CN110448689A - mRNA疫苗及其试剂盒、应用 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明涉及mRNA疫苗及其试剂盒、应用，mRNA疫苗由隔开的Kras的表位抗原基因序列，和Survivin的表位抗原基因序列，和CEA的表位抗原序列制备得到，试剂盒中包括本发明的mRNA疫苗，和PD‑1抗体。本发明的抗体可以用于制备诸如直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、肾癌、白血病、肺癌、白淋巴瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、浆细胞瘤和前列腺癌的药物。本发明首次把KRas、Survivin和CEA这3个“不可成药”靶点的表位抗原联合在一起制备出mRNA疫苗，达到抑制肿瘤生长的目的。
Description
技术领域
本发明涉及mRNA疫苗及其试剂盒、应用。
背景技术
癌症治疗领域尝试许多方法，如肿瘤切除，但切掉之后很快就复发；放化疗法可以把长得快的癌症细胞杀死，但肿瘤也会重新长出来；小分子靶向药物和大分子靶向药物治疗癌症，发生耐药性问题；CAR-T作为一种新的治疗癌症手段，主要在治疗血癌患者中有效；PD-1和PD-L1抗体药物的出现代表免疫治疗的开始，但也只有不到30％的癌症病人能从中受益。因此治疗型mRNA疫苗是一种新型免疫治疗疗法，能够有效抑制肿瘤生长。具体来说mRNA通过纳米脂质颗粒运送到细胞质，运用人体本身的蛋白翻译系统产生抗原，加工成为表位抗原多肽(Epitopes)，这些多肽和MHC Class I或者MHC Class II分子结合，转运到细胞表面，MHC Class I结合的表位抗原与CD8+T细胞相互作用，诱导T细胞细胞毒性应答反应；MHC Class II结合的epitopes与CD4+T细胞相互作用，引发抗原专一的抗体反应，从而达到抑制肿瘤生长的目的。
mRNA疫苗在安全性，快速制备和免疫原性方面具有颠覆性的优势。mRNA疫苗不存在减毒疫苗潜在的逆转危险；不存在灭活疫苗的恢复突变问题；不存在DNA疫苗被整合到宿主基因组中并导致基因突变的可能。并且通常生产一种传统流感疫苗需要至少5-6个月的时间，而mRNA疫苗可以实现标准化生产，在10天内生产出所需疫苗。免疫原性方面，mRNA疫苗能够诱导B细胞和T细胞免疫应答，能引起免疫记忆效果，可以传递更多有效抗原，可以一次表达多个抗原，这是传统疫苗所无法比拟的。
KRas、Survivin和CEA这三个基因属于肿瘤相关抗原(Tumor associatedantigens，TAAs)，它们本质上是非突变的自身抗原，存在于正常基因组中。TAAs通常在人体正常细胞中以相对低水平表达的状态存在，而在癌症组织中表现为过度表达。接种以TAAs为靶点的癌症疫苗之后可以激发机体产生针对相应TAAs的免疫反应，主要是通过激活T细胞，达到杀灭和清除表达该TAAs抗原的癌细胞的目的。
虽然KRas、Survivin和CEA是已知的癌症基因靶点，但是迄今为止还没有针对这三个癌症基因靶点的小分子或者大分子药物成功批准上市，它们是著名的“不可成药”靶点。很多生物制药公司尝试开发针对KRas的靶向药物，但Kras乃是最难成药靶点之一，所以多年来没有进展。很多现在小分子药物研发的前沿新技术都是以征服Kras为目的，如诱导蛋白降解的PROTAC技术、小分子RNA抑制剂、化学诱导二聚的SMART平台等，但这些技术自身都有很多细节需要时间搞清楚。目前有针对KRas和Survivin这两个靶点的多肽疫苗，但目前还没有成功的利用这些多肽疫苗在临床实验上成功的报道。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种mRNA疫苗及其试剂盒、应用。
