CN105331586B - 一种包含高效杀伤启动机制的肿瘤精准t细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫学和细胞生物学领域，涉及包含高效杀伤启动机制的肿瘤精准T细胞及其用途。具体地，本发明涉及一种对肿瘤细胞表面广谱表达膜抗原具有中等亲和力结合特性的嵌合抗原受体以及新一代的肿瘤精准T细胞，又称白泽T。中等亲和力结合特性的嵌合抗原受体作用下快速启动T细胞激活，该嵌合抗原受体激活信号将与肿瘤特异性T细胞中天然识别肿瘤抗原的TCR信号叠加，激活肿瘤特异性T细胞在肿瘤微环境中增殖、生长，并通过肿瘤抗原特异性TCR精准杀灭肿瘤细胞。本发明的肿瘤精准T细胞具有良好的抗肿瘤应用前景。

Description

一种包含高效杀伤启动机制的肿瘤精准T细胞及其用途

技术领域

本发明属于免疫学和细胞生物学领域，涉及包含高效杀伤启动机制的肿瘤精准T细胞及其用途。具体地，涉及一种T细胞治疗技术，特别地该技术以肿瘤特异性T细胞为对象，通过转基因修饰方法转入可快速启动并增强T细胞杀伤功能的元件，例如识别肿瘤细胞广谱表达、具有中等亲和力的嵌合抗原受体基因。本发明还涉及获得的T细胞用于治疗恶性肿瘤的用途。

背景技术

近年来，肿瘤免疫治疗取得重大突破。利用嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptors,CAR)修饰的T细胞(简称CAR-T)治疗复发难治性B细胞白血病，有效率达到90％；利用PD-1抗体单药治疗多种类型恶性肿瘤，有效率达到10-30％。事实上，这两种方法最终发挥作用的均是肿瘤特异性T细胞(Tumor-specific Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)，其中前者是在患者自体初始T细胞基础上，通过体外转基因修饰的方法实现；而后者是通过原位重新激活患者体内残留的肿瘤特异性T细胞的方法实现。因而，肿瘤免疫治疗成功的关键是如何更好的发挥肿瘤特异性T细胞的功能。

T细胞活化需要两个信号的刺激。其中，T细胞表面TCR-CD3复合体与抗原提呈细胞(例如树突状细胞，Dendritic cells，DC)表面抗原肽-MHC分子复合物结合，提供T细胞活化的第一信号。活化后的T细胞能特异识别具有相同表面抗原肽-MHC分子复合物的靶细胞，发挥杀伤作用。但肿瘤细胞第一信号刺激源(如MHC分子)缺乏或表达下降，无法有效提供T细胞活化相关的信号，从而激活T细胞免疫反应。尽管有研究表明，活化的T细胞能分泌IFNγ及TNFα，该两分子一方面能诱使肿瘤细胞MHC分子的表达上调，使其重新恢复免疫原性，被T细胞有效识别与攻击；但另一方面，IFNγ及TNFα也可诱导肿瘤细胞上调PDL1分子的表达，结合到T细胞表面PD1上，促使T细胞失活，从而逃逸T细胞的攻击。所以，这一过程需要最初参与的肿瘤特异性T细胞具有足够数量，才能产生一开始就大量IFNγ及TNFα，高效启动T细胞的杀伤作用，并通过正反馈作用(T细胞在首轮杀灭相应肿瘤细胞时，释放IFNγ及TNFα使其它肿瘤细胞更易被T细胞识别；更多肿瘤细胞可被识别后，T细胞接受的刺激放大，可以在杀伤过程中分泌更多的IFNγ及TNFα)；而且，该杀伤作用必需启动迅速，在肿瘤细胞通过上调PDL1表达形成免疫逃逸机制前，完成杀伤作用。

遗憾的是，肿瘤组织具有高度的异质性，不同肿瘤患者、同一肿瘤患者不同病灶、乃至同一病灶不同肿瘤细胞均可能具有不同的分子特征。针对单一靶点的肿瘤特异性T细胞在遇到异质性肿瘤细胞群后，由于表达该靶点的肿瘤细胞局限在一定比例，T细胞难以接受足够的刺激，启动前述的正反馈杀伤；而针对多个靶标的肿瘤特异性T细胞群，虽然整体上能更有效的识别异质性肿瘤细胞群，但由于体外培养条件的限制，T细胞群中每种针对特定靶点的T细胞的数量相对有限，客观上难以启动对MHC分子下调的肿瘤细胞的正反馈杀伤作用。综上所述，肿瘤特异性T细胞的高效启动杀伤异质性、MHC分子下调的肿瘤细胞仍是个难题。

