JP2024500847A - 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム - Google Patents

適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム Download PDF

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Abstract

本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、特に適合可能な受容体特異性を有するＣＡＲ（ａｒＣＡＲ）に関する。本発明はまた、ＣＡＲのポリペプチドおよび他の関連分子、ポリヌクレオチド、ベクター、およびそれらを含む細胞組成物を提供する。本開示のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含む医薬組成物、および対象における疾患の処置でのそれらの使用も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月１８日出願の米国特許仮出願第６３／１２７，５８７号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、特に適合可能な受容体特異性（adaptable receptor specificity）を有するＣＡＲ（ａｒＣＡＲ）、および免疫療法（例えば養子細胞療法）におけるそれらの使用に関する。
電子的に提出された配列表への参照
この出願は、ファイル名「ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」および作成日２０２１年１２月１５日で、サイズが１０３，８８６バイトであるＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
養子細胞療法（ＡＣＴ）は、典型的には、ドナーから細胞を単離すること、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を培養および／または操作すること、およびその後、疾患の処置のために患者に細胞を移入することを含む。細胞が特異的抗原を標的とすることを可能にするために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて細胞を操作することが多い。従来のＣＡＲは固定した設計を有する；したがって、１つのタイプのＣＡＲ Ｔ細胞は通常、１つの抗原エピトープのみを標的とすることができる。この融通性のない設計は、臨床適用を制限し、非常に高い製造コストにつながる。スイッチ－ＣＡＲプラットフォームのための様々なアプローチがあるが、これらの抗原特異的ＣＡＲは、典型的にはカスタムメイドベースで作製される。
したがって、ＣＡＲの特異性を容易に適合させて、養子細胞療法を使用して疾患を処置するための療法および方法を改善するために、ＣＡＲを調節するための組み込み（ビルトイン）の便利な機構を有する改善されたユニバーサルＣＡＲプラットフォームが依然として必要とされている。
一態様では、本明細書で提供されるのは、適合可能な受容体特異性成分を有するユニバーサルキメラ抗原受容体（ａｒＣＡＲ）システムであり、ａｒＣＡＲシステムは、
（ｉ）（ａ）細胞外タグ結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインとを含む第１のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を有する免疫エフェクター細胞；および
（ｉｉ）（ａ）標的細胞上の少なくとも１つの抗原に結合する抗原結合ドメインと、（ｂ）キメラ抗原受容体の第１のポリペプチドのタグ結合ドメインによって認識されるタグとを含む第２のポリペプチド；
を含み、
（ｉ）タグは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場（alternative scaffold）を含み、タグ結合ドメインは、タグに結合する抗イディオタイプ分子を含む、あるいは
（ｉｉ）タグは、タグ結合ドメインに結合する抗イディオタイプ分子を含み、タグ結合ドメインは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場を含む。
いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ分子は、抗体、その抗原結合フラグメントまたは代替足場の少なくとも１つの抗原結合領域に結合する。いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ分子は、抗体もしくはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に結合する。
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場を含む。いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ分子は、抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗イディオタイプ代替足場である。
いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖダイアボディ、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはナノボディ、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、重鎖可変領域、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ダイアボディ、トリアボディ、またはデカボディである。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、またはタグのうちの少なくとも１つは、シングルドメイン抗体またはナノボディを含む。いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、またはタグのうちの少なくとも１つは、ＶＨＨを含む。いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメインおよびタグはそれぞれＶＨＨを含む。いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、タグ、および抗原結合ドメインはそれぞれＶＨＨを含む。
いくつかの実施形態において、抗原結合フラグメント、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、およびタグのうちの１つまたは複数は、少なくとも部分的に、配列番号８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、および１１０～１３３からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、またはタグのうちの少なくとも１つは、ｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態では、代替足場は、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）またはセンチリン（Ｃｅｎｔｙｒｉｎ）である。
いくつかの実施形態では、タグは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場を含む。いくつかの実施形態では、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場は、非ヒト供給源由来のポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、非ヒト供給源に由来するポリペプチドは、呼吸器多核体ウイルス（respiratory syncytial virus）（ＲＳＶ）Ｆタンパク質、リステリア菌のインターナリン（Listeria internalin）、コブラ毒ホスホリパーゼＡ２（Cobra phospholipase A2）、エボラウイルス核タンパク質（Ebola nucleoprotein）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄ、ラクトコッカスのファージ受容体結合タンパク質（ＲＢＰ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、リシン、またはニワトリ卵白リゾチームである。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの腫瘍抗原または自己免疫抗原に結合する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原は、同じ腫瘍または自己免疫疾患に関連する。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、膠芽腫（グリオブラストーマ）、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍に関連する。いくつかの実施形態では、膠芽腫に関連する腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＰＤＧＦＲＡ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、またはＩＬ１３Ｒα２である。いくつかの実施形態では、卵巣がんに関連する腫瘍抗原は、ＦＯＬＲ１、ＦＳＨＲ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、またはＢ７Ｈ４である。いくつかの実施形態では、子宮頸がんまたは頭頸部がんに関連する腫瘍抗原は、ＧＤ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ２、またはＥＧＦＲである。いくつかの態様において、肝臓がんに関連する腫瘍抗原は、クローディン１８．２（Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２）、ＧＰＣ－３、ＥｐＣＡＭ、ｃＭＥＴ、またはＡＦＰである。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒンジドメインをさらに含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインおよび／またはヒンジドメインはＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＬ２Ｒｂ、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、または２Ｂ４（ＣＤ２４４）に由来する。
様々な実施形態において、第２のポリペプチドは、Ｎ末端に抗原結合ドメインを含み、Ｃ末端にタグを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｃ末端に抗原結合ドメインを含み、Ｎ末端にタグを含む。
様々な実施形態において、第２のポリペプチドは可溶性ポリペプチドである。
本明細書に記載のａｒＣＡＲの様々な実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、樹状細胞またはマクロファージである。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）（ｉＰＳＣ）に由来する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＴ細胞またはＮＫ細胞である。
本明細書に記載のａｒＣＡＲの様々な実施形態では、ａｒＣＡＲは１つまたは複数のポリペプチドをさらに含み、そのポリペプチドのそれぞれが、（ａ）ユニークな抗原に結合する抗原結合ドメインと、（ｂ）第１のポリペプチドのタグ結合ドメインによって認識されるタグとを含む。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、２つ以上の本明細書に記載のａｒＣＡＲを含むａｒＣＡＲシステムであり、各ａｒＣＡＲが、タグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のａｒＣＡＲシステムの第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のａｒＣＡＲシステムの第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のａｒＣＡＲシステムの第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本明細書に記載のポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、抗原結合フラグメント、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、およびタグのうちの１つまたは複数は、配列番号８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、および１０９からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によって少なくとも部分的にコードされる。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドである。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のａｒＣＡＲシステムの第１のポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のａｒＣＡＲシステムの第２のポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のａｒＣＡＲシステムの免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のａｒＣＡＲシステムの第２のポリペプチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のａｒＣＡＲシステムの免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物と、ａｒＣＡＲシステムの第２のポリペプチドを含む医薬組成物とを組み合わせて含むキットである。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ａｒＣＡＲシステムの第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、細胞に導入することを含む、第１のポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む宿主細胞を調製する方法である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ａｒＣＡＲシステムの第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、細胞に導入することを含む、第２のポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む宿主細胞を調製する方法である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象において疾患を処置する方法であって、その方法は、
（ｉ）明細書に記載のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を含む免疫エフェクター細胞、および
（ｉｉ）前記ａｒＣＡＲの第２のポリペプチド、または前記第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記第２のポリペプチドを含む宿主細胞
の治療有効量を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、免疫エフェクター細胞の前、後、またはそれと併せて投与される。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象において疾患を処置する方法であって、その方法は、
（ｉ）２つ以上のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞であって、２つ以上のａｒＣＡＲがそれぞれタグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む、免疫エフェクター細胞、および
（ｉｉ）前記２つ以上のａｒＣＡＲの第２のポリペプチド、または前記第２のポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、または前記第２のポリペプチドを含む１つまたは複数の宿主細胞
の治療有効量を対象に投与することを含む。
本明細書に記載の処置方法のいくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、樹状細胞またはマクロファージである。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、第１のポリペプチドを構成的に発現する。
いくつかの実施形態では、疾患はがんまたは自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、がんは、膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍である。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞と第２のポリペプチドは同時投与される。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞と第２のポリペプチドは逐次投与される。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は自己細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は同種異系細胞である。
いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
本開示の例示的な適合可能な受容体特異性を有するＣＡＲ（ａｒＣＡＲ）の概略図を示す。ＣＡＲは、可溶性薬物上の「タグ」に結合する。可溶性薬物は、抗体もしくは抗体フラグメント（例えば、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｍＡｂ）または代替足場であり得る。腫瘍特異性およびＣＡＲの活性化は、可溶性薬物によって駆動される。 本開示の別の例示的なａｒＣＡＲの概略図を示す。ＶＨＨが、可溶性薬物における抗原結合ドメインおよびタグの両方、ならびにａｒＣＡＲのタグ結合ドメイン（α－タグ）において使用される。 抗イディオタイプｍＡｂの構造的特徴を示す。 例示的なＶＨＨ構造の構造的特徴を示す。 本開示の別の例示的なａｒＣＡＲの概略図を示す。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のＶＨＨおよび抗イディオタイプ（ＩＤ）ＮＨＰ ＶＨＨが、可溶性薬物、ならびにａｒＣＡＲのタグ結合ドメインにおいて使用される。 本開示の別の例示的なａｒＣＡＲの概略図を示す。 本開示の別の例示的なａｒＣＡＲの概略図を示す。 本開示の別の例示的なａｒＣＡＲの概略図を示す。ハーセプチンｓｃＦｖがＣＡＲに融合され、ハーセプチン抗ＩＤ ｓｃＦｖ（Ｈｅｒ－抗ＩＤ）がＥＧＦＲ標的化ＶＨＨ（９Ｇ８）に融合される。 ハーセプチンｓｃＦｖ ＣＡＲを発現するＴ細胞が、９Ｇ８－ｓｃＦｖ６９融合タンパク質との組み合わせにより、ＥＧＦＲ＋細胞を標的とすることができることを示す。 本開示のＣＡＲ構築物を送達するために使用されるレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。 本開示のブリッジ構築物を発現するために使用されるプラスミドのベクターマップを示す。 ブリッジタンパク質の純度を示すゲル電気泳動画像を示す。 ｓｃＦｖ６９－ＣＡＲ、ならびにブリッジタンパク質の２つのバリアント：９Ｇ８＿ハーセプチンｓｃＦｖおよびハーセプチンｓｃＦｖ ９Ｇ８の概略図を示す。 ブリッジタンパク質へのｓｃＦｖ６９－ＣＡＲの結合を示す。グラフ中のサンプルは、以下の順序：９Ｇ８＿ハーセプチン、ハーセプチン＿９Ｇ８；で現れる。 ＥＧＦＲ形質導入ＣＨＯ細胞でのＥＧＦＲの発現を示す。 Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現を示す。 ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞が、正しいブリッジタンパク質と組み合わせるとＣＤ２５活性化を示したことを実証する。グラフ中のサンプルは、凡例に指定される順序で現れる。 ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞が、ミスマッチブリッジタンパク質と組み合わせるとＣＤ２５活性化を示さなかったことを実証する。グラフ中のサンプルは、凡例に指定される順序で現れる。 ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞が、正しいブリッジタンパク質と組み合わせると細胞傷害活性を示したことを実証する。グラフ中のサンプルは、凡例に指定される順序で現れる。 ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞が、ミスマッチブリッジタンパク質と組み合わせると細胞傷害活性を示さなかったことを実証する。グラフ中のサンプルは、凡例に指定される順序で現れる。 本開示のＶＨＨ ＣＡＲを送達するために使用されるレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。 Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＶＨＨ ＣＡＲの発現を示す。 ＶＨＨ ＣＡＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞の表面でのトニックシグナル伝達（tonic signaling）の欠如を示す。 図１１ＣにおけるＣＤ６９検出に使用したＦＡＣｓゲーティング戦略を示す。 ニワトリまたはヒト由来のリゾチームへの抗ニワトリ卵白リゾチーム（anti-Chicken Hen Egg Lysozyme）－ＶＨＨ ＣＡＲの結合を示す。 ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を標的とするＶＨＨのアミノ酸配列（配列番号９６）、ＬＹＳＯ＿ＣＷ＿Ｐ０１＿Ｂ１１を標的とするＶＨＨのアミノ酸配列（配列番号１０２）、およびＬＹＳＯ＿ＣＷ＿Ｐ０１＿Ｄ０４を標的とするＶＨＨのアミノ酸配列（配列番号１０４）のアラインメントを示す。アラインメントされた配列の上方にコンセンサス配列（配列番号１３４）を示す。 ａｒＣＡＲの概念実証（ＰＯＣ）（ｐｒｏｏｆ－ｏｆ－ｃｏｎｃｅｐｔ）試験のためのプラスミドマップｐ５１０を示す。 ａｒＣＡＲの概念実証（ＰＯＣ）試験のためのプラスミドマップｐ５１１を示す。 ａｒＣＡＲの概念実証（ＰＯＣ）試験のためのプラスミドマップｐ５１４を示す。 ａｒＣＡＲの概念実証（ＰＯＣ）試験のためのプラスミドマップｐ５１５を示す。 ａｒＣＡＲの概念実証（ＰＯＣ）試験のためのプラスミドマップｐ５１６を示す。 ａｒＣＡＲの概念実証（ＰＯＣ）試験のためのプラスミドマップｐ５１７を示す。 ａｒＣＡＲの概念実証（ＰＯＣ）試験のためのプラスミドマップｐ５１８を示す。 ａｒＣＡＲの概念実証（ＰＯＣ）試験のためのプラスミドマップｐ５１９を示す。 ａｒＣＡＲの概念実証（ＰＯＣ）試験のためのプラスミドマップｐ５２０を示す。 ａｒＣＡＲの概念実証（ＰＯＣ）試験のためのプラスミドマップｐ５２１を示す。 ａｒＣＡＲの概念実証（ＰＯＣ）試験のためのプラスミドマップｐ５２２を示す。 ヒト化Ｂ１１（ｐ１６４９）ＣＡＲおよびヒト化Ｄ０４（ｐ１６４８）ＣＡＲを含むレンチウイルス（ＬＶ）で形質導入したＮｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞のＮｕｒ７７レポーター株）のＣＡＲおよびＧＦＰの発現を示す。非形質導入（ＵＴＤ）Ｎｕｒｋａｔの結果も示す。ＣＡＲの発現を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔからのポリクローナル抗ラクダ科動物ＶＨＨカクテルによって測定した（例えば、ロバストな検出のためのＶＨＨのヒト化バージョンとラクダ科動物バージョンとの間の充分な相同性）。 フローサイトメトリーを介してストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出された、ビオチン化ＨＥＬで染色されたＢ１１（ｐ１６４９）およびＤ０４（ｐ１６４８）ＣＡＲ Ｎｕｒｋａｔ細胞を示す。ＵＴＤは、陰性対照として使用される非形質導入Ｎｕｒｋａｔ細胞である。 ファージディスプレイパニングスキーマの概要を示す。Ｄ０４に対する抗イディオタイプの発見のスキーマを例として示す。同様に、Ｂ１１に対する抗イディオタイプの発見の場合は、図中において２つのＶＨＨの場所が入れ替わる。 各ＣＮＴＹライブラリーについて得られたコロニーのペリプラズム抽出物（ＰＰＥ）のＥＬＩＳＡ出力（４５０ｎｍでの吸光度）を示す。黒いバーはＢ１１タンパク質に対するＥＬＩＳＡ応答を表し、灰色のバーはＤ０４タンパク質に対する応答を表す。 各ＣＮＴＹライブラリーについて得られたコロニーのペリプラズム抽出物（ＰＰＥ）のＥＬＩＳＡ出力（４５０ｎｍでの吸光度）を示す。黒いバーはＢ１１タンパク質に対するＥＬＩＳＡ応答を表し、灰色のバーはＤ０４タンパク質に対する応答を表す。 各ＣＮＴＹライブラリーについて得られたコロニーのペリプラズム抽出物（ＰＰＥ）のＥＬＩＳＡ出力（４５０ｎｍでの吸光度）を示す。黒いバーはＢ１１タンパク質に対するＥＬＩＳＡ応答を表し、灰色のバーはＤ０４タンパク質に対する応答を表す。 各ＣＮＴＹライブラリーについて得られたコロニーのペリプラズム抽出物（ＰＰＥ）のＥＬＩＳＡ出力（４５０ｎｍでの吸光度）を示す。黒いバーはＢ１１タンパク質に対するＥＬＩＳＡ応答を表し、灰色のバーはＤ０４タンパク質に対する応答を表す。 ＩｇＧベースのリンカーなしでの抗イディオタイプＶＨＨ－Ｆｃ融合構築物のＢ１１ ＣＡＲ発現Ｎｕｒｋａｔ細胞へのＦＡＣＳ結合を示す。破線の囲みは、ＥＬＩＳＡにおいてＤ０４に結合することが観察された表１５からの選択タンパク質を同定する。点線の囲みは、ＥＬＩＳＡにおいてＢ１１に結合することが観察された表１６からの選択タンパク質を同定する。各タンパク質を、（凡例に示すように）５０ｎＭ～０．０２ｐＭまでの３倍希釈系列で両方の細胞株において試験した。抗Ｆｃ ＡＰＣを介してＦｃ融合タンパク質を検出し、この検出方法について陽性であった細胞のパーセンテージを示す。希釈系列で標的細胞株への特異的結合を示したタンパク質は、タンパク質ＩＤの下に星印がつけられている。対照には、（ｉ）ＶＨＨ－Ｆｃ添加なし、および（ｉｉ）抗ＶＨＨカクテル検出試薬（右端）が含まれる。各タンパク質のグラフに示される試料は、凡例に指定される順序で現れる。 ＩｇＧベースのリンカーなしでの抗イディオタイプＶＨＨ－Ｆｃ融合構築物のＤ０４ ＣＡＲ発現Ｎｕｒｋａｔ細胞へのＦＡＣＳ結合を示す。破線の囲みは、ＥＬＩＳＡにおいてＤ０４に結合することが観察された表１５からの選択タンパク質を同定する。点線の囲みは、ＥＬＩＳＡにおいてＢ１１に結合することが観察された表１６からの選択タンパク質を同定する。各タンパク質を、（凡例に示すように）５０ｎＭ～０．０２ｐＭまでの３倍希釈系列で両方の細胞株において試験した。抗Ｆｃ ＡＰＣを介してＦｃ融合タンパク質を検出し、この検出方法について陽性であった細胞のパーセンテージを示す。希釈系列で標的細胞株への特異的結合を示したタンパク質は、タンパク質ＩＤの下に星印がつけられている。対照には、（ｉ）ＶＨＨ－Ｆｃ添加なし、および（ｉｉ）抗ＶＨＨカクテル検出試薬（右端）が含まれる。各タンパク質のグラフに示される試料は、凡例に指定される順序で現れる。 ストレプトアビジン－ＡＰＣを用いたＦＡＣＳを介して検出された、標的およびオフターゲットＣＡＲ Ｎｕｒｋａｔ細胞へのリード抗イディオタイプビオチン化ＶＨＨ－Ｆｃの結合を示す。試験した細胞株には、Ｂ１１、Ｄ０４、Ｐ７１１、Ｐ７１２、Ｐ７１３、Ｐ７１６、および親細胞が含まれる。Ｂ１１およびＤ０４細胞は、それぞれＢ１１およびＤ０４ ＶＨＨ ＣＡＲを発現するＣＡＲ Ｎｕｒｋａｔである。Ｐ７１１、Ｐ７１２、Ｐ７１３、Ｐ７１６細胞は、オフターゲットＣＡＲ Ｎｕｒｋａｔである。親細胞は、形質導入されていない非ＣＡＲ発現Ｎｕｒｋａｔである。対照には、ビオチン化プロテインＡ（ほとんどのＶＨＨに非特異的に結合する）、ＰＲＯＴ７８６（無関係のビオチン化ＶＨＨ－Ｆｃタンパク質）、およびビオチン化タンパク質の添加なしが含まれる。各タンパク質のグラフに示される試料は、凡例に指定される順序で現れる。 ＦＡＣＳを介して１０ｎＭの抗イディオタイプＶＨＨ Ｆｃ融合物とインキュベートしたＮｕｒｋａｔ細胞を用いた終夜刺激アッセイの結果を示す。抗イディオタイプＦｃ融合タンパク質と終夜共培養した後のＢ１１およびＤ０４ ＣＡＲ Ｎｕｒｋａｔ細胞ならびに親Ｎｕｒｋａｔ細胞のＧＦＰ発現を示す。対照には、ＰＭＡ／イオノマイシン（堅牢なＮｕｒｋａｔ細胞活性化をもたらすＴＣＲ－架橋剤）、ビオチン化プロテインＡ（ｂｔＰＲＯＴＡ）、およびタンパク質を添加しない試料が含まれる。各タンパク質のグラフに示される試料は、凡例に指定される順序で現れる。 ＦＡＣＳを介して１０ｎＭの抗イディオタイプＶＨＨ Ｆｃ融合物とインキュベートしたＮｕｒｋａｔ細胞を用いた終夜刺激アッセイの結果を示す。終夜のインキュベーション後におけるストレプトアビジン－ＡＰＣを介したビオチン化タンパク質の検出を示す。対照には、ＰＭＡ／イオノマイシン（ロバストなＮｕｒｋａｔ細胞活性化をもたらすＴＣＲ－架橋剤）、ビオチン化プロテインＡ（ｂｔＰＲＯＴＡ）、およびタンパク質を添加しない試料が含まれる。各タンパク質のグラフに示される試料は、凡例に指定される順序で現れる。 ブリッジタンパク質ＡＭＤ１０９を５ｎＭで添加した同一のＴ細胞キリングアッセイの結果を示す。死んだ標的の割合（％）を、Ｕ８７標的細胞またはＫ５６２標的細胞のいずれかについて示す。 ブリッジタンパク質ＡＭＤ１１２を５ｎＭで添加した同一のＴ細胞キリングアッセイの結果を示す。死んだ標的の割合（％）を、Ｕ８７標的細胞またはＫ５６２標的細胞のいずれかについて示す。
