ES2690420T3 - Receptor de antígeno quimérico anti-toso y su uso - Google Patents
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Abstract
Célula T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita, en la que el receptor de antígeno quimérico contiene al menos los siguientes dominios del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-TOSO, en particular, scFv de 6B10 de SEQ. ID. No. 2 o un homólogo del mismo que se une específicamente a TOSO que tiene una identidad de al menos el 70% con SEQ. ID. No. 2; ii) opcionalmente un dominio espaciador; iii) un dominio transmembrana; y iv) un dominio de señalización citoplásmico; caracterizada porque dicha célula T con el receptor de antígeno quimérico inicia o aumenta la respuesta inmunitaria a o es tóxica para células cancerosas TOSO+ en dicho sujeto.
Description
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RECEPTOR DE ANTIGENO QUIMERICO ANTI-TOSO Y SU USO DESCRIPCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a células T modificadas genéticamente que tienen un receptor de antígeno quimérico (CAR) para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+, como leucemia/linfoma de células p, en un sujeto que lo necesita. En particular, la presente invención se refiere a una célula T modificada por ingeniería genética que contiene y que expresa un receptor de antígeno quimérico específico que es tóxico para células cancerosas TOSO+. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un receptor de antígeno quimérico específico y la molécula de ácido nucleico que codifica para el mismo, así como a vectores y células que contienen el mismo.
Técnica anterior
La terapia celular adoptiva para enfermedades cancerosas está resultando prometedora en recientes ensayos de fase temprana en el tratamiento de la leucemia/linfoma de células B. Las células T de pacientes modificadas por ingeniería genética con un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de tumor, producen regresión de leucemia completa y duradera. Sin embargo, el tratamiento se asocia con cierta toxicidad que requiere atención y el sector todavía se enfrenta a algunos obstáculos a nivel científico, tecnológico y clínico. Habitualmente, las células T derivadas de pacientes se modifican por ingeniería genética ex vivo para expresar una célula T recombinante (TCR), alternativamente, un receptor de antígeno quimérico (CAR). Dicho CAR normalmente está compuesto por un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de un anticuerpo y un dominio de activación de células T intracelular derivado de un endodominio de receptor de células T de señalización. A diferencia de la TCR fisiológica, el CAR está compuesto por una sola cadena polipeptídica que combina la unión a antígenos por medio del resto extracelular con una maquinaria de activación de células T proporcionada por el resto de señalización intracelular. Por tanto, debido al dominio de unión derivado de anticuerpo, las células T modificadas con CAR reconocen a su diana, habitualmente, una antígeno de superficie celular, independientemente de la presentación por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Además, las células T modificadas por el receptor de antígeno quimérico no se ven comprometidas por variantes celulares tumorales con procesamiento de antígenos disminuido o deficiente que presenta un mecanismo observado frecuentemente de escape inmunitario de tumores.
Los CAR constituyen el centro de atención de amplias actividades de investigación durante los últimos años, en particular, desde que la leucemia linfática crónica (CLL) avanzada que no responde al tratamiento se convirtió en remisión completa y duradera mediante el tratamiento con células T modificadas por ingeniería genética (J. N. Kochenderfer, et al., Blood, Bd. 122, n.° 25, S. 4129-4139, diciembre de 2013.). Células T de pacientes se redirigieron a células leucémicas mediante un receptor de antígeno quimérico (CAR) injertado con especificidad por CD19 (“CTL019”). Con pocas alternativas restantes pero todavía sensibles a algunos agentes quimioterápicos, los pacientes recibieron células T modificadas por CAR específicas de CD19 en dosis divididas en el plazo de 3 días hasta una dosis total de 1,1 x 109 células T modificadas con CAR, siendo la dosis menor 1,4 x 107 células T modificadas con CAR (M. Kalos, et al., Sci Transl Med, Bd. 3, n.° 95, S. 95ra73, agosto de 2011.). La terapia con células T produjo remisión en 12 de 23 pacientes con CLL, con 6 respuestas completas que continúan libres de enfermedad hasta la fecha. La inducción de remisiones duraderas convierte al ensayo con células T modificadas con CAR que se dirigen a CD19 (NCT01029366) en un hito en el campo de CAR, aunque el ensayo en la Universidad de Pensilvania no es el primero ni el único estudio con células T modificadas con CAR en realizarse en seres humanos. Otros centros, incluyendo el Sloan Kettering Memorial Institute (Brentjens et al., Blood. 3 de noviembre de 2011;118(18):4817-28. doi: 10.1182/blood-2040) y el Bailor College of Medicine (Cruz et al., Blood, Bd. 122, n.° 17, S. 2965-2973, Oct. 2013) también trataron satisfactoriamente pacientes con CLL con células T modificadas con CAR anti-CD19. En uno de los ensayos de seguimiento dirigidos a la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica con células CTL019, el primer paciente tratado alcanzó remisión completa y duradera. Considerados juntas, la ALL pediátrica y de adulto, se lograron 27/30 remisiones completas, 19 pacientes permanecen en remisión hasta la fecha y 6 pacientes experimentados recidivas (NCT01626495, NCT01029366) (por ejemplo S. L. Maude, et al., N. Engl. J. Med., Bd. 371, n.° 16, S. 1507-1517, Okt. 2014). Estos y otros ensayos con leucemia/linfoma demuestran el destacado potencial de las células T modificadas con CAR. Desde el primer ensayo clínico con células T modificadas con CAR anti-CD19 en tumores malignos de células B, se han tratado más de 70 pacientes en diferentes ensayos en los EE.UU.