T细胞活化的第二信号，也称作共刺激信号，由T细胞表面的共刺激分子(如CD28、CD137、CD134等)与抗原提呈细胞相应配体(如B7、CD137L、CD134L等)结合来提供，能增强T细胞的增殖与存活能力。然而，肿瘤细胞一般不具有提供T细胞第二信号的刺激源，而在肿瘤部位具有正常功能的抗原提呈细胞的数量又有限，所以T细胞第二信号的刺激源整体匮乏。更加不利的是，肿瘤细胞及其基质细胞还能通过分泌一些抑制免疫的因子(如TGFβ、VEGF、IDO)或通过直接接触(如上调肿瘤表面PDL-1，结合到T细胞表面PD-1上，诱导T细胞凋亡)，使T细胞失活。所以，也亟需为活化的T细胞提供第二信号的支撑，使其更好的发挥作用，延长体内存活时间。

嵌合抗原受体CAR由一个识别肿瘤细胞表面抗原的单链抗体(scFv，由抗体V_L区氨基酸序列和V_H区氨基酸序列经Linker连接而成)，通过铰链结构与跨膜、胞内信号结构连接构成。表达CAR的T细胞可识别肿瘤细胞表面抗原，通过非MHC限制性途径与抗原反应，使肿瘤细胞无法通过下调MHC分子形成免疫逃逸。此外，与常规的TCR只能针对的蛋白抗原相比，CAR并不局限于蛋白抗原，还包括糖类和糖脂类TAA，而这些抗原不像蛋白抗原那么容易突变(Curr Opin Immunol 2009；21:215-23；Blood 2010；116:1035-44；Cancer Res 2011；71:3175-81；J Cancer 2011；2:378-82)。自1989年，由Eshhar和其同事首次提出CAR的概念以来，其已经历了三个不同的发展阶段。第一代CAR受体，包含胞外特异识别肿瘤抗原的scFv片段，胞内激活信号由CD3ζ或FcεRIγ的ITAM(immunoreceptor tyrosine-basedactivation motifs)信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二代CAR受体在第一代CAR的基础上增加了一个共刺激信号分子的胞内结构域，提供T细胞活化的两种信号，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，lymphocyte-specific protein tyrosine kinase(LCK)，inducible T-cell co-stimulator(ICOS)以及DNAX-activation protein 10(DAP10)等结构域，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-γ以及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AICD(activation induced cell death,AICD)。第三代CAR受体，在第二代CAR的基础上，增加了另外一种共刺激信号分子的胞内结构域，如在共刺激结构CD28和ITAM信号链的之间再融合一个二级共刺激分子如4-1BB，产生一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。但随之给临床治疗带来了一定风险，因为第二代与第三代CAR修饰后T细胞会针对某些少量表达肿瘤相关抗原的正常组织产生超强的反应，呈“瀑布”式过量增加，造成对正常组织的过激免疫反应。目前已有两个注射CAR修饰后的T细胞而导致死亡的病例报道。其一例应用第三代CAR(针对Her2)，患者由于急性肺水肿而死亡，其原因是CAR⁺的T细胞误攻击低表达Her2的肺上皮细胞(Mol Ther 2010；18:843-51)；另一例应用第二代CAR(针对CD19)，死亡原因复杂，但伴随着血液中细胞因子水平的增高(Hum Gene Ther 2010；21:1039-42；Mol Ther 2010；18:666-8)。为解决这一安全性隐患，研究者将HSV-TK、△Fas、iCasp9、CD20-Rituximab等自杀系统引入T细胞的CAR修饰，发挥刹车作用，避免T细胞过量增殖(J Cancer 2011；2:378-82；N Engl J Med 2011；365:1673-83)。然而，CAR⁺的T细胞脱靶引发的“瀑布”效应速度非常快，这些自杀系统未必能及时发挥作用。另一种方法是减少CAR⁺的T细胞回输数量，这种方案随之使治疗疗效下降。所以，亦亟需引进新的分子刹车系统，提高CAR-T细胞治疗的安全性。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，制备了对肿瘤细胞表面广谱表达膜抗原具有中等亲和力结合特性的嵌合抗原受体基因。在肿瘤特异性T细胞(具有识别肿瘤抗原的TCR基因)的基础上，通过转基因修饰方法导入对肿瘤细胞表面广谱表达膜抗原具有中等亲和力结合特性的嵌合抗原受体基因。由此制备了新一代的肿瘤精准T细胞，又称白泽T。白泽T可在中等亲和力结合特性的嵌合抗原受体作用下快速启动T细胞激活，该嵌合抗原受体激活信号将与肿瘤特异性T细胞中天然识别肿瘤抗原的TCR信号叠加，激活肿瘤特异性T细胞在肿瘤微环境中增殖、生长，并通过肿瘤抗原特异性TCR精准杀灭肿瘤细胞；同时中等亲和力结合的嵌合抗原受体也可直接对高表达肿瘤膜蛋白的肿瘤细胞进行杀伤，其释放出干扰素γ及肿瘤坏死因子α，使异质性肿瘤细胞的MHC上调并提呈出肿瘤抗原，使白泽T更容易识别这些异质性肿瘤细胞,从而对其精准杀灭。白泽T通过肿瘤特异性TCR与嵌合抗原受体第一及第二信号作用下形成记忆T细胞的表型，可在体内发挥长效作用，同时也避免传统CAR-T细胞中的TCR引起的非肿瘤杀伤能力。其刹车开关也将进一步提高其安全性。

