＲＳＱ２４５７０（配列番号１０８）を含むＲＮＰと接触させた。ヌクレオフェクションの７日後にフローサイトメトリーを実施して、ＧＦＰ発現を検出し、各プラスミド媒介ドナー鋳型及びノックインカセットがそのそれぞれのＧＡＰＤＨ標的部位にうまく組み込まれた程度を決定することを促進した。図１７ＡにおけるＧＡＰＤＨの結果は、ＲＳＱ２２３３７を含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞がＲＳＱ２４７５０でヌクレオフェクトされた細胞と比較して、はるかに高い量のＧＦＰ発現を示し、ほとんどの細胞がエレクトロポレーション後７日目にＧＦＰを発現することを示している。これは、ＧＦＰをコードするノックインカセットがＲＳＱ２２３３７トランスフェクト細胞内に高レベルでうまく組み込まれたことを示唆する。ＲＳＱ２４７５０を含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞は、はるかに低いＧＦＰ発現を示し、ノックインカセットがこれらの細胞のほとんどにうまく組み込まれなかったことを示す（図１７Ａ）。図１７ＢのＧＡＰＤＨ結果は、ＲＳＱ２２３３７の使用がＲＮＰトランスフェクションの４８時間後にゲノムＤＮＡを使用して測定した場合、約８０％の編集をもたらし、一方、ＲＳＱ２４５７０はＲＮＰトランスフェクションの４８時間後にゲノムＤＮＡを使用して測定した場合、約７５％の編集をもたらしたことを示す。ＲＳＱ２２３３７の高い編集は図１７Ａに示される高いＧＦＰ発現レベルとよく相関したが、ＲＳＱ２４７５０の高い編集は図１７Ａに示される低いＧＦＰ発現レベルとあまり相関しなかった。図１７Ｃは、編集された細胞の相対的な組み込まれた「カーゴ」（ＧＦＰ）発現強度を示す。最後に、ＲＳＱ２２３３７及びＰＬＡ１５９３ドナープラスミドを含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞におけるＧＡＰＤＨアレルにおけるノックイン組み込み事象のパーセンテージを決定するために、ｄｄＰＣＲアッセイを行った。図１９は、ｄｄＰＣＲにより、アレルの６０％超がＧＦＰをコードするカセットをうまくノックインしたことを示す。

実施例３：複数のカーゴの標的組み込みによるＧＡＰＤＨノックアウトのレスキュー
いくつかの場合において、２つ以上の異なる外因性コード配列、例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子座などの単一の必須遺伝子座に組み込まれた２つ以上の異なる外因性遺伝子を含む編集された細胞を効率的に生成及び単離するために、本明細書に開示される選択及びカーゴノックイン戦略を使用することが望ましい。図１４は、２つ以上の異なる外因性コード領域を必須遺伝子座に導入するための２つの戦略を示す。図１４Ａは、リンカー（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ及び／又はＩＲＥＳ、配列番号２９～３２及び３３～３７を参照）によって分離された、多シストロン性ノックインカセット、例えば、２つ以上のコード領域（図１４ＡのＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ）を含む２シストロン性ノックインカセットが必須遺伝子、例えばＧＡＰＤＨのアレルの一方又は両方に挿入される、第１の例示的な戦略を示す。図１４Ｂは、異なるカーゴ配列（例えば、図１４ＢのＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙなどの異なる外因性遺伝子）を含む２つのノックインカセットが必須遺伝子座、例えば、ＧＡＰＤＨの別々のアレルに挿入される、第２の例示的戦略（二対立遺伝子挿入戦略）を示す。

図１４Ａに示す組み込み戦略を試験し、ノックインカセット中のリンカーの異なる組み合わせの使用がカーゴ配列の発現に影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、実験を行った。Ｃａｓ１２ａ及びＲＳＱ２２３３７（実施例１及び２に記載されるように、ＧＡＰＤＨ遺伝子座を標的とする）を含むＲＮＰを、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙをコードする「カーゴ」配列を含む２シストロン性ノックインカセットを含む６つの異なるプラスミド（ＰＬＡ）の１つでｉＰＳＣにヌクレオフェクトした（図１５Ａに示されるように、ＰＬＡ１５７３、ＰＬＡ１５７４、ＰＬＡ１５７５、ＰＬＡ１５８２、ＰＬＡ１５８３及びＰＬＡ１５８４；ドナー鋳型配列番号３８～４３を含む）。ＧＦＰはこれらの構築物のそれぞれにおける第１のカーゴであり、ｍＣｈｅｒｒｙは第２のカーゴであった。試験したプラスミドのそれぞれは、コード配列間に異なるリンカーの組み合わせを含んでいた（図１５Ａに示すように、リンカー１及び２）。ＰＬＡ１５７３（ドナー鋳型配列番号３８を含む）は、リンカー１及び２としてそれぞれＴ２Ａ及びＴ２Ａを含み；ＰＬＡ１５７４（ドナー鋳型配列番号３９を含む）は、リンカー１及び２としてそれぞれＰ２Ａ及びＩＲＥＳを含み；ＰＬＡ１５７５（ドナー鋳型配列番号４０を含む）は、リンカー１及び２としてそれぞれＰ２Ａ及びＰ２Ａを含み；ＰＬＡ１５８２（ドナー鋳型配列番号４１を含む）は、リンカー１及び２としてそれぞれＰ２Ａ及びＴ２Ａを含み；ＰＬＡ１５８３（ドナー鋳型配列番号４２を含む）は、リンカー１及び２としてそれぞれＴ２Ａ及びＰ２Ａを含み；ＰＬＡ１５８４（ドナー鋳型配列番号４３を含む）は、リンカー１及び２としてそれぞれＴ２Ａ及びＩＲＥＳを含んでいた。図１５Ｂ及び図１５Ｃは、ＧＡＰＤＨ遺伝子座における様々なノックインカセット組み込み事象の結果を示す。図１５Ｂは、例示的なプラスミドＰＬＡ１５８２、ＰＬＡ１５８３及びＰＬＡ１５８４を用いたヌクレオフェクションの９日後の編集されたｉＰＳＣの例示的な顕微鏡画像（Ｋｅｙｅｎｃｅ顕微鏡上の２Ｘでの明視野及び蛍光顕微鏡法）を示し、これらのそれぞれは、検出可能なＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ発現を示した。

図１５Ｃは、異なる記載されたリンカー対を有する２シストロン性ノックインカセットを含む図１５Ａに記載された様々なプラスミドでヌクレオフェクトされたｉＰＳＣにおけるＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光レベルを定量化する（ＰＬＡ１５７５、ＰＬＡ１５８２、ＰＬＡ１５７４、ＰＬＡ１５８３、ＰＬＡ１５７３及びＰＬＡ１５８４）。これらの２シストロン性構築物の各において、ＧＦＰは常に第１のカーゴであり、ｍＣｈｅｒｒｙは常に第２のカーゴであった。唯一の「カーゴ」としてｍＣｈｅｒｒｙを有するノックインカセットを含むプラスミド（図１５Ｃに示す）も、対照として試験した。データは、第１のカーゴとしてのＧＦＰの発現レベルが２シストロン性構築物間で類似しており、第２のカーゴであるｍＣｈｅｒｒｙの発現レベルよりも一貫して高いことを示す。唯一のカーゴとしてｍＣｈｅｒｒｙを含む対照ノックインカセットを含有する細胞は、最も高いｍＣｈｅｒｒｙ発現を示し、これは、それを２シストロン性カセット中の第２のカーゴとして配置することにより、カーゴの発現を変化させる（例えば、減少させる）ことが可能であることを示唆する。加えて、図１５Ｃは、第２のカーゴコード配列の直前のＩＲＥＳリンカーの配置が、第２のカーゴコード配列の前のＰ２Ａ又はＴ２Ａリンカーの配置と比較した場合、第２のカーゴのより低い発現をもたらしたことを示す。従って、結果は、カセット中のカーゴの順序を変えること（より高い発現のために第１のカーゴとしてカーゴを配置すること又はより低い発現のために第２のカーゴとしてカーゴを配置すること）により、且つカーゴのそれぞれの上流に特定のリンカー（より高い発現のためにＰ２Ａ又はＴ２Ａ；より低い発現のためにＩＲＥＳ）を配置することにより、多シストロン性ノックインカセットからの２つのカーゴコード配列の発現を差次的に調節する（即ち増加又は減少させる）ことが可能であることを示す。

図１４Ｂに示した二対立遺伝子組み込み戦略を試験するために実験を行った。Ｃａｓ１２ａ及びＲＳＱ２２３３７（実施例１及び２に記載されるように、ＧＡＰＤＨ遺伝子座を標的とする）を含むＲＮＰを、２つの異なるプラスミドでｉＰＳＣにヌクレオフェクトした。１つのプラスミドは、カーゴとしてＧＦＰコード配列を含むノックインカセットを含み、第２のプラスミドは、カーゴとしてｍＣｈｅｒｒｙコード配列を含むノックインカセットを含んでいた（図１４Ｂに示すように）。図１６Ａは、ヌクレオフェクトされたｉＰＳＣの例示的なフローサイトメトリーデータを示す。ゲーティングは、ヌクレオフェクトされた細胞の高いパーセンテージ、約１５％がＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙを発現することを示し、ＧＦＰノックインカセット及びｍＣｈｅｒｒｙノックインカセットがそれぞれＧＡＰＤＨのアレルに組み込まれたことを示唆した。ヌクレオフェクトされた細胞の約４１％がｍＣｈｅｒｒｙを発現し、ヌクレオフェクトされた細胞の約３６％がＧＦＰを発現した。

ｉＰＳＣの集団におけるＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの二対立遺伝子挿入を試験するために、更なる実験を行った。ｉＰＳＣ集団を記載のように形質転換した。細胞を、Ｃａｓ１２ａ及びＲＳＱ２２３３７（実施例１及び２に記載されるように、ＧＡＰＤＨ遺伝子座を標的とする）並びに２．５μｇのドナー鋳型（５回の試験）又は５μｇのドナー鋳型（１回の試験）を含む０．５μＭのＲＮＰでヌクレオフェクトし、次いで、ヌクレオフェクションの３又は９日後に選別した。フローサイトメトリー分析によって分析された編集された細胞集団の例示的な画像を図１６Ｂに示す。図１６Ｃは、これらの試験からのフローサイトメトリー分析結果を提供する。図１６Ｃの各時点（３日目又は９日目）におけるより大きいバーは、少なくとも１つのカーゴ、例えば、ＧＦＰの少なくとも１つのアレル及び／又はｍＣｈｅｒｒｙカーゴの少なくとも１つのアレルを陽性に発現する各集団における細胞の総パーセンテージを表す。各時点におけるより小さいバーは、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの両方を発現する各集団における細胞のパーセンテージを示し、従ってＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ二対立遺伝子組み込みを有する細胞を表す。これらの結果は、各集団における形質転換細胞の約８～１５％が形質転換後９日目に二対立遺伝子ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ挿入表現型を示すことを示した。

実施例４：標的組み込みを介したＢ２Ｍノックアウトのレスキュー
実施例２に記載されたアプローチを用いて、ＮＫ細胞中のＢ２Ｍ遺伝子を標的とする（例えば、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞などのＮＫ細胞を直接標的とするか、又はその後、ＮＫ細胞に分化するｉＰＳ細胞を標的とすることによって）。機能的Ｂ２Ｍ遺伝子を欠くＮＫ細胞は、互いの表面上のＭＨＣクラスＩを認識することができず、互いに攻撃し合い、フラトリサイドとして知られる現象において集団を枯渇させる。Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトし、機能的Ｂ２Ｍ遺伝子も回復する「カーゴ」配列をノックインすることにより、ノックイン細胞型が自動的に濃縮される。

実施例５：標的組み込みを介したノックアウトための候補必須遺伝子としてのＲＰＬＰ０の評価
実施例２に記載したノックイン組み込み及び選択アプローチを、細胞中の他の必須遺伝子、例えばＲＰＬＰ０遺伝子などのリボソーム遺伝子を標的とする際の潜在的使用について評価した。ＲＰＬＰ０遺伝子は、６０Ｓサブユニットの構成要素であるリボソームタンパク質をコードする。リボソームタンパク質Ｐ０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質Ｌ１０の機能的均等物であり、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイにおいてハウスキーピング遺伝子として一般に使用される。

ＲＰＬＰ０遺伝子の末端エクソンを標的とする例示的なＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡを以下の表８に示す。ガイドＲＮＡは、以下の設計：５’－ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ－［２１－ｍｅｒターゲティングドメイン配列］－３’（配列番号９０）を有する全て４１－ｍｅｒのＲＮＡ分子である。図７及び図８は、これらのガイドをＲＰＬＰ０遺伝子の末端エクソンにマッピングする。

しかしながら、表８におけるゲノムの他の場所（ＲＰＬＰ０遺伝子座の外側）におけるｇＲＮＡの潜在的なオフターゲット部位の分析は、リボソームの構造又は機能に関連する他の必須遺伝子におけるいくつかの同一又はほぼ同一のｇＲＮＡの標的結合部位を明らかにし、これは、リボソーム遺伝子の高度に保存された性質に起因する可能性がある（データは示さず）。表８のｇＲＮＡを含むＲＮＰを細胞にトランスフェクトすることは、実施例２に記載したように、編集されたＲＰＬＰ０遺伝子を回復するように設計されたドナープラスミドの存在下でさえ、ＲＰＬＰ０以外の他の必須遺伝子にインデルを導入することにより、細胞の大部分を潜在的に殺傷することができる。加えて及び／又は代替的に、オフターゲットは一次標的遺伝子座からＲＮＰ複合体を除去し、編集率の低下及び所望の組み込み事象の減少をもたらし得る。従って、ＲＰＬＰ０におけるこれらの特定のｇＲＮＡターゲティング部位は、本明細書に記載されるノックイン組み込み及び選択アプローチのための可能な候補として割り引かれた。

実施例６：標的組み込みを介したノックアウトのための候補必須遺伝子としてのＲＰＬ１３Ａの評価
実施例２に記載のノックイン組み込み及び選択アプローチを、細胞中の他の必須遺伝子を標的とする際の潜在的な使用について評価した。ＲＰＬ１３Ａ遺伝子はリボソームと関連するが、標準的なリボソーム機能には必要とされず、リボソーム外機能を有する。それは、ｒＲＮＡのメチル化に関与し、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイにおいてハウスキーピング遺伝子として一般に使用される。

ＲＰＬ１３Ａ遺伝子の末端エクソンを標的とする例示的なＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡを以下の表９に示す。ガイドＲＮＡは、以下の設計：５’－ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ－［２１］－ｍｅｒターゲティングドメイン配列］－３’（配列番号９０）を有する全て４１ｍｅｒのＲＮＡ分子である。図９及び図１０は、これらのガイドをＲＰＬ１３Ａ遺伝子の末端エクソンにマッピングする。

しかしながら、表９におけるゲノムの他の場所（ＲＰＬ１３Ａ遺伝子座の外側）におけるｇＲＮＡの潜在的なオフターゲット部位の分析は、リボソームの構造又は機能に関連する他の必須遺伝子におけるいくつかの同一又はほぼ同一のｇＲＮＡの標的結合部位を明らかにし、これは、リボソーム遺伝子の高度に保存された性質に起因する可能性がある（データは示さず）。表９からのｇＲＮＡを含むＲＮＰを細胞にトランスフェクトすることは、実施例２に記載したように、編集されたＲＰＬ１３Ａ遺伝子を回復するように設計されたドナープラスミドの存在下でさえ、ＲＰＬ１３Ａ以外の他の必須遺伝子にインデルを導入することにより、細胞の大部分を潜在的に殺傷することができる。加えて及び／又は代替的に、オフターゲットは一次標的遺伝子座からＲＮＰ複合体を除去し、編集率の低下及び所望の組み込み事象の減少をもたらし得る。従って、ＲＰＬ１３Ａにおけるこれらの特定のｇＲＮＡターゲティング部位は、本明細書に記載されるノックイン組み込み及び選択アプローチのための可能な候補として割り引かれた。

実施例７：標的組み込みを介したノックアウトのための候補必須遺伝子としてのＲＰＬ７の評価
実施例２に記載のノックイン組み込み及び選択アプローチを、細胞中の他の必須遺伝子、例えば細胞中のＲＰＬ７遺伝子などのリボソーム遺伝子を標的とする際の潜在的な使用について評価した。ＲＰＬ７遺伝子は、６０Ｓサブユニットの構成要素であるリボソームタンパク質をコードする。このリボソームタンパク質は、２８ＳｒＲＮＡ及びｍＲＮＡにおけるＧに富む構造に結合し、翻訳装置において調節的役割を果たす。