Aunque el diseño de ensayo apenas puede compararse, se han hecho visibles algunas líneas básicas para la eficacia terapéutica. En primer lugar, no hay correlación entre el número de células T modificadas con CAR infundidas o la carga tumoral de los pacientes y el desenlace clínico, lo que señala al alto potencial proliferativo y las capacidades de eliminación en serie de las células T modificadas con CAR tras la administración (R. J. Brentjens, et al., Sci Transl Med, Bd. 5, n.° 177, S. 177ra38, marzo de 2013). En segundo lugar, la destrucción de linfocitos antes de la terapia de células T modificadas con CAR parece ser obligatoria para conformar un entorno preferido para las células T transferidas de manera adoptiva, para erradicar células supresoras y para hacer que la médula ósea afectada gravemente sea más sensible a la penetración por células T (L. Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol., Bd. 6, n.° 5, S. 383-393, 2006). En tercer lugar, la coestimulación para empujar a las células T transferidas a la activación completa es un requisito previo para su persistencia y para el establecimiento de una memoria específica,
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requeridos ambos para obtener una respuesta antitumoral duradera. En este contexto, los denominados CAR de segunda generación con señalización de CD3^ coestimuladora y primaria cointegrada en la propia molécula de CAR son una ventaja innegable con respecto a los CAR de primera generación con la señal de CD3^ solo (B. Savoldo, et al., J. Clin. Invest., Bd. 121, n.° 5, S. 1822-1826, mayo de 2011).
Sin embargo, es obvio que las toxicidades y los riesgos sustanciales constituyen una parte inminente de la terapia de células T modificadas con CAR anti-CD 19. Entre ellos, se observó aplasia de células B como consecuencia principal de la toxicidad de “efecto específico, colateral al tumor” en todos los pacientes tratados hasta ahora. La destrucción de células B requiere atención clínica de por vida y actualmente se trata mediante terapia de sustitución con inmunoglobulinas. La elección de una diana adecuada sigue siendo el principal desafío con respecto a la toxicidad y la selectividad asociadas con células T modificadas con CAR en la selección como diana de células cancerosas. La amplia aplicación clínica de la terapia celular adoptiva en cáncer requiere CAR con más selectividad por células cancerosas y menos selección como diana de células sanas.
Se han realizado numerosos esfuerzos para identificar tales dianas adecuadas para la terapia con CAR y para diseñar CAR adecuados para la selección como diana selectiva. Los esfuerzos actuales incluyen unión de baja afinidad y reconocimiento combinatorio de dos antígenos en la misma célula diana. En el contexto de la selección como diana de células leucémicas, el reconocimiento combinatorio de CD5 y CD19 por dos CAR puede prevenir la aplasia de células B a la vez que se seleccionan como diana células leucémicas.
Aunque el direccionamiento de CAR es específico para el antígeno relacionado, las células cancerosas mutantes con antígenos mutados o regulados por disminución son invisibles para las células T modificadas con CAR. La pérdida de diana se produce bajo presión selectiva y se observó en un reciente ensayo para el tratamiento de B-ALL con células T modificadas por CAR (S. A. Grupp. et al., New England Journal of Medicine, Bd. 368, n.° 16, S. 15091518, 20132013). Para impedir la recidiva de células cancerosas con pérdida de antígenos, el uso de células T modificadas con CAR biespecíficas podría ser una opción, o bien modificando por ingeniería genética con dos CAR, cada uno de especificidad diferente, o bien con un CAR con dos especificidades. Alternativamente, puede usarse una mezcla de dos poblaciones de células T, que expresan cada una un CAR con una especificidad definida.
En conjunto, un inconveniente significativo de la terapia de células T modificadas con CAR frente a CD19 de células B derivadas de leucemia y linfoma es la eliminación de las células B CD19+ sanas que requiere atención clínica de por vida y sustitución con inmunoglobulinas. Aunque actualmente está realizándose un tremendo esfuerzo, hasta ahora no se ha logrado una selección como diana preferente en la leucemia/linfoma.
En los últimos años, se han realizado esfuerzos en la optimización del diseño de CAR, (para una revisión, véase por ejemplo Bridgeman J.S., et al., Curr Gene Ther 2010, 10, 77-90). Sin embargo, sigue habiendo muchos retos, en particular, la necesidad de una respuesta antitumoral más eficaz y la prolongación de la supervivencia de las células T, que permita la persistencia de las células T a largo plazo de dichas células T modificadas por ingeniería genética en el organismo. La selectividad en la selección como diana de células cancerosas frente a las células sanas constituye todavía un problema principal, en particular cuando se selecciona como diana leucemia/linfoma. Además, todavía tienen que identificarse las señales coestimuladoras requeridas para mantener la persistencia de las células T y la activación durante la aplicación clínica. Por tanto, todavía queda trabajo para optimizar CAR para diversos enfoques incluyendo inmunoterapia adaptativa.
Ya en 1999, Hombach A., et al., J. Immunotherapy, 1999, 22(6), 473-480, describen un receptor de células T quimérico con especificidad para el antígeno CD30 asociado con el linfoma de Hodgkin. En ese documento se identifica que la reticulación específica del receptor quimérico mediante la unión a CD30 induce toxicidad celular no restringida por el MHC contra células diana CD30+, pro no contra células CD30-. Puesto que CD30 se expresa por células tumorales, aunque también por células B activadas normales, se dudó usar cD30 como diana para la eliminación de células de leucemia/linfoma. La hipótesis se mantuvo por el informe de Savoldo et al., Blood, 2007, 110(7), 2620 - 2630, que demuestra que las células T modificadas con CAR presentan citólisis de líneas celulares linfoblastoides del tipo de células B (líneas celulares LCL). El CAR usado en ese documento es un CAR de “primera generación”.
Para el tratamiento de la leucemia/linfoma, se notificó que los CAR dirigidos hacia otras dianas incluían CD19 (Cooper LJ, et al., Leukemia. Abril de 2004;18(4):676-84), CD20 (Jensen MC, et al., Mol Ther. Abril de 2004;9(4):577-86), CD22, (James SE, et. al., J Immunol. 15 de mayo de 2008 15;180(10):7028-38), CD23 (Giordano Attianese GM, et al., Blood. 5 de mayo de 2011 5;117(18):4736-45. doi: 10.1182/blood-2045), la cadena ligera de Ig kappa (Vera J, et al., Blood. 1 de diciembre de 2006; 108(12):3890-7. Epub, 22 de agosto de 2006).