様々な刊行物、論文および特許が、背景技術および明細書全体において引用または記載されている；これらの参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、行為、材料、デバイス、物品などの議論は、本発明の文脈を提供することを目的としている。そのような議論は、これらの事項のいずれかまたは全てが、開示または特許請求される任意の発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
本願は、とりわけ、適合可能な受容体特異性成分を有するユニバーサルキメラ抗原受容体（ａｒＣＡＲ）システム、および免疫療法（例えば養子細胞療法）におけるそれらの使用を提供する。このａｒＣＡＲプラットフォームは、タグポリペプチド親和性を使用し、複数の受容体が細胞療法で提示されることを可能にする、受容体の調節のための組み込み（ビルトイン）の便利な機構を提供する。このようなａｒＣＡＲは、目的に適合する（fit-for-purpose）細胞療法を可能にすることができる。
定義
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、一般に、細胞外標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、シグナル伝達ドメインおよび任意選択で少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインとを、天然では単一タンパク質上で一緒には見いだされない組み合わせですべて含む、細胞表面受容体を指す。これは特に、細胞外ドメインと細胞質ドメインが天然では単一の受容体タンパク質上で一緒には見いだされない受容体を含む。
本明細書で使用される「適合可能な受容体特異性成分を有するキメラ抗原受容体」または「ａｒＣＡＲ」という用語は、受容体の細胞外標的結合ドメインを様々な異なる抗原結合部分と結合（coupled with）させることができる２成分ＣＡＲシステムを指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、本明細書に記載の「適合可能な受容体特異性成分を有するキメラ抗原受容体」または「ａｒＣＡＲ」を包含することを意味する。本開示のａｒＣＡＲシステムは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞に由来し得るＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含め、リンパ球などの免疫エフェクター細胞とともに使用され得る。
用語「免疫エフェクター細胞」は、本明細書で使用される場合、特異的免疫応答を調節または達成することができる形態に分化した細胞を意味する。このような細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含むがこれらに限定されない、治療に適した成熟リンパ球を含むことができ、樹状細胞またはマクロファージも含んでいてよい。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含み、インタクトな抗体および機能的（抗原結合性）抗体フラグメント、例えば、フラグメント抗原結合（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）フラグメント、単鎖（または一本鎖）抗体フラグメント（単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む）、およびシングルドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ）フラグメントまたはナノボディ、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、重鎖可変領域、または単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。この用語は、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性（例えば二重特異性）抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、デカボディ、タンデムジ－ｓｃＦｖ、およびタンデムトリ－ｓｃＦｖなどの、免疫グロブリンの遺伝子操作および／または他の修飾形態を包含する。特に明記しない限り、「抗体」という用語は、その機能的抗体フラグメントを包含すると理解されるべきである。この用語はインタクトなまたは完全長の抗体も包含し、ＩｇＧおよびそのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＹ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含む、任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む。
「抗イディオタイプ分子」という用語は、抗原結合フラグメントなどの抗体のイディオトープを特異的に認識し、特異的に標的化し、および／または特異的に結合する分子（例えば、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体フラグメント、代替足場）を指す。抗体のイディオトープは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、抗体の可変領域、ならびに／またはそのような可変領域および／もしくはそのようなＣＤＲの一部の部分もしくは部分、ならびに／または前述のものの任意の組み合わせのうちの１つもしくは複数の中の残基を含み得るが、必ずしもそれらに限定されない。ＣＤＲは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３からなる群より選択される１つまたは複数であり得る。抗体の可変領域は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、または重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせであってよい。抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の部分フラグメント（partial fragment）または部分は、抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域内の２個以上、５個以上、または１０個以上の連続アミノ酸、例えば、約２～約１００個、約５～約１００個、約１０～約１００個、約２～約５０個、約５～約５０個、または約１０～約５０個の連続アミノ酸を含むフラグメントであってよい；イディオトープは、アミノ酸の複数の非連続ストレッチを含み得る。抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の部分フラグメントは、可変領域内の２個以上、５個以上、または１０個以上の連続アミノ酸、例えば、約２～約１００個、約５～約１００個、約１０～約１００個、約２～約５０個、約５～約５０個、または約１０～約５０個の連続アミノ酸を含むフラグメントであってよく、一部の実施形態では、１つまたは複数のＣＤＲまたはＣＤＲフラグメントを含む。ＣＤＲフラグメントは、ＣＤＲ内の連続または非連続の２個以上、または５個以上のアミノ酸であり得る。したがって、抗体のイディオトープは、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域内の１つまたは複数のＣＤＲあるいは１つまたは複数のＣＤＲフラグメントを含む、約２～約１００個、約５～約１００個、約１０～約１００個、約２～約５０個、約５～約５０個、または約１０～約５０個の連続アミノ酸であり得る。別の実施形態では、イディオトープは、抗体の可変領域、例えばＣＤＲ部位に位置する単一アミノ酸であってもよい。
いくつかの実施形態では、イディオトープは、抗体の可変部分内の任意の単一の抗原決定基またはエピトープである。場合によっては、それは、抗体の実際の抗原結合部位と重複することができ、場合によっては、抗体の抗原結合部位の外側の可変領域配列を含んでいてもよい。抗体の個々のイディオトープのセットが、いくつかの実施形態では、そのような抗体の「イディオタイプ」と呼ばれる。
本明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、抗体もしくは抗体フラグメント、Ｔ細胞受容体または代替足場によって結合され得る任意の作用物質（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、それらの部分、またはそれらの組み合わせ）の分子を指す。抗原はまた、免疫応答を引き起こすことができる。免疫応答の例は、限定されないが、抗体産生、または特異的免疫担当細胞（specific immunologically competent cell）の活性化、またはその両方を含み得る。当業者は、抗原が決して「遺伝子」によってコードされる必要はないことを理解するであろう。抗原が合成されて作製され得ること、または生物学的試料に由来し得ること、またはポリペプチド以外の高分子であり得ることは容易に明らかである。そのような生物学的試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞、あるいは他の生物学的成分、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、死んだもしくは不活性化された全細胞もしくは溶解物を含む流体が含まれ得るが、これらに限定されない。
「ベクター」、「発現ベクター」、および「発現構築物」という用語は、目的の核酸を細胞内部に送達し、細胞内でのその発現を媒介するために使用することができる物質の構成を指すために互換的に使用される。ベクターの最も一般的に使用される例は、自律複製プラスミドおよびウイルス（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスベクターなど）である。発現構築物は、生細胞中で複製され得るか、または合成的に作製され得る。一実施形態では、発現ベクターは、ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）に作動可能に連結されたプロモーターを含み、このプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御する。哺乳動物細胞での発現のための典型的なプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター（例えば、米国特許５，１６８，０６２号および同第５，３８５，８３９号を参照されたい；その両方が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、マウス乳がんウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（adenovirus major late promoter）（ＡｄＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルスプロモーター、マウスメタロチオネイン遺伝子プロモーター、およびＵ６またはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが挙げられる。本開示の方法において本明細書に記載のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドを発現させるのに有用なプロモーターの非限定的な例としては、例えば、シナプシンプロモーター（ニューロン特異的）、ＣａｍＫＩＩａプロモーター（興奮性ニューロンに特異的）、ユビキチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、およびβ－アクチンプロモーターが挙げられる。これらおよび他のプロモーターは、当該分野で周知の技術を用いて、市販のプラスミドから得ることができる。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと。エンハンサーエレメントは、ベクターの発現レベルを高めるためにプロモーターと関連して使用され得る。例としては、Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4:761に記載されるようなＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79:6777（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるようなラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター、および例えばＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメントなど、Boshart et al., Cell (1985) 41:521（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるようなヒトＣＭＶに由来するエレメントが挙げられる。
転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルも発現ベクター中に存在していてよい。このような配列の例には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（下記）に記載されるようなＳＶ４０に由来する配列、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，１２２，４５８号を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、５’－ＵＴＲ配列が、コード配列の発現を増強するためにコード配列に隣接して配置され得る。そのような配列には、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＵＴＲ（Jang et al. J. Virol. (1989) 63:1651-1660；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などのピコルナウイルスのリーダー配列に存在する内部リボソーム進入部位（Internal Ribosome Entry Site）（ＩＲＥＳ）を含むＵＴＲが含まれる。他の有用なピコルナウイルスのＵＴＲ配列には、例えば、ポリオリーダー配列、Ａ型肝炎ウイルスのリーダーおよびＣ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳが含まれる。
用語「宿主細胞」は、異種核酸を含む任意の細胞を意味する。異種核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター）であり得る。例えば、宿主細胞は、細胞による物質の生成のため、例えば、遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素の細胞による発現のために、任意の方法で選択、改変、形質転換、増殖、使用または操作される任意の生物由来の細胞であり得る。適切な宿主が決定され得る。例えば、宿主細胞は、ベクターバックボーンおよび所望の結果に基づいて選択され得る。例として、いくつかのタイプのベクターの複製のために、プラスミドまたはコスミドを原核生物宿主細胞に導入することができる。ＤＨ５α、ＪＭ１０９、およびＫＣＢ、ＳＵＲＥ（登録商標）コンピテント細胞、およびＳＯＬＯＰＡＣＫ Ｇｏｌｄ Ｃｅｌｌｓなどであるがこれらに限定されない細菌細胞を、ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使用することができる。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＥ３９２などの細菌細胞をファージウイルスの宿主細胞として使用することができる。宿主細胞として使用され得る真核細胞としては、酵母（例えば、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１）、昆虫および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの複製および／または発現のための哺乳動物真核生物宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｓａｏｓ、およびＰＣ１２が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の宿主細胞には、ＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含むおよび／または細胞表面上にＣＡＲを発現するＴ細胞およびナチュラルキラー細胞が含まれる。宿主細胞は、Ｔ細胞の活性、ナチュラルキラー細胞の活性、がんの処置、および自己免疫疾患の処置を増強するために使用され得る。
用語「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」は交換可能であり、本明細書において同義的に使用される。本明細書で使用される場合、Ｔ細胞は、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含む。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであってよい。特定の実施形態における使用に適したＴ細胞の他の例示的な集団には、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞が含まれる。「ＮＫＴ細胞」も含まれ、ＮＫＴ細胞は、セミインバリアントな（または半不変の）αβＴ細胞受容体を発現するが、ＮＫ１．１などのＮＫ細胞と典型的に関連している様々な分子マーカーも発現するＴ細胞の専門化集団を指す。ＮＫＴ細胞には、ＮＫ１．１＋およびＮＫ１．１－、ならびにＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋およびＣＤ８－細胞が含まれる。ＮＫＴ細胞上のＴＣＲは、ＭＨＣ Ｉ様分子ＣＤＩｄによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で独特である。ＮＫＴ細胞は、炎症または免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生するそれらの能力に起因して、防御効果または有害効果のいずれかを有することができる。「ガンマ－デルタＴ細胞（γδＴ細胞）」も含まれ、それは、その表面に別個のＴＣＲを有するＴ細胞の小さなサブセットである専門家集団を指し、ＴＣＲがα－およびβ－ＴＣＲ鎖と呼ばれる２つの糖タンパク質鎖から構成される大部分のＴ細胞とは異なり、γδＴ細胞におけるＴＣＲはγ鎖およびδ鎖から構成される。γδＴ細胞は、免疫監視および免疫調節において役割を果たすことができ、ＩＬ－１７の重要な供給源であり、堅牢なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することが見出された。また、「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」は、異常なまたは過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容において役割を果たすＴ細胞を指す。Ｔｒｅｇ細胞は、典型的には転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＩＬ－１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞である転写因子Ｆｏｘｐ３陰性制御性Ｔ細胞も含むことができる。
「ナチュラルキラー細胞」および「ＮＫ細胞」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、同義的に使用される。本明細書で使用される場合、ＮＫ細胞は、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋および／またはＣＤ５７＋ＴＣＲ－表現型を有する分化リンパ球を指す。ＮＫは、特異的細胞溶解酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合してそれを死滅させるその能力、ＮＫ活性化受容体に対するリガンドを発現する腫瘍細胞または他の罹患細胞を死滅させる能力、および免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。
本開示の特定の実施形態では、本開示の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクターにマーカーを含めることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで同定。このようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を与え、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする。通常、薬物選択マーカーを含めると、形質転換体のクローニングおよび選択を助け、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素を用いてもよい。蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＥＧＦＰ、またはＤｒｏｎｐａ）または免疫学的マーカーも用いることができる。選択マーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
本明細書で使用される場合、タンパク質またはポリペプチド（例えば、ａｒＣＡＲポリペプチドまたはそのドメイン）の文脈における「バリアント」という用語は、以下を指す：（ａ）そのポリペプチドと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；（ｃ）そのポリペプチドに対して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上のアミノ酸変異（すなわち、付加、欠失および／または置換）を含むポリペプチド；（ｄ）そのポリペプチドをコードする核酸に、高ストリンジェント、中ストリンジェント、または典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド；（ｅ）少なくとも２０個の連続アミノ酸、少なくとも３０個の連続アミノ酸、少なくとも４０個の連続アミノ酸、少なくとも５０個の連続アミノ酸、少なくとも７５個の連続アミノ酸、少なくとも１００個の連続アミノ酸、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸、または少なくとも１５０個の連続するアミノ酸のそのポリペプチドのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に、高ストリンジェント、中ストリンジェント、または典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または（ｆ）そのポリペプチドのフラグメント。
配列同一性パーセントは、当業者に公知の任意の方法を用いて決定することができる。特定の実施形態では、同一性パーセントは、配列解析ソフトウェアパッケージ（Ｖｅｒｓｉｏｎ １０；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」または「Ｇａｐ」プログラムを使用して決定される。ハイブリダイゼーション条件（例えば、高、中、および典型的なストリンジェント条件）に関する情報は記載されており、例えば、米国特許出願公開第２００５／００４８５４９号（例えば、段落７２～７３）を参照されたい。
本開示の文脈において、本明細書に列挙される疾患状態のいずれかに関する限り、「処置する（treat）」、「処置（treatment）」などの用語は、そのような状態に関連する少なくとも１つの症状を予防、緩和もしくは軽減すること、またはそのような状態の進行を遅らせるもしくは逆転させること、または発病（すなわち、疾患の臨床症状の前の期間）を停止、遅延させることおよび／または疾患の発症もしくは悪化のリスクを低減させることを意味する。
本明細書で使用される場合、用量または量に適用される「治療有効」という用語は、それを必要とする対象に投与すると所望の活性（例えば、がんまたは自己免疫疾患に関連する症状の緩和）をもたらすのに充分な化合物または医薬組成物の量を指す。活性成分（または有効成分）の組合せが投与される場合、組合せの有効量は、個々に投与された場合に有効であったであろう各成分の量を含んでいても含まなくてもよいことに留意されたい。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢および全身状態、処置される状態の重症度、使用される特定の薬物（単数または複数）、投与様式などに応じて、対象ごとに変化する。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、本明細書に提供される情報に基づいて、日常的な実験を使用して当業者によって決定され得る。
本開示の組成物に関連して使用される「薬学的に許容される」という語句は、生理学的に耐容性であり、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合に典型的には有害な反応を生じないような組成物の分子実体および他の成分を指す。好ましくは、本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、米国連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されているか、または哺乳動物、より具体的にはヒトにおける使用のために米国薬局方もしくは他の一般的に認められている薬局方に掲載されていることを意味する。
本明細書で使用する場合、本開示の組成物と少なくとも追加の治療剤との「組み合わせ」の用語は、少なくとも２つであるが任意の所望の薬剤の組み合わせが同時にまたは逐次的に送達され得ることを意味する。様々な疾患を処置するために使用される場合、本開示の組成物および方法は、同じまたは同様の疾患に好適な他の治療方法／薬剤とともに利用され得ることが企図される。このような他の治療方法／薬剤を（同時にまたは逐次的に）共投与して、相加効果または相乗効果を生じさせることができる。各薬剤の適切な治療有効投与量は、相加作用または相乗作用により低減され得る。
用語「担体」は、それと共に化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、水および油（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物または合成起源のものを含む）などの滅菌液体であり得る。水または水溶液（生理食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液など）は、特に注射用溶液のための担体として好ましく使用される。あるいは、担体は、（圧縮丸剤用の）結合剤、流動促進剤、カプセル化剤、風味剤、および着色剤のうちの１つまたは複数を含むがこれらに限定されない固体剤形担体であり得る。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
本明細書で使用される「個体」または「対象」または「動物」は、ヒト、獣医学的動物（例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど）、または疾患または障害（例えば、がんまたは自己免疫疾患）の実験動物モデルを指す。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
用語「関連する」は、任意の相関、同時発生および任意の因果関係を包含するために使用される。
「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の実践に従って、許容される標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値または範囲の一桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、さらにより好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内、最も好ましくは１％以内を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の一桁以内、好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は暗示的であり、この文脈では、特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