ＲＰＬ７遺伝子の末端エクソンを標的とする例示的なＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡを以下の表１０に示す。ガイドＲＮＡは、以下の設計：５’－ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ－［２１ｍｅｒターゲティングドメイン配列］－３’（配列番号９０）を有する全て４１－ｍｅｒのＲＮＡ分子である。図１１及び図１２は、これらのガイドをＲＰＬ７遺伝子の末端エクソンにマッピングする。

しかしながら、表１０におけるゲノムの他の場所（ＲＰＬ７遺伝子座の外側）におけるｇＲＮＡの潜在的なオフターゲット部位の分析は、リボソームの構造又は機能に関連する他の必須遺伝子におけるいくつかの同一又はほぼ同一のｇＲＮＡの標的結合部位を明らかにし、これは、リボソーム遺伝子の高度に保存された性質に起因する可能性がある（データは示さず）。表１０からのｇＲＮＡを含むＲＮＰを細胞にトランスフェクトすることは、実施例２に記載したように、編集されたＲＰＬ７遺伝子を回復するように設計されたドナープラスミドの存在下でさえ、ＲＰＬ７以外の他の必須遺伝子にインデルを導入することにより、細胞の大部分を潜在的に殺傷することができる。加えて及び／又は代替的に、オフターゲットは一次標的遺伝子座からＲＮＰ複合体を滴定除去し、編集率の低下及び所望の組み込み事象の減少をもたらし得る。従って、ＲＰＬ７におけるこれらの特定のｇＲＮＡターゲティング部位は、本明細書に記載されるノックイン組み込み及び選択アプローチのための可能な候補として割り引かれた。

実施例８：標的組み込みを介したＴＢＰノックアウトのレスキュー
実施例２に記載のノックイン組み込み及び選択アプローチを用いて、ｉＰＳＣ中のＴＢＰ遺伝子を標的とした。ｉＰＳＣをこの実験の目的のために試験したが、記載された方法は他の細胞型に適用することができる。ＴＢＰ遺伝子は、転写開始装置において重要な役割を果たす転写調節因子であるＴＡＴＡボックス結合タンパク質をコードする。ＴＢＰ遺伝子の末端エクソンを標的とするＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡを以下の表１１に示す。ガイドＲＮＡは、以下の設計：５’－ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ－［２１］－ｍｅｒターゲティングドメイン配列］－３’（配列番号９０）を有する全て４１－ｍｅｒのＲＮＡ分子である。

表１１に記載のＲＳＱ３３５０２、ＲＳＱ３３５０３及びＲＳＱ３３５０４（配列番号１４８～１５０）はそれぞれ、ＴＢＰに対して高度に特異的であり、ゲノム中に最小のオフターゲット部位を有すると決定された（データは示さず）。従って、ＴＢＰ遺伝子は、少なくとも部分的には末端エクソン（それぞれ、ｍＲＮＡアイソフォーム１エクソン８又はｍＲＮＡアイソフォーム２エクソン７）を非常に特異的に標的化することが可能な利用可能なｇＲＮＡがあるため、本明細書に記載のカーゴ組み込み及び選択方法のための良好な候補遺伝子標的と考えられた。しかしながら、これらのｇＲＮＡのいずれかが本明細書に記載の方法に非常に適しているためには、遺伝子機能をノックアウト及び／又は重度に低下させるＴＢＰ遺伝子座の位置にインデルを導入するのに非常に有効である必要がある。

次いで、ＲＮＰ誘導インデルをこの必須遺伝子のコード領域に導入することによって生じる致死的表現型をレスキューするプロセスにおいて、これらのｇＲＮＡのそれぞれを試験して、細胞のＴＢＰ遺伝子の末端エクソンに、ＴＢＰの一部及びＧＦＰをコードするインフレームカーゴ配列を含むカセットをノックインするために使用することができるかどうかを決定した。試験されたｇＲＮＡが高頻度での機能に重要なＴＢＰの位置にインデルを導入するのに有効である場合、ＨＤＲを受けずにノックインカセットを組み込んだトランスフェクト細胞は死滅し、ＴＢＰ遺伝子座からＧＦＰを発現する細胞の大集団をもたらすと予想される。具体的には、ｉＰＳＣ細胞を、ＡｓＣａｓ１２ａ（配列番号６２）及びＲＳＱ３３５０２、ＲＳＱ３３５０３又はＲＳＱ３３５０４（配列番号１４８～１５０）を含むＲＮＰ並びにそれぞれのｇＲＮＡ標的結合部位でＨＤＲを媒介するように設計された二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（ｄｓＤＮＡプラスミド）と接触させた。二本鎖ＤＮＡドナー鋳型は、最終ＴＢＰエクソンコード配列（それぞれｍＲＮＡアイソフォーム１エクソン８又はｍＲＮＡアイソフォーム２エクソン７）の一部のコドン最適化バージョンとインフレーム且つ下流（３’側）にＧＦＰのコード配列を有するノックインカセット（「カーゴ」）と、ＧＡＰＤＨについて実施例２に記載のｄｓＤＮＡプラスミドと同様のＰ２Ａ自己切断ペプチド（「Ｐ２Ａ」）をコードする配列とを含んだ。二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（ＰＬＡ１６１５、ＰＬＡ１６１６又はＰＬＡ１６１７；ドナー鋳型配列番号４７、４９又は５０を含む）中のＴＢＰ配列をコドン最適化して、付随するガイドＲＮＡ分子（ＲＳＱ３３５０２、ＲＳＱ３３５０３又はＲＳＱ３３５０４）による更なる結合を防止した。ノックインカセットは、カーゴ配列の下流に３’ＵＴＲ及びポリＡシグナル配列も含んだ。ＲＳＱ３３５０２を含むＲＮＰをＰＬＡ１６１５（ドナー鋳型配列番号４７を含む）と共に投与し；ＲＳＱ３３５０３をＰＬＡ１６１６（ドナー鋳型配列番号４９を含む）と共に投与し；ＲＳＱ３３５０４をＰＬＡ１６１７（ドナー鋳型配列番号５０を含む）と共に投与した。特定の各ｄｓＤＮＡプラスミド（ＰＬＡ）は、相同性アームを有するドナー鋳型と、ノックインカセット組み込み後に特定のｇＲＮＡ標的部位を特異的に包含し、無効にするように設計されたノックインカセットとを含んだ。

フローサイトメトリーはヌクレオフェクションの７日後に行い、各プラスミドベースのノックインカセットがそのそれぞれのＴＢＰ標的部位にうまく組み込まれた程度を決定するのに役立てるために使用した。図１７Ａは、ＲＳＱ３３５０３を含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞が、他のＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞と比較して、最大量のＧＦＰ発現を示したことを示し、これらの細胞内にＧＦＰをコードするノックインカセットが高レベルでうまく組み込まれたことを示唆した。図１８は、ＲＳＱ３３５０３（配列番号１４９）及びＰＬＡ１６１６（ドナー鋳型配列番号４９を含む）プラスミドを含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞の約７６％が、ＰＬＡ１６１６プラスミド単独（ＲＮＰ対照なし）でヌクレオフェクトされた細胞の約１％のみと比較して、ＧＦＰを発現したことを示す。ＲＳＱ３３５０４（配列番号１５０）を含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞も高レベルのＧＦＰ発現を示し、より高いノックインカセット組み込みレベルを示唆した（図１７Ａ）。ＲＳＱ３３５０２（配列番号１４８）を含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞は、はるかに低いＧＦＰ発現を示し、ノックインカセットがこれらの細胞のほとんどにうまく組み込まれなかったことを示した（図１７Ａ）。図１７Ｂは、ＲＳＱ３３５０３（配列番号１４９）を含むＲＮＰの使用が約８０％の編集をもたらしたことを示し、これは図１７Ａに示されるより高いＧＦＰ発現レベルと相関した。パーセンテージ編集はトランスフェクションの２日後に測定し、ＩＣＥアッセイによって決定した（Ｈｓｉａｕｅｔａｌ．，ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓｆｒｏｍＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅＤａｔａ．ＢｉｏＲｘｉｖ，２５１０８２，Ａｕｇｕｓｔ２０１９に記載されるように）。ＲＳＱ３３５０２（配列番号１４８）を含むＲＮＰの使用は、比較的低い編集パーセンテージをもたらし、これは図１７Ａにおける低いＧＦＰ発現と相関した。図１７Ｃは、編集された細胞の相対的な組み込まれた「カーゴ」（ＧＦＰ）発現強度を示す。最後に、ＲＳＱ３３５０３（配列番号１４９）及びＰＬＡ１６１６ドナープラスミド（ドナー鋳型配列番号４９を含む）を含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞のＴＢＰアレルへのＧＦＰカーゴのパーセントノックインを決定するために、ｄｄＰＣＲアッセイを行った。図１９は、ｄｄＰＣＲにより、４０％を超えるＴＢＰアレルがＧＦＰをコードするカセットをうまくノックインしたことを示す。

実施例９：標的組み込みを介したＥ２Ｆ４ノックアウトのレスキュー
実施例２に記載のノックイン組み込み及び選択アプローチを用いて、ｉＰＳＣ中のＥ２Ｆ４遺伝子を標的とした。ｉＰＳＣをこの実験の目的のために試験したが、記載された方法は他の細胞型に適用することができる。Ｅ２Ｆ４遺伝子は、Ｅ２Ｆ転写因子４をコードする。この転写調節因子は、細胞周期調節において重要な役割を果たす。Ｅ２Ｆ４遺伝子の末端エクソンを標的とするＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡを以下の表１２に示す。ガイドＲＮＡは、以下の設計：５’－ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ－［２１－ｍｅｒターゲティングドメイン配列］－３’（配列番号９０）を有する全て４１－ｍｅｒのＲＮＡ分子である。

ＲＳＱ３３５０５、ＲＳＱ３３５０６及びＲＳＱ３３５０７（配列番号１５１～１５３）はそれぞれ、Ｅ２Ｆ４に対して高度に特異的であり、ゲノム中に最小のオフターゲット部位を有すると決定された（データは示さず）。従って、Ｅ２Ｆ４遺伝子は、少なくとも部分的には末端エクソン（エクソン１０）を非常に特異的に標的化することが可能な利用可能なｇＲＮＡがあるため、本明細書に記載のカーゴ組み込み及び選択方法のための良好な候補遺伝子標的と考えられた。しかしながら、これらのｇＲＮＡのいずれかが本明細書に記載の方法に非常に適しているためには、遺伝子機能をノックアウトするか又は重度に低下させるＥ２Ｆ４遺伝子座の位置にインデルを導入するのに非常に有効である必要がある。

次いで、ＲＮＰ誘導インデルをこの必須遺伝子のコード領域に高頻度で導入することによって生じる致死的表現型をレスキューするプロセスにおいて、ｇＲＮＡＲＳＱ３３５０５、ＲＳＱ３３５０６及びＲＳＱ３３５０７（配列番号１５１～１５３）を試験して、Ｅ２Ｆ４の一部及びＧＦＰをコードするカーゴ配列を含むカセットを、細胞のＥ２Ｆ４遺伝子座の末端エクソンにノックインするために使用することができるかどうかを決定した。具体的には、ｉＰＳＣを、ＡｓＣａｓ１２ａ（配列番号６２）及びＲＳＱ３３５０５、ＲＳＱ３３５０６又はＲＳＱ３３５０７（配列番号１５１～１５３）を含むＲＮＰ並びにそれぞれのｇＲＮＡ標的結合部位でＨＤＲを媒介するように設計された二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（ｄｓＤＮＡプラスミド）と接触させた。二本鎖ＤＮＡドナー鋳型は、最終Ｅ２Ｆ４エクソンコード配列（エクソン１０）のコドン最適化バージョンとインフレームで且つ下流（３’側）にＧＦＰのコード配列を有するノックインカセット（「カーゴ」）と、ＧＡＰＤＨについて実施例２に記載のｄｓＤＮＡプラスミドと同様のＰ２Ａ自己切断ペプチド（「Ｐ２Ａ」）をコードする配列とを含んだ。二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（ＰＬＡ１６２６、ＰＬＡ１６２７又はＰＬＡ１６２８；ドナー鋳型配列番号５２～５４を含む）中のＥ２Ｆ４配列をコドン最適化して、付随するガイドＲＮＡ分子（ＲＳＱ３３５０５、ＲＳＱ３３５０６又はＲＳＱ３３５０７；配列番号１５１～１５３）による更なる結合を防止した。ノックインカセットは、カーゴ配列の下流に３’ＵＴＲ及びポリＡシグナル配列も含んだ。ＲＳＱ３３５０５（配列番号１５１）を含むＲＮＰはＰＬＡ１６２６（ドナー配列番号５２を含む）と共に投与され；ＲＳＱ３３５０６（配列番号１５２）はＰＬＡ１６２７（ドナー配列番号５３を含む）と共に投与され；ＲＳＱ３３５０７（配列番号１５３）はＰＬＡ１６２８（ドナー配列番号５４を含む）と共に投与された。特定の各ｄｓＤＮＡプラスミド（ＰＬＡ）は、相同性アームを有するドナー鋳型と、組み込み後に特定のｇＲＮＡ標的部位を特異的に包含し、無効にするように設計されたノックインカセットとを含んだ。

ヌクレオフェクションの７日後にフローサイトメトリーを行い、各プラスミドベースのノックインカセットがそのそれぞれのＥ２Ｆ４標的部位にうまく組み込まれた程度を決定するのに役立てるために使用した。図１７Ａは、ＲＳＱ３３５０５（配列番号１５１）を含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞が、Ｅ２Ｆ４を標的とする他のＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞と比較して、最大量のＧＦＰ発現を示したことを示し、ＧＦＰをコードするノックインカセットがこれらの細胞の多くにうまく組み込まれたことを示唆した。ＲＳＱ３３５０６又はＲＳＱ３３５０７（配列番号１５２及び１５３）を含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞は、はるかに低いＧＦＰ発現を示し、ノックインカセットがこれらの細胞のほとんどにうまく組み込まれなかったことを示した（図１７Ａ）。図１７Ｂは、ＲＳＱ３３５０５（配列番号１５１）又はＲＳＱ３３５０６（配列番号１５２）を含むＲＮＰの使用が、ＲＮＰトランスフェクションの４８時間後に測定した場合、それぞれ約１５％及び約２０％の編集率をもたらしたことを示す。ＲＳＱ３３５０５（配列番号１５１）についての比較的低い観察された編集率は、Ｅ２Ｆ４における比較的高いレベルのＧＦＰ組み込みと予想外に相関すると考えられ得（図１７Ａにおいて観察されるように）、４８時間における編集された細胞の集団内の有意な死の結果であり得る。パーセンテージ編集はトランスフェクションの２日後に測定し、ＩＣＥアッセイによって決定した（Ｈｓｉａｕｅｔａｌ．，Ａｕｇｕｓｔ２０１９に記載されるように）。図１７Ｃは、編集された細胞の相対的な組み込まれた「カーゴ」（ＧＦＰ）発現強度を示す。

実施例１０：標的組み込みを介したＧ６ＰＤノックアウトのレスキュー
実施例２に記載のノックイン組み込み及び選択アプローチを用いて、ｉＰＳＣ中のＧ６ＰＤ遺伝子を標的とした。ｉＰＳＣをこの実験の目的のために試験したが、記載された方法は他の細胞型に適用することができる。Ｇ６ＰＤ遺伝子はグルコース－６リン酸デヒドロゲナーゼをコードする。この代謝酵素は、解糖及びＮＡＤＰＨ産生において重要な役割を果たす。Ｇ６ＰＤ遺伝子の末端エクソンを標的とするＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡを以下の表１３に示す。

ＲＳＱ３３５０８（配列番号１５４）は、Ｇ６ＰＤに高度に特異的であると決定され、ゲノム中に最小のオフターゲット部位を有する（データは示さず）。従って、Ｇ６ＰＤ遺伝子は、少なくとも部分的には末端エクソン（エクソン１３）を非常に特異的に標的化することが可能な利用可能なｇＲＮＡがあるため、本明細書に記載のカーゴ組み込み及び選択方法のための良好な候補遺伝子標的と考えられた。