Hombach A. et al., Gene Therapy, 2010, 17, 1206-1213 describen la modificación del dominio espaciador Fc de IgG1 en el resto extracelular de CAR para evitar la activación colateral por células receptoras+ de Fc y el inicio no deseado de una respuesta inmunitaria innata.
Hombach et al. (J Immunol. 1 de diciembre de 2001;167(11):6123-31.) y Finney et al. (J Immunol. 15 de septiembre de 1998 15;161 (6):2791-7.) notifican combinar el dominio intracelular de CD3zeta y CD28 en la misma molécula de
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CAR para proporcionar coestimulación tras el acoplamiento a la diana. Como resultado, mejora la respuesta de células T con respecto a la liberación de citocina, la amplificación, la persistencia y la lisis entre otras funciones. Kofler et al., 2011, Mol. Ther. 19, 760-767 describen una molécula de CAR que tiene un endodominio de CD28 modificado combinado con un endodominio de CD3zeta y un ectodominio de scFv derivado de anticuerpo específico para CEA. Se describe en ese documento que una deleción del resto de unión Ick en el endodominio de CAR de CD28 mejora la actividad antitumoral redirigida en presencia de células T reguladoras (Treg) sin afectar a la secreción, proliferación y citólisis del interferón gamma (IFN-g). Se especula que el CAR con el endodominio de CD28 modificado aceleran la implementación de la terapia de células T adoptiva en pacientes con una variedad de tipos de cáncer que están muy infiltrados por células Treg.
Además, en Hombach et al., Current Molecular Medicine, 2013, 13(1), 1-10 se proporciona un resumen de la terapia adoptiva de cáncer con células T redirigidas por CAR. En ese documento, se resumen los efectos de CAR incluyendo la actividad de coestimulación, así como la mejora y la prolongación de la respuesta de células T antitumoral redirigida. Además, se describen los efectos adversos de este tipo de terapia adaptativa incluyendo la “tormenta de citocinas” y la “represión de células T”.
Además del efecto beneficioso de las células T que expresan CAR en la terapia adoptiva, se conocen efectos secundarios adversos que actualmente obstaculizan el desarrollo preferido de la terapia respectiva, tal como se mencionó anteriormente. Tal como se describe en los documentos a los que se hace referencia, el desarrollo de CAR da como resultado CAR de segunda y tercera generación, que albergan uno o dos dominios de señalización coestimuladores, intentando superar los mismos. Sin embargo, un problema pendiente de la terapia adoptiva basada en CAR es que las células T modificadas por ingeniería genética que expresan el CAR no diferencian entre células malignas (células cancerosas) y células sanas (células no tumorales), mientras que ambos tipos de células expresan el mismo determinante antigénico del dominio de unión a antígeno presente en la molécula de CAR.
Por tanto, un problema principal de la terapia de células T modificadas con CAR específicas de cáncer es minimizar los efectos secundarios sobre tejidos sanos. Además, es necesaria una selección como diana más selectiva de las células tumorales. En particular, es necesaria la selección como diana selectiva de linfoma/leucemia con el fin de evitar la deficiencia inducida por la terapia inmunitaria que persiste siempre que las células T modificadas con CAR están activas.
TOSO, también conocida como molécula inhibidora de Fas 3 (FAIM3), es una proteína transmembrana y la función todavía no se ha elucidado completamente (Kubagawa H, et al., J Immunol. 1 de mayo de 2015;194(9):4055-7). La inhibición de la apoptosis mediada por Fas está mediada por la unión del dominio C terminal de TOSO con FADD. TOSO también se describe como el receptor de Fc de IgM (Fc|iR) (Vire et al., J Immunol 2011, 187: 4040-4050).
TOSO se sobreexpresa en la leucemia de células p incluyendo B-CLL. Se notificaron pruebas de que TOSO es un factor antiapoptótico en la patogenia de CLL, desencadenado por la señalización de BCR y regulado adicionalmente por la interacción del estroma por medio de la molécula de CD40.
Recientemente, Lang P.A., et. al., (Cell Death and Differentiation, 2015, 22, 164-173) describieron que TOSO tiene un papel esencial en la diferenciación y maturación de células dendríticas inflamatorias.
En el documento WO 2013/136193 A2 se han descrito métodos y composiciones para modular la actividad de TOSO, en particular, se describen proteínas TOSO solubles útiles en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos.
Pallasch C. P. y Wendtner C. M., Leukemia and Lymphoma, 2009, 50(3), 498-501 identifican que la sobreexpresión de la molécula inhibidora de Fas, TOSO, representa un factor antiapoptótico novedoso en la leucemia linfocítica crónica.
En Nguyen X.-H. et al., Blood, 2011, 118 (3), 598-608 se describe que TOSO regula el equilibrio entre la señalización del receptor de muerte apoptótica y no apoptótica facilitando la ubiquitinación de RIP1.
Bérengére V. et al, J. Immunol. 2011, 187, 4040-4050 se refiere a TOSO que se expresa mucho en células B de leucemia linfocítica crónica, se internaliza tras la unión a IgM, se traslada al lisosoma y se regula por disminución en respuesta a la activación de TLR.
Tan Y. et al, Chin. Sce. Bull. 2014, 59 (13), 1374-1385 describe un tratamiento con anticuerpos anti-TOSO que promueve la muerte celular inducida por activación (AICD) de células T in vitro y in vivo que elimina células T.
Breve descripción de la presente invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una célula T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+, incluyendo leucemia TOSO+ o linfoma TOSO+, en un sujeto que lo necesita, mediante lo cual el receptor de antígeno quimérico contiene los siguientes dominios del
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extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-TOSO, en particular, 6B10, o un homólogo del mismo que se une específicamente a TOSO que tiene una identidad de al menos el 70% con SEQ ID No. 2; ii) opcionalmente un dominio espaciador; iii) un dominio transmembrana; y iv) un dominio de señalización citoplásmico; caracterizada porque dicha célula T con el receptor de antígeno quimérico inicia o aumenta una respuesta inmunitaria contra o es tóxica para células cancerosas TOSO+, en particular, células de leucemia TOSO+ o células de linfoma TOSO+. Dichas células no son tóxicas o son menos tóxicas para las células no tumorales TOSO+ (sanas) en dicho sujeto. En aspectos alternativos de la divulgación, puede usarse otro anticuerpo o polipéptido que se une a TOSO o un ligando de TOSO como dominio de unión del receptor de antígeno quimérico.