由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种T细胞，其包含

(1)具有识别肿瘤抗原的TCR基因，以及

(2)嵌合抗原受体基因；

其中，所述嵌合抗原受体，依次包含信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽、铰链区、跨膜区和胞内信号区，

所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达膜抗原，所述嵌合抗原受体插入有抗原表位，插入的位置选自如下3个位置中的任意1个、2个或3个：

信号肽与结合肿瘤细胞膜抗原的多肽之间，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽内部，以及结合肿瘤细胞膜抗原的多肽和铰链区之间；

所插入的抗原表位为单拷贝或者多拷贝(例如2、3、4或5个拷贝)；当所述位置大于1个时，不同位置的抗原表位相同或者不同；

优选地，所述抗原表位不是所述肿瘤细胞膜抗原的表位。

上述“结合”包括但不限于：抗原与抗体的特异性结合，以及配体与受体的结合。

优选地，其中所述的能够结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原的多肽能够同时和两种或多种上述膜抗原结合，使得本发明的嵌合抗原受体能够接受异质性肿瘤细胞群体的信号刺激，以延长免疫反应细胞的效应时间。

根据本发明任一项所述T细胞，其中，肿瘤细胞广泛表达膜抗原选自如下的任意一种或者多种：

EGFR、EGFRvIII、ERBB2、ERBB3、ERBB4、MSLN、MUC1、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、CD44和IGFR1。

根据本发明任一项所述T细胞，所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肽为天然多肽或人工合成多肽，

优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段

优选地，天然多肽为人类Her2基因第8个内含子Herin编码的氨基酸序列HERIN；优选地，为SEQ ID NO:5。

根据本发明任一项所述T细胞，其中，所述抗原表位为可被美罗华抗体识别的CD20抗原表位；优选地，其氨基酸序列如为SEQ ID NO:4所示。

根据本发明任一项所述T细胞，其中所述嵌合抗原受体还包括如下的(1)-(5)项中的任意一项或者多项：

(1)所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

(2)所述铰链区选自CD8的胞外铰链区、CD28的胞外铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种；优选地为CD8的胞外铰链区；优选地，所述CD8的胞外铰链区如SEQ ID NO:7所示；

(3)所述跨膜区选自CD8的跨膜区、CD28的跨膜区和CD4的跨膜区的任意一种或多种；优选地，为CD8跨膜区；优选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

(4)所述胞内信号区选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS、DAP10、CD3ζ和FcεRIγ任意一种或多种的胞内信号区，优选为4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区，或者CD28胞内信号区和CD3ζ胞内信号区；优选地，所述4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；优选地，所述CD28胞内信号区和CD3ζ胞内信号区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:10所示；

(5)所述抗原表位与结合肿瘤细胞膜抗原的多肽直接相连或者通过蛋白linker相连；优选地，所述蛋白linker为至少2个甘氨酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个甘氨酸。

AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI(SEQ IDNO:7)

YIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:8)

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:9)

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:10)

PFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:11)

根据本发明任一项所述的T细胞，其中所述嵌合抗原受体由信号肽、CD20抗原表位、人类Her2基因第8个内含子Herin编码的氨基酸序列HERIN、CD20抗原表位、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激肽段依次此构成；优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