次いで、ＲＮＰ誘導インデルをこの必須遺伝子のコード領域に高頻度で導入することによって生じる致死的表現型をレスキューするプロセスにおいて、ｇＲＮＡＲＳＱ３３５０８（配列番号１５４）を試験して、Ｇ６ＰＤの一部及びＧＦＰをコードするカーゴ配列を含むカセットを、細胞のＧ６ＰＤ遺伝子座の末端エクソンにノックインするために使用することができるかどうかを決定した。具体的には、ｉＰＳＣを、ＡｓＣａｓ１２ａ（配列番号６２）及びＲＳＱ３３５０８（配列番号１５４）を含むＲＮＰ並びにＨＤＲをｇＲＮＡ標的結合部位で媒介するように設計された二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（ｄｓＤＮＡプラスミド）と接触させた。二本鎖ＤＮＡドナー鋳型は、最終Ｇ６ＰＤエクソンコード配列（エクソン１３）のコドン最適化バージョンとインフレームで且つ下流（３’側）にＧＦＰのコード配列を有するノックインカセット（「カーゴ」）と、ＧＡＰＤＨについて実施例２に記載のｄｓＤＮＡプラスミドと同様のＰ２Ａ自己切断ペプチド（「Ｐ２Ａ」）をコードする配列とを含んだ。二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（ＰＬＡ１６１８；ドナー鋳型配列番号５１を含む）中のＧ６ＰＤ配列をコドン最適化して、付随するガイドＲＮＡ分子（ＲＳＱ３３５０８）による更なる結合を防止した。ノックインカセットは、カーゴ配列の下流に３’ＵＴＲ及びポリＡシグナル配列も含んだ。ＲＳＱ３３５０８（配列番号１５４）を含むＲＮＰを、ＰＬＡ１６１８（ドナー鋳型配列番号５１を含む）と共に投与した。ｄｓＤＮＡプラスミド（ＰＬＡ）は、相同性アームを有するドナー鋳型と、組み込み後に付随するｇＲＮＡ標的部位を特異的に包含し、無効にするように設計されたノックインカセットとを含んだ。

ヌクレオフェクションの７日後にフローサイトメトリーを行い、プラスミドベースのノックインカセットが、そのＧ６ＰＤ標的部位にうまく組み込まれた程度を決定するのに役立てるために使用した。図１７Ａは、ＲＳＱ３３５０８（配列番号１５４）を含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞が、アッセイされた細胞の約１０％においてＧＦＰ発現を示したことを示し、ＧＦＰをコードするノックインカセットがこれらの細胞内に比較的低いレベルで組み込まれていることを示唆する。図１７Ｃは、編集された細胞の相対的な組み込まれた「カーゴ」（ＧＦＰ）発現強度を示す。

実施例１１：標的組み込みを介したＫＩＦ１１ノックアウトのレスキュー
実施例２に記載のノックイン組み込み及び選択アプローチを用いて、ｉＰＳＣ中のＫＩＦ１１遺伝子を標的とした。ｉＰＳＣをこの実験の目的のために試験したが、記載された方法は他の細胞型に適用することができる。ＫＩＦ１１遺伝子は、キネシンファミリーメンバー１１をコードする。この酵素は、細胞内微小管に沿った微小管の移動及び有糸分裂中の染色体の配置において重要な役割を果たす。ＫＩＦ１１遺伝子の末端エクソンを標的とするＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ）ガイドＲＮＡを以下の表１４に示す。

ＲＳＱ３３５０９、ＲＳＱ３３５１０及びＲＳＱ３３５１１（配列番号１５５～１５７）はそれぞれ、ＫＩＦ１１に対して高度に特異的であり、ゲノム中に最小のオフターゲット部位を有すると決定された（データは示さず）。従って、ＫＩＦ１１遺伝子は、少なくとも部分的には、利用可能な末端エクソン（エクソン２２）を非常に特異的に標的化することができる利用可能なｇＲＮＡが存在するため、本明細書に記載のカーゴ組み込み及び選択方法のための良好な候補遺伝子標的と考えられた。しかしながら、これらのｇＲＮＡのいずれかが本明細書に記載の方法に非常に適しているためには、遺伝子機能をノックアウトするか又は重度に低下させるＫＩＦ１１遺伝子座の位置にインデルを導入するのに非常に有効である必要がある。

次いで、ＲＮＰ誘導インデルをこの必須遺伝子のコード領域に高頻度で導入することによって生じる致死的表現型をレスキューするプロセスにおいて、これらのｇＲＮＡのそれぞれを試験して、ＫＩＦ１１の一部及びＧＦＰをコードするカーゴ配列を含むカセットを、細胞のＫＩＦ１１遺伝子座の末端エクソンにノックインするために使用することができるかどうかを決定した。具体的には、ｉＰＳＣ細胞を、ＡｓＣａｓ１２ａ（配列番号６２）及びＲＳＱ３３５０９、ＲＳＱ３３５１０又はＲＳＱ３３５１１（配列番号１５５～１５７）を含むＲＮＰ並びにそれぞれのｇＲＮＡ標的結合部位でＨＤＲを媒介するように設計された二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（ｄｓＤＮＡプラスミド）と接触させた。二本鎖ＤＮＡドナー鋳型は、最終ＫＩＦ１１エクソンコード配列（エクソン２２）のコドン最適化バージョンとインフレームで且つ下流（３’側）にＧＦＰ（「カーゴ」）のコード配列を有するノックインカセットと、ＧＡＰＤＨについて実施例２に記載されたｄｓＤＮＡプラスミドと同様のＰ２Ａ自己切断ペプチド（「Ｐ２Ａ」）をコードする配列とを含んだ。二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（ＰＬＡ１６２９、ＰＬＡ１６３０又はＰＬＡ１６３１；ドナー鋳型配列番号５５～５７を含む）中のＫＩＦ１１配列をコドン最適化して、付随するガイドＲＮＡ分子（ＲＳＱ３３５０９、ＲＳＱ３３５１０又はＲＳＱ３３５１１；配列番号１５５～１５７）による更なる結合を防止した。ノックインカセットは、カーゴ配列の下流に３’ＵＴＲ及びポリＡシグナル配列も含んだ。ＲＳＱ３３５０９（配列番号１５５）を含むＲＮＰをＰＬＡ１６２９プラスミド（ドナー鋳型配列番号５５を含む）と共に投与し；ＲＳＱ３３５１０（配列番号１５６）をＰＬＡ１６３０（ドナー鋳型配列番号５６を含む）と共に投与し；ＲＳＱ３３５１１（配列番号１５７）をＰＬＡ１６３１（ドナー鋳型配列番号５７を含む）と共に投与した。特定の各ｄｓＤＮＡプラスミド（ＰＬＡ）は、相同性アームを有するドナー鋳型と、組み込み後に特定のｇＲＮＡ標的部位を特異的に包含し、無効にするように設計されたノックインカセットとを含んだ。

フローサイトメトリーをヌクレオフェクションの７日後に行い、各プラスミドノックインカセットがそのそれぞれのＫＩＦ１１標的部位にうまく組み込まれた程度を決定するのに役立てるために使用した。図１７Ａは、ＲＳＱ３３５０９（配列番号１５５）を含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞が、ＫＩＦ１１を標的とする他のＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞と比較して、最大量のＧＦＰ発現を示したことを示し、ＧＦＰをコードするノックインカセットがこれらの細胞の多くにうまく組み込まれたことを示唆する。ＲＳＱ３３５１０又はＲＳＱ３３５１１（配列番号１５６又は１５７）を含むＲＮＰでヌクレオフェクトされた細胞も、いくらかのＧＦＰ発現を示した（図１７Ａ）。図１７Ｂは、ＲＳＱ３３５０９（配列番号１５５）を含むＲＮＰの使用が、トランスフェクション後４８時間で約４０％の編集をもたらしたことを示し（より低いレベルはおそらく、この時点での細胞集団における有意な細胞死の結果である）、これは図１７Ａに示されるＧＦＰ発現レベルと相関する。興味深いことに、図１７Ｂは、ＲＳＱ３３５１０（配列番号１５６）を含むＲＮＰの使用が約９０％の観察された編集率をもたらし、一方、ＲＳＱ３３５１１（配列番号１５７）を含むＲＮＰは約６５％の観察された編集率をもたらしたが、これらのガイドをトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰ発現は、ＲＳＱ３３５０９（配列番号１５５）をトランスフェクトされた細胞と比較した場合、比較的低かった。これらの結果は、ＲＳＱ３３５１０又はＲＳＱ３３５１１（配列番号１５６又は１５７）ガイドがＫＩＦ１１において十分に有害なインデルを生成していない可能性があり、高い編集効率にもかかわらず、高い割合の細胞が生存可能であることを可能にし、その結果、トランスフェクトされた細胞は、カーゴがうまくノックインされたトランスフェクト細胞の効果的な選択を可能にするのに十分な数で死滅しなかったことを示唆する。従って、ＲＳＱ３３５１０及びＲＳＱ３３５１１（配列番号１５６又は１５７）ｇＲＮＡは、それらのＫＩＦ１１標的部位に対して高度に特異的であり（最小のオフターゲットを有する）、高い編集レベルを示すが、ＫＩＦ１１の十分な機能不全をもたらす傷害性インデルを誘導せず、従ってレスキューノックインカセットの相同組換えが起こらない場合に細胞死をもたらす可能性があるため、本明細書に記載の選択機構に適したｇＲＮＡではない可能性がある。パーセンテージ編集はトランスフェクションの２日後に測定し、ＩＣＥアッセイによって決定した（Ｈｓｉａｕｅｔａｌ．，Ａｕｇｕｓｔ２０１９に記載されるように）。

実施例１２：ウイルスベクターを用いた必須遺伝子座におけるカーゴのノックイン。
本実施例は、細胞集団のウイルスベクター形質導入を含む、本明細書に記載の遺伝子編集方法の使用を記載する。

本明細書に記載される標的細胞は、ドナー対象又は治療を必要とする対象（例えば、患者）から収集される。適切な選別、培養及び／又は分化プロセス後、標的細胞に、ｇＲＮＡ、適切なヌクレアーゼ及び／又は適切なレスキュー構築物を含むヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＡＡＶベクターを形質導入する。フローサイトメトリーを用いて細胞を選別して、成功した形質導入、編集、組み込み及び／又は発現事象を決定する。

造血幹細胞の集団に、ＧＡＰＤＨターゲティングＲＮＰ（配列番号６２のＣａｓ１２ａ及び配列番号９５のｇＲＮＡＲＳＱ２２３３７を含む）及びＰＬＡ１５９３（ドナー鋳型配列番号４４を含む）を含むＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）を形質導入する。成功した形質導入、編集、ノックインカセット組み込み及び／又は発現事象を、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーを用いて決定する。ＡＡＶ形質導入後、細胞の大部分はＲＮＰによってＧＡＰＤＨ遺伝子座で編集され、ＨＤＲを介してノックインカセットを組み込んでいる。造血幹細胞の集団に、ＴＢＰターゲティングＲＮＰ（配列番号６２のＣａｓ１２ａ及び配列番号１４９のｇＲＮＡＲＳＱ３３５０３を含む）及びＰＬＡ１６１６（ドナー鋳型配列番号４９を含む）を含むＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）を形質導入する。成功した形質導入、編集、組み込み及び／又は発現事象を、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーを用いて決定する。ＡＡＶ形質導入後、細胞の大部分はＲＮＰによってＴＢＰ遺伝子座で編集され、ＨＤＲを介してノックインカセットを組み込んでいる。

Ｔ細胞の集団に、ＧＡＰＤＨターゲティングＲＮＰ（配列番号６２のＣａｓ１２ａ及び配列番号９５のｇＲＮＡＲＳＱ２２３３７を含む）及びＰＬＡ１５９３（ドナー鋳型配列番号４４を含む）を含むＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）を形質導入する。成功した形質導入、編集、ノックインカセット組み込み及び／又は発現事象を、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーを用いて決定する。ＡＡＶ形質導入後、細胞の大部分はＲＮＰによってＧＡＰＤＨ遺伝子座で編集され、ＨＤＲを介してノックインカセットを組み込んでいる。Ｔ細胞集団に、ＴＢＰターゲティングＲＮＰ（配列番号６２のＣａｓ１２ａ及び配列番号１４９のｇＲＮＡＲＳＱ３３５０３を含む）及びＰＬＡ１６１６（ドナー鋳型配列番号４９を含む）を含むＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）を形質導入する。成功した形質導入、編集、組み込み及び／又は発現事象を、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーを用いて決定する。ＡＡＶ形質導入後、細胞の大部分はＲＮＰによってＴＢＰ遺伝子座で編集され、ＨＤＲを介してノックインカセットを組み込んでいる。

ＮＫ細胞の集団に、ＧＡＰＤＨターゲティングＲＮＰ（配列番号６２のＣａｓ１２ａ及び配列番号９５のｇＲＮＡＲＳＱ２２３３７を含む）及びＰＬＡ１５９３（ドナー鋳型配列番号４４を含む）を含むＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）を形質導入する。成功した形質導入、編集、ノックインカセット組み込み及び／又は発現事象を、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーを用いて決定する。ＡＡＶ形質導入後、細胞の大部分はＲＮＰによってＧＡＰＤＨ遺伝子座で編集され、ＨＤＲを介してノックインカセットを組み込んでいる。ＮＫ細胞集団に、ＴＢＰターゲティングＲＮＰ（配列番号６２のＣａｓ１２ａ及び配列番号１４９のｇＲＮＡＲＳＱ３３５０３を含む）及びＰＬＡ１６１６（ドナー鋳型配列番号４９を含む）を含むＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）を形質導入する。成功した形質導入、編集、ノックインカセット組み込み及び／又は発現事象を、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーを用いて決定する。ＡＡＶ形質導入後、細胞の大部分はＲＮＰによってＴＢＰ遺伝子座で編集され、ＨＤＲを介してノックインカセットを組み込んでいる。

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団に、ＧＡＰＤＨターゲティングＲＮＰ（配列番号６２のＣａｓ１２ａ及び配列番号９５のｇＲＮＡＲＳＱ２２３３７を含む）及びＰＬＡ１５９３（ドナー鋳型配列番号４４を含む）を含むＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）を形質導入する。成功した形質導入、編集、ノックインカセット組み込み及び／又は発現事象を、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーを用いて決定する。ＡＡＶ形質導入後、細胞の大部分はＲＮＰによってＧＡＰＤＨ遺伝子座で編集され、ＨＤＲを介してノックインカセットを組み込んでいる。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞集団に、ＴＢＰターゲティングＲＮＰ（配列番号６２のＣａｓ１２ａ及び配列番号１４９のｇＲＮＡＲＳＱ３３５０３を含む）及びＰＬＡ１６１６（ドナー鋳型配列番号４９を含む）を含むＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）を形質導入する。成功した形質導入、編集、ノックインカセット組み込み及び／又は発現事象を、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーを用いて決定する。ＡＡＶ形質導入後、細胞の大部分はＲＮＰによってＴＢＰ遺伝子座で編集され、ＨＤＲを介してノックインカセットを組み込んでいる。

ニューロンの集団に、ＧＡＰＤＨターゲティングＲＮＰ（配列番号６２のＣａｓ１２ａ及び配列番号９５のｇＲＮＡＲＳＱ２２３３７を含む）及びＰＬＡ１５９３（ドナー鋳型配列番号４４を含む）を含むＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）を形質導入する。成功した形質導入、編集、ノックインカセット組み込み及び／又は発現事象を、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーを用いて決定する。ＡＡＶ形質導入後、細胞の大部分はＲＮＰによってＧＡＰＤＨ遺伝子座で編集され、ＨＤＲを介してノックインカセットを組み込んでいる。ニューロンの集団に、ＴＢＰターゲティングＲＮＰ（配列番号６２のＣａｓ１２ａ及び配列番号１４９のｇＲＮＡＲＳＱ３３５０３を含む）及びＰＬＡ１６１６（ドナー鋳型配列番号４９を含む）を含むＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）を形質導入する。成功した形質導入、編集、ノックインカセット組み込み及び／又は発現事象を、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーを用いて決定する。ＡＡＶ形質導入後、細胞の大部分はＲＮＰによってＴＢＰ遺伝子座で編集され、ＨＤＲを介してノックインカセットを組み込んでいる。

実施例１３：ウイルスベクターを用いた必須遺伝子座におけるカーゴのノックイン。
本実施例は、Ｔ細胞の集団のウイルスベクター形質導入を含む本明細書に記載の方法を用いたＴ細胞の集団の遺伝子編集を記載する。本明細書に記載の方法は、他の免疫細胞などの他の細胞型にも適用することができる。