En particular, la presente invención se refiere a una célula T que expresa el CAR que es un polipéptido de SEQ. ID No. 4 codificado por un ácido nucleico de Seq. ID. No. 3 o un homólogo del mismo tal como se define en las reivindicaciones. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de dicha célula T con un receptor de antígeno quimérico según la presente invención para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita. En particular, el cáncer TOSO+ es uno cualquiera de leucemia/linfoma derivado de células B o T, en particular leucemia linfocítica crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma anaplásico de células grandes, leucemia linfocítica aguda y crónica, linfoma cutáneo, micosis fungoide, linfoma de Sezary, enfermedades linfoproliferativas, mastocitosis sistémica, tumores malignos derivados de células madre, células madre cancerosas u otros.
Además, la presente invención se refiere a un polipéptido de SEQ ID No. 4 o un homólogo del mismo que tiene una identidad de al menos el 90% con Seq. ID. No. 4, por lo que dicho polipéptido o un homólogo del mismo cuando se expresa en una célula T como receptor de antígeno quimérico presenta un efecto tóxico sobre células cancerosas TOSO+, siendo además dicho polipéptido no tóxico o menos tóxico sobre células no cancerosas TOSO+.
Además, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido según la presente invención así como a un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico, por ejemplo Seq. ID. No. 3. Además, se proporciona una célula, línea celular o una célula huésped que contiene dicha secuencia de ácido nucleico o dicho vector así como un kit o sistema que contiene el vector o una célula, una línea celular o una célula huésped que contiene dicho vector o dicha molécula de ácido nucleico o que contiene dicha molécula de ácido nucleico.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: las células T con CAR específico de TOSO reconocen y eliminan células TOSO+. [A] Diagrama esquemático que representa la composición modular del CAR anti-TOSO usado en este estudio. El casete de expresión contiene el ADN que codifica para el scFv anti-TOSO (derivado de la línea celular de hibridoma 6B10) fusionado al ADN que codifica para la región bisagra-CH2CH3 de la IgG1 humana, el dominio de CD28 transmembrana y el dominio de CD28 y CD3^ intracelular para la señalización. [B] Expresión de CAR sobre la superficie de las células T. Se modificaron por ingeniería genética células T de sangre periférica humana mediante transferencia génica retroviral con el CAR respectivo y se cultivaron en presencia de 500 U/ml de IL-2. Se detectó la expresión de CAR mediante citometría de flujo tras 48 horas usando el anticuerpo anti-IgG1 humana conjugado con PE que se une al dominio de IgG1 de CAR extracelular y con el anticuerpo anti-CD3 conjugado con FITC para identificar células T. Se usaron células T no modificadas (sin CAR) como control. Los números representan el porcentaje de células T que expresan el CAR sobre la superficie, en comparación con el número total de células T.
[C] El dominio scFv anti-TOSO se une específicamente a células tumorales positivas para TOSO. Se incubaron células tumorales positivas para TOSO y negativas para TOSO (2x105 células) con la proteína de fusión scFv anti- TOSO-Fc (en diluciones en serie) y una proteína de fusión scFv-Fc irrelevante (concentración de partida 0,025 mg/ml), respectivamente. Se detectó la proteína no unida mediante citometría de flujo tras 30 minutos usando anticuerpo anti-IgG1 humana conjugado con PE que se une al dominio Fc de IgG1. Los datos representan la intensidad de fluorescencia media (MFI). Cada barra representa la media de tres muestras ± desviación estándar.
[D] La citólisis y la activación de las células T redirigidas por CAR son específicas de antígeno. Se modificaron por ingeniería genética células T de sangre periférica con el CAR anti-TOSO y se cocultivaron con células HEK293 modificadas por ingeniería genética con TOSO y negativas para TOSO (1,5x104 células/pocillo) en el número de células T indicado (células efectoras). Células T no modificadas (sin CAR) sirvieron como control. Se determinó la citotoxicidad de las células tumorales mediante el ensayo de viabilidad basado en XTT. Se determinaron IFN-y e IL-2 en el sobrenadante de cultivo mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Los datos representan la media de tres muestras ± desviación estándar.
Figura 2: TOSO se expresa mucho en células de CLL en comparación con las células B sanas
[A] Se tiñeron células de CLL primarias (n=14) y células B de donante sano (n=8) mediante el AcM anti-TOSO 6B10 conjugado con FITC (línea negra continua) o un anticuerpo de control de isotipo correspondiente (línea discontinua) y se registraron mediante citometría de flujo. Se realizó análisis estadístico usando la prueba de la t de Student (*p=0,03). Los histogramas muestran los análisis de células de un donante sano representativo y un paciente con CLL.
[B] Detección de TOSO sobre la superficie celular de células mononucleares sanguíneas obtenidas de pacientes con
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B-CLL en comparación con células sanguíneas de donante sano. Se tiñeron las células con anticuerpo anti-CD5- APC humanas, anticuerpo anti-CD19-FITC para identificar células B y células B-CLL, seguido por tinción con el anticuerpo anti-TOSO conjugado con FITC (línea continua). Un anticuerpo conjugado con FITC de isotipo correspondiente sirvió como control (línea discontinua). El gráfico de puntos y los histogramas muestran los análisis de células de un donante sano representativo.