本開示に従って、当技術分野の技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は文献に完全に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９」); ＤＮＡクローニング: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)；オリゴヌクレオチド合成(M.J. Gait ed. 1984)；核酸ハイブリダイゼーション[B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]；転写および翻訳 [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]；動物細胞培養 [R.I. Freshney, ed. (1986)]；固定化細胞および酵素 [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Ausubel, F.M. et al. (eds.). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., 1994を参照されたい。これらの技術には、Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985)；米国特許第５，０７１，７４３号；Fukuoka et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 263: 357-360 (1999); Kim and Maas, BioTech. 28: 196-198 (2000); Parikh and Guengerich, BioTech. 24: 4 28-431 (1998); Ray and Nickoloff, BioTech. 13: 342-346 (1992); Wang et al., BioTech. 19: 556-559 (1995); Wang and Malcolm, BioTech. 26: 680-682 (1999); Xu and Gong, BioTech. 26: 639-641 (1999), 米国特許第５，７８９，１６６号および同第５，９３２，４１９号； Hogrefe, Strategies l4. 3: 74-75 (2001)；米国特許第５，７０２，９３１号、同第５，７８０，２７０号、および同第６，２４２，２２２号；Angag and Schutz, Biotech. 30: 486-488 (2001)； Wang and Wilkinson, Biotech. 29: 976-978 (2000); Kang et al., Biotech. 20: 44-46 (1996); Ogel and McPherson, Protein Engineer. 5: 467-468 (1992); Kirsch and Joly, Nucl. Acids. Res. 26: 1848-1850 (1998); Rhem and Hancock, J. Bacteriol. 178: 3346-3349 (1996); Boles and Miogsa, Curr. Genet. 28: 197-198 (1995); Barrenttino et al., Nuc. Acids. Res. 22: 541-542 (1993); Tessier and Thomas, Meths. Molec. Biol. 57: 229-237；およびPons et al., Meth. Molec. Biol. 67: 209-218に記載されている部位特異的突然変異誘発が含まれる
適合可能な受容体特異性成分を有するキメラ抗原受容体（ａｒＣＡＲ）
一態様では、本明細書で提供されるのは、適合可能な受容体特異性成分を有するユニバーサルキメラ抗原受容体（ａｒＣＡＲ）システムであり、ａｒＣＡＲシステムは、
（ｉ）（ａ）細胞外タグ結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインとを含む第１のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を有する免疫エフェクター細胞；および
（ｉｉ）（ｄ）標的細胞上の少なくとも１つの抗原に結合する抗原結合ドメインと、（ｂ）キメラ抗原受容体の第１のポリペプチドのタグ結合ドメインによって認識されるタグとを含む第２のポリペプチド；
を含み、
（ｉ）タグは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場を含み、タグ結合ドメインは、タグに結合する抗イディオタイプ分子を含む、あるいは
（ｉｉ）タグは、タグ結合ドメインに結合する抗イディオタイプ分子を含み、タグ結合ドメインは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場を含む。
いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ分子は、抗体もしくはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つの抗原結合領域または非フレームワーク領域に結合する。
いくつかの実施形態では、タグは、非ヒト供給源に由来するポリペプチドに結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは代替足場を含む。あるいは、タグ結合ドメインは、非ヒト供給源に由来するポリペプチドに結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは代替足場を含む。
いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ分子は、抗体もしくはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に結合する。
いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ分子は、抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場である。
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場を含む。
様々な実施形態において、本開示のａｒＣＡＲシステムにおける使用に適した抗体または抗体フラグメントには、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、ポリペプチド－Ｆｃ融合物、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、マスクされた抗体（masked antibody）（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、小モジュラー免疫薬（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（「ＳＭＩＰ（商標）」）、イントラボディ、ミニボディ、シングルドメイン抗体可変ドメイン、ナノボディ、ＶＨＨ、ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。抗体および／または抗体フラグメントは、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、ラクダ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、サメ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、ならびにラクダ化抗体可変ドメインに由来し得る。
いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖダイアボディ、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはナノボディ、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、重鎖可変領域、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ダイアボディ、トリアボディ、またはデカボディである。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖフラグメントである。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントはＶＨＨである。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、またはタグのうちの少なくとも１つは、シングルドメイン抗体またはナノボディを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、またはタグのうちの少なくとも１つは、ＶＨＨを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメインおよびタグはそれぞれＶＨＨを含む。
いくつかの態様において、細胞外タグ結合ドメイン、タグ、および抗原結合ドメインはそれぞれＶＨＨを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、またはタグのうちの少なくとも１つは、ｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメインおよびタグはそれぞれｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外タグ結合ドメイン、タグ、および抗原結合ドメインはそれぞれｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される抗体または抗原結合フラグメント（例えば、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ）は、ヒト化されている。ヒト化タンパク質は、免疫原性のリスクを低減する可能性を有する。
標的生体物質の高親和性および特異的結合などの類似の機能的特徴を示す、免疫グロブリンドメインの代替足場もまた、本開示のａｒＣＡＲにおいて使用され得る。このような足場は、改善された特徴（例えば、より高い安定性または低減された免疫原性など）を有する分子を生じることが示されている。本開示のａｒＣＡＲシステムにおいて使用され得る代替足場の非限定的な例としては、操作された、テネイシン由来のテネイシンＩＩＩ型ドメイン（例えば、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（商標））；操作されたγＢ－クリスタリン由来足場または操作されたユビキチン由来足場（例えば、Ａｆｆｉｌｉｎｓ）；操作された、フィブロネクチン由来の第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメイン（例えば、モノボディ、ＡｄＮｅｃｔｉｎｓ（商標）、またはＡｄＮｅｘｉｎｓ（商標））；操作された、アンキリン反復モチーフ含有ポリペプチド（例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ（商標））；操作された、低密度リポタンパク質受容体由来のＡドメイン（ＬＤＬＲ－Ａ）（例えば、Ａｖｉｍｅｒｓ（商標））；リポカリン（例えば、アンチカリン）；操作された、プロテアーゼ阻害剤由来のＫｕｎｉｔｚドメイン（例えば、ＥＥＴＩ－ＩＩ／ＡＧＲＰ、ＢＰＴＩ／ＬＡＣＩ－Ｄ１／ＩＴＩ－Ｄ２）；操作された、プロテインＡ由来のＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（商標））；Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド（例えば、Ｎａｎｏｆｆｉｔｉｎｓ（登録商標）またはａｆｆｉｔｉｎｓ）；操作された、Ｆｙｎ由来のＳＨ２ドメイン（例えば、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標））；ＣＴＬＤ３（例えば、テトラネクチン）；チオレドキシン（例えば、ペプチドアプタマー）；ＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）；βサンドイッチ（例えば、ｉＭａｂ）；小タンパク質（miniprotein）；Ｃ型レクチン様ドメイン足場；操作された抗体模倣物；ならびにその結合機能性を保持する上述したものの任意の遺伝子操作対応物が挙げられる（Woern A, Pluckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001); Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002); Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004); Binz H et al., Nat Biolechnol 23: 1257-68 (2005); Hey T et al., Trends Biotechnol 23:514-522 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36 (2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007); Skerra, Current Opin. in Biotech., 2007 18: 295-304; Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010); Zoller F et al., Molecules 16: 2467-85 (2011)；それぞれが参照によりその全体が組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、代替足場は、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）またはセンチリン（Ｃｅｎｔｙｒｉｎ）である。
非ヒト供給源に由来する分子は、任意の非ヒト生物（ウイルス、細菌、酵母、真菌、植物、および非ヒト動物が含まれるが、これらに限定されない）に由来し得る。
いくつかの実施形態では、非ヒト供給源に由来する分子は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、タンパク質の供給源は、ヒトホモログ（相同体）を有さない非ヒトポリペプチドに由来する。
いくつかの実施形態では、非ヒト供給源に由来するポリペプチドは、呼吸器多核体ウイルス（respiratory syncytial virus）（ＲＳＶ）Ｆタンパク質、リステリア菌のインターナリン（Listeria internalin）、コブラ毒ホスホリパーゼＡ２（Cobra phospholipase A2）、エボラウイルス核タンパク質（Ebola nucleoprotein）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄ、ラクトコッカスファージ（lactococcal phage）の受容体結合タンパク質（ＲＢＰ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、リシン、またはニワトリ卵白リゾチームである。
いくつかの実施形態では、本開示のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドは、リーダー配列を含む。リーダー配列は、細胞外タグ結合ドメインのＮ末端に位置し得る。リーダー配列は、任意選択で、細胞プロセシング（細胞処理）および細胞膜へのＣＡＲの局在化の間に細胞外タグ結合ドメインから切断され得る。当業者に公知の様々なリーダー配列をリーダー配列として用いることができる。リーダー配列が由来し得るペプチドの非限定的な例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＦｃεＲ、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）重鎖（ＨＣ）可変領域、ＣＤ８α、マウスＩｇ－κシグナルペプチド、またはＴ細胞によって分泌される様々な他のタンパク質のいずれかが挙げられる。様々な実施形態において、リーダー配列は、Ｔ細胞の分泌経路と適合性を有する。特定の実施形態において、リーダー配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）に由来する。
いくつかの実施形態において、リーダー配列は、ＧＭＣＳＦに由来する。一実施形態では、ＧＭＣＳＦリーダー配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、リーダー配列は、マウスＩｇ－κシグナルペプチドに由来する。一実施形態では、マウスＩｇ－κシグナルペプチドは、配列番号６１に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号６１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドは、細胞外タグ結合ドメインと細胞質ドメインとの間にインフレーム（in frame）で融合された膜貫通ドメインを含む。
膜貫通ドメインは、細胞外タグ結合ドメインに寄与するタンパク質、シグナル伝達ドメインもしくは共シグナル伝達（co-signaling）ドメインに寄与するタンパク質、または全く異なるタンパク質に由来してもよい。場合によっては、膜貫通ドメインは、ａｒＣＡＲ複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるように、選択され、あるいはアミノ酸の置換、欠失、または挿入によって改変され得る。場合によっては、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインと天然に会合するタンパク質の結合を回避するように、選択され、あるいはアミノ酸の置換、欠失、または挿入によって改変され得る。ある実施形態では、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインに接続されたドメイン間の柔軟性および／または最適な距離を可能にする追加のアミノ酸を含む。
膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれに由来してもよい。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示において特に有用な膜貫通ドメインの非限定的な例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖、β鎖またはζ鎖、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２８、ＣＤ３ ｅｐｓｉｌｏｎ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含み得る）。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。例えば、フェニルアラニン、トリプトファンおよび／またはバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見られ得る。
いくつかの態様において、ジスルフィド結合することができるシステイン残基を含むζ、ηまたはＦｃεＲ１γ鎖の膜貫通ドメインを利用することが望ましく、その結果、得られるキメラタンパク質は、それ自体と、またはζ、ηまたはＦｃεＲ１γ鎖の未修飾バージョンもしくは関連タンパク質とジスルフィド結合ダイマーを形成することができる。場合によっては、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避して受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、選択されまたはアミノ酸置換によって改変される。他の場合には、受容体複合体の他のメンバーとの物理的会合を保持するために、ζ、ηまたはＦｃεＲ１γおよび－β、ＭＢ１（Ｉｇα）、Ｂ２９またはＣＤ３－γ、ζまたはηの膜貫通ドメインを使用することが望ましい。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。ある態様において、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。ある態様において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のａｒＣＡＲシステムの第１のポリペプチドは、細胞外タグ結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域を含み、タグ結合ドメイン、リンカー、および膜貫通ドメインは、互いにインフレームである。
本明細書で使用される「スペーサー領域」という用語は、概して、タグ結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサー領域は、タグ結合ドメインに対してより柔軟性およびアクセス可能性を提供するために使用することができる。スペーサー領域は、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含み得る。スペーサー領域は、天然に存在する分子の全部もしくは一部に由来していてよく、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４またはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部に由来し、または抗体定常領域の全部もしくは一部に由来していてもよい。あるいは、スペーサー領域は、天然に存在するスペーサー領域配列に対応する合成配列であってもよく、または完全に合成のスペーサー領域配列であってもよい。本開示に従って使用され得るスペーサー領域の非限定的な例としては、ヒトＣＤ８α鎖の一部、ＣＤ２８の部分的細胞外ドメイン、ＦｃｙＲｌｌｌａ受容体、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｉｇヒンジ、またはそれらの機能的フラグメントが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインが膜貫通ドメインから最適な距離であることを確実にするために、追加の連結アミノ酸がスペーサー領域に付加される。いくつかの実施形態において、スペーサーがＩｇに由来する場合、スペーサーは、Ｆｃ受容体結合を防ぐために変異され得る。
いくつかの実施形態では、スペーサー領域はヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ２８または免疫グロブリン（ＩｇＧ）に由来し得る。例えば、ＩｇＧヒンジは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはそれらのキメラに由来し得る。
ある実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンＩｇＧのヒンジまたはその機能的フラグメントを含む。ある実施形態では、ＩｇＧのヒンジは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはそれらのキメラに由来する。ある実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはヒンジ領域を含む。ある実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンのコアヒンジ領域を含む。用語「コアヒンジ」は、用語「短いヒンジ（short hinge）」（「ＳＨ」としても知られる）と互換的に使用することができる。適切なヒンジドメインの非限定的な例は、コアイムノグロブリンヒンジ領域であり、ＩｇＧ１からのＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５７）、ＩｇＧ２からのＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号５８）、ＩｇＧ３からのＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）３（配列番号５９）、およびＩｇＧ４からのＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号６０）（Wypych et al., JBC 2008 283(23): 16194-16205を参照されたい；あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。ある実施形態では、ヒンジドメインは、免疫グロブリンヒンジのフラグメントである。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインはＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。ある態様において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。ある態様において、ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの態様において、膜貫通ドメインおよび／またはヒンジドメインはＣＤ８またはＣＤ２８に由来する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインおよびヒンジドメインの両方がＣＤ８に由来する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインおよびヒンジドメインの両方がＣＤ２８に由来する。
ある態様では、本開示のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞質ドメインはまた、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
細胞質ドメインは、ａｒＣＡＲが配置されている宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の専門化された機能（specialized function）を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に専門化された機能を行うように指示するタンパク質の部分を指す。通常、シグナル伝達ドメイン全体が存在するが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分（truncated portion）が使用される場合、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、そのような短縮部分をインタクトな鎖に代えて使用することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに充分なシグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。
本開示のａｒＣＡＲにおいて使用することができるシグナル伝達ドメインの非限定的な例としては、例えば、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｆｃε受容体Ｉγ鎖（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲ β、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ２２６、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９Ａ、またはＣＤ７９Ｂに由来するシグナル伝達ドメインが挙げられる。
いくつかの実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一実施態様では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号６に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号６と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、細胞質ドメインは、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＬ２Ｒｂ、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４ （ＣＤ２４４）、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２２６、ＣＤ７９Ａ、またはＨＶＥＭに由来する。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは４１ＢＢに由来する。一実施形態では、４１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号８に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号８と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインはＩＬ２Ｒｂに由来する。一実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号９に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号９と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ４０に由来する。ある態様において、ＣＤ４０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、または配列番号１０と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインはＯＸ４０に由来する。一実施形態では、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、または配列番号１１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ８０に由来する。ある態様において、ＣＤ８０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列、または配列番号１２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ８６に由来する。ある態様において、ＣＤ８６共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、または配列番号１３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２７に由来する。ある態様において、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、または配列番号１４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインはＩＣＯＳに由来する。一実施形態では、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、または配列番号１５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインはＮＫＧ２Ｄに由来する。一実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、または配列番号１６と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインはＤＡＰ１０に由来する。一実施形態では、ＤＡＰ１０共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、または配列番号１７と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインはＤＡＰ１２に由来する。一実施形態では、ＤＡＰ１２共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは２Ｂ４（ＣＤ２４４）に由来する。ある態様において、２Ｂ４（ＣＤ２４４）共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、または配列番号１９と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