Ｔ細胞を、当技術分野で知られているようにビーズ浴中で解凍し、２日目に浴から取り出した。解凍後４日目に細胞をエレクトロポレーションし、手短にはＬｏｎｚａ９６ウェルキュベット中のウェル当たり２５０，０００個のＴ細胞を緩衝液Ｐ２中に懸濁し、ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的とするｇＲＮＡＲＳＱ２２３３７（配列番号９５）及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）を含む様々な濃度のＲＮＰ（４μＭＲＮＰ、２μＭＲＮＰ、１μＭＲＮＰ又は０．５μＭＲＮＰ）を、パルスコードＣＡ－１３７を使用してエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後に適切な培地を細胞に添加し、細胞を１５分間回復させた。次いで、ＧＦＰカーゴを有するノックインカセットを含むドナープラスミド構築物を含むＡＡＶ６ウイルス粒子を、様々な感染多重度（ＭＯＩ）濃度（５Ｅ４、２．５Ｅ４、１．２５Ｅ４、６．２５Ｅ３、３．１３Ｅ３、１．５６Ｅ３又は７．８１Ｅ２）でＴ細胞に添加した。ドナープラスミドは、実施例２に記載されるように、ガイドＲＮＡ（ＲＳＱ２２３３７）のｇＲＮＡターゲティングドメイン配列の更なる結合を防止するように最適化されたＧＡＰＤＨエクソン９の５’コドン最適化コード部分、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド（「Ｐ２Ａ」）をコードするインフレーム配列、ＧＦＰ（「カーゴ」）のインフレームコード配列、終止コドン及びポリＡシグナル配列を用いて設計した。Ｔ細胞を２日後に分割し、次いで、フローサイトメトリーによって分析されるまで４８時間毎に分割した。エレクトロポレーションの７日後にフローサイトメトリーを用いてＴ細胞を選別して、成功した形質導入、形質転換、編集、ノックインカセット組み込み及び／又は発現事象を決定した（図２０、図２１、図２２Ａ及び図２２Ｂを参照）。図２０に示すように、Ｔ細胞の集団に、４μＭＲＮＰ、２μＭＲＮＰ、１μＭＲＮＰ又は０．５μＭＲＮＰを、様々なＡＡＶ６感染多重度（ＭＯＩ）（５Ｅ４、２．５Ｅ４、１．２５Ｅ４、６．２５Ｅ３、３．１３Ｅ３、１．５６Ｅ３又は７．８１Ｅ２）で形質導入した。ＧＡＰＤＨ遺伝子における高い割合のＧＦＰ組み込みが、５Ｅ４ＡＡＶ６ＭＯＩの全てのＲＮＰ濃度で形質導入／形質転換されたＴ細胞集団において観察され、細胞が１．２５Ｅ４もの低いＡＡＶ６ＭＯＩで形質導入された場合、１μＭを超えるＲＮＰ濃度で観察された（図２０及び２２Ａを参照）。ＡＡＶ形質導入を伴わない対照実験は、ＧＦＰ組み込み事象を示さないＴ細胞集団をもたらした（図２２Ｂを参照）。細胞を様々なＭＯＩでＲＮＰ及びＡＡＶ６で形質転換した４日後にＴ細胞生存率を測定した（図２１）。

更に、本明細書に記載の方法を用いたノックイン効率を、当技術分野で公知の方法の最適化バージョンと比較した。手短には、Ｔ細胞集団に、本明細書に記載のＧＡＰＤＨ遺伝子でのＧＦＰのノックインに適したドナー鋳型を含むＡＡＶ６ベクターを形質導入し、上述したようにｇＲＮＡＲＳＱ２２３３７（配列番号９５）及びＣａｓ１２ａ（配列番号６２）で形質転換した；代替的に、ＡＡＶ６ベクター形質導入を用いたＴＲＡＣ遺伝子座での高度に最適化されたＧＦＰノックインにＴ細胞集団を供した（例えば、Ｖａｋｕｌｓｋａｓｅｔａｌ．Ａｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙＣａｓ９ｍｕｔａｎｔｄｅｌｉｖｅｒｅｄａｓａｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘｅｎａｂｌｅｓｅｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｈｕｍａｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍａｎｄｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ．ＮａｔＭｅｄ．２０１８；２４（８）：１２１６－１２２４を参照）。フローサイトメトリーを用いてノックイン効率を測定した（ＧＦＰを発現するＴ細胞集団のパーセンテージによって決定され、エレクトロポレーション後７日目に測定された）。ＴＲＡＣ遺伝子座でのノックイン率は、類似の方法論の公に記載された組み込み頻度と比較した場合に高かった（約５０％）が、ＡＡＶ６形質導入によって促進された本明細書に記載の方法を用いたＧＡＰＤＨ遺伝子でのノックイン効率は有意に高かった（独立ｔ検定を用いたｐ＝０．００２２）（約６８％）（図２３参照）。同じＲＮＰ濃度、ＡＡＶ６ＭＯＩ及び相同性アーム長を両方の実験で使用し、３つの独立した生物学的複製からの平均結果を示す（図２３参照）。従って、本明細書に記載の方法は、他の遺伝子ノックイン方法と比較して目的の遺伝子を高度に発現する、Ｔ細胞のような免疫細胞などの改変細胞の集団を単離するために使用することができる。

実施例１４：ＣＤ１６ノックインｉＰＳＣは、機能が強化された編集ｉＮＫを生じさせる。
本実施例は、癌細胞を死滅させるのに適した改変された免疫細胞を作製するための、本明細書に記載の遺伝子編集方法の使用を記載する。

図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃに示され、実施例２に記載された例示的なシステムを使用してＰＳＣを編集した。手短には、ＡｓＣｐｆ１（配列番号６２）及びガイドＲＮＡ（ＲＳＱ２２３３７）（配列番号９５）を使用して、ＧＡＰＤＨ遺伝子をｉＰＳＣにおいて標的化し、ＧＡＰＤＨの最後のエクソン（エクソン９）の５’末端に向かう二本鎖切断をもたらした。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを、公知の方法に従って、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）のヌクレオフェクション（エレクトロポレーション）によって細胞に導入した。また細胞を、５’から３’の順序で、長さ約５００ｂｐの５’相同性アーム（エクソン８の３’部分、イントロン８及びガイドＲＮＡ（ＲＳＱ２２３３７）のｇＲＮＡターゲティングドメイン配列の更なる結合を防止するために最適化されたエクソン９の５’コドン最適化コード部分を含む）、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド（「Ｐ２Ａ」）をコードするインフレーム配列、ＣＤ１６（「カーゴ」）（非切断性ＣＤ１６；配列番号１６５）のインフレームコード配列、終止コドン及びポリＡシグナル配列並びに長さ約５００ｂｐの３’相同性アーム（終止コドンを含むエクソン９のコード部分、エクソン９の３’非コードエクソン領域及び下流遺伝子間配列の部分を含む）を含むドナー鋳型を含む、二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（ｄｓＤＮＡプラスミド、ドナー鋳型配列番号２０５）と接触させた（図３Ｂに示されるように）。

カーゴ遺伝子ＣＤ１６は、本明細書に記載の選択システムを用いて、高効率でｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子にうまく組み込まれた。図２４Ａは、エレクトロポレーション後０日目及びエレクトロポレーション後１９日目のＧＡＰＤＨ遺伝子、４μＭの濃度のＲＮＰ及びＣＤ１６をコードするｄｓＤＮＡプラスミドで形質転換されたｉＰＳＣ又はｄｓＤＮＡプラスミドで形質転換されなかった「未編集細胞」における、ＣＤ１６をコードする「カーゴ」組み込みの効率を示す。ノックインは、ｇＲＮＡ標的部位の５’のプライマー又はポリＡ領域の部位の３’のプライマーを使用して、ノックイン「カーゴ」の５’又は３’位置を標的とするｄｄＰＣＲを用いてバルク編集ＣＤ１６ＫＩ細胞において測定し、結果の信頼性を増加させた。図２４Ａに示すように、ＣＤ１６はエレクトロポレーション及びノックインカセットの標的組み込みの２週間超後に安定してノックインされ、バルク編集細胞集団中に存在した。

バルク編集細胞集団から、単一細胞を増殖させて遺伝子型をホモジナイズした。図２４Ｂには、４つの編集細胞集団：ホモ接合性クローン１、ホモ接合性クローン２、ヘテロ接合性クローン３及びヘテロ接合性クローン４が示されている。ホモ接合性クローンは、ＣＤ１６ノックインを含むＧＡＰＤＨ遺伝子の２つのアレルを含み、一方、ヘテロ接合性クローンは、ＣＤ１６ノックインを含むＧＡＰＤＨ遺伝子の１つのアレルを含んだ（ノックインカーゴの５’及び３’位置のｄｄＰＣＲを用いて測定）。

ＧＡＰＤＨ遺伝子におけるＣＤ１６をコードする「カーゴ」組み込みの確認後、ホモジナイズされた細胞株を、当技術分野で公知のスピン胚様体法を用いてナチュラルキラー（ＮＫ）免疫細胞に分化させた。手短には、胚様体（ＥＢ）を形成するために、ｉＰＳＣをウェル当たり５，０００～６，０００細胞で超低付着９６ウェルプレートに置いた。１１日目に、ＥＢをフラスコに移し、ここでそれらを実験の残りにわたって留めた（ＹｅＬｉｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．２０１８Ａｕｇ２；２３（２）：１８１－１９２．ｅ５を参照）。分化プロセスの３２日目に、当技術分野で公知のフローサイトメトリー法を用いて細胞を分析した。標準的なコントロールゲーティング実験（ＹｅＬｉｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．２０１８Ａｕｇ２；２３（２）：１８１－１９２．ｅ５を参照）に続いて、マーカーＣＤ５６及びＣＤ４５の発現を用いて分化プロセスを分析し、これに続いて、マーカーＣＤ５６及びＣＤ１６の共発現を測定した。図２５Ａ～２５Ｄに示されるように、一般に、ＣＤ５６発現が陽性の細胞はＣＤ１６発現も陽性であり（それぞれ、９８％、９９％、９７．８％及び９９．９％）、ホモ接合性及びヘテロ接合性ＴＩクローンの両方が安定且つ頑強なＣＤ１６発現レベルを有することを示した。

次に、ＧＡＰＤＨ遺伝子に目的の遺伝子（ＣＤ１６）のノックインを含むこれらの分化したｉＮＫ細胞を、様々な癌細胞株によるチャレンジに供して、それらの細胞傷害能を決定した。例示的な３Ｄ固形腫瘍殺傷アッセイを図２６に示す。手短には、５，０００個のＮｕｃＬｉｇｈｔＲｅｄ標識ＳＫ－ＯＶ－３細胞を９６ウェル超低付着プレートに播種することにより、スフェロイドを形成した。スフェロイドを３７℃でインキュベートした後、エフェクター細胞（異なるＥ：Ｔ比で）及び任意の場合による薬剤（例えば、サイトカイン、抗体など）を添加し、続いてＩｎｃｕｃｙｔｅＳ３システムを用いて２時間毎に６００時間までスフェロイドを画像化した。示されるデータは、エフェクター添加時の赤色物体強度に対して正規化されている。スフェロイド曲線の正規化は、非正規化データにおいて観察される同じ有効性パターンを維持する。このアッセイを用いて、ＧＡＰＤＨ遺伝子におけるＣＤ１６のノックインを含むｉＰＳＣから分化したｉＮＫの細胞傷害性を測定した。

図２７Ａ及び２７Ｂに示すように、ＧＡＰＤＨ遺伝子でノックインされたＣＤ１６を含む両方のホモ接合性編集ｉＮＫ株及び両方のヘテロ接合性編集ｉＮＫ株は、未編集ｉＮＫ対照細胞（ＷＴＰＣＳ）又はＧＡＰＤＨ遺伝子（ＷＴＧＦＰＫＩ）にノックインされたＧＦＰを有する対照細胞よりも効果的にＳＫ－ＯＶ－３スフェロイドのサイズを減少させることができた（２つのアッセイからの平均データ）。ＧＡＰＤＨでＣＤ１６を含む編集ホモ接合性及びヘテロ接合性ｉＮＫ細胞も、ＧＡＰＤＨ遺伝子にノックインされたＧＦＰを有する対照細胞よりも効果的にＳＫ－ＯＶ－３スフェロイドのサイズを減少させた（データは示さず）。１０μｇ／ｍＬの抗体トラスツズマブの導入は、対照細胞と比較した場合、ＣＤ１６ＫＩｉＮＫの死滅能力を大幅に増強し、おそらく、ＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）発現レベルの増加による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加の機能としてのものである。いくつかの固形腫瘍死滅アッセイの結果を、ＣＤ１６ＫＩ編集ｉＮＫ（バルク編集ｉＰＳＣ又は単一編集ｉＰＳＣに由来する）のＣＤ１６発現レベルに対してプロットした。３．１６：１のＥ：Ｔ比では、ＣＤ１６を発現する細胞集団のパーセンテージと、生じた細胞死滅の量との間に相関が示される（図２９参照）。

編集ｉＮＫの機能性を更に解明するために、細胞を腫瘍細胞への反復曝露に供し、編集ｉＮＫが腫瘍標的を多日間にわたって反復的に殺傷する能力をインビトロ連続殺傷アッセイにおいて分析した。この実験の結果を図２８に示す。アッセイの０日目に、１０×１０^６個のＲａｊｉ腫瘍細胞（造血起源のリンパ芽球様細胞株）及び２×１０^５個のｉＮＫを、０．１μｇ／ｍＬの抗体リツキシマブの存在下又は非存在下で、９６ウェルプレートの各ウェルに蒔いた。約４８時間隔で、５×１０^３個のＲａｊｉ腫瘍細胞のボーラスを加えて、ｉＮＫ集団を再チャレンジした。図２８に示されるように、編集ｉＮＫ細胞（ＣＤ１６ＫＩｉＮＫヘテロ接合性又はホモ接合性）は、Ｒａｊｉ腫瘍細胞での複数のチャレンジ（最大５９８時間）後にＲａｊｉ細胞の継続的な殺傷を示したが、未編集ｉＮＫ細胞は、それらの連続的な殺傷効果において制限された。データは、ＧＡＰＤＨにおいてホモ接合性又はヘテロ接合性ＣＤ１６ＫＩを含むｉＮＫ細胞が、延長及び増強された腫瘍細胞殺傷をもたらすことを示す。更に、ヘテロ接合性ＣＤ１６ＫＩｉＮＫの有効性は、例えば、適切な必須遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ、ＴＢＰ、ＫＩＦ１１など）の１つのアレル中にＣＤ１６を含み、他のアレル中に目的の異なる遺伝子を含む、２つの異なるノックインカセットの二対立遺伝子挿入の可能性を強調する。

実施例１５：適切な必須遺伝子座（モノシストロン性又は２シストロン性）における免疫学的に関連する配列のノックイン
実施例２及び実施例１５において上記したように、ＧＡＰＤＨ遺伝子及び細胞表現型における正の標的組み込み事象がＧＦＰ、ＣＤ４７又はＣＤ１６の組み込みについて認められた。更なる又は代替的なカーゴ配列を、高い組み込み率で、本明細書に記載のＧＡＰＤＨ遺伝子又は他の適切な必須遺伝子に組み込むことができる。必須遺伝子ＧＡＰＤＨを、実施例２に記載されるように、ＡｓＣｐｆ１（配列番号６２）及びガイドＲＮＡ（ＲＳＱ２２３３７；配列番号９５）を含むＲＮＰを使用してｉＰＳＣ細胞において標的化し、ＧＡＰＤＨの最後のエクソン（エクソン９）の５’末端に向かう二本鎖切断をもたらした。目的のカーゴを有するノックインカセットを含むドナープラスミドも、ＲＮＰを用いてエレクトロポレーションした。図３０Ａに示すように、ａ）ＣＤ１６、ｂ）ＮＫ細胞における発現に適したＣＡＲ、又はｃ）二対立遺伝子ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙなどのカーゴのＧＡＰＤＨ遺伝子における標的組み込み（ＴＩ）率は、ｄｄＰＣＲを用いて測定した場合、２つの独立したｉＰＳＣクローン株においてアッセイした場合、全て４０％を超えた。図３０Ｂに示されるように、ＣＸＣＲ２カーゴのＧＡＰＤＨ遺伝子における標的ＴＩ率は、バルク編集ｉＰＳＣの少なくとも２９．２％であり（フローサイトメトリーを用いて決定された発現）、一方、ＣＸＣＲ２の表面発現はバルク編集ｉＰＳＣの約８．５％で観察された（フローサイトメトリーを用いて決定された発現）。対照的に、未編集ｉＰＳＣは、フローサイトメトリーによって非常に少量のＣＸＣＲ２（約１％）を有する（データは示さず）。