Figura 3: citólisis específica de células B-CLL mediante células T modificadas por ingeniería genética con CAR. Se marcaron células B-CLL con CFSE (0,83 |iM). Se modificaron células T sin modificar y células T alogénicas [A] o autólogas derivadas de paciente [B] con CAR anti-TOSO y CAR anti-CD19, respectivamente, y se co-incubaron con células B-CLL (1 x 105) durante 24 horas. Se registró la viabilidad de las células B-CLL mediante citometría de flujo. Cada punto representa un B-paciente con CLL individual. Se tiñeron las células apoptóticas y muertas con anexina V-APC. Se calculó la citólisis redirigida por CAR en comparación con la citólisis por células T sin CAR (sin). Los cálculos estadísticos se basaron en la prueba de la t de Student, * representa p<0,05, ** representa p<0,01, *** representa p<0,001. n.s. representa no significativo. [C, D] Se cocultivaron células B-CLL con células T autólogas o alogénicas modificadas por ingeniería genética con CAR y se analizaron los sobrenadantes para determinar IFN-y mediante ELISA. Cada punto representa un paciente con B-CLL individual. La prueba se realizó por triplicado. Los cálculos estadísticos se basaron en la prueba de la t de Student, * representa p<0,05.
Descripción detallada de la presente invención
Los inventores pretenden proporcionar células T modificadas por ingeniería genética que contienen un receptor de antígeno quimérico, mediante lo cual dichas células T presentan una actividad tóxica sobre células cancerosas TOSO+, tal como se define en la reivindicación 1. Es decir, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a células T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+ en particular, linfoma TOSO+ o leucemia TOSO+ en un sujeto que lo necesita, mediante lo cual el receptor de antígeno quimérico contiene al menos los siguientes dominios del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-TOSO, en particular derivado del anticuerpo anti-TOSO 6B10 y representado por Seq. ID. No. 2, o un homólogo que tiene especificidad de unión a TOSO que tiene una identidad de al menos el 70% con SEQ ID No. 2; ii) opcionalmente un dominio espaciador; iii) un dominio transmembrana; y iv) un dominio de señalización citoplásmico; caracterizadas por que dicha célula T con el receptor de antígeno quimérico inicia o aumenta una respuesta inmunitaria en o es tóxica para células cancerosas TOSO+, en particular, células de leucemia TOSO+ o células de linfoma TOSO+. Dichas células T no son tóxicas o son menos tóxicas para las células no cancerosas TOSO+ en dicho sujeto.
El anticuerpo anti-TOSO 6B10 se describe en Pallasch CP, et al., Blood, 15 de noviembre de 2008;112(10):4213-9. doi: 10.182/blood-2055.
En relación con esto, el término “células cancerosas TOSO+” se refiere a células malignas o células neoplásicas que expresan la molécula de TOSO.
Además, el término “células no cancerosas TOSO+” se refiere a células benignas (sanas) que expresan la molécula de TOSO, como las células B.
Los términos “células no tumorales” y “células tumorales” así como “células no cancerosas” y “células cancerosas” se usan en el presente documento de manera intercambiable a menos que se defina de otro modo.
Los términos “no tóxico” y “menos tóxico” se usan en el presente documento de manera intercambiable a menos que se indique de otro modo e identifican que el nivel o la cantidad de células no cancerosas eliminadas por CAR es menos significativo en comparación con el nivel o la cantidad de células cancerosas eliminadas por el mismo CAR.
Tal como se usa en el presente documento, el término “comprender” o “que comprende” así como los términos “contener” o “que contiene” se refiere a la realización de “consistir” o “que consiste en”.
El término “homólogo”, tal como se usa en el presente documento se refiere a moléculas, o bien ADN o bien polipéptidos, que tienen una homología de secuencia de una determinada cantidad, concretamente de al menos el 70%, como al menos el 80%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% de la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos a la que se hace referencia. Homología se refiere a la magnitud de identidad entre dos secuencias. Las secuencias homólogas tienen características iguales o similares, en particular, tienen propiedades iguales o similares a las de la secuencia identificada. Por ejemplo, el homólogo de la secuencia de 6B10 de Seq. ID. No. 2 tiene especificidad de unión igual o similar a la molécula de TOSO, como en el caso para la molécula de 6B10. Además, los homólogos incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican para el mismo péptido, pero pueden variar en su secuencia debido a la degeneración del código genético. Además, identidad se refiere a la presencia de moléculas de aminoácido o ácido nucleico idénticas en el orden descrito para la secuencia a la que se hace referencia. Es decir, en el caso de de una identidad de al menos el 90%, el 90% o más de las moléculas de ácido nucleico y aminoácido, respectivamente, son idénticas en las posiciones respectivas. A menos que se identifique de otro modo, los términos “homología” e “identidad” se usan en el presente documento de manera intercambiable. En
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una realización, el homólogo es un homólogo del péptido scFv de 6B10 de SEQ ID No. 2 que se une específicamente al mismo epítopo reconocido por el péptido scFv de 6B10 de SEQ ID No. 2.
Además, el término “modificado por ingeniería genética” se refiere a células que se han manipulado mediante ingeniería genética. Es decir, las células contienen una secuencia heteróloga que no se produce de manera natural en dichas células. Normalmente, la secuencia heteróloga se introduce por medio de un sistema de vector u otros medios para introducir moléculas de ácido nucleico en células incluyendo liposomas. La molécula de ácido nucleico heteróloga puede integrarse en el genoma de dichas células o puede estar presente de manera extracromosómica, por ejemplo en forma de plásmidos. El término también incluye realizaciones de introducir polipéptidos de CAR aislados, modificados por ingeniería genética, en la célula.
El término “inicia o aumenta una respuesta inmunitaria a células TOSO+” se refiere a realizaciones donde la respuesta inmunitaria del sujeto que recibe la terapia celular adoptiva contra esas células se inicia o aumenta, lo que puede determinarse basándose en la liberación de citocina o la citotoxicidad contra las células TOSO+.