ある態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８に由来する。ある態様において、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、または配列番号２０と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のａｒＣＡＲは、１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のａｒＣＡＲは、２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、本開示のａｒＣＡＲは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序で配置することができる。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインの上流にある。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインの下流にある。２つ以上の共刺激ドメインが含まれる場合、共刺激シグナル伝達ドメインの順序を入れ替えることができる。
非限定的な例示的ＣＡＲ領域および配列を表１に提供する。
Figure 2024500847000002
Figure 2024500847000003
Figure 2024500847000004
Figure 2024500847000005
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは抗原に結合する。第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、抗原中の複数の抗原または複数のエピトープに結合してもよい。例えば、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれ以上の抗原に結合し得る。別の例として、第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、同じ抗原中の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれ以上のエピトープに結合し得る。
抗原結合ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定する抗原の種類および数に依存し得る。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして機能する抗原を認識するように選択され得る。ある実施形態では、本開示のａｒＣＡＲは、（例えば、腫瘍細胞上の）抗原に特異的に結合する所望の抗原結合ドメインを操作することによって、目的の腫瘍抗原を標的とするように遺伝子改変することができる。本開示のａｒＣＡＲにおける抗原結合ドメインの標的として機能し得る細胞表面マーカーの非限定的な例には、腫瘍細胞または自己免疫疾患に関連するものが含まれる。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの腫瘍抗原または自己免疫抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの腫瘍抗原に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、２つ以上の腫瘍抗原に結合する。いくつかの実施形態において、２つ以上の腫瘍抗原は、同じ腫瘍に関連する。いくつかの実施形態では、２つ以上の腫瘍抗原は、異なる腫瘍に関連する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの自己免疫抗原に結合する。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、２つ以上の自己免疫抗原に結合する。いくつかの実施形態において、２つ以上の自己免疫抗原は、同じ自己免疫疾患に関連する。いくつかの実施形態において、２つ以上の自己免疫抗原は、異なる自己免疫疾患に関連する。
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍に関連する。膠芽腫に関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＰＤＧＦＲＡ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、ＣＤ７０、ＲＯＢＯ１およびＩＬ１３Ｒα２が挙げられる。卵巣がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＦＯＬＲ１、ＦＳＨＲ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、メソテリン（Mesothelin）、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、Ｎｅｃｔｉｎ－４およびＢ７Ｈ４が挙げられる。子宮頸がんまたは頭頸部がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＧＤ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ２、およびＥＧＦＲが挙げられる。肝臓がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、クローディン１８．２、ＧＰＣ－３、ＥｐＣＡＭ、ｃＭＥＴ、およびＡＦＰが挙げられる。血液悪性腫瘍に関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ７９、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＳＬＡＭ Ｆ７、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ１２３、およびＣＤ７０が挙げられる。膀胱がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、ネクチン－４およびＳＬＩＴＲＫ６が挙げられる。腎臓がんに関連する腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＣＤ７０およびＦＯＬＲ１が挙げられる。
抗原結合ドメインが標的とし得る抗原のさらなる例としては、α－フェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、Ｂａ７３３、ＢｒＥ３抗原、炭酸脱水酵素ＥＸ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、結腸特異的抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ－Ｉ、ＥＧＰ－２、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６、ＦＩｔ－Ｉ、Ｆｌｔ－３、葉酸受容体、ＨＬＡ－ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、低酸素誘導因子（ＨＩＦ－１）、Ｉａ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、インスリン成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ＫＣ４抗原、ＫＳ－１抗原、ＫＳ１－４、Ｌｅ－Ｙ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ－４抗体に特異的な抗原、胎盤成長因子、ｐ５３、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＣ、ＴＡＧ－７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、Ｔｎ抗原、トムゼン－フリーデンライヒ（Ｔｈｏｍｓｏｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ）抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、１７－１Ａ抗原、血管新生マーカー、がん遺伝子マーカー、またはがん遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。
ある態様において、抗原結合ドメインが標的とする抗原はＣＤ１９である。ある態様において、抗原結合ドメインは抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ある態様において、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号４に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ある態様において、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号７に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号７と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、抗原は、自己免疫疾患または障害に関連する。そのような抗原は、細胞受容体、および「自己」抗体（”self”-directed antibodies）を産生する細胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、抗原は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、１型糖尿病、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症（多発血管炎性肉芽腫症）、重症筋無力症、橋本病（Hashimoto's thyroiditis）、甲状腺機能亢進症（バセドウ病またはグレーブス病）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ギラン・バレー症候群、クローン病または潰瘍性大腸炎などの自己免疫疾患または障害に関連する。
いくつかの態様において、本明細書に開示されるａｒＣＡＲが標的とし得る自己免疫抗原には、血小板抗原、ミエリンタンパク質抗原、ｓｎＲＮＰ中のＳｍ抗原、膵島細胞抗原、リウマチ因子、および抗シトルリン化タンパク質、シトルリン化タンパク質およびペプチド（例えば、ＣＣＰ－１、ＣＣＰ－２（環状シトルリン化ペプチド））、フィブリノーゲン、フィブリン、ビメンチン、フィラグリン、コラーゲンＩおよびＩＩペプチド、α－エノラーゼ、翻訳開始因子４Ｇ１、核周囲因子、ケラチン、Ｓａ（細胞骨格タンパク質ビメンチン）、関節軟骨の成分（例えば、コラーゲンＩＩ、ＩＸおよびＸＩ）、循環血清タンパク質（例えば、ＲＦ（ＩｇＧ、ＩｇＭ）、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、フェリチン）、核成分（例えば、ＲＡ３３／ｈｎＲＮＰ Ａ２、Ｓｍ、真核生物翻訳伸長因子１α１）、ストレスタンパク質（例えば、ＨＳＰ－６５、－７０、－９０、ＢｉＰ）、炎症／免疫因子（例えば、Ｂ７－Ｈ１、ＩＬ－１α、およびＩＬ－８）、酵素（例えば、カルパスタチン、α－エノラーゼ、アルドラーゼ－Ａ、ジペプチジルペプチダーゼ、オステオポンチン、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ）、受容体（例えば、リポコルチン１）、好中球核タンパク質（例えば、ラクトフェリンおよび２５～３５ｋＤ核タンパク質）、顆粒タンパク質（例えば、殺菌性浸透性増大タンパク質（bactericidal permeability increasing protein）（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、ミエロペルオキシダーゼ、プロテイナーゼ３、血小板抗原、ミエリンタンパク質抗原、膵島細胞抗原、リウマチ因子、ヒストン、リボソームＰタンパク質、カルジオリピン、ビメンチン）、核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、およびＲＮＡ）、リボ核粒子およびタンパク質（例えば、Ｓｍ抗原（ＳｍＤおよびＳｍＢ’／Ｂを含むが、これらに限定されない）、Ｕ１ＲＮＰ、Ａ２／Ｂ１ ｈｎＲＮＰ、Ｒｏ（ＳＳＡ）、およびＬａ（ＳＳＢ）抗原）などが含まれるが、これらに限定されない。
非限定的な例示的抗原標的を表２～４に提供する。
Figure 2024500847000006
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様々な実施形態において、本開示のａｒＣＡＲシステムにおいて使用されるｓｃＦｖフラグメントは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にリンカーを含んでいてよい。リンカーは、ペプチドリンカーであってよく、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。リンカーに含まれ得る例示的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、およびＴｈｅである。リンカーは、ＶＨおよびＶＬが互いに対して正しい立体構造を形成して抗原への結合などの所望の活性を保持するように、ＶＨおよびＶＬを連結するのに適切な長さを有するべきである。リンカーは、約５～５０アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは約１０～４０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは約１０～３５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは約１０～３０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは約１０～２５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは約１０～２０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは約１５～２０アミノ酸長である。使用され得る例示的なリンカーは、Ｇｌｙリッチリンカー、ＧｌｙおよびＳｅｒ含有リンカー、ＧｌｙおよびＡｌａ含有リンカー、ＡｌａおよびＳｅｒ含有リンカー、ならびに他のフレキシブルリンカーである。
一実施形態では、リンカーはＷｈｉｔｌｏｗリンカーである。一実施形態では、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーは、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または配列番号３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。別の実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）３リンカーである。一実施形態では、（Ｇ４Ｓ）３リンカーは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列、または配列番号２５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
他のリンカー配列は、任意の免疫グロブリン重鎖または軽鎖アイソタイプに由来する免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＬまたはＣＨ１の部分を含み得る。使用され得る例示的なリンカーとしては、表１の配列番号２６～５６のいずれかが挙げられる。さらなるリンカーは、例えば、国際公開第ＷＯ２０１９／０６０６９５号に記載されており、それは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、。
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｎ末端に抗原結合ドメインを含み、Ｃ末端にタグを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｃ末端に抗原結合ドメインを含み、Ｎ末端にタグを含む。
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは可溶性ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ａｒＣＡＲシステムは、それぞれが（ａ）ユニークな抗原に結合する抗原結合ドメインと、（ｂ）第１のポリペプチドのタグ結合ドメインによって認識されるタグとを含む、１つまたは複数の追加のポリペプチドをさらに含む。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、２つ以上の本明細書に記載のａｒＣＡＲを含むａｒＣＡＲシステムであり、各ａｒＣＡＲは、タグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む。
さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のａｒＣＡＲのポリペプチドである。一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドである。一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドである。
理論に拘束されることを望むものではないが、本開示のａｒＣＡＲシステムは、以下を含む様々な利点を有することができる：
・特に抗体特異性のために非ヒトタンパク質標的と組み合わせて、抗ＩＤ分子／抗体フラグメントがオフターゲット相互作用を最小限に抑える高度の特異性。
・タグ上の結合ループに対する特異性は、類似のフレームワーク／足場タンパク質との望ましくない相互作用を回避する。標的への結合を中和するＴｒｕｅ－ＩＤも使用することができる。
・「タグ」ポリペプチドとＣＡＲとの相互作用を最適化および調節するためにある範囲の親和性を開発する固有の能力。
・システムは、各々が、結合親和性の調節、論理ゲート、細胞あたり複数の特異性および処置あたり複数の可溶性薬物を含む目的に適合する治療を可能にするユニークな特異性を有する、多数の最適化されたＣＡＲ／「タグ」ポリペプチド対を開発できるように、可能な対において無制限である。
・このアプローチは、「プラットフォーム非依存性（platform agnostic）」であり、１つの足場に対する免疫原性または他の制限が生じる場合、異なる足場を組み込む（例えば、ｓｃＦｖをＶＨＨで置き換える）ことを可能にする。
ポリヌクレオチドおよびベクター
別の態様では、本開示のａｒＣＡＲシステムにおける１つまたは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本開示のａｒＣＡＲシステムの第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、２つ以上の本開示のａｒＣＡＲシステムの第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、２つ以上のａｒＣＡＲシステムはそれぞれ、タグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のａｒＣＡＲシステムの第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、２つ以上の本開示のａｒＣＡＲシステムの第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、２つ以上のａｒＣＡＲシステムはそれぞれ、タグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のａｒＣＡＲシステムの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の本開示のａｒＣＡＲシステムの両方のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、２つ以上のａｒＣＡＲシステムはそれぞれ、タグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む。
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意のタイプのヌクレオチドを含むことができ、これらは、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、合成されたものまたは部分的に天然源から得られたものでよく、天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含んでいてよい。ポリヌクレオチドは、天然に存在するもしくは天然に存在しないヌクレオチド間結合、または両方のタイプの結合を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドはＤＮＡ分子である。様々な実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。
ある態様では、本開示は本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。
いくつかの実施形態では、組換えベクターは、本開示のａｒＣＡＲシステムの第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、２つ以上の本開示のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、２つ以上のａｒＣＡＲはそれぞれ、タグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む。
いくつかの実施形態では、組換えベクターは、本開示のａｒＣＡＲシステムの第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、２つ以上の本開示のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、２つ以上のａｒＣＡＲはそれぞれ、タグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む。
いくつかの実施形態では、組換えベクターは、本開示のａｒＣＡＲシステムの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、２つ以上の本開示のａｒＣＡＲの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、２つ以上のａｒＣＡＲはそれぞれ、タグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む。
組換えベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであってよい。適切なベクターとしては、増殖および拡大のために、または発現のために、またはその両方のために設計されたもの、例えば、プラスミドおよびウイルスが挙げられる。例えば、ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, Md.）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Stratagene, LaJolla, Calif.）、ｐＥＴシリーズ（Novagen, Madison, Wis.）、ｐＧＥＸシリーズ（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）、およびｐＥＸシリーズ（Clontech, Palo Alto, Calif.）から選択することができる。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、およびλＮＭ１１４９などのバクテリオファージベクターも使用することができる。本開示の文脈において有用な植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。本開示の文脈において有用な動物発現ベクターの例としては、ｐｃＤＮＡ、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、およびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、バイシストロニックＩＲＥＳベクター（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用して、本明細書に記載のａｒＣＡＲシステムの第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方を含めることができる。
いくつかの実施形態では、組換えベクターは非ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、プラスミドまたはトランスポゾン（ＰｉｇｇｙＢａｃ－またはＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙトランスポゾンなど）であり得る。一実施形態では、ベクターはプラスミドである。
いくつかの実施形態では、組換えベクターはウイルスベクターである。適切なウイルスベクターには、限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアベクター、および鶏痘ウイルスベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）を形質転換する天然のまたは操作された能力を有する。
組換えベクターは、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.2001；およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994に記載される標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製することができる。環状または直鎖状である発現ベクター構築物は、原核宿主細胞または真核宿主細胞において機能的である複製系を含むように調製することができる。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。
組換えベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする１つまたは複数のマーカー遺伝子を含んでいてよい。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における相補性などを含む。組換え発現ベクターに適したマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
本開示の文脈において有用なベクターは、「裸の」核酸ベクター（すなわち、それらを封入するタンパク質、糖および／または脂質をほとんどまたは全く有さないベクター）、または他の分子と複合体形成したベクターであり得る。ベクターと適切に組み合わせることができる他の分子には、ウイルスコート、カチオン性脂質、リポソーム、ポリアミン、金粒子、ならびに細胞分子を標的とするリガンド、受容体、または抗体などの標的化部分が含まれるが、これらに限定されない。