根据本发明任一项所述的T细胞，其中，所述肿瘤抗原为肿瘤相关抗原和/或肿瘤特异性抗原；

优选地，所述肿瘤相关抗原选自如下的任意一种或者多种：

NY-ESO-1(又称CTAG1B，cancer/testis antigen 1B)、gp100(PMELpremelanosome protein)、MART-1(又称melan-A)、GD₂(又称B4GALNT1，beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 1)、MUC1(mucin 1,cell surface associated)、MAGE(Melanoma-associated antigen E1)家族蛋白、BAGE(B melanoma antigen family)家族蛋白、GAGE(growth hormone releasing factor)家族蛋白、P53、hTERT、Wnt、Oct4、EGF、muP53、HRas、KRas、P16、HGM、survivin、C-myc、SSX2、PSMA(Prostate-specificmembrane antigen)、CEA、CA9(carbonic anhydrase IX)、FR(Flavin reductase)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、AFP(alpha-fetoprotein)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD₃(又称ST8SIA1，ST8alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 1)、PSCA(prostate stem cellantigen)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，kallikrein-related peptidase 3)、HMGA2、fetal acetylcholine receptor、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(mesothelin)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB2、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16,mucin 16,cell surfaceassociated)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、GPC3(glypican-3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，vitamin D(1,25-dihydroxyvitamin D3)receptor)、β2-MG(beta-2-microglobulin)和PROGRP(GRPgastrin-releasing peptide)；

优选地，所述肿瘤特异性抗原选自肿瘤细胞由基因变异导致的氨基酸改变所形成的新抗原。

所述肿瘤相关抗原，在肿瘤细胞中异常高水平表达，而在正常组织细胞中表达量较低。所述肿瘤特异性抗原，由肿瘤相关考验基因变异产生(导致了氨基酸发生变异)，而正常组织细胞中不存在。

根据本发明任一项所述的T细胞，其为表达嵌合抗原受体基因的肿瘤浸润淋巴细胞；优选地，所述肿瘤选自如下的任意一种或者多种：

肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌。

不拘于理论的限制，另外，由于CAR-T只能识别细胞表面抗原，选择范围较窄。而肿瘤细胞，尤其是实体瘤细胞由基因变异产生的新抗原主要为胞内抗原，其与正常细胞的表面抗原差异主要表现在表达量上，应用高亲和力的CAR靶向肿瘤细胞膜抗原可导致严重的安全性风险(Mol Ther 2010；18:843-51)。因而，本发明人研究发现，为提高CAR-T细胞对异质性肿瘤细胞的疗效与安全性，以中等亲和力(减少对少量表达相应抗原的正常细胞的毒性)结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原(提供更广的杀伤谱)的CAR是个理想选择；而为使CAR-T细胞能特异识别肿瘤细胞胞内抗原，亟需协同发挥T细胞TCR介导的杀伤作用。

本发明的再一方面涉及一种T细胞的基因修饰方法。即通过将表达嵌合抗原受体的载体导入免疫反应细胞，使嵌合抗原受体得以表达，来对细胞进行遗传修饰。

所述基因修饰方法选自本领域常用的方法，例如基因枪法、转染法、电转法、病毒转导法中的一种。本发明的一个实施方案中，所述方法为电转法。

所述的基因修饰载体选自转座子质粒、重组病毒；所述重组病毒例如可以为重组逆病毒、重组慢病毒，本发明的一个实施方案中，所述载体为转座子质粒。

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含上面任一项所述的T细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。

本发明的另一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明的药物组合物，以及至少一种抗体，所述抗体能够特异性地识别所述抗原表位；优选地，所述抗体为美罗华抗体。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的T细胞在制备治疗和/或预防和/辅助治疗恶性肿瘤的药物中的用途；优选地，所述恶性肿瘤选自如下的任意一种或者多种：

肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌。

本发明的再一方面涉及一种治疗和和/或预防和/辅助治疗恶性肿瘤的方法，包括给予受试者有效量的本发明中任一项所述的T细胞的步骤；优选地，所述恶性肿瘤选自如下的任意一种或者多种：

肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌。

本发明中，

术语“嵌合抗原受体”是人工改造受体，能够将识别肿瘤抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。

术语“T细胞活化所需的第一信号与第二信号”(T细胞活化相关信号)是指与T细胞活化所需要两个信号，即T细胞表面TCR-CD3复合体与抗原肽-MHC分子结合，提供T细胞活化的第一信号，决定T细胞的杀伤特异性；T细胞表面的共刺激分子(如CD28)与相应配体(如B7)结合，提供T细胞活化的第二信号，促进T细胞活化、增殖与存活。

术语“抗原表位”，又称抗原决定簇(antigenic determinant，AD)，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。一般情况下，一个多肽表位含5～6个氨基酸残基抗原表位，可被特定的抗体所识别。抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。而根据抗原表位的氨基酸连续性的不同，可以分为线性表位与空间表位，线性表位是一段序列相邻的氨基酸组成的表位，而空间表位是数个不相邻，但在空间结构上相邻的氨基酸组成的表位。

术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。“特异性识别”具有类似的含义。

术语“免疫受体酪氨酸活化基序”(immunoreceptor tyrosine-based activationmotifs，ITAM)是指免疫细胞活化相关受体(如BCR/Igα/Igβ，TCR/CD3、FcαR和FcRγ等)胞浆区所共有的以酪氨酸残基(tyrosine,Y)为基础的氨基酸序列基序，其特征为:两个酪氨酸残基被大约13外其它氨酸残基隔开(…YXX[L/V]X 7-11YXX[L/V]…)，其中酪氨酸是蛋白激酶磷酸化位点，被磷酸化后能够与信号转导途径下游的信号分子结合，导致细胞的活化。

术语“共刺激信号分子”(Co-stimulating molecule)是指免疫细胞表面的一些粘附分子，如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等，通过与其配体结合，激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。

术语“肿瘤特异性抗原”(tumor specific antigen,TSA)是肿瘤细胞特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原，这些抗原通常由肿瘤细胞经过基因变异(如基因点突变、基因缺失、基因移位、基因融合)等产生，又称肿瘤新抗原(neo-antigen)。

术语“肿瘤相关抗原”(tumor-associated antigen,TAA)是指非肿瘤细胞所特有的、正常细胞和其他组织上也存在的抗原，只是其含量在细胞癌变时明显增高的抗原。

术语“亲和力”是指两个大分子之间的相互作用力，可以用亲和力常数Kd来量化。在该发明中，CAR基因与细胞表面抗原的亲和力介于5×10^-8M～1×10^-9M，可定义为中等亲和力。

术语“EGFR”是指人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor)，又简称为ERBB1或HER1，其家族成员包括EGFR、ERBB2(HER2)、ERBB3(HER3)、ERBB4(HER4)。

术语“Herin”是指人类Her2的第8个内含子中编码Herstatin的C末端79个氨基酸的DNA序列，所述HERIN是人类Her2的第8个内含子中编码Herstatin的C末端79个氨基酸序列，其可以和EGFR家族成员(包括EGFR、ERBB2、ERBB4)以及EGFR突变体EGFRvIII结合。

术语“Linker”或“铰链/铰链区”是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。

术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

发明的有益效果

本发明在具有识别肿瘤抗原TCR基因的肿瘤特异性T细胞基础上，转入具有中等亲和力、靶向肿瘤细胞广谱表达细胞表面抗原的嵌合抗原受体基因。修饰成功的T细胞具有如有益处：

1)中等亲和力结合特性的嵌合抗原受体作用下快速启动T细胞激活，该嵌合抗原受体激活信号将与肿瘤特异性T细胞中天然识别肿瘤抗原的TCR信号叠加，激活肿瘤特异性T细胞在肿瘤微环境中增殖、生长，并通过肿瘤抗原特异性TCR精准杀灭肿瘤细胞；

2)即使遇到MHC分子下调的异质性肿瘤细胞群后，仍能高效启动杀伤，中等亲和力结合的嵌合抗原受体也可直接对高表达肿瘤膜蛋白的肿瘤细胞进行杀伤，其释放出干扰素γ及肿瘤坏死因子α，使异质性肿瘤细胞的MHC上调并提呈出肿瘤抗原，使白泽T更容易识别这些异质性肿瘤细胞,从而对其精准杀灭；

3)可以协同发挥嵌合抗原受体(只可识别肿瘤细胞表面抗原，但以非MHC限制性方式杀伤)介导与TCR介导(也可识别肿瘤胞内抗原，但具有MHC限制性)的杀伤作用，增强抗肿瘤疗效；