本发明的mRNA疫苗，由隔开的：
Kras的表位抗原基因序列，和
Survivin的表位抗原基因序列，和
CEA的表位抗原序列
制备得到，
其中，Kras的表位抗原基因序列选自SEQ ID No：1、2、3、8、10和15中的一个或多个，Survivin的表位抗原基因序列选自SEQ ID No：4、5、11、24、26中的一个或多个，Kras的表位抗原基因序列选自SEQ ID No：6、7、13、19、20中的一个或多个。
本发明的mRNA疫苗优选由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7所述的表位抗原基因序列制备得到。
本发明的mRNA疫苗优选由SEQ ID NO：10、11、13、15、19、20和24所述的表位抗原基因序列。
进一步的，表位抗原基因序列之间由连接肽隔开。
本发明还涉及一种试剂盒，试剂盒中包括：
本发明的mRNA疫苗，和
PD-1抗体。
本发明的mRNA疫苗可以应用于制备肿瘤药物，
所述的肿瘤具体为直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、肾癌、白血病、肺癌、白淋巴瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、浆细胞瘤和前列腺癌。
本发明第一次把KRas、Survivin和CEA这3个肿瘤相关抗原联合在一起制备出mRNA疫苗，达到抑制肿瘤生长的目的，首次用非传统的新药开发技术针对“不可成药”靶点。
附图说明
图1为对照组肿瘤生长曲线。
图2为对照组Elispot数据。
图3为2号疫苗处理组肿瘤生长曲线
图4为2号疫苗Epitope专一免疫反应实验图。
图5为3号疫苗处理组肿瘤生长曲线。
图6为3号疫苗处理组Elispot数据。
图7为4号疫苗处理组肿瘤生长曲线。
图8为4号疫苗处理组Elispot数据。
图9为5号疫苗处理组肿瘤生长曲线。
图10为5号疫苗处理组Elispot数据。
图11为3号DNA疫苗组预防性模型实验数据。
图12为3号普通mRNA疫苗组预防性模型实验数据。
图13为3号修饰mRNA疫苗组预防性模型实验数据。
图14为经疫苗处理后肿瘤体积归零小鼠在第49天重新接种2种直肠癌细胞(CT26和CEA-CT26癌细胞)和在第77天重新接种H22肝癌细胞实验数据。
图15为#3号普通mRNA疫苗组治疗性模型实验数据。
图16为#3号修饰mRNA疫苗组治疗性模型实验数据。
图17为胰腺癌MuPrime模型肿瘤生长实验数据。
图18为胰腺癌MuPrime模型体重实验数据。
具体实施方式
以下，结合实施例和附图对于本发明做进一步说明，实施例和附图仅用于解释说明而不用于限定本发明的保护范围。
本发明及实施例主要涉及以下内容：
1)针对KRas、Survivin和CEA分别设计了6个、10个和11个表位抗原(Epitopes),混合后分别克隆到4个载体(每个载体都含有3个靶点)，通过体外转录制备mRNA,经过加帽提高mRNA稳定性,纯化后制备成4个mRNA疫苗。
2)CT26鼠源直肠癌细胞只含KRas和Survivin两个基因，为了同时评估三个靶点，我们构建CEA-CT26稳定细胞株，用于建立动物模型实验。
3)采用预防型动物模型，把CEA-CT26直肠癌癌细胞和疫苗同时加到雌性Balb/c老鼠,评估疫苗对肿瘤生长抑制效果，癌细胞接种后第40天杀死老鼠，取出脾脏，用单个表位抗原多肽去刺激脾脏细胞，通过Elispot实验筛选27个表位抗原，挑选出14个最佳表位抗原。