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して、宿主細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）に導入することができる。本明細書で使用する場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、遺伝子銃、またはエレクトロポレーションなどの、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を細胞に導入するための当技術分野で認識されている様々な技術を指すことが意図される。
様々な実施形態において、ａｒＣＡＲポリペプチド（例えば、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも調節エレメントに作動可能に連結される。調節エレメントは、宿主細胞におけるａｒＣＡＲポリペプチド（例えば、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチド）の発現を媒介することができる。調節エレメントには、プロモーター、エンハンサー、開始部位、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）テール、ＩＲＥＳエレメント、応答エレメント、および終結シグナルが含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、調節エレメントは、ａｒＣＡＲポリペプチドの発現を調節する。ある実施形態では、調節エレメントは、ａｒＣＡＲポリペプチド（例えば、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチド）の発現を増加させる。ある実施形態では、調節エレメントは、宿主細胞が活性化されると、ａｒＣＡＲポリペプチド（例えば、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチド）の発現を増加させる。ある実施形態では、調節エレメントは、ａｒＣＡＲポリペプチド（例えば、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチド）の発現を減少させる。ある実施形態では、調節エレメントは、宿主細胞が活性化されると、ａｒＣＡＲポリペプチド（例えば、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチド）の発現を減少させる。
改変宿主細胞
一態様では、本開示のａｒＣＡＲのポリペプチドの１つまたは複数を発現するように改変された宿主細胞が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本開示のａｒＣＡＲシステムの第１のポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞である宿主細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、２つ以上の本開示のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。いくつかの態様において、２つ以上のａｒＣＡＲはそれぞれ、タグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、２つ以上の本開示のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。いくつかの態様において、２つ以上のａｒＣＡＲはそれぞれ、タグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む。
いくつかの実施態様では、本開示のａｒＣＡＲの第１および第２のポリペプチドの両方を含む宿主細胞が本明細書で提供される。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む宿主細胞が本明細書で提供される。
様々な実施形態において、第１のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を有する細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、樹状細胞またはマクロファージである。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は幹細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞はｉＰＳＣである。ある態様において、細胞はｉＰＳＣに由来するＴ細胞である。一実施形態では、細胞は、ｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞である。
一態様では、本明細書に記載の改変宿主細胞を調製する方法が本明細書で提供される。
一実施形態では、改変宿主細胞を調製する方法は、本開示のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む組換えベクターを細胞に導入することを含む。
一実施形態では、改変宿主細胞を調製する方法は、本開示のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む組換えベクターを細胞に導入することを含む。
一実施形態では、改変宿主細胞を調製する方法は、本開示のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの両方をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む組換えベクターを細胞に導入することを含む。
様々な実施形態では、改変細胞は、本明細書に記載のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドを構成的に発現する。様々な実施形態では、改変細胞は、本明細書に記載のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドを誘導的に発現する。
様々な実施形態では、改変細胞は、本明細書に記載のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドを構成的に発現する。様々な実施形態では、改変細胞は、本明細書に記載のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドを誘導的に発現する。
様々な実施形態において、宿主細胞は、自己由来（autologous）／自家（autogenic）（「自己（self）」）または非自己由来（「非自己」、例えば、同種異系（allogeneic）、同系（syngeneic）または異種（xenogeneic））のものであってよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物対象から得られる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は霊長類対象から得られる。いくつかの実施形態では、宿主細胞はヒト対象から得られる。
特定の実施形態において、リンパ球などの免疫細胞が使用される。リンパ球は、限定されないが、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍などの供給源から得ることができる。リンパ球は、幹細胞の分化によっても生成され得る。特定の実施形態では、リンパ球は、沈降、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に一般に知られている技法を使用して、対象から収集された血液から得ることができる。
特定の実施形態では、対象の循環血液由来の免疫細胞がアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス装置は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含む。ある実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理のために細胞を適切な緩衝液または培地中に入れる。細胞は、ＰＢＳで、あるいはカルシウム、マグネシウム、および全てではないにしてもほとんどの他の二価カチオンを欠く別の適切な溶液で洗浄することができる。洗浄工程は、限定されないが、半自動フロースルー遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサー、またはＢａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ）を使用するなど、当業者に公知の方法によって行うことができる。洗浄後、細胞は、種々の生体適合性緩衝液、細胞培養培地、または緩衝液を含むもしくは含まない他の生理食塩水に再懸濁され得る。
ある実施形態では、Ｔリンパ球は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、赤血球を溶解させ、さらに単球を枯渇させることによって、単離することができる。例として、細胞は、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって選別することができる。ある実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方を、活性化、拡大、および／または遺伝子改変の前または後のいずれかに、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、およびエフェクターＴ細胞の亜集団に選別することができる。
特定の実施形態では、Ｔリンパ球を濃縮することができる。例えば、限定はされないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ２３５ａ、ＣＣＲ７、ＨＬＡ－ＤＲまたはそれらの組み合わせなどの１つまたは複数のマーカーを発現するＴリンパ球の特定の亜集団を、ポジティブまたはネガティブ選択技術のいずれかを用いて濃縮することができる。特定の実施形態では、本開示の組成物において使用するためのＴリンパ球は、以下のマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、およびＬＡＧ３の１つまたは複数を発現しないか、または実質的に発現しない。
特定の実施形態では、ＮＫ細胞を濃縮することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ９４、ＣＤ１２２またはその組み合わせなどの１つまたは複数のマーカーを発現するＴリンパ球の特定の亜集団を、ポジティブまたはネガティブ選択技術のいずれかを用いて濃縮することができる。
ある実施形態では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）を使用して、ＮＫ細胞またはＴリンパ球などの宿主細胞を作製する。ヒトｉＰＳＣおよびヒトＥＳＣは、当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。例えば、ａｒＣＡＲのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは組換えベクターと細胞を接触させることにより、本開示のａｒＣＡＲによってＰＳＣ（例えば、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）を改変することができ、操作されたＰＳＣを使用して、本開示のａｒＣＡＲを含む免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を作製または生成することができる。
成体細胞（体細胞）から直接ｉＰＳＣを作製することができる。ｉＰＳＣは、多能性関連遺伝子（pluripotency-associated gene）または「リプログラミング因子」の特定のセットを所与の細胞タイプに導入することによって生成または作製することができる。リプログラミング因子として、限定はされないが、ＯＣＴ４（「ＰＯＵ５ＦＬ」としても知られる）、ＳＯＸ２、ｃＭＹＣ、およびＫＬＦ４が挙げられ、それらは山中因子としても知られている；Takahashi, K; Yamanaka, S (2006). Cell 126 (4): 663-76を参照されたい。リプログラミング因子の各々は、関連する転写因子、ｍｉＲＮＡ、小分子によって、または分化系列指定子（lineage specifier）などの非関連遺伝子によってさえも、機能的に置換することができる。リプログラミング因子の導入時に、細胞はＰＳＣに似たコロニーを形成し始め、これは、その形態や、その増殖を選択する条件に基づいて、または表面マーカーもしくはレポーター遺伝子の発現を介して、単離することができる。特定の実施形態では、本発明の方法で使用されるＰＳＣは対象特異的である。
山中因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ）を用いたリプログラミングにより、各種体細胞からＰＳＣを作製する技術が知られている。例えば、成熟リンパ球のｉＰＳＣへのリプログラミングが、マウスＢ細胞に関して (Hanna et al., (2008) Cell, 133, pp. 250-264; Wada et al., (2011) Int. Immunol., 23, pp. 65-74)、マウスＴ細胞および成熟ＮＫ Ｔ細胞に関して(Watarai et al., (2010) J. Clin. Invest., 120, pp. 2610-2618)、およびヒトＴ細胞に関して (Loh et al., (2010) Cell Stem Cell, 7, pp. 15-19; Seki et al., (2010) Cell Stem Cell, 7, pp. 11-14) 達成された。全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＣＤ３＋細胞を細胞源集団として用いることにより、ヒトＴ細胞からｉＰＳＣを作製することができる (Loh et al., (2010) Cell Stem Cell, 7, pp. 15-19; Seki et al., (2010) Cell Stem Cell, 7, pp. 11-14; Staerk et al. (2010) Cell Stem Cell, 7, pp. 20-24; Brown et al, (2010) PloS One 5, e11373)。
宿主細胞組成物の充分な治療用量に到達するために、宿主細胞はしばしば１または複数ラウンドの刺激／活性化に供される。特定の実施形態において、対象に投与するための宿主細胞を作製する方法は、１つまたは複数の刺激シグナルまたは薬剤（例えば、化合物、小分子、例えば、有機小分子、核酸、ポリペプチド、またはそれらのフラグメント、アイソフォーム、バリアント、類似体、もしくは誘導体）の存在下で宿主細胞を刺激して、活性化させることを含む。特定の実施形態において、対象に投与するための宿主細胞を作製する方法は、１つまたは複数の刺激シグナルまたは薬剤の存在下で宿主細胞を刺激して、活性化させ、さらに増殖させることを含む。
免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球およびＮＫ細胞）は、細胞が活性化マーカーを発現し、サイトカインを産生し、増殖し、および／または標的細胞に対して細胞傷害性になる、それらの生物学的状態の変化を誘導することによって、活性化され得る。これらの変化はすべて、主刺激シグナルによって生じ得る。共刺激シグナルは、主シグナルの大きさを増幅し、初期刺激後の細胞死を抑制し、より持続性のある活性化状態、したがってより高い細胞傷害能力をもたらす。
Ｔ細胞は、概して、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；および同第６，８６７，０４１号に記載されるような方法を使用して活性化することができ、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３ζを活性化する薬剤に結合することによって活性化される。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２結合剤は、Ｔ細胞に主刺激シグナルを提供するために使用され得る。例えば、限定するものではないが、ＣＤ２薬剤には、限定するものではないが、ＣＤ２リガンドおよび抗ＣＤ２抗体、例えば、Ｔ１ １．３抗体をＴ１ １．１またはＴ１ １．２抗体と組み合わせたもの（Meuer, S. C. et al. (1984) Cell 36:897-906）、および９．６抗体（Ｔ１１．１と同じエピトープを認識する）を９－１抗体と組み合わせたもの（Yang, S. Y. et al. (1986) J. Immunol. 137:1097-1100）が含まれる。上記の抗体のいずれかと同じエピトープに結合する他の抗体も使用することができる。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）およびイオノマイシンを投与することによって活性化される。ある実施形態では、宿主細胞は、活性化および次いで拡大を誘導する適切な抗原を投与することによって、活性化される。ある実施形態では、ＰＭＡ、イオノマイシン、および／または適切な抗原をＣＤ３と共に投与して、活性化および／または拡大を誘導する。
概して、本開示において使用される活性化剤には、抗体、そのフラグメント、および抗体様機能を有するタンパク質性結合分子が含まれるが、これらに限定されない。（組換え）抗体フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、（Ｆａｂ）２’－フラグメントなどの二価抗体フラグメント、ダイアボディ、トリアボディ（Iliades, P., et al., FEBS Lett (1997) 409, 437-441）、デカボディ（Stone, E., et al., Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88-94）および他のドメイン抗体（Holt, L. J., et al., Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490）である。二価抗体フラグメントは、（Ｆａｂ）２’－フラグメント、または二価単鎖Ｆｖフラグメントであってよく、一方、一価抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、および単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）からなる群より選択され得る。
ある実施形態では、ＣＤ３ζ剤の１つまたは複数の結合部位は、二量体リポカリンムテイン（すなわち、デュオカリン）などの二価タンパク質性人工結合分子であり得る。ある実施形態では、受容体結合試薬は、単一の第２の結合部位（すなわち、一価）を有し得る。一価薬剤の例としては、一価抗体フラグメント、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子、またはＭＨＣ分子が挙げられるが、これらに限定されない。一価抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、および二価単鎖Ｆｖフラグメントを含む単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＤ３に特異的に結合する薬剤としては、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体の二価抗体フラグメント、抗ＣＤ３抗体の一価抗体フラグメント、および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３結合分子が挙げられるが、これらに限定されない。抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３結合分子は、アプタマー（aptamer）、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ（glubody）、アンキリン足場に基づくタンパク質、結晶性足場に基づくタンパク質、アドネクチン（adnectin）、およびアビマー（avimer）であり得る。それらをビーズに結合させてもよい。
ある実施形態では、活性化剤（例えば、ＣＤ３結合剤）は、約０．１～約１０μ／ｍｌの濃度で存在することができる。ある実施形態では、活性化剤（例えば、ＣＤ３結合剤）は、約０．２μｇ／ｍｌ～約９μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌ、約０．４μｇ／ｍｌ～約７μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ～約６μｇ／ｍｌ、約０．６μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌ、約０．７μｇ／ｍｌ～約４μｇ／ｍｌ、約０．８μｇ／ｍｌ～約３μｇ／ｍｌ、または約０．９μｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。ある実施形態では、活性化剤（例えば、ＣＤ３結合剤）は、約０．１μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ、約０．４μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ、約０．６μｇ／ｍｌ、約０．７μｇ／ｍｌ、約０．８μＭ、約０．９μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μＭ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、または１０μｇ／ｍｌの濃度で投与される。ある実施形態では、ＣＤ３結合剤は、１μｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。
ＮＫ細胞は、概して、例えば、米国特許第７，８０３，３７６号、同第６，９４９，５２０号、同第６，６９３，０８６号、同第８，８３４，９００号、同第９，４０４，０８３号、同第９，４６４，２７４号、同第７，４３５，５９６号、同第８，０２６，０９７号、同第８，８７７，１８２号；米国特許出願公開第２００４／００５８４４５号、同第２００７／０１６０５７８号、同第２０１３／００１１３７６号、同第２０１５／０１１８２０７号、同第２０１５／００３７８８７号；およびＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１６／１２２１４７号に記載されるような方法を使用して活性化することができる。これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、例えば、限定されないが、ＮＫ細胞上の抑制性受容体（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＬＩＬＲＢ１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＬＩＬＲＢ５受容体）の阻害によって活性化される。
特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、例えば、限定されないが、フィーダー細胞（例えば、ネイティブなＫ５６２細胞、または４－１ＢＢＬおよびサイトカイン（例えばＩＬ１５またはＩＬ２１）を発現するように遺伝子改変されたＫ５６２細胞）によって活性化される。
他の実施形態では、インターフェロン、またはマクロファージ由来サイトカインを使用して、ＮＫ細胞を活性化することができる。例えば、そのようなインターフェロンとしては、インターフェロンαおよびインターフェロンγが挙げられるが、これらに限定されず、またそのようなサイトカインとしては、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２１が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、ＮＫ活性化剤は、約０．１～約１０μｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。特定の実施形態では、ＮＫ活性化剤は、約０．２μｇ／ｍｌ～約９μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌ、約０．４μｇ／ｍｌ～約７μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ～約６μｇ／ｍｌ、約０．６μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌ、約０．７μｇ／ｍｌ～約４μｇ／ｍｌ、約０．８μｇ／ｍｌ～約３μｇ／ｍ、または約０．９μｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。特定の実施形態では、ＮＫ活性化剤は、約０．１μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ、約０．４μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ、約０．６μｇ／ｍｌ、約０．７μｇ／ｍｌ、約０．８μＭ、約０．９μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μＭ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、または約１０μｇ／ｍｌの濃度で投与される。特定の実施形態では、ＮＫ活性化剤は、１μｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。
ある実施形態では、活性化剤は、限定されないが、ビーズ、培養プレートもしくはウェル中に存在する吸収性ポリマー、または限定されないが、セファロースもしくはガラスなどの他のマトリックスなどの、固体支持体に付着される；当業者に公知の手段によって、天然または組換え細胞株の細胞表面上に（天然または組換え形態などで）発現され得る。
特定の実施形態では、宿主細胞は、刺激／活性化後に遺伝子改変することができる。ある実施形態では、宿主細胞は、刺激／活性化の１２時間、１６時間、２４時間、３６時間、または４８時間以内に改変される。ある実施形態では、細胞は、刺激／活性化後１６～２４時間以内に改変される。特定の実施形態では、宿主細胞は２４時間以内に改変される。特定の実施形態では、宿主細胞は、刺激／活性化の前に遺伝子改変することができる。
本開示のａｒＣＡＲを発現するように宿主細胞を遺伝子改変するために、ａｒＣＡＲポリヌクレオチドまたは組換えベクターを宿主細胞に移入しなければならない。ポリヌクレオチドの移入は、ウイルスまたは非ウイルス送達方法を介して行うことができる。本方法と共に使用するためのポリヌクレオチド送達に好適な方法には、ポリヌクレオチドを細胞小器官、細胞、組織または生物に導入することができる当業者に公知の任意の方法が含まれる。
様々な実施形態において、遺伝子改変はｅｘ ｖｉｖｏで行われる。ｅｘ ｖｉｖｏ改変を介して対象から取り出された細胞および組織をトランスフェクトするための様々な方法が利用可能である。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのレトロウイルス遺伝子導入を使用して、対象から取り出された細胞を遺伝子改変することができ、その細胞を対象に移入して戻す。例えば、Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989 and Nabel et al., Science, 244(4910):1342-1344, 1989を参照されたい；これらの両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、宿主細胞を対象から取り出し、本開示のポリヌクレオチドまたは組換えベクターを用いてｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトすることができる。ある実施形態では、対象から得られた宿主細胞に、本開示のポリヌクレオチドまたは組換えベクターをトランスフェクトまたは形質導入し、次いで、対象に投与して戻すことができる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、レトロウイルス形質導入を介して形質導入され得る。遺伝子のレトロウイルス形質導入について記載する参考文献は、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，３９９，３４６号; Mann et al., Cell 33:153 (1983);Ｔｅｍｉｎらの米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎらの米国特許第４，９８０，２８９号; Markowitz et al., J. Virol. 62:1120 (1988); Ｔｅｍｉｎらの米国特許第５，１２４，２６３号；国際特許出願公開第ＷＯ９５／０７３５８;およびKuo et al., Blood 82:845 (1993)であり、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
遺伝子導入の別の適切な方法としては、注射（またはインジェクション）が挙げられる。ある実施形態において、ポリヌクレオチドまたは組換えベクターは、１または複数の注射（例えば、針注射）を介して、細胞、組織、または生物に送達され得る。注射の非限定的な方法としては、組成物（例えば、生理食塩水ベースの組成物）の注射が挙げられる。ポリヌクレオチドまたは組換えベクターは、直接マイクロインジェクションによって導入することもできる。注射の非限定的な部位には、皮下、皮内、筋肉内、リンパ節内（intranodal）（リンパ組織への抗原の直接送達を可能にする）、静脈内、前立腺内、腫瘍内、リンパ内（intralymphatic）（ＤＣの直接投与を可能にする）および腹腔内が含まれる。注射部位の適切な準備（例えば、適切な針配置を観察するために注射部位の剃毛）が必要であることが理解される。