Generalmente, los CAR son proteínas de fusión, que consisten en un dominio de reconocimiento extracelular de tipo anticuerpo fusionado a proteínas de señalización intracelulares de células T. Normalmente, el ectodominio que contiene la región de reconocimiento de antígeno comprende un péptido señal y una unidad de reconocimiento de antígeno. Según la presente invención, el ectodominio comprende un dominio de cadena sencilla anti-TOSO. Se prefiere que dicho dominio de cadena sencilla sea un dominio de cadena sencilla seleccionado de scFv de 6B10 de SEQ. ID. No. 2 o un homólogo del mismo que se une específicamente a TOSO que tiene una identidad de al menos el 70% con SEQ ID No. 2. Además, el dominio de cadena sencilla puede derivarse de otros anticuerpos anti-TOSO como los anticuerpos monoclonales anti-FAIM3, clon 1E4 de Abnova Corp., o clon OTI1E6 (inicialmente 1E6) (TA507395) de Origene Technologies, clon EPR3811 (TA307218) de OriGene Technologies, MAAG745 de Creative BioMart, clon 2F5 de Creative BioMart, AcM A36 y A38 tal como se describe en Nguyen XH, et al., Blood. 21 de julio de 2011;118(3):598-608. doi: 10.1182/blood-2043. Dichos anticuerpos tienen especificidad de unión similar a TOSO como en el caso para el anticuerpo 6B10, concretamente unión a TOSO.
El ectodominio puede estar separado del dominio transmembrana por la presencia de un dominio espaciador. Dicho dominio espaciador opcional une el dominio de unión a antígeno al dominio transmembrana y se prefiere que dicho dominio transmembrana sea lo suficientemente flexible como permitir que el dominio de unión a antígeno se oriente en diferentes direcciones para facilitar el reconocimiento de antígenos.
El dominio transmembrana es normalmente una hélice alfa hidrófoba que abarca la membrana. También pueden usarse otros dominios transmembrana. Finalmente, en endodominio representa el dominio de señalización en la parte citoplásmica del CAR.
Se ha reconocido que una célula T que contiene el CAR tal como se ha descrito, concretamente, contiene un CAR que del extremo N-terminal al extremo C-terminal tiene la siguiente composición: un dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-TOSO, opcionalmente, un dominio espaciador, un dominio transmembrana, un dominio citoplasmático que puede presentar actividad de respuesta inmunitaria de manera distintiva entre células cancerosas TOSO+ y células no cancerosas TOSO+. Por tanto, las células T de la presente invención superan los problemas conocidos en la técnica de efectos citotóxicos en ambos tipos de células, por ejemplo células B malignas de leucemia/linfoma y células B sanas, tal como se describe en la técnica.
En una realización de la presente invención, el CAR comprende una secuencia líder que está ubicada en posición N- terminal con respecto al dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-TOSO.
Además, en otra realización, el dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-TOSO es un péptido scFv de 6B10, en particular, de SEQ. ID. No. 2. Se ha reconocido en el presente documento que un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla anti-TOSO de la región variable (scFv), en particular, del anticuerpo 6B10, permite presentar la actividad deseada, concretamente, que sea tóxico para células cancerosas TOSO+.
En otra realización, el dominio espaciador de la molécula de CAR es un dominio bisagra-CH2CH3 de IgG1 o un homólogo del mismo que tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de SEQ. ID. No. 5, con ello, preferiblemente, el dominio espaciador es un dominio bisagra-CH2CH3 mutado de IgG1 según SEQ. ID. No. 5.
En algunas realizaciones, entre el dominio espaciador y el dominio transmembrana puede estar ubicado un ligador. Por ejemplo, en el CAR de Seq. ID. No. 4 está ubicado un ligador de 4 aminoácidos entre el dominio espaciador y el dominio transmembrana.
Además, otra realización se refiere a una célula T con un receptor de antígeno quimérico en la que el dominio transmembrana se deriva de la molécula de CD28, por ejemplo el dominio transmembrana de la molécula de CD28 que incluye un dominio intracelular corto que carece del dominio Ick, por ejemplo de SEQ. ID. No. 6
El dominio de señalización o endodominio o dominio intracelular que se usan en el presente documento de manera
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intercambiable, contiene una cadena de señalización de cadena gamma de receptor CD3 zeta o FcÉpsilon (receptor de IgE) y/o un dominio coestimulador. Por ejemplo, el dominio intracelular es un dominio de señalización de CD3 zeta de SEQ. ID. No. 7 o un homólogo del mismo que tiene una homología de al menos el 70%. En otra realización, el dominio intracelular es el dominio de señalización del receptor gamma Fc épsilon de SEQ. ID. No. 8 o un homólogo del mismo que tiene una identidad de al menos el 70%. El dominio de señalización es responsable de la activación de la actividad de respuesta inmunitaria en células T incluyendo la actividad citotóxica o secreción de interferón-gamma.
La molécula de CAR puede ser una denominada molécula de CAR de “segunda generación”. Las moléculas de CAR de segunda generación tienen dominios de señalización mejorados que contienen adicionalmente un segundo dominio de señalización coestimulador, por ejemplo derivado de CD28, CD134 (OX40) o CD137 (4-1BB). Las moléculas de CAR de “tercera generación” contienen un dominio de señalización coestimulador combinado, por ejemplo, CD28 combinado con CD137 o CD134.
Una visión general sobre las moléculas de CAR se proporciona, por ejemplo, en Gilham D.E. et al., Trends in Molecular Medicine, 2012, 18(7), 377-384.
En una realización preferida de la presente invención, la célula T es una célula T con un receptor de antígeno quimérico en la que el receptor de antígeno quimérico es un polipéptido de SEQ. ID. No. 3. Dicho CAR también se denomina en el presente documento como n.° 1389.