3)可以形成更高比例的转化为效应记忆性T细胞，延长肿瘤特异性T细胞在体内的存活时间；

4)TCR基因与嵌合抗原受体基因均具有肿瘤特异性，降低对正常组织的毒副作用；

5)携带分子刹车系统，可将回输的T细胞的杀伤作用及时关闭，进一步提高治疗的安全性。

附图说明

图1.HerinCAR的结构模式图；

图2.HerinCAR的表达载体图；

图3.Bz-T细胞的表型检测图。3A-3D，活化T细胞的表型；3E-3F，效应记忆T细胞表型；3G-3H，调节性T细胞表型。

图4.Bz-T细胞的体外杀伤作用检测图；自下而上的曲线分别代表效靶比(效应细胞相对于靶细胞的比值)为16:1、8:1、4:1、2:1的杀伤曲线。图4A至4M所用细胞依次为卵巢癌细胞株HO-8910、胃癌细胞株BGC-828、HGC-27、MKN45、结直肠癌癌细胞株SW480、胰腺癌细胞株PANC-1、肺癌细胞株H446、肺癌细胞株A549、胆囊癌细胞株GBC-SD、胆管癌细胞株EH-GB1、胶质瘤细胞株LuxL-1、骨肉瘤细胞株U-2OS、正常肾胚细胞株HEK293。

图5.Bz-T细胞的体内杀伤作用检测图。

图6.Bz-T细胞的体内清除检测图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：CAR表达框的合成与表达载体的构建

根据herinCAR的组成结构(模式图见图1)，拼接成整个融合的氨基酸序列与编码DNA表达框:

herinCAR的氨基酸残基序列为：

GGGGGGGGG

GGGGGGGGG

FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:1)。

其中加虚线下划线的为信号肽(MALPVTALLLPLALLLHAARPS，SEQ ID NO:3)，加波浪下划线的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位(NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSI，SEQID NO:4)，加单下划线的linker序列。加粗的为HERIN(GTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEG，SEQ ID NO:5)

herinCAR的核苷酸编码序列为：

GCCACC

GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGT

GTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGT

TTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA

(SEQ ID NO:2)

其中加虚线下划线的为信号肽编码序列，加波浪下划线的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位的编码序列，加单下划线的linker的编码序列。加粗的为HERIN。

按SEQ ID NO:2的DNA编码序列，委托上海杰瑞生物科技有限公司全基因合成，插入pNB328载体EcoRI-SalI位点，转化到E.coli(Top10,购自invitrogen公司)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒，即pNB328-herinCAR质粒(载体图谱见图2)。

其中，pNB328载体按如下序列委托上海杰瑞生物科技有限公司全基因合成:

实施例2：胆管癌组织来源TIL的分离培养

收集新切除的胆管癌标本，立即在无菌条件下进行处理。具体方法如下：去除胆管癌标本周围的正常组织和坏死区域，从标本的不同区域取下大小为1-2mm³的小组织块，24孔板的每一孔放置一块。每孔加2mL完全培养基(含10％FBS的GT-T551培养基)和3000IU/mL的IL-2。将24孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。培养起始后的第5-6天为所有孔进行半量换液。之后，根据肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)生长情况，每隔1-2天进行一次半量换液。一旦孔内TIL长满，且所有贴壁细胞已除去，就将各个长满孔内的TIL收集起来。

随后，1×10⁶TIL重悬于含150mL完全培养基、30ng/mL抗CD3抗体、不少于200倍于TIL的照射过的饲养细胞(来自3个不同健康人的PBMC)和6000IU/mL IL-2的T175培养瓶中，将培养瓶竖直培养。培养至第5天，瓶内65％液体换为新的完全培养基和IL-2。培养至第7天，2个T175培养瓶内的细胞悬液转移至细胞培养袋内，加入300mL完全培养基和IL-2。从第6天开始，每隔1天进行一次台盼蓝染色计数，通过加入新的完全培养基和IL-2控制细胞密度至0.5-2×10⁶/mL。

实施例3：TIL细胞的遗传修饰

收集1×10⁷TIL细胞(实施例2制备)，通过Lonza 2b-Nucleofector仪器，将6μgpNB328-herinCAR质粒(实施例1制备)转染到细胞核中，置37℃、5％CO₂孵箱培养；6小时后转移到含30ng/mL抗CD3抗体、3000IU/mL IL-2(购自Novoprotein公司)的6孔板中，置37℃、5％CO₂孵箱培养。待细胞长满后，按1:5的比例传代培养。即得包含herinCAR的TIL细胞，简称Bz-T细胞，用于下面的实施例4－7。