エレクトロポレーションは、遺伝子導入の別の適切な方法である。例えば、Potter et al., (1984) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81, 7161-7165 and Tur-Kaspa et al., (1986) Mol. Cell Biol., 6, 716-718を参照されたい；これらは両方とも、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションは、高圧放電への細胞およびＤＮＡの懸濁液の曝露を含む。ある実施形態では、ペクチン分解酵素などの細胞壁分解酵素を使用して、宿主細胞を未処理細胞よりもエレクトロポレーションによる遺伝子改変に対してより感受性にすることができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８４，２５３号を参照されたい。
本開示と共に使用するためのエレクトロポレーションの方法としては、例えば、Sardesai, N. Y., and Weiner, D. B., Current Opinion in Immunotherapy 23:421-9 (2011) およびFerraro, B. et al., Human Vaccines 7:120-127 (2011)に記載されているものが挙げられ、これらは両方とも、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
核酸ワクチンを使用して、ａｒＣＡＲポリヌクレオチドまたはベクターを宿主細胞に導入することができる。このようなワクチンには、非ウイルスベクター、「裸の」ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。これらのワクチンで細胞を遺伝子改変する方法、およびこれらのワクチンに含まれる遺伝子の発現を最適化する方法は、当業者に公知である。
遺伝子導入のさらなる方法としては、リポソーム媒介トランスフェクション（例えば、過剰な水溶液中に懸濁された脂質複合体中に捕捉されたポリヌクレオチド。例えば、Ghosh and Bachhawat, (1991) In: Liver Diseases, Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands. pp. 87-104を参照されたい）が挙げられる。また、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）またはスーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）と複合体を形成したポリヌクレオチド；ＤＥＡＥ－デキストラン（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン、続いてポリエチレングリコールを使用して、ポリヌクレオチドが細胞に送達される。例えば、Gopal, T. V., Mol Cell Biol. 1985 May; 5(5):1188-90を参照されたい）；リン酸カルシウム（例えば、リン酸カルシウム沈殿を用いてポリヌクレオチドを細胞に導入する。例えば、Graham and van der Eb, (1973) Virology, 52, 456-467; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987),およびRippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990を参照されたい）；超音波処理負荷（直接音波負荷によるポリヌクレオチドの導入。例えば、Fechheimer et al., (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84, 8463-8467を参照されたい）；微粒子銃（microprojectile bombardment）（例えば、１つまたは複数の粒子を少なくとも１つのポリヌクレオチドでコーティングし、推進力によって細胞に送達することができる。例えば、米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；および国際特許出願第ＷＯ９４／０９６９９；Klein et al., (1987) Nature, 327, 70-73, Yang et al., (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 87, 9568-9572を参照されたい）；および受容体媒介トランスフェクション（例えば、様々な受容体の細胞型特異的分布を用いて、標的細胞において生じる受容体媒介エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込み。例えば、Wu and Wu, (1987) J. Biol. Chem., 262, 4429-4432; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(9):3410-3414, 1990; Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4086-4090, 1994; Myers, EPO 0273085; Wu and Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12:159-167, 1993; Nicolau et al., (1987) Methods Enzymol., 149, 157-176を参照されたい）；ここで引用される各参考文献は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる；が企図される。
さらなる実施形態において、宿主細胞は、相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いた遺伝子編集を使用して遺伝子改変される。相同組換え修復（ＨＤＲ）は、二本鎖ＤＮＡ切断を修復するために細胞によって使用される機構である。ＨＤＲでは、二本鎖ＤＮＡ切断部位と相同性を有するドナーポリヌクレオチドが、切断されたＤＮＡ配列を修復するための鋳型として使用され、ドナーポリヌクレオチドからＤＮＡへの遺伝情報の転移をもたらす。したがって、新しい核酸材料が標的ＤＮＡ切断部位に挿入またはコピーされ得る。宿主細胞における二本鎖ＤＮＡ切断は、部位特異的ヌクレアーゼによって誘導され得る。本明細書で使用される「部位特異的ヌクレアーゼ」という用語は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を特異的に認識および切断することができるヌクレアーゼを指す。本開示における使用に適した部位特異的ヌクレアーゼには、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、またはメガ－ＴＡＬＥＮヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、標的ＤＮＡ配列における二本鎖切断を誘導することができる部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９＋ガイドＲＮＡ）を、本開示のａｒＣＡＲのポリペプチドをコードするドナーポリヌクレオチドと共に宿主細胞に導入することができる。
宿主細胞を活性化および形質導入した後、細胞を培養して増殖させる。
Ｔ細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間、少なくとも２週間、少なくとも１、２、３、４、５、または６ヶ月、あるいはそれ以上、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ラウンド以上の拡大で培養され得る。
Ｔ細胞の拡大に使用することができる薬剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１などのインターロイキンを含むことができる（例えば、Cornish et al. 2006, Blood. 108(2):600-8, Bazdar and Sieg, 2007, Journal of Virology, 2007, 81(22):12670-12674, Battalia et al, 2013, Immunology, 139(1):109-120を参照されたい）。Ｔ細胞の拡大のために使用され得る薬剤の他の例示的な例は、ＣＤ８、ＣＤ４５またはＣＤ９０に結合する薬剤、例えば、αＣＤ８、αＣＤ４５またはαＣＤ９０抗体である。Ｔ細胞集団の例示的な例として、抗原特異的Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（メモリーＴ細胞の例示的な例は、ＣＤ６２Ｌ／ＣＤ８／特異的セントラルメモリーＴ細胞である）または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇの例示的な例は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇ細胞である）が挙げられる。
Ｔ細胞を拡大させるために使用され得るさらなるものとしては、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；および同第６，８６７，０４１号に記載されるような方法が挙げられる；これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、拡大に使用される薬剤（例えば、ＩＬ－２）は、約２０単位／ｍｌ～約２００単位／ｍｌで投与される。特定の実施形態では、拡大に使用される薬剤（例えば、ＩＬ－２）は、約２５単位／ｍｌ～約１９０単位／ｍｌ、約３０単位／ｍｌ～約１８０単位／ｍｌ、約３５単位／ｍｌ～約１７０単位／ｍｌ、約４０単位／ｍｌ～約１６０単位／ｍｌ、約４５単位／ｍｌ～約１５０単位／ｍｌ、約５０単位／ｍｌ～約１４０単位／ｍｌ、約５５単位／ｍｌ～約１３０単位／ｍｌ、約６０単位／ｍｌ～約１２０単位／ｍｌ、約６５単位／ｍｌ～約１１０単位／ｍｌ、約７０単位／ｍｌ～約１００単位／ｍｌ、約７５単位／ｍｌ～約９５単位／ｍｌ、または約８０単位／ｍｌ～約９０単位／ｍｌで投与される。特定の実施形態では、拡大に使用される薬剤（例えば、ＩＬ－２）は、約２０単位／ｍｌ、約２５単位／ｍｌ、約３０単位／ｍｌ、３５単位／ｍｌ、４０単位／ｍｌ、４５単位／ｍｌ、約５０単位／ｍｌ、約５５単位／ｍｌ、約６０単位／ｍｌ、約６５単位／ｍｌ、約７０単位／ｍｌ、約７５単位／ｍｌ、約８０単位／ｍｌ、約８５単位／ｍｌ、約９０単位／ｍｌ、約９５単位／ｍｌ、約１００単位／ｍｌ、約１０５単位／ｍｌ、約１１０単位／ｍｌ、約１１５単位／ｍｌ、約１２０単位／ｍｌ、約１２５単位／ｍｌ、約１３０単位／ｍｌ、約１３５単位／ｍｌ、約１４０単位／ｍｌ、約１４５単位／ｍｌ、約１５０単位／ｍｌ、約１５５単位／ｍｌ、約１６０単位／ｍｌ、約１６５単位／ｍｌ、約１７０単位／ｍｌ、約１７５単位／ｍｌ、約１８０単位／ｍｌ、約１８５単位／ｍｌ、約１９０単位／ｍｌ、約１９５単位／ｍｌ、または約２００単位／ｍｌで投与される。特定の実施形態では、拡大に使用される薬剤（例えば、ＩＬ－２）は、約５ｍｇ／ｍｌ～約１０ｎｇ／ｍｌで投与される。ある実施形態では、拡大に使用される薬剤（例えば、ＩＬ－２）は、約５．５ｎｇ／ｍｌ～約９．５ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍｌ、約６．５ｎｇ／ｍｌ～約８．５ｎｇ／ｍｌ、または約７ｎｇ／ｍｌ～約８ｎｇ／ｍｌで投与される。ある実施形態では、拡大に使用される薬剤（例えば、ＩＬ－２）は、約５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、または１０ｎｇ／ｍｌで投与される。
ＮＫ細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間、少なくとも２週間、少なくとも１、２、３、４、５、または６ヶ月、あるいはそれ以上、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ラウンド以上の拡大で培養され得る。
ＮＫ細胞の拡大に使用することができる薬剤は、ＣＤ１６またはＣＤ５６に結合する薬剤、例えば、αＣＤ１６抗体またはαＣＤ５６抗体などを含むことができる。特定の実施形態では、結合剤（binding agent）は抗体を含む（例えば、Hoshino et al, Blood. 1991 Dec. 15; 78(12):3232-40を参照されたい）。ＮＫ細胞の拡大のために使用され得る他の薬剤は、ＩＬ－１５である（例えば、Vitale et al. 2002. The Anatomical Record. 266:87-92を参照されたい；あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
Ｔ細胞培養に適した条件には、適切な培地（例えば、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンを添加した、無血清の、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの定義されたセット、および／または増殖および拡大に充分な量のサイトカインを補足した、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ培地１６４０、Ｌｏｎｚａ ＲＰＭＩ １６４０、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、ＴｅｘＭＡＣＳ、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）が含まれる。
宿主細胞の拡大のための他の添加物の例としては、限定はされないが、界面活性剤、プラスマネート（Plasmanate）、ＨＥＰＥＳなどのｐＨ緩衝液、およびＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）が挙げられ、これらは実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するために必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）下で維持される。
ＰＳＣ（例えば、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）が出発細胞集団として使用される特定の実施形態では、本方法は、ＰＳＣをＴ細胞などの免疫細胞に分化させることをさらに含んでいてもよい。ｉＰＳＣ由来造血細胞系列を得るための適用可能な分化方法および組成物には、当技術分野で記載されているもの、例えば、国際特許出願公開第Ｗ０２０１７／０７８８０７およびＷＯ２０１９／１１２８９９に記載されているものが含まれ、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ｉＰＳＣ由来造血系統細胞には、限定はされないが、胚体造血内皮（definitive hemogenic endothelium）、造血多能性前駆細胞、造血幹細胞および造血前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および好中球が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のａｒＣＡＲのポリペプチドを精製する方法も提供する。いくつかの実施形態では、その方法は、ａｒＣＡＲの第２のポリペプチドを発現するように改変された宿主細胞からａｒＣＡＲの第２のポリペプチドを精製することを含む。いくつかの実施形態では、ａｒＣＡＲの第２のポリペプチドは可溶性タンパク質である。
医薬組成物
一態様では、組成物は、本明細書に開示されるように、本明細書に記載されるａｒＣＡＲの１つまたは複数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、および細胞組成物を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、限定はされないが、医薬組成物を含む。
一態様では、本開示は、本明細書に記載のａｒＣＡＲのポリペプチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２つ以上の本明細書に記載のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは組換えベクターと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２つ以上の本明細書に記載のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、それぞれが本明細書に記載のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２つ以上の本明細書に記載のａｒＣＡＲの第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む。様々な実施形態において、２つ以上のａｒＣＡＲはそれぞれ、タグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の改変宿主細胞と、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
医薬担体の例としては、水および油（石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む）などの滅菌液体が挙げられるが、これらに限定されない。水または生理食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、特に注射用溶液のための担体として好ましく使用される。
本明細書に開示される改変宿主細胞を含む組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えばグリシン）；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含み得る。
本明細書に開示される改変宿主細胞を含む組成物は、以下の１つまたは複数を含み得る：注射用水、生理食塩水（好ましくは生理学的生理食塩水）、リンゲル液、等張塩化ナトリウムなどの滅菌希釈剤、溶媒または懸濁媒体として機能し得る合成モノグリセリドまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒などの不揮発性油；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸またはナトリウム亜硫酸水素塩などの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤；、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度調整のための薬剤。
いくつかの実施形態では、組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内、腫瘍内、脳室内、胸膜内または筋肉内投与用に製剤化される。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投与用バイアルに封入することができる。注射用医薬組成物は、好ましくは無菌である。いくつかの実施形態では、組成物は、投与前に凍結乾燥製剤から再構成される。
いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、それらの投与の前に、それらが接着または浸透する物質、例えば、限定されないが、ナノ粒子と混合され得る。
処置方法
いくつかの態様では、疾患の処置のために本開示のａｒＣＡＲを使用する方法が本明細書で提供される。
一態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要とする対象において疾患を処置する方法であり、その方法は、
（ｉ）本明細書に記載のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を含む免疫エフェクター細胞、および
（ｉｉ）前記ａｒＣＡＲの第２のポリペプチド、または前記第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記第２のポリペプチドを含む宿主細胞
の治療有効量を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、その方法は、それぞれが（ａ）ユニークな抗原に結合する抗原結合ドメインと、（ｂ）第１のポリペプチドのタグ結合ドメインによって認識されるタグとを含む１つまたは複数の追加のポリペプチドを投与することをさらに含む。
別の態様では、本明細書に提供されるのは、それを必要とする対象において疾患を処置する方法であり、その方法は、
（ｉ）２つ以上のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を含む免疫エフェクター細胞であって、２つ以上のａｒＣＡＲが本明細書に記載のａｒＣＡＲシステムから選択される、免疫エフェクター細胞、および
（ｉｉ）前記２つ以上のａｒＣＡＲの第２のポリペプチド、または前記第２のポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、または前記第２のポリペプチドを含む１つまたは複数の宿主細胞
の治療有効量を対象に投与することを含む。
本明細書に記載の処置方法の様々な実施形態では、細胞は免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はｉＰＳＣに由来する。様々な実施形態において、細胞は、第１のポリペプチドを構成的に発現する。
本明細書に記載の処置方法の様々な実施形態において、宿主細胞および／またはポリペプチドは、本明細書に記載の薬学的に許容される担体および／または賦形剤も含む医薬組成物として投与される。
本明細書に記載の処置方法の様々な実施形態において、疾患はがんである。「がん」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍」、および「がん腫」という用語は、比較的異常な、制御されていない、および／または自律的な増殖を示す細胞を指すために本明細書において互換的に使用され、したがって、それらは、細胞増殖の制御の著しい喪失によって特徴付けられる異常増殖の表現型を示す。概して、本出願における処置のための対象細胞には、前がん（例えば、良性）細胞、悪性細胞、前転移細胞、転移細胞、および非転移細胞が含まれる。本開示の教示は、あらゆるがんに関連し得る。いくつかの非限定的な例を挙げると、いくつかの実施形態では、本開示の教示は、例えば、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、骨髄腫および骨髄増殖性疾患を含む、造血器がん；肉腫、黒色腫、腺腫、固形組織のがん腫、口、咽頭、喉頭および肺の扁平上皮がん、肝臓がん、尿生殖器がん、例えば前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、子宮がん、子宮内膜がん、および腎細胞がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、皮膚または眼内黒色腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、頭頸部がん、乳がん、消化器がんおよび神経系がん、乳頭腫などの良性病変などの、１つまたは複数のがんに適用される。いくつかの実施形態では、本開示の方法によって処置されるがんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、本開示の方法によって処置されるがんは、血液悪性腫瘍である。など
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって処置されるがんは、膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は、白血病（例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、骨髄腫、またはリンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））である。
本明細書に記載の処置方法の様々な実施形態において、疾患は自己免疫疾患または障害である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患または障害は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、１型糖尿病、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、重症筋無力症、橋本病、グレーブス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ギラン・バレー症候群、クローン病または潰瘍性大腸炎である。
ユニークな抗原結合特異性を有する複数のポリペプチドが投与される場合、本方法を用いて、同じ疾患（例えば、腫瘍または自己免疫疾患）における複数の抗原（または同じ抗原中の複数のエピトープ）、または異なる疾患（例えば、腫瘍または自己免疫疾患）における複数の抗原を標的とすることができる。
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞と、第２のポリペプチド、または前記第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記第２のポリペプチドを含む宿主細胞とが、同時に投与される。
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞と、第２のポリペプチド、または前記第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記第２のポリペプチドを含む宿主細胞とが、逐次的に投与される。例えば、第２のポリペプチド、または前記第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記第２のポリペプチドを含む宿主細胞は、改変宿主細胞の投与の前または後に投与され得る。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、処置を受ける対象に対して自己細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、処置を受ける対象に対して同種異系細胞である。免疫エフェクター細胞がドナーから単離される場合、この方法は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および宿主細胞拒絶を予防する方法をさらに含んでいてよい。
いくつかの実施形態において、追加のステップを対象への投与の前に行うことができる。例えば、免疫エフェクター細胞を本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは組換えベクター（例えば、ａｒＣＡＲの第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは組換えベクター）と接触（例えば、形質導入またはトランスフェクション）させた後で、しかし対象への投与の前に、免疫エフェクター細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大させることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大は、対象への投与前に、１日以上、例えば、２日以上、３日以上、４日以上、６日以上、または８日以上の間行うことができる。あるいは、または加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大は、対象への投与前に、２１日以下、例えば、１８日以下、１６日以下、１４日以下、１０日以下、７日以下、または５日以下の間、続けることができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大は、対象への投与前に、１～７日間、２～１０日間、３～５日間、または８～１４日間行うことができる。
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大中に、免疫エフェクター宿主細胞を抗原（例えば、ＴＣＲ抗原）で刺激することができる。抗原特異的な拡大は、任意選択で、例えば、抗ＣＤ３抗体、抗Ｔａｃ抗体、抗ＣＤ２８抗体、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などのリンパ球増殖を非特異的に刺激する条件下での拡大を追加することができる。拡大された宿主細胞は、対象に直接投与してもよく、あるいは将来の使用のため、すなわち対象への後での投与のために凍結してもよい。