El CAR n.° 1389 anti-TOSO se expresa sobre la superficie de células T y está compuesto por partes extracelulares del fragmento de cadena sencilla de la región variable (scFv) del anticuerpo anti-TOSO 6B10 y el dominio CH2CH3 de IgG1 humana como espaciador entre scFv y el dominio transmembrana. En una realización de la invención, la modificación del dominio de IgG1 consiste en mutaciones puntuales para convertir la secuencia de aminoácidos de tipo natural PELLGGP X13 MISRT (Seq. ID. No. 9) en PPvA-GP X13 MIART (Seq. ID. No. 10) que reduce la unión no deseada del dominio Fc de CAR a receptores de Fc en otras células como células inmunitarias innatas que mediarían la activación no deseada y la activación de las células T modificadas con CAR. La parte proximal de membrana intracelular y transmembrana de CAR n.° 1389 se deriva de CD28 humano y se fusiona a la parte intracelular de CD3zeta humano. En una realización de la invención, la secuencia de CD28 se muta a P560 > A560, P563 > A563, P564 > A564 (Kofler et al., Mol. Ther. 19, 760 - 767 (2011). De ese modo, se destruye el sitio de unión de CD28 para la cinasa Ick con la consecuencia de que se impide la activación de la ruta de señalización de Ick y la secreción de IL-2 mediada por CAR posterior. Los modelos preclínicos implican que, en estas condiciones, se reduce la represión mediada por células Treg de las funciones efectoras de células T modificadas con CAR.
Tal como se demuestra en los ejemplo, las células T actúan de manera diferente en células TOSO+, concretamente, las células cancerosas TOSO+ se eliminan, mientras que las células no cancerosas TOSO+ permanecen vivas o se elimina un menor número en presencia de células T con CAR n.° 1389.
Como ejemplo, las células T que expresan el n.° 1389 no son tóxicas contra las células B TOSO+ humanas sanas, mientras que se eliminan las células de linfoma TOSO+.
Además, tal como se demuestra en el ejemplo, las células T que contienen el CAR n.° 1389 según la presente invención muestran menos actividad tóxica o ninguna hacia células B y T humanas sanas. No se produjo actividad autoinmunitaria significativa hacia células sanas autólogas y no se prevén efectos secundarios peores. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de la célula T con un receptor de antígeno quimérico según la presente invención en terapia celular adaptativa para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, el cáncer TOSO+ puede ser leucemia/linfoma derivado de células B o T, en particular leucemia linfocítica crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma anaplásico de células grandes, leucemia linfocítica aguda, linfoma cutáneo, micosis fungoide, enfermedades linfoproliferativas, mastocitosis sistémica, tumores malignos derivados de células madre, o células madre cancerosas u otros.
Es decir, sorprendentemente las células T con el receptor de antígeno quimérico según la presente invención permiten tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita sin dañar a las células TOSO+ no cancerosas presentes en el sujeto que va a tratarse. A diferencia de las observaciones anteriores con una variedad tremenda de CAR que tienen diferentes dominios de unión a antígeno, el dominio de anticuerpo anti-TOSO permite eliminar células TOSO+ malignas mientras que las células TOSO+ benignas no resultan afectadas o lo hacen menos.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al polipéptido de SEQ. ID. No. 4 que representa el polipéptido CAR indicado como n.° 1389 en el presente documento, o un homólogo del mismo que tiene una identidad de al menos el 90%, mediante lo cual dicho polipéptido o su homólogo, cuando se expresa en una célula T, es un receptor de antígeno quimérico que presenta un efecto tóxico sobre células cancerosas TOSO+, mientras que no es tóxico sobre células no cancerosas TOSO+. Por ejemplo, el polipéptido de Seq. ID. No. 4 está codificado por la secuencia de ácido nucleico de Seq. ID. No. 3.
El polipéptido está compuesto por el dominio de cadena sencilla scFv de 6B10 del anticuerpo anti-TOSO, un dominio
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espaciador que es un dominio bisagra-CH2CH3 de IgG1, un dominio transmembrana derivado de CD28, en particular, un dominio transmembrana derivado de CD28 que incluye un dominio intracelular proximal, y el dominio intracelular de CD3 zeta.
Además, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido según la presente invención. Además, se proporcionan vectores que comprenden la secuencia de ácido nucleico según la presente invención que codifican para el polipéptido tal como se describe. El experto conoce vectores y sistemas de vectores adecuados, en particular, vectores que permiten la transfección y transducción de células eucariotas, en particular, células T.
Además, la presente invención proporciona una célula, una línea celular o una célula huésped que contiene el vector según la presente invención o una molécula de ácido nucleico según la presente invención. Preferiblemente, dicha célula, línea celular o célula huésped es una célula T, por ejemplo, una célula T CD4+ o una célula T CD8+.
Además, la presente invención proporciona un kit o sistema que contiene el vector según la presente invención, la célula, la línea celular o la célula huésped según la presente invención, o el polipéptido según la presente invención o una molécula de ácido nucleico según la presente invención o mezclas de los mismos para su uso en la producción de células T que expresan el receptor de antígeno quimérico. El kit o sistema según la presente invención puede contener componentes adicionales incluyendo medios para introducir el vector o polipéptido en moléculas de ácido nucleico en las células. El experto conocerá medios adecuados para realizar esto.
La presente invención se describe adicionalmente por medio de ejemplos. Dichos ejemplos ilustran la invención adicionalmente sin limitar la misma a ellos.
Ejemplos
Preparación de las células T con CAR n.° 1389
Se produjo el vector retroviral que codifica para el CAR n.° 1389 usando una envoltura pseudotipada de Galv. En resumen, la producción de partículas de vector se realizó de manera transitoria en la línea celular 293T de riñón embrionario humano tras la transfección de ADN mediada por Polifect®. Se pseudotiparon las partículas de vector con Galv. No se determinó el título de vector.
Se realizó la transducción de linfocitos sanguíneos humanos según técnicas convencionales (Cheadle, E.J., et al., Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy. Capítulo 36, en: “Antibody engineering: methods and protocols”, 2a Edición, Ed. P. Chames, Met. Mol. Biol. 907, 645 -666 (2012), doi: 10.1007/978-1-61779-974-7_36). Se expresó el CAR n.° 1389 en células T humanas, tal como se midió en el día 2 mediante citometría de flujo usando un anticuerpo dirigido al dominio extracelular CH2 CH3 de IgG1 del CAR. Por motivos de comparación, se expresó el CAR anti-CD19 tal como se describe en Koehler, P., et al., Adv. Hematol., 2012, artículo ID 595060, doi: 10.1155/2012/595060, (2012) en células T humanas, tal como se mide mediante el mismo procedimiento.