例示的なｄｄＰＣＲ実験を用いて、以下のように標的組み込み（ＴＩ）率を測定した。手短には、ＧＡＰＤＨ末端エクソン領域についての５’相同性アーム及び３’ポリＡテールの両方を捕捉し、特定のカーゴの特定の配列とは無関係にカーゴ検出することができるプライマーのユニバーサルセットを使用してＴＩを測定した。５’ＣＤＮプライマー及び３’ポリＡプライマー及びＦＡＭフルオロフォアプローブを組み合わせて作製する。適切な参照遺伝子プローブは、ＴＴＣ５ＨＥＸプローブである。反応のために、プローブ、ゲノムＤＮＡ、ＢｉｏＲａｄマスターミックス及び２ｘ対照緩衝液を、製造業者の推奨と一致する比率で一緒に混合した。まず、ゲノムＤＮＡをＢｉｏＲａｄ９６ウェルプレート（全ゲノムＤＮＡ＋水９．２μｌ）に入れ、次に、プライマープローブセットを有するマスターミックス（ウェル当たり１３．８μｌ）を加えた。水対照は１つのウェル中に５’プライマープローブセットマスターミックスを含み、異なるウェル中に３’プライマープローブセットマスターミックスを含んだ。ブランクウェル対照については、２ｘ対照緩衝液及び水（全２５μｌ）の５０／５０混合物を加えた。次いで、自動液滴発生器を調製し、運転した。液滴が生成されたら、ｄｄＰＣＲプレートを１８０℃で密封し、次いで、増幅のためにサーモサイクラーに入れた。５’ＣＤＮプライマー：ＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣ（配列番号２１９）、３’ポリＡプライマー：ＴＧＣＣＣＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣ（配列番号２２０）、ＦＡＭプローブ：ＴＣＣＣＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＴＴＧＣＣＡ（配列番号２２１）、ＴＴＣ５参照遺伝子フォワードプライマー：ＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＴＣＣＡＧＧＣＡＴＡＡＧ（配列番号２２２）、ＴＴＣ５参照遺伝子リバースプライマー：ＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＴＣ（配列番号２２３）、ＴＴＣ５ＦＡＭプローブ：ＡＧＴＴＴＧＴＧＴＣＡＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＴ（配列番号２２４）。

次に、本明細書に記載のカーゴ組み込み及び選択方法を、異なる５’から３’の順序（例えば、ＣＤ１６、続いてＣＡＲ又はＣＡＲ、続いてＣＤ１６）でＣＤ１６及びＮＫ適切なＣＡＲを含み、Ｐ２Ａ又はＩＲＥＳ配列によって分離された、いくつかの２シストロン性ノックインカセットを使用して試験した。必須遺伝子ＧＡＰＤＨを、実施例２に記載されるように、ＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ、（配列番号６２））及びガイドＲＮＡ（ＲＳＱ２２３３７；配列番号９５）を含むＲＮＰを使用してｉＰＳＣ細胞において標的化し、ＧＡＰＤＨの最後のエクソン（エクソン９）の５’末端に向かう二本鎖切断をもたらした。図３１に示したノックインカセットのそれぞれを含むドナープラスミドも、ＲＮＰでエレクトロポレーションした。図３１に示すように、ＣＤ１６及びＮＫ適切なＣＡＲを含む２シストロン性構築物のＴＩ率は、形質転換後０日目にｄｄＰＣＲを用いてバルク編集細胞で測定した場合、２０～７０％の範囲であった。加えて、膜結合ＩＬ－１５（ｍｂＩＬ－１５）カーゴ遺伝子（図３２に示されるように、Ｓｕｓｈｉドメイン及び完全長ＩＬ－１５Ｒαに連結されたＩＬ－１５を含む融合物）も、４μＭの濃度の（ＲＳＱ２２３３７）及びＣａｓ１２ａを含むＲＮＰ並びに５μｇのｍｂＩＬ－１５をコードするｄｓＤＮＡプラスミド（ＰＬＡ１６３２；ドナー鋳型配列番号４５を含む）を用いてＧＡＰＤＨ遺伝子座にノックインして、目的の更なる遺伝子が編集細胞集団内において高レベルで必須遺伝子に組み込まれ得るかどうかを決定した。図３１は、ｍｂＩＬ－１５カーゴが、ｄｄＰＣＲによって測定されるように、５０％を超えるパーセンテージＴＩでＧＡＰＤＨ遺伝子座にノックインされたことを示す（形質転換後０日目）。従って、本明細書に記載される方法は、ＧＡＰＤＨなどの必須遺伝子座にノックインされた非常に高いレベルの目的の遺伝子を有する、ｉＰＳＣなどの編集細胞の集団を単離するために使用することができる。

実施例１６：ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１５／ＩＬ１５－ＲαノックインｉＰＳＣは、増強された機能を有する編集ｉＮＫを生じさせる。
本実施例は、癌細胞殺傷に適した改変された免疫細胞を作製するための、本明細書に記載の遺伝子編集方法の使用を記載する。

図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃに示され、実施例２に記載された例示的なシステムを使用してＰＳＣを編集した。手短には、ＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ、配列番号６２）及びガイドＲＮＡ（ＲＳＱ２２３３７；配列番号９５）を含むＲＮＰを使用して、ｉＰＳＣにおいてＧＡＰＤＨ遺伝子を標的化し、ＧＡＰＤＨの最後のエクソン（エクソン９）の５’末端に向かう二本鎖切断をもたらした。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを、公知の方法に従って、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）のヌクレオフェクション（エレクトロポレーション）によって細胞に導入した。細胞を、５’から３’の順序で、長さ約５００ｂｐの５’相同性アーム（エクソン８の３’部分、イントロン８及びガイドＲＮＡ（ＲＳＱ２２３３７）のｇＲＮＡターゲティングドメイン配列の更なる結合を防止するために最適化されたエクソン９の５’コドン最適化コード部分を含む）、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド（「Ｐ２Ａ」）をコードするインフレーム配列、図３２に示されるｍｂＩＬ－１５のインフレームコード配列（「カーゴ」）（配列番号１７２）、終止コドン及びポリＡシグナル配列並びに長さ約５００ｂｐの３’相同性アーム（終止コドン含むエクソン９のコード部分、エクソン９の３’非コードエクソン領域及び下流遺伝子間配列の部分を含む）を含むドナー鋳型を含む、二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（ｄｓＤＮＡプラスミド、ＰＬＡ）とも接触させた（図３Ｂに示されるように）。ドナー鋳型のカーゴコード配列に隣接する５’及び３’相同性アームを、細胞のゲノム中の内因性終止コドンの両側に位置する配列に対応するように設計した。

カーゴ遺伝子ｍｂＩＬ－１５（図３２に示される）は、本明細書に記載される選択システムを用いて、高効率でｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子にうまく組み込まれた（実施例１５を参照）。図３１は、エレクトロポレーション後０日目における、４μＭの濃度の（ＲＳＱ２２３３７）及びＣａｓ１２ａを含むＲＮＰ並びに５μｇのｍｂＩＬ－１５をコードするｄｓＤＮＡプラスミド（ＰＬＡ１６３２；ドナー鋳型配列番号４５を含む）で形質転換されたｉＰＳＣにおけるｍｂＩＬ－１５をコードする「カーゴ」のＧＡＰＤＨにおける効率を示す。ゲノムＤＮＡをヌクレオフェクションの約７日後に抽出した。ゲノムＤＮＡ抽出後、ｄｄＰＣＲを行った。

次いで、バルク編集ｍｂＩＬ－１５ＫＩｉＰＳＣ細胞の２つの別個の集団をｉＮＫ細胞に分化させ、ｉＮＫ分化プロセスの２８日目にｄｄＰＣＲを用いてＴＩ率を測定した。図３３は、これらの編集ｉＮＫ細胞集団についてのＴＩ組み込み率が１０～１５％の範囲であったことを示す。ｉＮＫ集団におけるＴＩ率はｉＰＳＣのエレクトロポレーション後０日目のＴＩと比較して減少したが、これらの細胞集団内のＴＩ組み込みレベルは有意なままであった。分化開始後３２日目に、フローサイトメトリーを実施して、これらの編集ｉＮＫ細胞集団におけるＣＤ５６及び外因性ＩＬ－１５Ｒαを発現する細胞の割合を決定した（図３４Ａを参照）。ＣＤ５６及びＣＤ１６の共発現レベルも、これらの編集ｉＮＫ細胞集団において決定した（図３４Ｂを参照）。またバルク編集ｍｂＩＬ－１５ＫＩ細胞集団を、分化開始後３２日目、３９日目、４２日目及び４９日目にフローサイトメトリーによって分化マーカーについて分析した（図３４Ｃを参照）。

編集ｉＰＳＣからｉＮＫへの分化の開始後３９日目に、実施例１４に記載され、図２６に示されるように、細胞を３Ｄスフェロイド殺傷アッセイでチャレンジした。このアッセイを用いて、ＧＡＰＤＨ遺伝子におけるｍｂＩＬ－１５のノックインを含むｉＰＳＣから分化したｉＮＫの細胞傷害性を測定した（図３６参照）。細胞を５ｎｇ／ｍＬの外因性ＩＬ－１５の存在下又は非存在下で試験した。表１５及び図３６に示すように、ｍｂＩＬ－１５ＫＩｉＮＫ細胞（ＭｂＩＬ－１５Ｓ１及びＭｂＩＬ－１５Ｓ２集団）は、ｉＮＫに分化した未編集の親細胞（「ＷＴ」ＰＣＳ、１及び２）と比較して、より効率的な腫瘍細胞死滅を示した。注目すべきことに、ｍｂＩＬ－１５ＫＩｉＮＫ細胞は、より低いＥ：Ｔ比で、内因性ＩＬ－１５の非存在下でのＷＴｉＮＫ細胞と比較して、外因性ＩＬ－１５の非存在下でより良好な腫瘍細胞死滅を示した。ｍｂＩＬ－１５ＫＩｉＮＫ細胞は、同じ濃度の外因性ＩＬ－１５の存在下での未編集のＷＴｉＮＫ細胞と比較して、低濃度の外因性ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）の存在下でより良好な腫瘍細胞死滅も示した。

加えて、分化の後期（セット１（Ｓ１）については分化開始後６３日目、セット２（Ｓ２）については分化開始後５６日目）のｍｂＩＬ－１５ＫＩｉＮＫ細胞も、上述した３Ｄスフェロイド殺傷アッセイにおいてチャレンジした。細胞を１０μｇ／ｍｌのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ及び／又は５ｎｇ／ｍＬの外因性ＩＬ－１５の存在下又は非存在下で試験した。表１６及び図３７Ａ～３７Ｄに示すように、ｍｂＩＬ－１５ＫＩｉＮＫ細胞は、特に抗体療法と組み合わせた場合、高い腫瘍細胞殺傷効率を示した。６３日目に、全てのｍｂＩＬ－１５ＫＩｉＮＫ細胞は検出可能なレベルのＩＬ－１５Ｒａを発現しなかった；５６日目に、１つのｍｂＩＬ－１５ＫＩｉＮＫ細胞株（ＭｂＩＬ－１５Ｓ２Ｒ２）のみが、検出可能なレベルのＩＬ－１５Ｒａを発現した（データは示さず）。

ｍｂＩＬ－１５ＫＩｉＮＫ及び対照ＷＴｉＮＫ細胞についての特定の３Ｄスフェロイド殺傷アッセイの累積結果を図３８に示す。ＧＡＰＤＨ遺伝子におけるｍｂＩＬ－１５ノックインを含むｉＰＳＣの２つの独立したバルク編集集団（セット１（Ｓ１）及びセット２（Ｓ２））をｉＮＫ細胞に分化させた（セット１についてはｉＰＳＣ分化の３９日目及び４９日目、セット２についてはｉＰＳＣ分化の４２日目）これらのｉＮＫ細胞は、外因性ＩＬ－１５の非存在下で分化したＷＴ親細胞ｉＮＫと比較した場合、腫瘍細胞スフェロイドサイズを有意に減少させた（Ｐ＝０．０３４、＋／－標準偏差、独立ｔ検定）。分化したノックインｍｂＩＬ－１５ｉＮＫ細胞は、５ｎｇ／ｍＬの外因性ＩＬ－１５の存在下で分化したＷＴ親細胞と比較した場合、腫瘍細胞スフェロイドサイズの有意な減少に向かう傾向もあった（Ｐ＝０．０５２、＋／－標準偏差、独立ｔ検定）。これらの結果は、本明細書に記載の方法を用いてＧＡＰＤＨ遺伝子座にｍｂＩＬ－１５ノックインを含むｉＮＫ細胞の集団が、非編集ｉＮＫ細胞の集団と比較して、外因的に添加されたＩＬ－１５の非存在下で腫瘍細胞を殺傷する際により良好に機能することを示す。

加えて、分化の後期（セット１（Ｓ１）については分化開始後６３日目、セット２（Ｓ２）については分化開始後５６日目）のｍｂＩＬ－１５ＫＩｉＮＫ細胞を、血液癌細胞（例えば、Ｒａｊｉ細胞）でもチャレンジした。ｍｂＩＬ－１５ＫＩＮＫ細胞の２つの生物学的複製集団（Ｓ１及びＳ２）を、１０μｇ／ｍｌリツキシマブの存在下又は非存在下で試験した。図３５に示すように、ｍｂＩＬ－１５ＫＩｉＮＫ細胞は、特に抗体療法と組み合わせた場合、高い腫瘍細胞殺傷効率を示した。Ｒａｊｉ細胞はＮＫ細胞に対して自然に耐性であるが、抗体と組み合わせたｍｂＩＬ－１５ＫＩｉＮＫ細胞はこれらの細胞を見出し、殺傷することができたため、これらの細胞のこの殺傷能力は重要である。

実施例１７：適切な必須遺伝子座における多シストロン性ＣＤ１６、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１５Ｒα配列のノックイン。
実施例２において上述したように、目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、本明細書に記載の方法を用いて、適切な必須遺伝子座にカーゴ配列として組み込まれ得る。特定の実施形態では、複数のＧＯＩを組み合わせて、２シストロン性又は多シストロン性ノックインカーゴ配列とすることができる。図３９Ａは、ＩＬ－１５ペプチド配列、ＩＬ－１５Ｒαペプチド配列及びＧＦＰペプチド配列（それぞれ、配列番号１８７、１８９及び１９５）を含むＧＡＰＤＨ遺伝子における標的組み込みのために使用された２シストロン性ノックインカーゴ配列を含むＰＬＡ１８２９（ドナー鋳型配列番号２０８を含む）の一部を示す。これらのペプチド配列のそれぞれは、Ｐ２Ａ配列によって分離された。図３９Ｂには、ＣＤ１６ペプチド配列、ＩＬ－１５ペプチド配列及びＩＬ－１５Ｒαペプチド配列（それぞれ、配列番号１８４、１８７及び１８９）を含むＧＡＰＤＨ遺伝子における標的組み込みに使用された多シストロン性ノックインカーゴ配列を含むＰＬＡ１８３２（ドナー鋳型配列番号２０９を含む）の一部が示されている。これらのペプチド配列のそれぞれは、Ｐ２Ａ配列によって分離された。図３９Ｃには、Ｐ２Ａ配列によって分離された、ＣＤ１６ペプチド配列及びｍｂＩＬ－１５ペプチド配列（図３２に示すＩＬ－１５Ｒα配列に融合したＩＬ－１５配列）（それぞれ配列番号１８４及び１９０）を含むＧＡＰＤＨ遺伝子における標的組み込みに使用された２シストロン性ノックインカーゴ配列を含むＰＬＡ１８３４（ドナー鋳型配列番号２１２を含む）の一部が示されている。

図３９Ａ～３９Ｃに記載されるノックインカーゴ配列は、それぞれプラスミド１８２９、１８３２及び１８３４（ドナー鋳型配列番号２０８、２０９及び２１２を含む）内に含まれる。ＰＳＣは、図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃに示され、実施例２に記載された例示的なシステムを使用して編集された。手短には、ＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ（配列番号６２））及びガイドＲＮＡ（ＲＳＱ２２３３７（配列番号９５））を使用してＧＡＰＤＨ遺伝子をｉＰＳＣにおいて標的化し、ＧＡＰＤＨの最後のエクソン（エクソン９）の５’末端に向かう二本鎖切断をもたらした。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを、公知の方法に従ってリボ核タンパク質（ＲＮＰ）のヌクレオフェクション（エレクトロポレーション）によって導入した。５’から３’の順序で、約５００ｂｐの長さの５’相同性アーム（エクソン８の３’部分、イントロン８及びガイドＲＮＡ（ＲＳＱ２２３３７）のｇＲＮＡターゲティングドメイン配列の更なる結合を防止するために最適化されたエクソン９の５’コドン最適化コード部分を含む）、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド（「Ｐ２Ａ」）をコードするインフレーム配列、上述したインフレームコード配列（「カーゴ」）、終止コドン及びポリＡシグナル配列並びに約５００ｂｐの長さの３’相同性アーム（終止コドンを含むエクソン９のコード部分、エクソン９の３’非コードエクソン領域及び下流遺伝子間配列の一部を含む）を含むドナー鋳型（配列番号２０８、２０９及び２１２）を含む二本鎖ＤＮＡドナー鋳型（それぞれ、ｄｓＤＮＡプラスミド（ＰＬＡ１８２９、ＰＬＡ１８３２又はＰＬＡ１８３４））と細胞を接触させた（図３Ｂに示すように）。４つのユニークなヌクレオフェクション事象を実施し（ＲＮＰ及びＰＬＡ１８２９、ＲＮＰ及びＰＬＡ１８３２、ＲＮＰ及びＰＬＡ１８３４並びにプラスミド対照を含まないＲＮＰに対応する）、細胞をクローン密度で蒔いた。コロニーを、ｄｄＰＣＲを用いたＴＩの分析のために増殖させた。