いくつかの態様において、免疫エフェクター宿主細胞は、対象への注入前にインターロイキン－２（ＩＬ－２）でｅｘ ｖｉｖｏで処理され、および／または対象は注入後にＩＬ－２で処置される。さらに、いくつかの実施形態において、患者は、改変宿主細胞の投与の前に、準備的なリンパ球枯渇（preparative lymphodepletion）（免疫系の一時的な除去）を受けることができる。ＩＬ－２処理と準備的なリンパ球枯渇の組み合わせは、改変宿主細胞の持続性を増強することができる。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター宿主細胞は、サイトカインをコードする核酸で形質導入またはトランスフェクトされ、この核酸は、サイトカインの構成的発現、調節可能な発現、または時間的に制御された発現を提供するように操作され得る。適切なサイトカインには、例えば、収縮期中にＴリンパ球の生存を高めるように作用し、メモリーＴ細胞の形成および生存を促進することができるサイトカインが含まれる。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物（例えば、宿主細胞またはポリペプチド）は、治療有効量で投与される。本開示の方法において投与される組成物の投与量は、対象の身体パラメーター、投与頻度、投与様式、クリアランス速度などに応じて広く変化する。初期用量はより多く、その後により少ない維持用量が続いてもよい。有効な投与量レベルを維持するために、用量を毎週または隔週などのように少ない頻度で投与してもよく、あるいはより少ない用量に分割し、毎日、週に２回などで投与してもよい。様々な用量が、改変宿主細胞のｉｎ ｖｉｖｏ持続性を達成するのに有効となると考えられる。様々な用量が改変宿主細胞のｉｎ ｖｉｖｏエフェクター機能を改善するのに有効であると考えられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって調製された改変宿主細胞を含む組成物は、１０２～１０１０細胞／ｋｇ体重、１０５～１０９細胞／ｋｇ体重、１０５～１０８細胞／ｋｇ体重、１０５～１０７細胞／ｋｇ体重、１０７～１０９細胞／ｋｇ体重、または１０７～１０８細胞／ｋｇ体重（これら範囲内の全ての整数値を含む）の用量で投与され得る。改変宿主細胞の数は、組成物の意図される治療用途に依存する。
改変宿主細胞は、上に列挙した投与量で複数回投与され得る。改変宿主細胞は、処置を受けている患者に対して同種異系、同系、異種、または自己由来であり得る。
様々な疾患／障害を処置するために使用される場合、本開示の組成物および方法は、同じまたは同様の疾患／障害に好適な他の治療方法／薬剤とともに利用され得ることも企図される。このような他の治療方法／薬剤は、（同時にまたは逐次的（sequentially）に）共投与して、相加効果または相乗効果を生じさせることができる。各薬剤の適切な治療有効投与量は、相加作用または相乗作用により低減され得る。
ある実施形態では、本開示の組成物（例えば、宿主細胞またはポリペプチド）は、がん治療剤などの追加の治療剤の投与の前に、それと実質的に同時に、またはその後に投与される。追加のがん治療剤は、例えば、化学療法剤、生物学的薬剤、手術、遺伝子療法または放射線療法であり得る。いくつかの実施形態では、組成物を投与される対象は、リンパ球枯渇化学療法または放射線療法などの、免疫細胞の枯渇を引き起こすのに充分な処置を受けない。
上記の治療方法のいずれかの一部の実施形態では、その方法は、免疫抑制剤、生物学的製剤、プロバイオティクス、プレバイオティクス、およびサイトカイン（例えば、ＩＦＮまたはＩＬ－２）からなる群より選択される１つまたは複数の追加の化合物を対象に投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示の方法および組成物は、（例えば、ＩＬ１、ＩＮＦα／β、ＩＬ６、ＴＮＦ、ＩＬ２３などの遮断を介して）炎症を遮断する他の療法と組み合わせることができる。
本開示の方法および組成物は、例えば、治療用ワクチン（ＧＶＡＸ、ＤＣベースのワクチンなどを含むが、これらに限定されない）、チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３などを遮断する薬剤を含むが、これらに限定されない）またはチェックポイント活性化剤（４－１ＢＢ、ＯＸ４０などを増強する薬剤を含むが、これらに限定されない）などの、他の免疫調節処置と組み合わせることができる。本開示の方法はまた、ＮＫＴの機能または安定性を調節する能力を有する他の処置と組み合わせることもでき、そのような他の処置には、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｄ融合タンパク質、抗原を負荷されていないもしくは負荷されたＣＤ１ｄダイマーもしくはＣＤ１ｄのより大きなポリマー、ＣＤ１ｄ－キメラ抗原受容体（ＣＤ１ｄ－ＣＡＲ）、または、ヒトに存在する５つの既知のＣＤ１アイソマーの任意の他のもの（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤｌｅ）が含まれるが、これらに限定されない。本開示の方法はまた、ミドスタウリン、エナシデニブ、またはそれらの組み合わせなどの他の処置と組み合わせてもよい。
本開示の治療方法は、追加の免疫療法および療法と組み合わせることもできる。例えば、腫瘍を処置するために使用される場合、本開示の組成物は、腫瘍のタイプ、患者の状態、他の健康問題、および様々な因子に応じて、従来の療法、例えば、手術、放射線療法、化学療法、またはそれらの組み合わせと組み合わせて使用することができる。特定の態様では、本開示の阻害剤との併用腫瘍療法に有用な他の治療剤は、抗血管新生剤を含む。例えば、ＴＮＰ－４７０、血小板因子４、トロンボスポンジン－１、メタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＥＭＰ１およびＴＩＭＰ２）、プロラクチン（１６－Ｋｄフラグメント）、アンジオスタチン（プラスミノーゲンの３８Ｋｄフラグメント）、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、トランスフォーミング増殖因子β、インターフェロンα、可溶性ＫＤＲおよびＦＬＴ－１受容体、胎盤プロリフェリン関連タンパク質（placental proliferin-related protein）、ならびにCarmeliet and Jain (2000)に列挙されているものなど、多くの抗血管新生剤が同定されており、当技術分野において公知である。一実施形態では、本開示の改変宿主細胞は、ＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体フラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤およびそれらの任意の組み合わせ（例えば、抗ｈＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１、ベバシズマブまたはラニビズマブ）と組み合わせて使用することができる。
本開示の併用療法で使用することができる化学療法化合物の非限定的な例として、例えば、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、アザシチジン、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン（campothecin）、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン(ironotecan)、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが挙げられる。
これらの化学療法化合物は、それらの作用機序によって、例えば、以下の群に分類することができる：代謝拮抗剤／抗がん剤、例えば、ピリミジン類似体（５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリン類似体、葉酸拮抗剤および関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、および２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；抗増殖／抗有糸分裂剤、例えば、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）などの天然物、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、およびナベルビンなどの微小管破壊剤（microtubule disruptor）、エピポドフィロトキシン（epidipodophyllotoxin）（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミン、オキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール（texotere）、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミスラマイシン）およびマイトマイシン；酵素（Ｌ－アスパラギンを体系的に代謝し、自身でアスパラギンを合成する能力を持たない細胞を取り除くＬ－アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート－ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン－ダカルバジニン（trazenes-dacarbazinine）（ＤＴＩＣ）；抗増殖／抗有糸分裂抗代謝剤、例えば葉酸類似体（メトトレキサート）；プラチナ配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）、およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩、および他のトロンビン阻害剤）；血栓溶解剤（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤（antimigratory agent）；抗分泌剤（ブレフェルジン（breveldin））；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（例えば、ＴＮＰ－４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ）および成長因子阻害剤（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導因子（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾンおよびプレニゾロン）；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導因子およびカスパーゼ活性化因子；およびクロマチン破壊剤。
本明細書に記載の方法の様々な実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。対象は、任意の年齢または性別を有する若年者または成人であり得る。
以下の実施例は、本明細書に開示される実施形態のいくつかをさらに説明するために提供される。実施例は、開示される実施形態を例示することを意図する。しかしながら、本出願は、以下に示す例示的な実施形態に限定されないことを理解されたい。
実施例１．新規なＶＨＨタグを有するａｒＣＡＲの開発
ファージディスプレイ技術を用いて、または免疫化によって、非ヒトタンパク質に対する特異性を有する新規ＶＨＨを同定する。生成および品質管理分析のために候補ＶＨＨを選択する。特異性および交差反応性について候補ＶＨＨをさらに試験する。抗ＶＨＨを作製するためにリードＶＨＨを使用する。
リードタグＶＨＨに対する特異性を有する抗ＶＨＨは、ファージディスプレイ技術を使用して同定されるか、またはラマもしくは他のラクダ科動物における免疫化によって生成される。タングステン、ＶＨＨ、およびＳｕｐｅｒＨｕｍａｎ、ならびにｓｃＦｖを含むいくつかの市販のファージキャンペーンを使用することができる。タグＶＨＨのＣＤＲまたは他の非フレームワーク領域に結合する候補抗ＶＨＨが選択される。
可溶性タグ付き（tagged）ＶＨＨを、ＣＨＯ細胞において発現および産生させる。可溶性タグ付きＶＨＨをプロテインＡクロマトグラフィーによって精製する。抗ＶＨＨは、細胞外タグ結合ドメインとしてＣＡＲ構築物に組み込まれる。Ｔ細胞にレンチウイルス構築物を形質導入して、抗ＶＨＨドメインを含むＣＡＲを発現させる。また、特異性および交差反応性について抗ＶＨＨを試験する。
サイトカイン産生および細胞傷害性をそれぞれ評価することによって、可溶性タグ付きＶＨＨおよび抗タグＣＡＲを介してＴ細胞活性化を評価するために、Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを確立する。リードａｒＣＡＲ構築物をさらなる分析のために選択する。
実施例２．既存のＶＨＨタグを有するａｒＣＡＲの開発
非ヒトタンパク質に結合する既存のＶＨＨを選択する。本開示のａｒＣＡＲを構築する際に使用することができるＶＨＨの非限定的な例としては、ＲＳＶ Ｆタンパク質、リステリア菌のインターナリン、コブラ毒ホスホリパーゼＡ２、エボラウイルス核タンパク質、ＨＳＶ糖タンパク質Ｄ、ラコトコッカスファージＲＢＰ、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、リシン（例えば、Ｖ５Ｅ４）、およびニワトリ卵白リゾチームを標的とするＶＨＨが挙げられる。ＶＨＨはまた、ＣＤＲをスクランブルすることによって結合を排除するように操作され得る。生成および品質管理分析のために候補ＶＨＨを選択する。抗ＶＨＨを作製するために、選択されたＶＨＨを使用する。
リードタグＶＨＨに対する特異性を有する抗ＶＨＨは、ファージディスプレイ技術を使用して、またはラマにおける免疫化によって同定される。タングステン、ＶＨＨおよびＳｕｐｅｒＨｕｍａｎ、ならびにｓｃＦｖを含むいくつかの市販のファージキャンペーンを使用することができる。タグＶＨＨのＣＤＲまたは他の非フレームワーク領域に結合する候補抗ＶＨＨが選択される。
可溶性タグ付きＶＨＨを、ＣＨＯ細胞において発現および産生させる。可溶性タグ付きＶＨＨをプロテインＡクロマトグラフィーによって精製する。抗ＶＨＨは、細胞外タグ結合ドメインとしてレンチウイルスＣＡＲ構築物に組み込まれる。Ｔ細胞にレンチウイルス構築物を形質導入して、抗ＶＨＨドメインを含むＣＡＲを発現させる。また、特異性および交差反応性について抗ＶＨＨを試験する。
サイトカイン産生および細胞傷害をそれぞれ評価することによって、可溶性タグ付きＶＨＨおよび抗タグＣＡＲを介してＴ細胞活性化を評価するために、Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを確立する。リードａｒＣＡＲ構築物をさらなる分析のために選択する。
実施例３．ＢＣＭＡ／抗ＢＣＭＡ ＶＨＨを有するａｒＣＡＲ
ａｒＣＡＲ概念を試験するために、以下に列挙するいくつかのアプローチを使用する。
タンパク質の最初の概念：ａｒＣＡＲプラットフォームにおけるタンパク質相互作用：を試験するために、抗ＢＣＭＡ抗体を腫瘍標的化ドメイン抗体に融合させる。ＢＣＭＡをＣＡＲの膜貫通ドメインに融合させる。ＢＣＭＡ／抗ＢＣＭＡ抗体を組み込む例示的なａｒＣＡＲを図３Ａに示す。
別の実験セットでは、ハーセプチンｍＡｂ配列に由来するｓｃＦｖを開発する。抗ハーセプチンイディオタイプｍＡｂについて同定された配列をｓｃＦｖフォーマットに変換する。これらの既知の配列をａｒＣＡＲプラットフォームに組み込んで、概念を実証する。ハーセプチンｓｃＦｖをＣＡＲに融合させ、ハーセプチン抗ＩＤ ｓｃＦｖを可溶性腫瘍標的化ドメイン抗体（例えば、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖまたはＶＨＨ）に融合させる。ハーセプチン／ハーセプチン ｓｃＦｖを組み込む例示的なａｒＣＡＲを図３Ｂに示す。このａｒＣＡＲを細胞傷害性の可能性についてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する。
非ヒトタンパク質に対する特異性を有するいくつかの抗体が文献において同定されている。このような例には、Ｈ６ｄｙｘ、ｈＰ３－３、ｈＡｎｔｉ－Ｚ、ｈＨＳＶ ＧＤ、ｈＬＰ ＲＢＰ、ｈＶＨＨ４、ｈＳｂｓＢ、およびｈＶ５Ｅ４が含まれる。これらを、特徴付けのためにｓｃＦｖまたはＶＨＨフォーマットで構築する。生物物理学的特性に基づいて候補物を選択する。次いで、これらのバインダーに対して抗ＩＤキャンペーンを実施して、ａｒＣＡＲ親和性を調節するための利点に関する概念実証を可能にする多様な親和性パネルを開発する。
実施例４．ハーセプチン／抗ハーセプチンｓｃＦｖを有するａｒＣＡＲ
概念実証（Ｐｒｏｏｆ－ｏｆ－Ｃｏｎｃｅｐｔ）研究において、ハーセプチン（トラスツズマブ）ｍＡｂに由来するｓｃＦｖを開発した。別のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ６９）を抗ハーセプチンイディオタイプｍＡｂから開発した。これらの配列を異なるＣＡＲ発現構築物に組み立て（表５）、次いで、それぞれをレンチウイルスベクターにパッケージングし、Ｊｕｒｋａｔ細胞または初代Ｔ細胞のいずれかにおいてウイルス形質導入を介して発現させた。フローサイトメトリーおよびＥＧＦＲ可溶性タンパク質への結合によって、ＣＡＲ発現を検出した。ＣＡＲ発現細胞を、ＥＧＦＲを過剰発現するＣＨＯ細胞またはＥＧＦＲのネイティブな細胞表面発現を有する細胞株と組み合わせて使用して、ＥＧＦＲ特異的細胞傷害性を実証した。図４Ａは、ハーセプチンｓｃＦｖをＣＡＲに融合させ、ハーセプチン抗ＩＤ ｓｃＦｖをＥＧＦＲ標的化ＶＨＨ（９Ｇ８）に融合させた、例示的なａｒＣＡＲを示す。図４Ｂは、９Ｇ８－ｓｃＦｖ６９融合タンパク質と結合した、ハーセプチンｓｃＦｖ ＣＡＲを発現するＴ細胞が、ＥＧＦＲ＋細胞を標的とすることができることを示す。
表５は、細胞外タグ結合ドメインとしてハーセプチンｓｃＦｖまたは抗ハーセプチンイディオタイプｓｃＦｖ６９のいずれかを含む、作製されたＣＡＲ発現構築物を示す。図５は、ＣＡＲ構築物を送達するために使用されるレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。表６は、ハーセプチンｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ６９（ハーセプチン抗ＩＤ）を示す。
Ｊｕｒｋａｔ細胞に、表５に記載のＣＡＲ構築物を担持するレンチウイルスベクターを形質導入して、ＣＡＲ発現およびＣＤ６９活性化を評価した。活性化の読み出しとしてＣＤ６９調節を測定するために、ＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞をＥＧＦＲ陽性細胞と２４時間および４８時間共培養した。共培養後、抗ヒトＣＤ６９－ＢＶ４２１抗体を用いてＣＤ６９レベルについて細胞を染色し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅフローサイトメーターで測定した。また、ＣＡＲ構築物をＴ細胞において発現させて細胞傷害性を評価した。このアッセイを行うために、Ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ カタログ番号１３０－０９６－５３５）を製造者の指示に従って使用してＴ細胞を単離した。３０単位／ｍｌのＩＬ２を含むＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）に細胞を再懸濁し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１１３２Ｄ）で終夜活性化した。翌日、ＴｒａｎｓＤｕｘ（商標）ＭＡＸレンチウイルス形質導入試薬（ＳＢＩ、カタログ番号ＬＶ８６０Ａ－１）を使用して、ＣＡＲ発現カセットを含むレンチウイルスプラスミドでＴ細胞を形質導入した（図１２Ａ～１２Ｋ）。Ｔ細胞を７日間拡大させ、７日目に細胞傷害アッセイを設定した。Ｒｅｃｏｎ細胞トレースバイオレットで標識した標的細胞を、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞と様々な比率で２４時間または４８時間共培養した。４８時間後、細胞の生存率をＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅフローサイトメーターでチェックした。
Figure 2024500847000040
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Figure 2024500847000042
Figure 2024500847000043
ハーセプチンｓｃＦｖまたは抗ハーセプチンイディオタイプｓｃＦｖ６９のいずれかと（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号２５）を介して融合した９Ｇ８ ＶＨＨ（表６）を含む４つの融合タンパク質（またはブリッジタンパク質）構築物（表７）を組み立てた。図６Ａは、表７に記載されるブリッジ構築物をクローニングするために使用されるプラスミドのベクターマップを示す。
製造業者の指示に従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、タンパク質発現のために表６に記載されるブリッジ構築物を担持するプラスミドをＥＸＰｉ－２９３細胞にトランスフェクトした。可溶性ブリッジタンパク質を精製した。清澄化した上清をＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムに１ｍｌ／分１ｍｌの流速でロードした。２０カラム体積のＰＢＳでカラムを洗浄して、結合していないタンパク質を除去した。１０ｃＶの０．１Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ３．５）でカラムを溶出し、２．５Ｍトリス（ｐＨ６．５）で試料を中和した。タンパク質試料をＳＥＣによってポリッシングして、高分子量種を除去した。図６Ｂは、各構築物から精製されたブリッジタンパク質の純度を示すゲル電気泳動画像を示す。
Figure 2024500847000044
ＣＡＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞へのブリッジタンパク質の結合についての結合アッセイを実施して、ｓｃＦｖ６９－ＣＡＲで形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞と、ブリッジタンパク質の２つのバリアント（図７Ａに示すように、９Ｇ８＿ハーセプチンｓｃＦｖおよびハーセプチンｓｃＦｖ ９Ｇ８）との間の結合を検出した。以下のように細胞をインキュベートして染色アッセイを行った後、ブリッジタンパク質の結合をＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅで検出した。ＣＡＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞をブリッジタンパク質と共に３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、次いでビオチン化ＥＧＦＲと共に３０分間インキュベートした。洗浄ステップ後、ＰＥ標識ストレプトアビジンを細胞と共にインキュベートした。ブリッジタンパク質結合ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞は、９Ｇ８＿ハーセプチンｓｃＦｖについて６５％陽性であり、ハーセプチンｓｃＦｖ ９Ｇ８について４５％陽性であるとフローサイトメトリーによって決定された（図７Ｂ）。ブリッジタンパク質の結合を反対の配置でも検出した：ｓｃＦｖ６９＿９Ｇ８ブリッジとハーセプチンＣＡＲ、および９Ｇ８＿ｓｃＦｖ６９ブリッジとハーセプチンＣＡＲ（データは示さず）。
標的細胞とＣＡＲ発現Ｔ細胞との間で細胞傷害活性を評価した。フローサイトメトリーによって評価されるように、ＥＧＦＲ形質導入ＣＨＯ細胞においてＥＧＦＲの発現が検出された（図８Ａ）。Ｔ細胞においてＣＡＲ発現も評価した。ＨＥＲ－ＣＡＲ（ｐ５１４）およびｓｃＦｖ６９－ＣＡＲ（ｐ５１５）の両方に関して長いＩｇ－ヒンジフォーマットを有するＣＡＲにおいて最高の発現が観察された（図８Ｂ）
細胞傷害活性アッセイを設定するために、標的細胞（ＥＧＦＲ形質導入ＣＨＯおよび親ＣＨＯ）を１０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識した。約５：１のおよそのＣＡＲ＋エフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）のために、ＣＡＲ Ｔ細胞を１００，０００細胞／ウェルでプレーティングした。ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＨＯ－ＥＧＦＲ＋細胞と４８時間共培養した。アッセイで使用した対照を表８に示す。１０、１、０．１、および０ｎＭのブリッジタンパク質９Ｇ８－ハーセプチン（ｐ５２２）および９Ｇ８－ｓｃＦｖ６９（ｐ５１９）を使用した。
Figure 2024500847000045
ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、正しいブリッジタンパク質と組み合わせる（または対にする）とＣＤ２５の活性化を示したが、ミスマッチブリッジタンパク質と組み合わせるとＣＤ２５の活性化を示さなかった（図９Ａ、９Ｂ）。さらに、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、正しいブリッジタンパク質と組み合わせると細胞傷害活性を示したが、ミスマッチブリッジタンパク質と組み合わせると細胞傷害活性を示さなかった（図１０Ａ、１０Ｂ）。
実施例５．ユニバーサルＣＡＲプラットフォームのためのＶＨＨの同定
ＶＨＨバインダーを抗イディオタイプの発見のための潜在的標的として選択して、交換可能に「タグ」および「抗タグ」として機能し得る特異的かつユニークな結合対を形成した。非ヒトタンパク質に結合することが知られているＶＨＨのリストを同定した。ニワトリ卵白（Ｈｅｎ Ｅｇｇ）リゾチーム（ＨＥＬ）に結合する追加のＶＨＨも得た。これらのＶＨＨおよび作製したプラスミドを表９に提供し、配列を表１０に提供する（下線を引いた配列はＣＤＲの位置を示す）。
Figure 2024500847000046
Figure 2024500847000047
Figure 2024500847000048
Figure 2024500847000049
Figure 2024500847000050
Figure 2024500847000051
表９に記載のＶＨＨを含むレンチウイルスＣＡＲ発現構築物を組み立てた。図１１Ａは、ＶＨＨ ＣＡＲを送達するために使用されるレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。次いで、レンチウイルスベクターを用いてＪｕｒｋａｔ細胞に形質導入した。１０／１４ ＶＨＨ ＣＡＲについてＪｕｒｋａｔ細胞での堅牢なＣＡＲ発現が観察された（図１１Ｂ）。全ての候補ＶＨＨが、ＣＡＲとしてＪｕｒｋａｔ細胞において非常に高いレベルで発現した。ＣＡＲに存在する場合にこれらのＶＨＨのトニックシグナル伝達（tonic signaling）または非特異的活性化があるかどうかを決定するために、形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞をヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ）と終夜インキュベートし、翌日、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９について評価した。全てのＶＨＨ ＣＡＲ構築物について、Ｊｕｒｋａｔ細胞における低い非特異的活性化が観察されるかまたは全く観察されず（図１１Ｃ、１１Ｄ）、これは、標的駆動活性化なしでのＣＡＲを介したシグナル伝達がほとんどないかまたは全くないことを示す。３つの抗リゾチームＶＨＨ ＣＡＲは、ニワトリリゾチームに結合し、ヒトと交差反応せず（図１１Ｅ）、ニワトリタンパク質に対する特異性を実証する。
これらのデータに基づいて、LＹＳＯ＿ＣＷ＿Ｐ０１＿Ｂ１１（Ｂ１１）ＶＨＨおよびＬＹＳＯ＿ＣＷ＿Ｐ０１＿Ｄ０４（Ｄ０４）ＶＨＨを、ＣＡＲとしてのそれらの高発現、低い～全くないトニックシグナル伝達および非特異的活性、ならびに理想的な生物物理学的特徴（可溶性タンパク質としてのそれらの強い発現によって示される）により、さらなる検討のために選択した。これらのＶＨＨは、ＣＡＲまたはブリッジタンパク質のいずれかにおいて良好な発現を有した。
Figure 2024500847000052
図１１Ｆは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、ＬＹＳＯ＿ＣＷ＿Ｐ０１＿Ｂ１１およびＬＹＳＯ＿ＣＷ＿Ｐ０１＿Ｄ０４を標的とするＶＨＨのアミノ酸配列のアラインメントを示す。アラインメントされた配列に基づいてコンセンサス配列が作製された。
これらＶＨＨの特異性の最終的な特徴付けとして、Ｂ１１ ＶＨＨおよびＤ０４ ＶＨＨを形質導入したＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞を、候補パネルの他の抗ＨＥＬ ＶＨＨと同様に、ビオチン化したニワトリおよびヒトリリゾチームへの結合について試験して、ヒトリリゾチームタンパク質への結合がないことを確認した。Ｂ１１（ｐ２４２）ＶＨＨおよびＤ０４（ｐ２４４）ＶＨＨの両方が、ヒトリリゾチームタンパク質に対する交差反応性なしに、ニワトリリゾチームへの結合を示す（図１１Ｅ）。
実施例６．Ｂ１１およびＤ０４ ＶＨＨのヒト化
Ｂ１１およびＤ０４タンパク質は、Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ Ｂｉｏ（カリフォルニア州サンフランシスコ）におけるラクダ科動物ＶＨＨファージディスプレイライブラリーに由来する。これらＶＨＨの免疫原性の可能性を制限するために、それらをＶＨＨのフレームワーク領域においてヒト化した。この実施例以降、Ｂ１１およびＤ０４への言及は、ヒト化ＶＨＨへの言及である。
Figure 2024500847000053
ヒト化Ｂ１１およびＤ０４は、フレームワーク領域のヒト化がそれらの生物物理学的特徴、ＣＡＲとして発現する能力、またはＣＡＲ上に存在する場合のそれらの特性が損なわれていないことを確認するために、ラクダ科動物バージョンと同様の特徴付けステップを経た。
Figure 2024500847000054