4)重复预防型动物模型实验，确认疫苗抑制肿瘤生长效率(甚至使肿瘤归零)的疗效，同时选择6个肿瘤归零老鼠在第一次接种后第49天重新接种直肠癌癌细胞，观察到这些老鼠没有结瘤，然后在第77天又一次接种H22肝癌细胞(该细胞含Kras和Survivin这两个靶点)，在第94天发现肿瘤生长抑制率(Tumor Growth Inhibition,TGI)达到92.2％，说明癌症疫苗有长期保护功能，对肝癌也会有好的治疗效果。同时评估疫苗治疗型模型效果，发现肿瘤体积长到100立方毫米后给药也可以有效抑制肿瘤生长，甚至让肿瘤体积归零。
5)使用鼠源胰腺癌瘤块(mPA6115，含KRas靶点)接种到雌性C57BL/6老鼠，肿瘤体积长到80-110立方毫米时开始给药，把疫苗和PD-1抗体联用，2个星期后肿瘤生长抑制率(Tumor Growth Inhibition,TGI)达到41％，并没有明显副作用，而阳性对照组，即顺铂处理组的肿瘤生长抑制率是55％，但有明显副作用。
选定三个癌症基因靶点KRas、Survivin和CEA，每个靶点设计6～11个表位抗原，本实施例设计的表位抗原序列如下：
表位抗原通过连接肽(Linker,氨基酸序列是GGSGGGGSGG)分开。
第一次预防性疫苗动物实验
第0天皮下接种2x105CEA-CT26细胞到雌性Balb/c老鼠，每组5只。
DNA疫苗给药时间：8次，第-7，0，3，7，13，19，25和31天给药，50ug DNA每只老鼠每次，肌肉注射。
鼠源PD-1抗体(RMP1-14)给药7次，腹腔注射：第-3天，2mg/kg；第2天，4mg/kg；第5天，6mg/kg；第10天，8mg/kg；第16,22,28天，10mg/kg；
分组：
对照组。
#2号疫苗组，含表位抗原1-7。
#3号疫苗组，含表位抗原8-13。
#4号疫苗组，含表位抗原14-20。
#5号疫苗组，含表位抗原21-27。
如图1所示，对照组肿瘤体积随着时间的延长而快速增长，与预期一致。第40天ID2343和ID3030两只老鼠的脾脏用于Elispot检测。
如图2是对照组的Elispot数据。
| 多肽 | 6 | 7 | 13 | 19 | 20 | 26 | 27 |
| ID2343 | -86 | -84 | -81 | -69 | 18 | -19 | -81 |
| ID3030 | 4 | 7 | 9 | -28 | -30 | 9 | 12 |
A1和A11孔脾脏细胞没有用多肽刺激，得到的Elispot数值即是背景值。B1和B11孔脾脏细胞用6号多肽刺激，C1和C11孔脾脏细胞用7号多肽刺激，D1和D11孔脾脏细胞用13号多肽刺激，E1和E11孔脾脏细胞用19号多肽刺激，F1和F11孔脾脏细胞用20号多肽刺激，G1和G11孔脾脏细胞用26号多肽刺激，H1和H11孔脾脏细胞用27号多肽刺激。多肽处理组得到的Elispot数值减去相对应的背景值后数据如上所示，这些Elispot数值低于20，说明免疫系统在对照组里没有被激活，与预期一致。
如图3所示，2号疫苗组有5只老鼠肿瘤体积缩小，4只几乎回零，TGI＝82.6％，p＝0.143。第40天ID3014，ID3026和ID3037老鼠脾脏用于Elispot检测。
如图4所示，表位抗原多肽能刺激脾脏细胞分泌IFN-γ，表明免疫系统被激活。Elispot数值越大，肿瘤体积归零的几率越高。
A3，A4和A5孔脾脏细胞没有用多肽刺激，得到的Elispot数值即是背景值。B3,B4和B5孔脾脏细胞用1号多肽刺激，C3,C4和C5孔脾脏细胞用2号多肽刺激，D3,D4和D5孔脾脏细胞用3号多肽刺激，E3,E4和E5孔脾脏细胞用4号多肽刺激，F3,F4和F5孔脾脏细胞用5号多肽刺激，G3,G4和G5孔脾脏细胞用6号多肽刺激，H3,H4和H5孔脾脏细胞用7号多肽刺激。多肽处理组得到的Elispot数值减去相对应的背景值后数据如上所示。ID3037小鼠肿瘤体积虽然比对照组小，2号疫苗的处理只是部分抑制肿瘤的生长，Elispot数值显示7个表位抗原只有2个表位抗原能够激活T细胞，而且激活程度也不高,显示该小鼠免疫系统只是被部分激活。相反，ID3026小鼠的Elispot数值显示7个表位抗原全部能够激活T细胞，而且激活程度很高，导致肿瘤体积不断缩小。另外ID3014小鼠的肿瘤体积彻底归零，与它的高Elispot值一致。2号疫苗7个表位抗原显示非常好的免疫系统激活功能。