ＴＩ後、ＰＬＡ１８２９、ＰＬＡ１８３２若しくはＰＬＡ１８３４カーゴ配列のＫＩを有する形質転換されたｉＰＳＣ（編集クローン）又はＲＮＰ単独で形質転換された対照ＷＴ親細胞を、形質転換の７日後にフローサイトメトリーを用いて分析した（図４０Ａ及び４０Ｂを参照）。ＧＦＰ及びＩＬ－１５Ｒα発現のレベルを、バルク編集ｉＰＳＣ集団において測定した。図４０Ａに示されるように、ＰＬＡ１８２９で形質転換された細胞の約５７％がＩＬ－１５Ｒα及びＧＦＰの両方を発現したが、対照細胞はＧＦＰ発現を有さず、約１４．４％のＩＬ－１５Ｒα発現レベルを有した。図４０Ｂに示されるように、ＰＬＡ１８３２で形質転換された細胞の約３３．１％及びＰＬＡ１８３４で形質転換された細胞の約５７．２％がＩＬ－１５Ｒαを発現した；これらの細胞集団のいずれも、それぞれのドナー鋳型がＧＦＰを含まないと予想されるように、認識できるＧＦＰレベルを示さなかった。これらのカーゴタンパク質の発現は、成功した形質転換、編集及び／又は組み込みを決定するための代理として使用することができる。

図４１Ａ～４１Ｃは、それぞれＰＬＡ１８２９、ＰＬＡ１８３２又はＰＬＡ１８３４（ドナー鋳型配列番号２０８、２０９及び２１２を含む）で形質転換されたコロニーの２４個についての遺伝子型を示し、野生型細胞と比較している。ｄｄＰＣＲで測定し、約８５～１００％ＴＩを有する細胞がホモ接合性として分類され、４０～６０％がヘテロ接合性として分類される一方、シグナルが非常に低いか、又はシグナルを有さないものは野生型として分類される。形質転換後、コロニーを増殖させ、次いで、当技術分野で公知のスピン胚様体法を用いて、細胞集団をｉＮＫ細胞に分化させた。図４２Ａ～４２Ｄには、ｉＮＫ分化プロセスの３２日目におけるＩＬ－１５Ｒα及び／又はＣＤ１６を発現する細胞のパーセンテージ並びにＩＬ－１５Ｒα及び／又はＣＤ１６の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を測定する例示的なフローサイトメトリー結果が示されている。図４２Ａに示されるように、ＰＬＡ１８２９、ＰＬＡ１８３２又はＰＬＡ１８３４による形質転換は、対照ＷＴ親細胞から分化したｉＮＫよりも有意に高い割合でヘテロ接合性又はホモ接合性コロニーにおけるＩＬ－１５Ｒαの表面発現を可能にした。図４２Ｂに示されるように、ＰＬＡ１８３２又はＰＬＡ１８３４による形質転換は、ＰＬＡ１８２９カーゴ配列で形質転換された細胞がＣＤ１６カーゴ配列を含まないため、対照ＷＴ親細胞から分化したｉＮＫよりも有意に高い割合でヘテロ接合性又はホモ接合性コロニーにおけるＣＤ１６の表面発現を可能にした。図４２Ｃに示されるように、ＰＬＡ１８３４による形質転換は、対照ＷＴ親細胞から分化したｉＮＫ又はＰＬＡ１８２９若しくはＰＬＡ１８３２で形質転換した細胞と比較した場合、ヘテロ接合性コロニー又はホモ接合性コロニーにおけるＩＬ－１５Ｒαのより高いＭＦＩを可能にした。図４２Ｄに示されるように、ＰＬＡ１８３２又はＰＬＡ１８３４による形質転換は、ヘテロ接合性又はホモ接合性コロニーにおけるＣＤ１６の表面発現を可能にした。これらのデータは、本明細書に記載の方法を用いて、ＧＡＰＤＨなどの必須遺伝子に目的の多数の遺伝子を含む多シストロン性カーゴをノックインし、編集細胞において目的の遺伝子の発現をもたらすことができることを示す。これらのデータは、ＧＡＰＤＨ遺伝子座からのカーゴ発現の構成的性質も明らかに実証する。

実施例１８－必須遺伝子ノックインによる選択に適したＡｓＣｐｆ１ガイドＲＮＡの計算スクリーニング
本実施例は、いくつかの必須ハウスキーピング遺伝子を標的とする、本明細書に記載の方法に適したＡｓＣｐｆ１（ＡｓＣａｓ１２ａ；例えば、配列番号６２によって表される）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を計算的にスクリーニングするための方法を記載する。このスクリーニングの結果を表１７にまとめ、これらのｇＲＮＡは、列挙した必須遺伝子のＤＮＡコード配列の最後の５００ｂｐ内でＣａｓ１２ａ切断を容易にする。

この分析のために選択された表１７中の必須遺伝子は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（例えば、ＥｉｓｅｎｂｅｒｇａｎｄＬｅｖａｎｏｎ，Ｈｕｍａｎｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｇｅｎｅｓ，ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔｉｃｓ，２０１４を参照）に記載の必須遺伝子及びＹｉｌｍａｚら（例えば、Ｙｉｌｍａｚｅｔａｌ．，ＤｅｆｉｎｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｓｆｏｒｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｉｎｈａｐｌｏｉｄｃｅｌｌｓ．ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，２０１８を参照）に記載の遺伝子を組み合わせることによって作製された必須遺伝子のプールにおいて同定された。手短には、ＣＲＩＳＰＲスコアが０未満であり、ＦＤＲが＜０．０５であるＹｉｌｍａｚらに記載されている必須遺伝子を、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ＆Ｌｅｖａｎｏｎに記載されている必須遺伝子と組み合わせて、全４，５８２個の遺伝子のリストを作成した。次いで、これらの遺伝子を、それらの平均発現レベル（種々の組織にわたる平均正規化発現、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ｄｏｗｎｌｏａｄ／ｒｎａ＿ｔｉｓｓｕｅ＿ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ｔｓｖ．ｚｉｐによって提供されるＲＮＡコンセンサス組織遺伝子発現データを参照されたい）によって選別し、組織にわたる最も高い平均発現レベルを有する１００個の遺伝子を、分析のために選択した。ＧＡＰＤＨはこの遺伝子群内に存在した。ＴＢＰ、Ｅ２Ｆ４、Ｇ６ＰＤ及びＫＩＦ１１をこの群に加え、更なる分析のために全１０４個の遺伝子を構成した。

代表的なコード領域（ｍＲＮＡ－２０１）にマッピングされた適切なプロトスペーサーを用いてヌクレアーゼ特異的ＰＡＭを検索することにより、目的の遺伝子のそれぞれについて潜在的なｇＲＮＡ標的配列を生成した。その名称の後に「－２０１」が続く転写物を、各遺伝子の代表として選択した（例えば、ＧＡＰＤＨ－２０１）。遺伝子情報（即ちコード領域）は、ＧＥＮＣＯＤＥｖ．３７遺伝子アノテーションＧＴＦファイルから得た。ヒト参照ゲノム（ｈｇ３８）中の標的遺伝子のゲノム領域内で潜在的ｇＲＮＡを最初に検索し、代表的なコード領域の終始部位の５００ｂｐ内に切断部位を有する同定したｇＲＮＡを更なる分析のために選択した。次いで、候補ｇＲＮＡを、ＢＷＡＡｌｎ（最大ミスマッチ許容度－ｎ２）でヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）に整列させた。潜在的なオフターゲット結合部位（即ち複数のゲノム領域への整列；マッピング品質ＭＡＰＱ＜３０）を有するガイドを濾別した。得られたｇＲＮＡは、代表的な終止コドンの５００コード塩基対内で高度に及び／又は広範に発現された必須遺伝子を標的とし、ヒトゲノムにおいてアノテートされた同一のオフターゲット結合部位を有さない。従って、それらは、本明細書に記載される選択方法のための優れた候補ｇＲＮＡである。

実施例１９－必須遺伝子ノックインによる選択のためのガイドＲＮＡの計算スクリーニング
本実施例は、ＲＮＡガイド化ヌクレアーゼが高い切断効率を示す限り、異なるＲＮＡガイド化ヌクレアーゼ及びその変異体（例えば、Ｃａｓ１２ａの変異体、例えば、Ｍａｄ７）に関連する本明細書の選択方法を使用して、必須遺伝子を標的化する際に使用するのに適している可能性がより高いｇＲＮＡを計算的にスクリーニングするための方法を記載する。先の実施例に記載の必須遺伝子（ＧＡＰＤＨ、ＴＢＰ、Ｅ２Ｆ４、Ｇ６ＰＤ及びＫＩＦ１１）を標的とするＣａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ－Ｐｈｉ、Ｍａｄ７及びＳｐｙＣａｓ９ｇＲＮＡをこの分析のために選択したが、同様のプロセスを適用して、他の必須遺伝子におけるこれらのＲＮＡガイド化ヌクレアーゼのｇＲＮＡを同定することができる。このスクリーニングの結果を表１８～２２にまとめ、これらのｇＲＮＡは、列挙した必須遺伝子のコード配列の最後の５００ｂｐ内でＤＮＡ切断を容易にする。

この分析における必須遺伝子（ＧＡＰＤＨ、ＴＢＰ、Ｅ２Ｆ４、Ｇ６ＰＤ及びＫＩＦ１１）のそれぞれの潜在的な標的配列を、代表的なコード領域（ｍＲＮＡ－２０１）にマッピングされた適切なプロトスペーサーを用いてヌクレアーゼ特異的ＰＡＭ（それぞれ、ＡＴＴＮ、ＴＴＣＮ、ＴＴＮ、ＴＴＮ及びＮＧＧについてＣａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｅ、ＣａｓΦ、Ｍａｄ７及びＳｐｙＣａｓ９）を検索することによって生成した。その名称の後に「－２０１」が続く転写物を、各遺伝子の代表として選択した（例えば、ＧＡＰＤＨ－２０１）。遺伝子情報（即ちコード領域）は、ＧＥＮＣＯＤＥｖ．３７遺伝子アノテーションＧＴＦファイルから得た。ヒト参照ゲノム（ｈｇ３８）中の標的遺伝子のゲノム領域内で潜在的ｇＲＮＡを最初に検索し、代表的なコード領域の停止部位の５００ｂｐ内に切断部位を有する同定したｇＲＮＡを更なる分析のために選択した。次いで、候補ｇＲＮＡを、ＢＷＡＡｌｎ（最大ミスマッチ許容度－ｎ２）でヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）に整列させた。潜在的なオフターゲット結合部位（即ち複数のゲノム領域への整列；マッピング品質ＭＡＰＱ＜３０）を有するガイドを濾別した。得られたｇＲＮＡは、代表的な終止コドンの５００コード塩基対内の必須遺伝子を標的とし、ヒトゲノムにおいてアノテートされた同一のオフターゲット結合部位を有さない。従って、配列番号８８９～１８８５に対応する表１８～２２のｇＲＮＡは、本明細書に記載の選択方法をＧＡＰＤＨ、ＴＢＰ、Ｅ２Ｆ４、Ｇ６ＰＤ及びＫＩＦ１１に適用するための優れた候補ｇＲＮＡを表す。

実施例２０－ＲＮＰ及びドナー鋳型又はＲＮＰ単独での編集の第２ラウンドは、ＧＡＰＤＨ遺伝子座を標的とする導入遺伝子によるｉＰＳＣの更なる濃縮を可能にする。
本実施例は、ＧＡＰＤＨ遺伝子に二対立遺伝子的に且つ２シストロン様式で挿入された２つの免疫学的に関連する遺伝子の導入に関する。２つの異なるドナー鋳型（例えば、ドナー核酸構築物）（一方がＰＤＬ１免疫調節分子の遺伝子配列及びその遺伝子ペイロードとしての安全スイッチを含み、他方のドナー鋳型がＣＤ４７免疫調節分子及びその遺伝子ペイロードとしての同じ安全スイッチを含む）は、ＧＡＰＤＨ遺伝子座を標的とした（図４３Ａ）。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ複合体遺伝子編集システム、ＰＤＬ１ベース及びＣＤ４７ベースのドナー鋳型による編集の第１ラウンド後、約８．１％のＰＤＬ１陽性細胞、約２．２％のＣＤ４７陽性細胞及び約２．４％のＰＤＬ１／ＣＤ４７二重陽性細胞が得られた。これは、隣接相同性アームを有するドナー核酸構築物がＧＡＰＤＨ遺伝子座に正確に組み込まれ、ＧＡＰＤＨエクソン内のヌクレアーゼ切断によって引き起こされた破壊を回復させたことを示した。二重陽性結果は、予想され、且つ以前に見られた結果（例えば、当技術分野において記載されているように）よりもはるかに優れていたため、この結果は驚くべきことであった。おそらくＰＤ－Ｌ１組み込みがより効率的であり、より高い比率の二対立遺伝子組み込みにより支援されたため、ＣＤ４７の単一ノックイン効率は、二重ノックインよりも低かったことに留意されたい。

編集細胞の集団を更に濃縮するために、細胞を増殖させ、次いでＲＮＰ及び両方のドナー鋳型（例えば、ドナー核酸構築物）のいずれか又はＲＮＰ単独を生存細胞のプールに再び提供することによって再編集した。ＲＮＰ及び両方のドナー鋳型（例えば、ドナー核酸構築物）で再編集された試料において、ＰＤＬ１陽性細胞の集団は約６３．８％に増加し、ＣＤ４７陽性細胞の集団は約６．５％に増加し、ＰＤＬ１／ＣＤ４７二重陽性細胞の集団は約１８．９％に増加した。ＲＮＰのみで再編集した試料では、ＰＤＬ１陽性細胞の集団は約５９．０％に増加し、ＣＤ４７陽性細胞の集団は約１０．４％に増加し、ＰＤＬ１／ＣＤ４７二重陽性細胞の集団は約１３．４％に増加した。ＲＮＰ及びドナー鋳型では８７．４％から１０．８％への又はＲＮＰ単独では１７．３％への未編集細胞の減少があった。いずれの場合も、ＲＮＰの第２ラウンドを提供することにより、ＧＡＰＤＨエクソン切断を介した非標的細胞の選択的除去、従ってＰＤＬ１ベース及びＣＤ４７ベースのドナー鋳型（例えば、核酸構築物）のいずれか又は両方で標的化された細胞の更なる濃縮が可能になった。

別の研究では、同じＰＤＬ１ベースのドナー鋳型を使用してＰＤＬ１をＧＡＰＤＨ遺伝子座に標的化した（図４３Ｂ）。ＲＮＰ及びＰＤＬ１ベースのドナー鋳型による編集の第１ラウンド後、約０．８％のＰＤＬ１陽性細胞が得られた。編集細胞の集団を更に濃縮するために、細胞を増殖させ、次いで、生存細胞の集団にＲＮＰのみを提供することによって再編集した。ＲＮＰのみで再編集された試料では、ＰＤＬ１陽性細胞の集団が６４．７％に増加した。このデータは、ＲＮＰの第２ラウンドでの編集がＧＡＰＤＨエクソン切断を介した非標的細胞の選択的除去、従ってＰＤＬ１ベースのドナー鋳型で標的化された細胞の更なる濃縮を可能にしたことを示す。