前述のように、各ＶＨＨ ＣＡＲをＪｕｒｋａｔ細胞に形質導入した。さらに、各ＶＨＨ ＣＡＲを、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＮｕｒ７７レポーター株（Ｎｕｒｋａｔ）であるＮｕｒｋａｔ細胞に形質導入した。この細胞株は、ＣＤ３ｚ刺激によって活性化されＣＡＲ活性化のレポーターとして働く転写因子であるＮｕｒ７７に応答するＧＦＰレポーターを含む。したがって、Ｎｕｒｋａｔ細胞におけるＣＡＲを介した活性化は、細胞にＧＦＰを発現させる。図１３は、ヒト化Ｂ１１（ｐ１６４９）ＣＡＲおよびヒト化Ｄ０４（ｐ１６４８）ＣＡＲを含むレンチウイルスで形質導入したＮｕｒｋａｔ細胞のＣＡＲおよびＧＦＰ発現を示す。ＵＴＤ細胞は、非形質導入Ｎｕｒｋａｔ細胞である。ポリクローナル抗ラクダ科動物ＶＨＨカクテル（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用いてＣＡＲ発現を測定した。これらの結果は、ＣＡＲとしてのＢ１１ ＶＨＨおよびＤ０４ ＶＨＨの発現が、これら配列のヒト化により影響を受けなかったことを示した。加えて、これらＣＡＲ ＮｕｒｋａｔにおけるＧＦＰ発現の欠如は、ＣＡＲのヒト化バージョンによって媒介されるトニックシグナル伝達がほとんどないことを示す。
ヒト化の結果として各ＶＨＨの結合特性に変化がないことを確認するために、本発明者らは、これらのヒト化ＶＨＨ ＣＡＲが依然としてＨＥＬに結合し得るかどうかを試験した。図１４は、Ｂ１１（ｐ１６４９）およびＤ０４（ｐ１６４８）ＣＡＲ Ｎｕｒｋａｔをビオチン化ＨＥＬで染色し、フローサイトメトリーを介してストレプトアビジン－ＡＰＣで検出したアッセイの結果を示す。ＵＴＤは、陰性対照としての非形質導入Ｎｕｒｋａｔである。Ｂ１１およびＤ０４は両方とも、ヒト化の後に、ＨＥＬに結合するそれらの能力を保持した。
実施例７．Ｂ１１およびＤ０４に対する抗イディオタイプＶＨＨのファージディスプレイパニング
ヒト化Ｂ１１およびＤ０４ ＶＨＨをファージライブラリーパニングに使用して、それぞれに対して特異的な抗ＩＤ ＶＨＨを同定した。合成ＶＨＨファージライブラリーは、主にそれらのＣＤＲ３配列の長さによって区別される４つのサブライブラリーからなり、ライブラリー１（ＣＮＴＹ１）は最も短いＣＤＲ長を有し、ライブラリー３および４（ＣＮＴＹ３およびＣＮＴＹ４）は最も長いＣＤＲ長を有する。
使用した１つのパニングスキーマを図１５に示す。この方法では、最初にＢ１１－Ｆｃタンパク質に対するライブラリーを枯渇させることによって、Ｄ０４に対する抗イディオタイプＶＨＨを発見した。これは、ＶＨＨのフレームワーク領域およびタンパク質のＦｃ部分に結合するファージを除去するために行われた。次いで、この枯渇させたファージアウトプットをビオチン化Ｄ０４－Ｆｃタンパク質でパニングした。ファージバインダーを有するビオチン化Ｄ０４を、ストレプトアビジンを介して単離することができた。アウトプットファージを細菌中で増幅させ、徐々にストリンジェントにしたパニング条件を用いるさらなるパニングラウンドで使用した。あるいは、ファージによって提示されるＶＨＨを、Ｄ０４またはＢ１１タンパク質への結合についてＥＬＩＳＡによって試験し、シーケンシング（配列決定）し、より厳密な試験のために発現ベクターにクローニングしてもよい。このファージライブラリーパニングアプローチを用いて、Ｄ０４およびＢ１１の両方に対するＶＨＨバインダーを同定した。
標的抗原濃度を徐々に減少させてこのパニングスキーマを４回繰り返し、高親和性バインダーを選択した（第１および第２ラウンドについて２００ｎＭ、第３ラウンドについて５０ｎＭ、および第４ラウンドについて１０ｎＭ）。最終ラウンドのパニングのアウトプットファージを使用し、細菌を形質転換して単一コロニーにして、これを標的ＶＨＨおよびオフターゲットＶＨＨの両方に対するＥＬＩＳＡにおいてペリプラズム抽出物（ＰＰＥ）としてスクリーニングした（図１６）。
標的タンパク質に対して特異的応答を示し、かつオフ標的タンパク質に対してほとんど応答を示さなかったＰＰＥ試料を、さらなる特徴付けのために選択した。６つのユニークなＢ１１バインダーおよび１８のユニークなＤ０４バインダーを同定した。これらのユニークな配列を、さらなる試験のためにＦｃ融合発現ベクターにクローニングした。これらのタンパク質の配列および識別子を表１４に示す。
Figure 2024500847000055
Figure 2024500847000056
実施例８．抗イディオタイプＶＨＨの特異性および親和性試験
抗イディオタイプの特異性および結合を決定するために、ＦＡＣＳによって、Ｂ１１ ＶＨＨ ＣＡＲまたはＤ０４ ＶＨＨ ＣＡＲのいずれかを発現するＮｕｒｋａｔ細胞に対してＦｃ融合タンパク質を試験した。
図１７Ａ～１７Ｂに示すように、いくつかの抗イディオタイプは、無視できる程度のオフターゲットＣＡＲへの結合で、ある範囲の濃度でＣＡＲ上のＶＨＨに対する堅牢かつ特異的な結合を示した（例えば、ＡＭＤ７１（Ｂ１１に対する）およびＡＭＤ６９、ＡＭＤ７７、ＡＭＤ８２、ＡＭＤ８４、ＡＭＤ８７およびＡＭＤ８８（Ｄ０４に対する））。両方の細胞株への結合によって示される、非特異的結合を示したいくつかのバインダーも注目された（ＡＭＤ７２およびＡＭＤ７４）。これらのうち、ＡＭＤ７１、ＡＭＤ７７、ＡＭＤ８２、ＡＭＤ８４、ＡＭＤ８７およびＡＭＤ８８をさらなる特異性試験のために選択した。ビオチン化抗イディオタイプＶＨＨ－Ｆｃ融合タンパク質を、様々な他のＶＨＨ ＣＡＲ－Ｎｕｒｋａｔに対してアレイし、その後、ＦＡＣＳを介してそれら細胞株への任意の結合を検出した。
図１８は、ストレプトアビジン－ＡＰＣを用いたＦＡＣＳを介して検出された、標的ＣＡＲ Ｎｕｒｋａｔ細胞およびオフターゲットＣＡＲ Ｎｕｒｋａｔ細胞へのリード抗イディオタイプビオチン化ＶＨＨ－Ｆｃの結合を示す。試験した細胞株は、Ｂ１１、Ｄ０４、Ｐ７１１、Ｐ７１２、Ｐ７１３、Ｐ７１６、および親細胞を含む。Ｂ１１およびＤ０４細胞は、それぞれＢ１１ ＶＨＨ ＣＡＲおよびＤ０４ ＶＨＨ ＣＡＲを発現するＣＡＲ Ｎｕｒｋａｔ細胞である。Ｐ７１１、７１２、７１３、７１６細胞は、オフターゲットＣＡＲ Ｎｕｒｋａｔ細胞である。親細胞は、形質導入されていない非ＣＡＲ発現Ｎｕｒｋａｔ細胞である。対照は、ほとんどのＶＨＨに非特異的に結合するビオチン化プロテインＡ、無関係のビオチン化ＶＨＨ－Ｆｃタンパク質であるＰＲＯＴ７８６、およびビオチン化タンパク質の添加なしが含まれる。リードＶＨＨは、標的ＶＨＨへの堅牢な結合を有しながら、オフターゲットＶＨＨ ＣＡＲおよび親Ｎｕｒｋａｔへの無視できる結合を示した。
場合によっては、ユニバーサルＣＡＲの「タグ」と「抗タグ」の相互作用の基礎を形成する特異的結合事象は、プラットフォームの安全性プロファイルに重要な側面である。さらに、リゾチームＶＨＨと抗イディオタイプ単独との結合事象は、ＣＡＲ誘導性活性化を引き起こすのに充分であるべきではない。Ｂ１１またはＤ０４のそれらの可溶性抗イディオタイプへの結合が、腫瘍抗原標的化ＶＨＨの可溶性タンパク質への融合なしにＣＡＲ誘導性活性化を引き起こすかどうかを決定するために、リード可溶性抗イディオタイプＦｃ融合タンパク質をそれらの標的ＣＡＲ ＮｕｒｋａｔおよびオフターゲットＣＡＲ Ｎｕｒｋａｔならびに親Ｎｕｒｋａｔとインキュベートする、終夜刺激アッセイを行った。図１９Ａ～１９Ｂは、ＦＡＣＳを介した、１０ｎＭの抗イディオタイプＶＨＨ Ｆｃ融合物とインキュベートしたＮｕｒｋａｔ細胞を用いた終夜刺激アッセイの結果を示す。図１９Ａは、抗イディオタイプＦｃ融合タンパク質と終夜共培養した後の、Ｂ１１およびＤ０４ ＣＡＲ Ｎｕｒｋａｔ細胞、ならびに親Ｎｕｒｋａｔ細胞のＧＦＰ発現を示す。図１９Ｂは、終夜インキュベーション後のストレプトアビジン－ＡＰＣを介したビオチン化タンパク質の検出を示す。対照は、ＰＭＡ／イオノマイシン（堅牢なＮｕｒｋａｔ細胞活性化をもたらすＴＣＲ－架橋剤）、ビオチン化プロテインＡ、およびタンパク質を添加しない試料を含む。抗イディオタイプリードのいずれも、ＰＭＡ／イオノマイシン誘導と比較して、ＧＦＰ発現によって測定されるＮｕｒｋａｔにおける観察可能な活性化を引き起こさなかった。抗イディオタイプはまた、終夜インキュベーション後にも依然として検出可能であり、抗イディオタイプがＣＡＲ活性化を引き起こすのであれば、アッセイにおいて使用した抗原の濃度が、観察可能であった実験の時間経過にわたって活性化を引き起こすのに充分であったことを示す。
Ｂ１１－ｈｉｓタグ付きＶＨＨおよびＤ０４－ｈｉｓタグ付きＶＨＨの両方に対する抗ＩＤバインダーについて、親和性測定値をＯｃｔｅｔによって得た。
Figure 2024500847000057
Figure 2024500847000058
抗イディオタイプタンパク質は、２ｎＭ（Ｄ０４に対するＡＭＤ７７）～３．７μＭ（Ｄ０４に対するＡＭＤ８７）の範囲の親和性を示した。Ｏｃｔｅｔを介して２つの最高親和性バインダーＡＭＤ７７（２ｎＭ）およびＡＭＤ８８（７２ｎＭ）の特異性を検証するために、本発明者らは、各タンパク質を、それ自体、その標的ＶＨＨ、オフターゲットＶＨＨ、血清由来の全ヒトＩｇＧ、およびＦｃ－ｙフラグメントに対する結合について試験した。
Figure 2024500847000059
各試料（ＡＭＤ７７またはＡＭＤ８８のいずれか）を、分析物Ｄ０４－ｈｉｓ、ＡＭＤ７７、ＡＭＤ８８、血清由来のＩｇＧ、ｆｃ－ｙフラグメント、ＰＲＯＴ９３９（オフターゲットＶＨＨ－ｆｃ可溶性）、およびＤ０４－ｆｃに対して試験した。レスポンス値を表１７に示す。ＡＭＤ７７およびＡＭＤ８８は両方とも、Ｄ０４－ｈｉｓおよびＤ０４－Ｆｃに対する強いレスポンスを維持しながら、ヒトＩｇＧ、Ｆｃ、およびオフターゲットＶＨＨ－Ｆｃ ＰＲＯＴ９３９に対して最小限のレスポンスを示した。ＡＭＤ８８は、それ自体およびＡＭＤ７７に対するレスポンスを示した。ＡＭＤ７７はそれ自体と関係しなかった。
実施例９．ブリッジタンパク質の設計
ブリッジタンパク質は、ＶＨＨ ａｒＣＡＲバインダーおよび腫瘍標的化ＶＨＨ、具体的には、この例では抗ＣＤ７０および抗ＥＧＦＲを含む。これらを、ｉｎ ｖｉｖｏで半減期延長因子として機能するＦｃドメイン有りおよび無しで構築した。ユニバーサルＣＡＲの特異性を達成するために、Ｄ０４ ＣＡＲと対をなすＤ０４に対する選択された抗イディオタイプ、またはＣＡＲとしてのＤ０４に対する抗ＩＤと対をなす可溶性ブリッジタンパク質上のＤ０４を組み込んだブリッジタンパク質を設計した。
Figure 2024500847000060
Figure 2024500847000061
Figure 2024500847000062
Figure 2024500847000063
実施例１０．Ｄ０４ ＣＡＲおよびｈｕＤ０４ ＣＮＴＹ１ Ｄ１０ブリッジでのＴ細胞傷害性
ユニバーサルプラットフォームがＴ細胞による細胞傷害性を媒介し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、ＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントに融合されたＥＧＦＲ標的化ＶＨＨ ９Ｇ８にＷｈｉｔｌｏｗリンカーによってタンデムに連結されたＡＭＤ８８タンパク質由来のＶＨＨ（ｈｕＤ０４＿ＣＮＴＹ１＿Ｄ１０）からなるブリッジタンパク質を作製した（表１９）。各ブリッジタンパク質を、Ｄ０４ ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞を用いたＴ細胞細胞傷害性アッセイにおいて試験した。
Figure 2024500847000064
Ｔ細胞のＣＡＲ陽性率（％）について調整して１：２のエフェクター対標的比で、ＣＡＲ Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識したＥＧＦＲ陽性細胞と４８時間共培養することにより、死滅アッセイを実施した。５ｎＭのブリッジＡＭＤ１０９（図２０Ａ）またはＡＭＤ１１２（図２０Ｂ）のいずれか。
図２０Ａ～２０Ｂに示すように、ブリッジとＣＡＲが「マッチしている」（例えば、抗イディオタイプＶＨＨがブリッジタンパク質上に存在し、その標的ＶＨＨがＣＡＲ上に存在する）場合、ＥＧＦＲ陽性細胞の堅牢な細胞傷害性が、ＣＡＲ上にＤ０４を有するＰ１６５０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ｈｕＤ０４＿ＣＮＴＹ１＿Ｄ１０、可溶性ブリッジタンパク質上にＤ０４に対する抗イディオタイプ）の場合のように観察される。この細胞傷害活性は、９Ｇ８ ＣＡＲに匹敵する。ＣＡＲ ＡＭＤ９４またはＮＯＮＳ Ｆ１２ ＣＡＲを用いる場合のように、ＣＡＲとブリッジがミスマッチである場合、細胞傷害性は観察されない。
＊ ＊ ＊
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な修飾が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
本明細書で引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の資料は、本明細書に物理的に存在するかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (63)

  1. 適合可能な受容体特異性成分を有するユニバーサルキメラ抗原受容体（ａｒＣＡＲ）システムであって、
    （ｉ）第１のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を有する免疫エフェクター細胞であって、前記第１のポリペプチドが、
    （ａ）細胞外タグ結合ドメインと、
    （ｂ）膜貫通ドメインと、
    （ｃ）少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインと
    を含む、免疫エフェクター細胞；および
    （ｉｉ）第２のポリペプチドであって、
    （ａ）標的細胞上の少なくとも１つの抗原に結合する抗原結合ドメインと、
    （ｂ）前記タグ結合ドメインによって認識されるタグと
    を含む第２のポリペプチド；
    を含み、
    （ｉ）前記タグは、抗体、もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場を含み、前記タグ結合ドメインは、前記タグに結合する抗イディオタイプ分子を含む、あるいは
    （ｉｉ）前記タグは、タグ結合ドメインに結合する抗イディオタイプ分子を含み、前記タグ結合ドメインは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場を含む、ａｒＣＡＲシステム。
  2. 前記抗イディオタイプ分子は、抗体、その抗原結合フラグメントまたは代替足場の少なくとも１つの抗原結合領域に結合する、請求項１に記載のａｒＣＡＲシステム。
  3. 前記抗イディオタイプ分子は、抗体もしくはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に結合する、請求項１または２に記載のａｒＣＡＲシステム。
  4. 前記第２のポリペプチドの抗原結合ドメインは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  5. 前記抗イディオタイプ分子は、抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗イディオタイプ代替足場である、請求項１～４のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  6. 前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖダイアボディ、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはナノボディ、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、重鎖可変領域、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ダイアボディ、トリアボディ、またはデカボディである、請求項１～５のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  7. 前記細胞外タグ結合ドメイン、前記抗原結合ドメイン、および前記タグのうちの少なくとも１つは、シングルドメイン抗体またはナノボディを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  8. 前記細胞外タグ結合ドメイン、前記抗原結合ドメイン、および前記タグのうちの少なくとも１つはＶＨＨを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  9. 前記細胞外タグ結合ドメインおよび前記タグはそれぞれＶＨＨを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  10. 前記細胞外タグ結合ドメイン、前記タグ、および前記抗原結合ドメインはそれぞれＶＨＨを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  11. 前記抗原結合フラグメント、前記細胞外タグ結合ドメイン、前記抗原結合ドメイン、および前記タグのうちの１つまたは複数は、配列番号８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、および１１０～１３３からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項６～１０のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  12. 前記細胞外タグ結合ドメイン、前記抗原結合ドメイン、および前記タグのうちの少なくとも１つはｓｃＦｖを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  13. 前記代替足場は、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）またはセンチリン（Ｃｅｎｔｙｒｉｎ）である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  14. 前記タグは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  15. 前記抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または代替足場は、非ヒト供給源に由来するポリペプチドに結合する、請求項１４に記載のａｒＣＡＲシステム。
  16. 前記非ヒト供給源に由来するポリペプチドは、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質、リステリア菌のインターナリン、コブラ毒ホスホリパーゼＡ２、エボラウイルス核タンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄ、ラクトコッカスのファージ受容体結合タンパク質（ＲＢＰ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、リシン、またはニワトリ卵白リゾチームである、請求項１５に記載のａｒＣＡＲシステム。
  17. 前記抗原結合ドメインは、少なくとも１つの腫瘍抗原または自己免疫抗原に結合する、請求項１～１６のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  18. 前記少なくとも１つの抗原は、同じ腫瘍または自己免疫疾患に関連する、請求項１７に記載のａｒＣＡＲシステム。
  19. 前記腫瘍抗原は、膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍に関連する、請求項１７または１８に記載のａｒＣＡＲシステム。
  20. 膠芽腫に関連する腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＰＤＧＦＲＡ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、またはＩＬ１３Ｒα２である、請求項１９に記載のａｒＣＡＲシステム。
  21. 卵巣がんに関連する腫瘍抗原は、ＦＯＬＲ１、ＦＳＨＲ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、メソテリン、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、またはＢ７Ｈ４である、請求項１９に記載のａｒＣＡＲシステム。
  22. 子宮頸がんまたは頭頸部がんに関連する腫瘍抗原は、ＧＤ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ２、またはＥＧＦＲである、請求項１９に記載のａｒＣＡＲシステム。
  23. 肝臓がんに関連する腫瘍抗原は、クローディン１８．２、ＧＰＣ－３、ＥｐＣＡＭ、ｃＭＥＴ、またはＡＦＰである、請求項１９に記載のａｒＣＡＲシステム。
  24. 抗イディオタイプ分子、抗体、および／または抗体フラグメントはヒト化されている、請求項１～２３のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  25. 前記膜貫通ドメインはヒンジドメインをさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  26. 前記膜貫通ドメインおよび／またはヒンジドメインはＣＤ８またはＣＤ２８に由来する、請求項２５に記載のａｒＣＡＲシステム。
  27. 前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  28. 前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  29. 前記１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＬ２Ｒｂ、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、または２Ｂ４（ＣＤ２４４）に由来する、請求項２８に記載のａｒＣＡＲシステム。
  30. 前記第２のポリペプチドは、Ｎ末端に抗原結合ドメインを含み、Ｃ末端にタグを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  31. 前記第２のポリペプチドは、Ｃ末端に抗原結合ドメインを含み、Ｎ末端にタグを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  32. 前記第２のポリペプチドは可溶性ポリペプチドである、請求項１～３１のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  33. 前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、樹状細胞またはマクロファージである、請求項１～３２のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  34. 前記免疫エフェクター細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、請求項３３に記載のａｒＣＡＲシステム。
  35. 前記免疫エフェクター細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＴ細胞またはＮＫ細胞である、請求項３４に記載のａｒＣＡＲシステム。
  36. 前記ａｒＣＡＲは、（ａ）ユニークな抗原に結合する抗原結合ドメインと、（ｂ）前記第１のポリペプチドのタグ結合ドメインによって認識されるタグとをそれぞれが含む１つまたは複数のポリペプチドをさらに含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステム。
  37. ２つ以上の請求項１～３６のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲを含むａｒＣＡＲシステムであって、各ａｒＣＡＲは、タグとタグ結合ドメインのユニークな対を含む、ａｒＣＡＲシステム。
  38. 請求項１～３６のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステムの第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  39. 請求項１～３６のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲシステムの第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  40. 請求項１～３６のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  41. 前記抗原結合フラグメント、前記細胞外タグ結合ドメイン、前記抗原結合ドメイン、および前記タグのうちの１つまたは複数が、配列番号８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、および１０９からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によって少なくとも部分的にコードされる、請求項３８～４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  42. 請求項３８～４１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  43. 前記ベクターがプラスミドである、請求項４２に記載の組換えベクター。
  44. 請求項１～３７のいずれか一項に記載の第１のポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  45. 請求項１～３７のいずれか一項に記載の第２のポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  46. 請求項１～３７のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物。
  47. 請求項１～３７のいずれか一項に記載の第２のポリペプチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物。
  48. 請求項４６に記載の医薬組成物と請求項４７に記載の医薬組成物とを組み合わせて含むキット。
  49. 請求項３８に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを細胞に導入することを含む、請求項４４に記載の宿主細胞を調製する方法。
  50. 請求項３９に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを細胞に導入することを含む、請求項４５に記載の宿主細胞を調製する方法。
  51. 必要とする対象において疾患を処置する方法であって、
    （ｉ）請求項１～３６のいずれか一項に記載のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を含む免疫エフェクター細胞、および
    （ｉｉ）前記ａｒＣＡＲの第２のポリペプチド、前記第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記第２のポリペプチドを含む宿主細胞
    の治療有効量を対象に投与することを含む、方法。
  52. 前記第２のポリペプチドが、免疫エフェクター細胞の前、後、またはそれと併せて投与される、請求項５１に記載の方法。
  53. 必要とする対象において疾患を処置する方法であって、
    （ｉ）２つ以上のａｒＣＡＲの第１のポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞であって、前記２つ以上のａｒＣＡＲが請求項３７に記載のａｒＣＡＲシステムから選択される、免疫エフェクター細胞、および
    （ｉｉ）前記２つ以上のａｒＣＡＲの第２のポリペプチド、または前記第２のポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、または前記第２のポリペプチドを含む１つまたは複数の宿主細胞
    の治療有効量を対象に投与することを含む、方法。
  54. 前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞もしくは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、樹状細胞、またはマクロファージである、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記免疫エフェクター細胞はｉＰＳＣに由来する、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記免疫エフェクター細胞は、第１のポリペプチドを構成的に発現する、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記疾患は、がんまたは自己免疫疾患である、請求項５１～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. がんは、膠芽腫、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、または血液悪性腫瘍である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記免疫エフェクター細胞と前記第２のポリペプチドが同時投与される、請求項５１～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記免疫エフェクター細胞と前記第２のポリペプチドが逐次投与される、請求項５１～５８のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記免疫エフェクター細胞は自己細胞である、請求項５１～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記免疫エフェクター細胞は同種異系細胞である、請求項５１～６０のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記対象はヒトである、請求項５１～６２のいずれか一項に記載の方法。

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