实施例4：Bz-T细胞的表型鉴定

收集1×10⁶Bz-T细胞，利用流式细胞仪检测细胞的表型(抗体均购自BD公司)，包括活化T表型，CD28⁺、CD137⁺、CD134⁺、PD1⁺；效应记忆T细胞表型，CD45RO⁺CCR7^-CD62L^low；调节性T细胞(Treg细胞，起抑制免疫作用)表型，CD4⁺CD25⁺CD127^-。结果显示，获得的Bz-T细胞具有高比例的活化T表型(图3A-3D)，高比例的效应记忆T细胞表型(图3E-3F)；几乎无调节性T细胞(图3G-3H)。

实施例5：Bz-T细胞的体外杀伤活性鉴定

在RTCA细胞增殖板(购自美国ACEA Biosciences公司)上按10000个/孔的比例铺卵巢癌细胞株HO-8910，胃癌细胞株BGC-828、HGC-27与MKN45，结直肠癌癌细胞株SW480，胰腺癌细胞株PANC-1，肺癌细胞株H446与A549，胆囊癌细胞株GBC-SD、胆管癌细胞株EH-GB1、胶质瘤细胞株LuxL-1，骨肉瘤细胞株U-2OS、正常肾胚细胞株HEK293(EH-GB1的构建参照转移灶的人胆囊癌细胞系EH-GB1的建立及鉴定，中华肿瘤杂志.2010；2:84-7，其余细胞株购自美国标准生物品收藏中心，ATCC)，置于xCELLigence RTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪上，实时记录细胞的生长情况(以测得的细胞指数，Cell index来反映，数值越高表明细胞状态越佳)。24小时后，分别按16:1、8:1、4:1、2:1的效靶比，加入Bz-T细胞，重新置于xCELLigence RTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪上进行细胞生长情况检测。

结果如图4A-图4M所示。Bz-T细胞对各种恶性肿瘤细胞株均具有良好的杀伤作用(见图4A-4L)，杀伤效率存在明显的量效关系(效靶比越高，杀伤作用越强)；杀伤作用非常快速(在加入Bz-T细胞后，肿瘤细胞被快速杀伤)。反之，Bz-T细胞对正常细胞HEK293细胞基本不杀伤(见图4M)。

以上结果表明，Bz-T对异质性肿瘤细胞具有高效、快速的杀伤能力，而对正常细胞的毒性较小。

实施例6：Bz-T细胞的体内杀伤活性鉴定

在NOD-SCID小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)中皮下注射5×10⁶的EH-GB1恶性胆管癌细胞，10天后经尾静脉分别注射Bz-T细胞、TIL细胞(实施例2制备)(注射剂量2×10⁵)或PBS缓冲液，测定移植瘤的生长状况。

结果表明，相对于对照组，Bz-T细胞对胆管癌的抑制作用具有显著差异(图5)。可见，Bz-T细胞在体内具有良好的抗肿瘤作用。

实施例7：Bz-T细胞的体内清除试验(分子刹车功能的验证)

在BABL/c裸鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)尾静脉注射Bz-T细胞(注射剂量5×10⁶)，3天后静脉注射100μg的美罗华抗体或人IgG对照抗体。12个小时后，采集血液及骨髓样品，用流式细胞仪检测Bz-T细胞的比例(CD20与CD3双阳性细胞)。

结果表明，相对于注射人IgG抗体的对照组，在注射美罗华抗体后，输注的Bz-T细胞在血液与骨髓中的比例显著降低(图6)。可见，CD20分子刹车在体内能有效发挥作用，可以通过ADCC及CDC效应将含有CD20表位的Bz-T细胞清除。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (28)

1.一种T细胞，其包含

1)编码识别肿瘤抗原的TCR的基因，以及

2)嵌合抗原受体基因；

其中，所述嵌合抗原受体，依次包含信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽、铰链区、跨膜区和胞内信号区，

所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达膜抗原，

所述嵌合抗原受体插入有抗原表位，插入的位置如下：

信号肽与结合肿瘤细胞膜抗原的多肽之间，以及结合肿瘤细胞膜抗原的多肽和铰链区之间；

所插入的抗原表位为单拷贝；

其中，

所述肿瘤细胞广泛表达膜抗原选自如下的任意一种或者多种：EGFR、EGFRvIII、ERBB2、ERBB3、ERBB4、MSLN、MUC1、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、CD44和IGFR1；