実施例２１－自殺スイッチ成分を含む２つの異なるドナー鋳型及びＧＡＰＤＨ遺伝子のコード領域に標的化されたＲＮＰを用いたＰＳＣにおける編集は、二対立遺伝子編集細胞の濃縮、従って自殺スイッチ成分の二量体化を可能にする。
本実施例は、それぞれが複数の目的の遺伝子産物をそれらの遺伝子ペイロードとしてコードする２つのノックインカセットの導入に関する。ＰＤＬ１又はＣＤ４７免疫調節分子を含む２つの異なるドナー鋳型（例えば、核酸構築物）をＧＡＰＤＨ遺伝子に標的化した（図４４）。ＰＤＬ１ベースのドナー鋳型は、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドを介してＰＤＬ１遺伝子のコード配列に連結された切断型カスパーゼ９遺伝子（ｄＣａｓｐ９）のコード配列にＧＳリンカーを介して連結されたＦＲＢ（ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合ドメイン断片）のコード配列から構成された。ＣＤ４７ベースのドナー鋳型は、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドを介してＰＤＬ１遺伝子のコード配列に連結された切断型カスパーゼ９遺伝子（ｄＣａｓｐ９）のコード配列にＧＳリンカーを介して連結されたＦＫＢＰ１２（１２－ｋＤａＦＫ５０６結合タンパク質をコードするペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＦＫＢＰ１２）のコード配列から構成された。ＦＲＢ－ｄＣａｓｐ９及びＦＫＢＰ１２－ｄＣａｓｐ９配列は、ラパマイシン誘導性カスパーゼ９殺傷スイッチ（ｒａｐａＣａｓｐ９）の２つの必要な成分を形成する。ラパマイシンの存在下で、ＦＲＢ及びＦＫＢＰ１２ドメインはヘテロ二量体化し、切断型カスパーゼ９タンパク質をホモ二量体化させ、これは次に下流エフェクターカスパーゼを活性化して、二対立遺伝子編集ｒａｐａＣａｓｐ９細胞においてアポトーシスを誘発する。

ＧＡＰＤＨターゲティングＲＮＰ並びにＰＤＬ１ベース及びＣＤ４７ベースのドナー鋳型を用いてＰＳＣを編集した後、生存細胞を回復及び増殖させ、抗ＰＤＬ－１及び抗ＣＤ４７抗体で染色したＰＳＣの集団に対して１週間後にサイトメトリー分析を行った。サイトメトリー分析後、ＧＡＰＤＨターゲティングＲＮＰ及び２つの異なるドナー鋳型（例えば、ドナー核酸構築物）を一緒に（ＦＲＢ－ｄＣａｓｐ９－ＰＤＬ１及びＦＫＢＰ１２－ｄＣａｓｐ９－ＣＤ４７）生存細胞に提供し、ＰＤＬ１陽性ＰＳＣ（約１１．９％）、ＣＤ４７陽性ＰＳＣ（約９．８％）並びにＰＤＬ１及びＣＤ４７に対して二重陽性（約３．５％）の細胞をもたらし、いくつかの細胞が、ＧＡＰＤＨを標的とする２つの遺伝子ペイロード：ＦＲＢ－ｄＣａｓｐ９－ＰＤＬ１導入遺伝子及びＦＫＢＰ１２－ｄＣａｓｐ９－ＣＤ４７アレルの両方を二対立遺伝子的に組み込んだことを示し、これはＧＡＰＤＨエクソン（例えば、コード領域）内のヌクレアーゼ切断によって引き起こされた破壊を回復させた。同じ遺伝子座で２つの異なる大きいドナー構築物について二対立遺伝子編集された細胞は、ＰＳＣにおいて相同組換え実験を行う場合、通常非常に稀な事象であるため、これらの結果は驚くべきものである。

均等物
本開示をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を例示することを意図し、限定するものではないことを理解するべきである。他の態様、利点及び修正は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims

細胞のゲノムを編集する方法であって、前記細胞を、
（ｉ）前記細胞における必須遺伝子であって、前記細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする必須遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼ、及び
（ｉｉ）前記必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型
と接触させることを含み、前記ノックインカセットは、前記切断の相同組換え修復（ＨＤＲ）によって前記細胞のゲノムに組み込まれ、その結果、ゲノム編集された細胞は、
（ａ）前記目的の遺伝子産物、及び
（ｂ）前記細胞の生存及び／又は増殖に必要である、前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物又はその機能変異体
を発現する、方法。
前記ノックインカセットが相同組換え修復（ＨＤＲ）によって前記細胞のゲノムに正しい位置又は向きで組み込まれない場合、前記細胞は、前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物又はその機能変異体をもはや発現しない、請求項１に記載の方法。
前記切断は、二本鎖切断である、請求項１又は２に記載の方法。
前記切断は、前記必須遺伝子の前記内因性コード配列の最後の１０００、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対内に位置する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記切断は、前記必須遺伝子の最後のエクソン内に位置する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、及び前記方法は、前記細胞を前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのためのガイド分子と接触させることを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はメガヌクレアーゼである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記ドナー鋳型は、ドナーＤＮＡ鋳型であり、任意選択で、前記ドナーＤＮＡ鋳型は、二本鎖である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記ドナーＤＮＡ鋳型は、プラスミドであり、任意選択で、前記プラスミドは、線状化されていない、請求項８に記載の方法。
前記ドナー鋳型は、前記ノックインカセットの両側に相同性アームを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記相同性アームは、前記細胞のゲノムにおいて前記切断の両側に位置する配列に対応する、請求項１０に記載の方法。
前記ノックインカセットは、前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物と前記目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、前記遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び前記調節エレメントは、前記タンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
前記ノックインカセットは、前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列と、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む、請求項１２に記載の方法。
前記２Ａエレメントは、Ｔ２Ａエレメント（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｐ２Ａエレメント（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｅ２Ａエレメント（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）又はＦ２Ａエレメント（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）である、請求項１３に記載の方法。
前記ノックインカセットは、前記２Ａエレメントの上流において、リンカーペプチドをコードする配列を更に含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
前記リンカーペプチドは、アミノ酸配列ＧＳＧを含む、請求項１５に記載の方法。
前記ノックインカセットは、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、３’ＵＴＲ配列が存在する場合、前記３’ＵＴＲ配列は、前記外因性コード配列の３’側且つ前記ポリアデニル化配列の５’側に位置する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性部分コード配列は、前記必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｃ末端断片は、５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である、請求項１８に記載の方法。
前記Ｃ末端断片は、前記必須遺伝子の前記内因性コード配列のうち、前記切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記細胞の前記必須遺伝子の前記対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記細胞の前記必須遺伝子の前記対応する内因性コード配列と比べて、前記ヌクレアーゼが標的部位に更に結合することを防ぎ、前記ノックインカセットが前記細胞のゲノムに組み込まれた後の組換えの可能性を低下させ、且つ／又は前記ノックインカセットが前記細胞のゲノムに組み込まれた後に前記必須遺伝子の前記遺伝子産物及び／若しくは前記目的の遺伝子産物の発現を増加させるようにコドン最適化されている、請求項２１に記載の方法。
前記必須遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子、例えば表３に掲載される遺伝子である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、及び前記必須遺伝子は、ｉＰＳ若しくはＥＳ細胞の分化又はｉＰＳ由来若しくはＥＳ由来細胞の増殖に関与し、例えば表４に掲載される遺伝子である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
前記ｉＰＳ由来細胞は、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞又はｉＰＳ由来Ｔ細胞である、請求項２４に記載の方法。
前記ドナー鋳型は、レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
前記目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン（例えば、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）又はその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）又はその変異体）、ヒト白血球抗原（例えば、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ））、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
目的の遺伝子産物のための外因性コード配列が必須遺伝子のコード配列とインフレームであり、且つその下流（３’側）にあるゲノムを含む遺伝子修飾された細胞であって、前記必須遺伝子は、前記細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする、遺伝子修飾された細胞。
ゲノム修飾を含む操作された細胞であって、前記ゲノム修飾は、前記細胞のゲノムにおける必須遺伝子の内因性コード配列内への外因性ノックインカセットの挿入を含み、前記必須遺伝子は、前記細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードし、前記ノックインカセットは、前記必須遺伝子の前記遺伝子産物又はその機能変異体をコードする外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含み、前記細胞は、前記目的の遺伝子産物と、前記細胞の生存及び／又は増殖に必要である、前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物又はその機能変異体とを発現し、任意選択で、前記目的の遺伝子産物及び前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物は、前記必須遺伝子の内因性プロモーターから発現される、操作された細胞。
前記細胞のゲノムは、前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物と前記目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、前記遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び前記調節エレメントは、前記タンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする、請求項２８又は２９に記載の細胞。
前記細胞のゲノムは、前記必須遺伝子の前記コード配列と、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む、請求項３０に記載の細胞。
前記細胞のゲノムは、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、３’ＵＴＲ配列が存在する場合、前記３’ＵＴＲ配列は、前記外因性コード配列の３’側且つ前記ポリアデニル化配列の５’側に位置する、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の細胞。
前記必須遺伝子の前記コード配列は、前記必須遺伝子の内因性コード配列と１００％未満の同一性である、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の細胞。
前記必須遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子、例えば表３に掲載される遺伝子である、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の細胞。
ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、及び前記必須遺伝子は、ｉＰＳ若しくはＥＳ細胞の分化又はｉＰＳ由来若しくはＥＳ由来細胞の増殖に関与し、例えば表４に掲載される遺伝子である、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の細胞。
前記ｉＰＳ由来細胞は、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞又はｉＰＳ由来Ｔ細胞である、請求項３５に記載の細胞。
前記細胞のゲノムは、レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない、請求項２８～３６のいずれか一項に記載の細胞。
前記目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の細胞。
医薬としての使用のための、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の細胞。
疾患、障害又は病態、例えば癌の治療における使用のための、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の細胞。
請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法によって作製される細胞若しくは細胞集団又はその子孫。
細胞のゲノムを編集するためのシステムであって、前記細胞と、前記細胞の必須遺伝子であって、前記細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする必須遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼと、前記必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に目的の遺伝子産物のための外因性コード配列を含むノックインカセットを含むドナー鋳型とを含むシステム。
前記切断は、二本鎖切断である、請求項４２に記載のシステム。
前記切断は、前記必須遺伝子の前記コード配列の最後の１０００、５００、４００、３００、２００、１００又は５０塩基対内に位置する、請求項４２又は４３に記載のシステム。
前記切断は、前記必須遺伝子の最後のエクソン内に位置する、請求項４２～４４のいずれか一項に記載のシステム。
前記ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、及び前記システムは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのためのガイド分子を更に含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載のシステム。
前記ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はメガヌクレアーゼである、請求項４２～４５のいずれか一項に記載のシステム。
前記ドナー鋳型は、ドナーＤＮＡ鋳型であり、任意選択で、前記ドナーＤＮＡ鋳型は、二本鎖である、請求項４２～４７のいずれか一項に記載のシステム。
前記ドナーＤＮＡ鋳型は、プラスミドであり、任意選択で、前記プラスミドは、線状化されていない、請求項４８に記載のシステム。
前記ドナー鋳型は、前記ノックインカセットの両側に相同性アームを含む、請求項４２～４９のいずれか一項に記載のシステム。
前記相同性アームは、前記細胞のゲノムにおいて前記切断の両側に位置する配列に対応する、請求項５０に記載のシステム。
前記ノックインカセットは、前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物と前記目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、前記遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び前記調節エレメントは、前記タンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする、請求項４２～５１のいずれか一項に記載のシステム。
前記ノックインカセットは、前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列と、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む、請求項５２に記載のシステム。
前記ノックインカセットは、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、３’ＵＴＲ配列が存在する場合、前記３’ＵＴＲ配列は、前記外因性コード配列の３’側且つ前記ポリアデニル化配列の５’側に位置する、請求項４２～５３のいずれか一項に記載のシステム。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性部分コード配列は、前記必須遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする、請求項４２～５４のいずれか一項に記載のシステム。
前記Ｃ末端断片は、５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である、請求項５５に記載のシステム。
前記Ｃ末端断片は、前記必須遺伝子の前記コード配列のうち、前記切断にまたがる領域によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項５５又は５６に記載のシステム。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記細胞の前記必須遺伝子の前記対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である、請求項４２～５７のいずれか一項に記載のシステム。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記細胞の前記必須遺伝子の前記対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼが標的部位に更に結合することを防ぐか、前記ノックインカセットが前記細胞のゲノムに組み込まれた後の組換えの可能性を低下させるか、又は前記ノックインカセットが前記細胞のゲノムに組み込まれた後に前記必須遺伝子の前記遺伝子産物及び／若しくは前記目的の遺伝子産物の発現を増加させるようにコドン最適化されている、請求項５８に記載のシステム。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記ヌクレアーゼの標的部位を含まない、請求項５９に記載のシステム。
前記必須遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子、例えば表３に掲載される遺伝子である、請求項４２～６０のいずれか一項に記載のシステム。
前記細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、及び前記必須遺伝子は、ｉＰＳ若しくはＥＳ細胞の分化又はｉＰＳ由来若しくはＥＳ由来細胞の増殖に関与し、例えば表４に掲載される遺伝子である、請求項４２～６１のいずれか一項に記載のシステム。
前記ｉＰＳ由来細胞は、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞又はｉＰＳ由来Ｔ細胞である、請求項６２に記載のシステム。
前記ドナーＤＮＡ鋳型は、レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない、請求項４２～６３のいずれか一項に記載のシステム。
前記目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである、請求項４２～６４のいずれか一項に記載のシステム。
目的の遺伝子産物のための外因性コード配列が必須遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームであり、且つその下流（３’側）にあるノックインカセットを含むドナー鋳型であって、前記必須遺伝子は、細胞の生存及び／又は増殖に必要な遺伝子産物をコードする、ドナー鋳型。
相同組換え修復（ＨＤＲ）による細胞のゲノムの編集における使用のための、請求項６６に記載のドナー鋳型。
ドナーＤＮＡ鋳型であり、任意選択で、前記ドナーＤＮＡ鋳型は、二本鎖である、請求項６６又は６７に記載のドナー鋳型。
前記ドナーＤＮＡ鋳型は、プラスミドであり、任意選択で、前記プラスミドは、線状化されていない、請求項６８に記載のドナー鋳型。
前記ノックインカセットの両側に相同性アームを含む、請求項６６～６９のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
前記ノックインカセットは、前記必須遺伝子によってコードされる前記遺伝子産物と前記目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、前記遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び前記調節エレメントは、前記タンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする、請求項６６～７０のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
前記ノックインカセットは、前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列と、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む、請求項７１に記載のドナー鋳型。
前記ノックインカセットは、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、３’ＵＴＲ配列が存在する場合、前記３’ＵＴＲ配列は、前記外因性コード配列の３’側且つ前記ポリアデニル化配列の５’側に位置する、請求項６６～７２のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性部分コード配列は、前記必須遺伝子の内因性コード配列によってコードされるタンパク質のＣ末端断片をコードする、請求項６６～７３のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
前記Ｃ末端断片は、５００、２５０、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２０、１５又は１０アミノ酸長未満である、請求項７４に記載のドナー鋳型。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記必須遺伝子の前記対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である、請求項６６～７５のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記必須遺伝子の前記対応する内因性コード配列と比べて、ヌクレアーゼが標的部位に更に結合することを防ぐか、前記ノックインカセットが細胞のゲノムに組み込まれた後の組換えの可能性を低下させるか、又は前記ノックインカセットが細胞のゲノムに組み込まれた後に前記必須遺伝子の前記遺伝子産物及び／若しくは前記目的の遺伝子産物の発現を増加させるようにコドン最適化されている、請求項７６に記載のドナー鋳型。
前記ノックインカセット中の前記必須遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、ヌクレアーゼの標的部位を含まない、請求項７７に記載のドナー鋳型。
前記必須遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子、例えば表３に掲載される遺伝子である、請求項６６～７８のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
前記細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、及び前記必須遺伝子は、ｉＰＳ若しくはＥＳ細胞の分化又はｉＰＳ由来若しくはＥＳ由来細胞の増殖に関与し、例えば表４に掲載される遺伝子である、請求項６６～７９のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない、請求項６６～８０のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
前記目的の遺伝子産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の天然に存在しない変異体、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）若しくはその変異体、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）若しくはその変異体、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、白血球表面抗原分化クラスターＣＤ４７（ＣＤ４７）又はこれらの２つ以上のいずれかの組み合わせである、請求項６６～８１のいずれか一項に記載のドナー鋳型。
安全スイッチを含む遺伝子修飾された哺乳類細胞を作成する方法であって、
安全スイッチの少なくとも１つの必須成分を含む遺伝子ペイロードを含む少なくとも１つのドナー核酸構築物を提供することであって、
前記遺伝子ペイロードは、第１の相同領域（ＨＲ）及び第２のＨＲによってフランキングされ、前記第１及び第２のＨＲは、本質的に、それぞれ第１のゲノム領域（ＧＲ）及び第２のＧＲと相同であり、前記第１のＧＲ及び前記第２のＧＲは、哺乳類細胞において必須遺伝子のエクソン中の所定のゲノム位置に隣接及びフランキングしている、提供すること、
前記所定のゲノム位置に標的化されるヌクレアーゼを含有する遺伝子編集システムを提供すること、及び
前記少なくとも１つのドナー核酸構築物及び前記遺伝子編集システムを哺乳類細胞集団中に加えることであって、複数の前記哺乳類細胞は、前記所定のゲノム位置に前記遺伝子ペイロードを取り込む、加えること
を含み、前記ヌクレアーゼによって引き起こされる前記必須遺伝子配列の破壊は、前記ＨＲ及び遺伝子ペイロードの組み込み時に修復される、方法。
各ドナー核酸構築物は、前記安全スイッチの少なくとも１つの必須成分を含む、請求項８３に記載の方法。
各ドナー核酸構築物は、安全スイッチの前記必須成分の全てを含む、請求項８３又は８４に記載の方法。
前記ドナー核酸構築物の組み合わせは、機能的安全スイッチの前記必須成分の全てを含有する、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
前記安全スイッチの前記必須成分は、二量体化して機能的自殺スイッチを作り出す、請求項８３～８６のいずれか一項に記載の方法。
第１のドナー核酸構築物からの前記遺伝子ペイロードは、前記必須遺伝子の第１のアレルに取り込まれ、及び第２のドナー核酸構築物からの前記遺伝子ペイロードは、前記必須遺伝子の第２のアレルに取り込まれる、請求項８３～８７のいずれか一項に記載の方法。
前記安全スイッチの前記必須成分の１つ以上は、前記必須遺伝子の第１のアレルに取り込まれ、及び前記安全スイッチの前記必須成分の残りは、前記必須遺伝子の前記第２のアレルに取り込まれる、請求項８３～８８のいずれか一項に記載の方法。
前記安全スイッチの活性化は、細胞イベント、環境イベント又は化学薬品によって惹起される、請求項８３～８９のいずれか一項に記載の方法。
前記安全スイッチの活性化は、アポトーシスを誘導する、請求項８３～９０のいずれか一項に記載の方法。
前記安全スイッチの活性化は、前記安全スイッチの前記必須成分の全てを取り込んだ細胞の成長を阻害する、請求項８３～９１のいずれか一項に記載の方法。
請求項８３～９２のいずれか一項に記載の方法によって作製される細胞集団。
前記細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）である、請求項９３に記載の細胞集団。
前記細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項９３に記載の細胞集団。
請求項９３～９５のいずれか一項に記載の細胞集団からの細胞であって、分化細胞に分化している細胞。
任意選択で、Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、骨髄系細胞、樹状細胞及びマクロファージから選択される、免疫系の細胞；
任意選択で、ドーパミン作動性ニューロン、ミクログリア細胞、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、皮質ニューロン、脊髄又は動眼ニューロン、腸ニューロン、プラコード由来細胞、シュワン細胞及び三叉神経又は感覚ニューロンから選択される、神経系の細胞；
任意選択で、網膜色素上皮細胞、光受容体錐体細胞、光受容体桿体細胞、双極細胞及び神経節細胞から選択される、視覚系の細胞；
任意選択で、心筋細胞、内皮細胞及び結節細胞から選択される、心血管系の細胞；又は
任意選択で、肝細胞、胆管細胞及び膵β細胞から選択される、代謝系の細胞
から選択される、請求項９６に記載の分化細胞。
請求項９３～９７のいずれか一項に記載の細胞集団において、前記所定のゲノム位置に前記遺伝子ペイロードを取り込む細胞の割合を増加させる方法であって、
第１の相同領域（ＨＲ）及び第２のＨＲによってフランキングされている特異的遺伝子ペイロードを含む少なくとも１つのドナー核酸構築物を提供することにより、請求項９３～９７のいずれか一項に記載の細胞を含む第１の哺乳類細胞集団を作成することであって、前記第１及び第２のＨＲは、本質的に、それぞれ第１のゲノム領域（ＧＲ）及び第２のＧＲと相同であり、前記第１のＧＲ及び前記第２のＧＲは、哺乳類細胞において必須遺伝子のエクソン中の所定のゲノム位置に隣接及びフランキングしている、作成すること、
前記所定のゲノム位置に標的化されるヌクレアーゼを含有する遺伝子編集システムを提供すること、
前記少なくとも１つのドナー核酸構築物及び前記遺伝子編集システムを前記第１の哺乳類細胞集団中に提供すること、
前記第１の哺乳類細胞集団を培養すること、及び
前記特異的遺伝子ペイロードを含む生存細胞の割合を同定すること、
前記第１の哺乳類細胞集団からの前記生存細胞に、前記所定のゲノム位置に標的化されるヌクレアーゼを含有する遺伝子編集システムを提供することにより、前記第１の哺乳類細胞集団からの前記生存細胞を増殖させることによって第２の哺乳類細胞集団を作成すること；
任意選択で、前記少なくとも１つドナー構築物を再導入すること；
前記第２の哺乳類細胞集団を培養すること；及び
前記特異的外因性遺伝子ペイロードを含む生存細胞の割合を同定すること
を含み、前記特異的外因性遺伝子ペイロードを含む、前記第２の哺乳類細胞集団からの生存細胞の割合は、前記特異的外因性遺伝子ペイロードを含む、前記第１の哺乳類細胞集団からの生存細胞の割合よりも高い、方法。
前記特異的遺伝子ペイロードを含まない、前記第１の哺乳類細胞集団からの複数の前記生存細胞は、前記第２の哺乳類細胞集団の前記作成中に死滅される、請求項９８に記載の方法。
前記特異的遺伝子ペイロードを含まない、前記第１の哺乳類細胞集団からの複数の生存細胞は、前記第２の哺乳類細胞集団の前記作成中に前記特異的遺伝子ペイロードを取り込む、請求項９８又は９９に記載の方法。
前記特異的遺伝子ペイロードを含む、前記第２の哺乳類細胞集団からの生存細胞の割合は、前記特異的遺伝子ペイロードを含む、前記第１の哺乳類細胞集団からの生存細胞の割合の少なくとも３倍である、請求項９８～１００のいずれか一項に記載の方法。
前記特異的遺伝子ペイロードを含まない、前記第２の哺乳類細胞集団からの生存細胞の割合は、前記特異的遺伝子ペイロードを含まない、前記第１の哺乳類細胞集団からの生存細胞の割合の少なくとも５分の１である、請求項９８～１０１のいずれか一項に記載の方法。
前記ドナー核酸構築物の少なくとも１つは、少なくとも１つの他のドナー核酸構築物と異なる遺伝子ペイロードを有し、及び少なくとも前記第２の哺乳類細胞集団のうちの複数のものは、前記異なる遺伝子ペイロードの各々を取り込む、請求項９８～１０２のいずれか一項に記載の方法。
前記ＨＲ領域の少なくとも１つは、ヌクレアーゼ切断部位における前記遺伝子ペイロードの切断を防ぐ少なくとも１つの突然変異を含有する、請求項９８～１０３のいずれか一項に記載の方法。
生存細胞の割合の同定は、フローサイトメトリーを用いて達成される、請求項９８～１０４のいずれか一項に記載の方法。
ゲノム修飾を含む操作されたｉＰＳＣであって、前記ゲノム修飾は、前記ｉＰＳＣのゲノムにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内への外因性ノックインカセットの挿入を含み、前記ノックインカセットは、ＧＡＰＤＨ又はその機能変異体をコードする外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に安全スイッチのための外因性コード配列を含み、前記ｉＰＳＣは、前記目的の遺伝子産物及びＧＡＰＤＨ又はその機能変異体を発現し、任意選択で、前記目的の遺伝子産物及び前記ＧＡＰＤＨは、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性プロモーターから発現される、操作されたｉＰＳＣ。
前記ｉＰＳＣのゲノムは、ＧＡＰＤＨと前記目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、前記遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び前記調節エレメントは、前記タンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする、請求項１０６に記載のｉＰＳＣ。
前記ｉＰＳＣのゲノムは、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の前記コード配列と、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む、請求項１０７に記載のｉＰＳＣ。
前記ｉＰＳＣのゲノムは、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、３’ＵＴＲ配列が存在する場合、前記３’ＵＴＲ配列は、前記外因性コード配列の３’側且つ前記ポリアデニル化配列の５’側に位置する、請求項１０６～１０８のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の前記コード配列は、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列と１００％未満の同一性である、請求項１０６～１０９のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
前記ｉＰＳＣのゲノムは、レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない、請求項１０６～１１０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
医薬としての使用のための、請求項１０６～１１１のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
疾患、障害又は病態、例えば癌の治療における使用のための、請求項１０６～１１２のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
ｉＰＳＣ集団中のｉＰＳＣのゲノムを編集するためのシステムであって、前記ｉＰＳＣ集団と、前記ｉＰＳＣのＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列内に切断を生じさせるヌクレアーゼと、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の外因性コード配列又は部分コード配列とインフレームで且つその下流（３’側）に安全スイッチを含むノックインカセットを含むドナー鋳型とを含むシステム。
前記切断は、二本鎖切断である、請求項１１４に記載のシステム。
前記切断は、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の最後のエクソン内に位置する、請求項１１４又は１１５に記載のシステム。
前記ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、及び前記システムは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのためのガイド分子を更に含む、請求項１１４～１１６のいずれか一項に記載のシステム。
前記ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はメガヌクレアーゼである、請求項１１４～１１６のいずれか一項に記載のシステム。
前記ノックインカセットは、ＧＡＰＤＨと前記目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、前記遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び前記調節エレメントは、前記タンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする、請求項１１４～１１８のいずれか一項に記載のシステム。
前記ノックインカセットは、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列と、前記目的の遺伝子産物のための外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む、請求項１１９に記載のシステム。
前記ノックインカセットは、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、３’ＵＴＲ配列が存在する場合、前記３’ＵＴＲ配列は、前記外因性コード配列の３’側且つ前記ポリアデニル化配列の５’側に位置する、請求項１１４～１２０のいずれか一項に記載のシステム。
前記ノックインカセット中の前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記ｉＰＳＣの前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の前記対応する内因性コード配列と１００％未満の同一性である、請求項１１４～１２１のいずれか一項に記載のシステム。
前記ノックインカセット中の前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記ｉＰＳＣの前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の前記対応する内因性コード配列と比べて、前記ＤＮＡヌクレアーゼの標的部位を除去し、且つ／又は前記ノックインカセットが前記ｉＰＳＣのゲノムに組み込まれた後の相同組換えの可能性を低下させるようにコドン最適化されている、請求項１２２に記載のシステム。
前記ノックインカセット中の前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の前記外因性コード配列又は部分コード配列は、前記ヌクレアーゼの標的部位を含まない、請求項１２３に記載のシステム。
哺乳類細胞集団内における、所望の遺伝子ペイロードを有する遺伝子修飾された哺乳類細胞の割合を増加させる方法であって、
第１の相同領域（ＨＲ）及び第２のＨＲによってフランキングされている特異的遺伝子ペイロードを含む少なくとも１つのドナー核酸構築物を提供することにより、第１の哺乳類細胞集団を作成することであって、前記第１及び第２のＨＲは、本質的に、それぞれ第１のゲノム領域（ＧＲ）及び第２のＧＲと相同であり、前記第１のＧＲ及び前記第２のＧＲは、哺乳類細胞において必須遺伝子のエクソン中の所定のゲノム位置に隣接及びフランキングしている、作成すること、
前記所定のゲノム位置に標的化されるヌクレアーゼを含有する遺伝子編集システムを提供すること、
前記少なくとも１つのドナー核酸構築物及び前記遺伝子編集システムを前記第１の哺乳類細胞集団中に提供すること、
前記第１の哺乳類細胞集団を培養すること、及び
前記特異的遺伝子ペイロードを含む生存細胞の割合を同定すること、
前記第１の哺乳類細胞集団からの前記生存細胞に、前記所定のゲノム位置に標的化されるヌクレアーゼを含有する遺伝子編集システムを提供することにより、第２の哺乳類細胞集団を作成すること；
任意選択で、前記少なくとも１つドナー構築物を再導入すること；
前記第２の哺乳類細胞集団を培養すること；及び
前記特異的外因性遺伝子ペイロードを含む生存細胞の割合を同定すること
を含み、前記特異的外因性遺伝子ペイロードを含む、前記第２の哺乳類細胞集団からの生存細胞の割合は、前記特異的外因性遺伝子ペイロードを含む、前記第１の哺乳類細胞集団からの生存細胞の割合よりも高い、方法。
前記特異的遺伝子ペイロードを含まない、前記第１の哺乳類細胞集団からの複数の前記生存細胞は、前記第２の哺乳類細胞集団の前記作成中に死滅される、請求項１２５に記載の方法。
前記特異的遺伝子ペイロードを含まない、前記第１の哺乳類細胞集団からの複数の生存細胞は、前記第２の哺乳類細胞集団の前記作成中に前記特異的遺伝子ペイロードを取り込む、請求項１２５又は１２６に記載の方法。
前記特異的遺伝子ペイロードを含む、前記第２の哺乳類細胞集団からの生存細胞の割合は、前記特異的遺伝子ペイロードを含む、前記第１の哺乳類細胞集団からの生存細胞の割合の少なくとも３倍である、請求項１２５～１２７のいずれか一項に記載の方法。
前記ドナー核酸構築物の少なくとも１つは、少なくとも１つの他のドナー核酸構築物と異なる遺伝子ペイロードを有し、及び少なくとも前記第２の哺乳類細胞集団のうちの複数のものは、前記異なる遺伝子ペイロードの各々を取り込む、請求項１２５～１２８のいずれか一項に記載の方法。
前記特異的遺伝子ペイロードを含まない、前記第２の哺乳類細胞集団からの生存細胞の割合は、前記特異的遺伝子ペイロードを含まない、前記第１の哺乳類細胞集団からの生存細胞の割合の少なくとも５分の１である、請求項１２５～１２９のいずれか一項に記載の方法。
前記ＨＲ領域の少なくとも１つは、ヌクレアーゼ切断部位における前記遺伝子ペイロードの切断を防ぐ少なくとも１つの突然変異を含有する、請求項１２５～１３０のいずれか一項に記載の方法。
生存細胞の割合の同定は、フローサイトメトリーを用いて達成される、請求項１２５～１３１のいずれか一項に記載の方法。
請求項１２５～１３２のいずれか一項に記載の方法によって作製される細胞集団。
前記細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）である、請求項１３３に記載の細胞集団。
前記細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１３３に記載の細胞集団。
請求項１３３～１３５のいずれか一項に記載の細胞集団からの細胞であって、分化細胞に分化している細胞。
任意選択で、Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、骨髄系細胞、樹状細胞及びマクロファージから選択される、免疫系の細胞；
任意選択で、ドーパミン作動性ニューロン、ミクログリア細胞、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、皮質ニューロン、脊髄又は動眼ニューロン、腸ニューロン、プラコード由来細胞、シュワン細胞及び三叉神経又は感覚ニューロンから選択される、神経系の細胞；
任意選択で、網膜色素上皮細胞、光受容体錐体細胞、光受容体桿体細胞、双極細胞及び神経節細胞から選択される、視覚系の細胞；
任意選択で、心筋細胞、内皮細胞及び結節細胞から選択される、心血管系の細胞；又は
任意選択で、肝細胞、胆管細胞及び膵β細胞から選択される、代謝系の細胞
から選択される、請求項１３６に記載の分化細胞。
前記ｉＰＳＣのゲノムは、ＧＡＰＤＨと前記目的の遺伝子産物とが別個の遺伝子産物として発現することを可能にする調節エレメントを含み、任意選択で、前記遺伝子産物の少なくとも一方は、タンパク質であり、及び前記調節エレメントは、前記タンパク質が他方の遺伝子産物と別個に発現することを可能にする、請求項１３５に記載のｉＰＳＣ。
前記ｉＰＳＣのゲノムは、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子のコード配列と、前記目的の遺伝子産物のための外因性コード配列との間に位置するＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを含む、請求項１３８に記載のｉＰＳＣ。
前記ｉＰＳＣのゲノムは、前記目的の遺伝子産物のための前記外因性コード配列の下流にポリアデニル化配列及び任意選択で３’ＵＴＲ配列を含み、３’ＵＴＲ配列が存在する場合、前記３’ＵＴＲ配列は、前記外因性コード配列の３’側且つ前記ポリアデニル化配列の５’側に位置する、請求項１３８又は１３９に記載のｉＰＳＣ。
前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の前記コード配列は、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の内因性コード配列と１００％未満の同一性である、請求項１３８～１４０のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
前記ｉＰＳＣのゲノムは、レポーター遺伝子、例えば蛍光レポーター遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子を含まない、請求項１３８～１４１のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
医薬としての使用のための、請求項１３８～１４２のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。
疾患、障害又は病態、例えば癌の治療における使用のための、請求項１３８～１４３のいずれか一項に記載のｉＰＳＣ。