Ejemplo 1: Actividad de células T modificadas con CAR n.° 1389 hacia tumor TOSO+ y células sanas
Células T modificadas por ingeniería genética con CAR n.° 1389
Se evaluó el injerto de células T periféricas humanas con el CAR n.° 1389 mediante citometría de flujo de dos colores 12 h tras la transducción. La figura 1B muestra un análisis de transferencia puntual de células T modificadas por ingeniería genética con CAR. El número de células T con expresión de CAR n.° 1389 fue del 37,5% de todas las células T (figura 1B).
Activación de células T mediante el CAR n.° 1389
Las células T modificadas por ingeniería genética con el CAR n.° 1389 se unen específicamente a células 293 que expresan TOSO y se activa, lo que se indica por la secreción aumentada de citocinas incluyendo IFN-y e IL-2, aumentando la proliferación y la citólisis de células diana TOSO+ (figura 1D). La activación de las células T modificadas con n.° 1389 es específica de antígeno tal como se define por la especificidad del CAR, puesto que las células TOSO-293 no desencadenan activación de células T.
Expresión de TOSO en células de leucemia y sanas.
Se registraron células B-CLL procedentes de pacientes con leucemia y células B procedentes de donantes sanos mediante citometría de flujo para TOSO usando el anticuerpo 6B10 (figura 2A, B). La tinción para CD5 y CD19 identificó las células B-CLL. El nivel de TOSO fue como promedio superior en células B-CLL de pacientes con leucemia que en células B de donantes sanos.
Toxicidad redirigida de células T con CAR n.° 1389 hacia células de leucemia B-CLL TOSO+ frente a células B
Claims (10)
10
2.
15
3.
20
4.
25
5.
30
6.
35
7.
40 8.
9.
45
10.
50
55 11.
60 12. 13.
65 14.
REIVINDICACIONES
Célula T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita, en la que el receptor de antígeno quimérico contiene al menos los siguientes dominios del extremo N-terminal al extremo C-terminal: i) un dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-TOSO, en particular, scFv de 6B10 de SEQ. ID. No. 2 o un homólogo del mismo que se une específicamente a TOSO que tiene una identidad de al menos el 70% con SEQ. ID. No. 2; ii) opcionalmente un dominio espaciador; iii) un dominio transmembrana; y iv) un dominio de señalización citoplásmico; caracterizada porque dicha célula T con el receptor de antígeno quimérico inicia o aumenta la respuesta inmunitaria a o es tóxica para células cancerosas TOSO+ en dicho sujeto.
Célula T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita según la reivindicación 1, que comprende además una secuencia líder que está ubicada en posición N-terminal con respecto al dominio de anticuerpo de cadena sencilla antiTOSO.
Célula T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que el dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-TOSO es el péptido scFv de 6B10 de SEQ ID No. 2.
Célula T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio espaciador es un dominio CH2CH3 de IgG1 o un homólogo del mismo que tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de Seq. ID. No. 5, preferiblemente, el dominio espaciador es un dominio CH2CH3 de IgG1 mutado según SEQ. ID. No. 5.
Célula T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio transmembrana se deriva de CD28.
Célula T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio intracelular contiene una cadena de señalización CD3zeta o FcepsilonRlgamma y/o un dominio coestimulador.
Célula T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio intracelular es el dominio de señalización CD28.
Célula T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el receptor de antígeno quimérico es un polipéptido de SEQ. ID. No. 4
Célula T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el cáncer es leucemia ToSo+ o linfoma TOSO+.
Célula T con un receptor de antígeno quimérico para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer TOSO+ en un sujeto que lo necesita según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el cáncer TOSO+ es una cualquiera de leucemia linfocítica crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma anaplásico de células grandes, leucemia linfocítica aguda, linfoma cutáneo, micosis fungoide, enfermedades linfoproliferativas, mastocitosis sistémica o tumores malignos derivados de células madre o células madre cancerosas.
Polipéptido de SEQ. ID. No. 4 o un homólogo del mismo que tiene una identidad de al menos el 90% con SEQ ID. No: 4 que contiene un dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-TOSO en el que dicho polipéptido cuando se expresa en una célula T como receptor de antígeno quimérico presenta un efecto tóxico sobre células cancerosas TOSO+.
Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido según la reivindicación 11.
Vector que comprende la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 12.
Célula aislada, línea celular o una célula huésped que contiene un vector según la reivindicación 13 o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12.
15. Kit o sistema que contiene un vector según la reivindicación 13, una célula, una línea celular o una célula huésped según la reivindicación 14, la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12 y/o el polipéptido según la reivindicación 11 para su uso en la producción de células T que expresan el receptor 5 de antígeno quimérico.
CAR antl-TOSO
Figura 1
CYT
lili CAR 0.1
A anu na
¿jum
(S»T
¿ílíH.S
tBIOacFv CHXH. CPÍ9 CD3Í
CDJ
■ oral» infle waifln
can scfv
a procema ce fusión
rrelerv’ante
células FOSO*
c ulula ií lOSÜ
células T050-
cé w as TOSO
c -•
i 10 100 0 1 1 10 1M
1 10 100 0.1 1 10
1OT1
60*
1 I
células afectaras ¡xlir]
CAft unli-TOSÜ V Sin CAR
Figura 2
célula de C i
célula B sana
células B-CLL células B sanas
TOSO
CD19 CD5
rRMC
oc oonante sano
CD5
CD19 I CD5
CD19
CD19 I CQ5
C019 'CD5 CD19/CD5 CD19 /CDS
n
AcM ant-TOSO-flTC
control üe isotipo
TOSO
FN-V [Pfl'nil] U IFN-v Ipgml]
autólogas
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