所述抗原表位为可被美罗华抗体识别的CD20抗原表位；

并且所述嵌合抗原受体包含如下的(1)-(5)项：

(1)所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

(2)所述铰链区选自CD8的胞外铰链区、CD28的胞外铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种；

(3)所述跨膜区选自CD8的跨膜区、CD28的跨膜区和CD4的跨膜区的任意一种或多种；

(4)所述胞内信号区选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS、DAP10、CD3ζ和FcεRIγ任意一种或多种的胞内信号区；

(5)所述抗原表位与结合肿瘤细胞膜抗原的多肽直接相连或者通过蛋白linker相连。

2.根据权利要求1所述的T细胞，其中所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肽为天然多肽或人工合成多肽。

3.根据权利要求2所述的T细胞，其中，所述人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。

4.根据权利要求2所述的T细胞，其中，所述天然多肽为人类Her2基因第8个内含子Herin编码的氨基酸序列HERIN。

5.根据权利要求2所述的T细胞，其中，所述天然多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

6.根据权利要求1所述的T细胞，其中，所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

7.根据权利要求1所述的T细胞，其中，第(2)项中，所述铰链区为CD8的胞外铰链区。

8.根据权利要求1所述的T细胞，其中，第(2)项中，所述CD8的胞外铰链区如SEQ ID NO:7所示。

9.根据权利要求1所述的T细胞，其中，第(3)项中，所述跨膜区为CD8跨膜区。

10.根据权利要求1所述的T细胞，其中，第(3)项中，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQID NO:8所示。

11.根据权利要求1所述的T细胞，其中，第(4)项中，所述胞内信号区为4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区，或者CD28胞内信号区和CD3ζ胞内信号区。

12.根据权利要求11所述的T细胞，其中，所述4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

13.根据权利要求11所述的T细胞，其中，所述CD28胞内信号区和CD3ζ胞内信号区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:10所示。

14.根据权利要求1所述的T细胞，其中，第(5)项中，所述蛋白linker为至少2个甘氨酸。

15.根据权利要求1所述的T细胞，其中，第(5)项中，所 述蛋白linker为2、3、4、5、6、7、8、9或10个甘氨酸。

16.根据权利要求1所述的T细胞，所述的嵌合抗原受体由信号肽、CD20抗原表位、人类Her2基因第8个内含子Herin编码的氨基酸序列HERIN、CD20抗原表位、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激肽段依次构成。

17.根据权利要求16所述的T细胞，其中，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

18.根据权利要求1所述的T细胞，其中，所述肿瘤抗原为肿瘤相关抗原和/或肿瘤特异性抗原。

19.根据权利要求18所述的T细胞，其中，所述肿瘤相关抗原选自如下的任意一种或者多种：

NY-ESO-1、MART-1、GD₂、MUC1、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、P53、hTERT、Wnt、Oct4、EGF、muP53、HRas、KRas、P16、HGM、survivin、C-myc、SSX2、PSMA、CEA、CA9、FR、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、AFP、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD₃、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、fetal acetylcholinereceptor、LeY、EpCAM、MSLN、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB2、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、GPC3、AFU、EBV-VCA、POA、β2-MG和PROGRP。

20.根据权利要求18所述的T细胞，其中，所述肿瘤特异性抗原选自肿瘤细胞由基因变异导致的氨基酸改变所形成的新抗原。

21.根据权利要求1所述的T细胞，所述T细胞为表达嵌合抗原受体基因的肿瘤浸润淋巴细胞。

22.根据权利要求21所述的T细胞，其中，所述肿瘤浸润淋巴细胞选自如下的任意一种或者多种肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞：

肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌。

23.一种药物组合物，其包含权利要求1至22中任一权利要求所述的T细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。

24.一种试剂盒，其包含权利要求23所述的药物组合物，以及至少一种抗体，所述抗体能够特异性地识别所述抗原表位。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中，所述抗体为美罗华抗体。

26.权利要求1至22中任一权利要求所述的T细胞在制备治疗和/或预防恶性肿瘤的药物中的用途。

27.根据权利要求26所述的用途，其中，所述恶性肿瘤选自如下的任意一种或者多种：

肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌。

28.根据权利要求26或27所述的用途，其中，所述治疗为辅助治疗。

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