如图5所示，3号疫苗组4只老鼠肿瘤体积全部回零，TGI＝100％，p＝0.026。第40天ID2351和ID3019老鼠脾脏用于Elispot检测。
| 多肽 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 7 |
| ID2351 | 100 | 49 | 23 | 130 | 42 | 109 | 129 |
| ID3019 | 63 | 9 | 120 | 147 | 30 | -6 | -10 |
如图6所示，ID3019和ID2351老鼠的肿瘤体积为0，与它们高Elispot值一致，说明免疫系统被完全激活。
A6和A7孔脾脏细胞没有用多肽刺激，得到的Elispot数值即是背景值。B6和B7孔脾脏细胞用8号多肽刺激，C6和C7孔脾脏细胞用9号多肽刺激，D6和D7孔脾脏细胞用10号多肽刺激，E6和E7孔脾脏细胞用11号多肽刺激，F6和F7孔脾脏细胞用12号多肽刺激，G6和G7孔脾脏细胞用13号多肽刺激，H6和H7孔脾脏细胞用7号多肽刺激。多肽处理组得到的Elispot数值减去相对应的背景值后数据如上所示。Elispot数值显示3号疫苗中的9号和12号表位抗原和其它表位抗原相比激活免疫系统能力相对差一些。
如图7所示4号疫苗组5只老鼠中的三只肿瘤体积缩小到0，表明该疫苗可以抑制肿瘤生长。第40天ID3023老鼠脾脏用于Elispot检测。
| 多肽 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 |
| ID3023 | 78 | 116 | 9 | 81 | 80 | 140 | 154 |
如图8所示，ID3023老鼠的肿瘤体积为0，与它们高Elispot值一致，说明免疫系统被完全激活。
A8孔脾脏细胞没有用多肽刺激，得到的Elispot数值即是背景值。B8孔脾脏细胞用14号多肽刺激，C8孔脾脏细胞用15号多肽刺激，D8孔脾脏细胞用16号多肽刺激，E8孔脾脏细胞用17号多肽刺激，F8孔脾脏细胞用18号多肽刺激，G8孔脾脏细胞用19号多肽刺激，H8孔脾脏细胞用20号多肽刺激。多肽处理组得到的Elispot数值减去相对应的背景值后数据如上所示。Elispot数值显示4号疫苗中的14号，16号，17号，和18号表位抗原和其它表位抗原相比激活免疫系统能力相对差一些。
如图9所示，5号疫苗组5只老鼠中的二只肿瘤体积缩小到0。第40天ID2353老鼠脾脏用于Elispot检测。
| 多肽 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 |
| ID3023 | 80 | 75 | 69 | 104 | 70 | 8 | 21 |
如图10所示，ID2353老鼠的肿瘤体积为0，与它高Elispot值一致，说明免疫系统被完全激活。
A9孔脾脏细胞没有用多肽刺激，得到的Elispot数值即是背景值。B9孔脾脏细胞用21号多肽刺激，C9孔脾脏细胞用22号多肽刺激，D9孔脾脏细胞用23号多肽刺激，E9孔脾脏细胞用24号多肽刺激，F9孔脾脏细胞用25号多肽刺激，G9孔脾脏细胞用26号多肽刺激，H9孔脾脏细胞用27号多肽刺激。多肽处理组得到的Elispot数值减去相对应的背景值后数据如上所示。Elispot数值显示5号疫苗中的21号，22号，23号，25号，26号和27号表位抗原和其它表位抗原相比激活免疫系统能力相对差一些。
上述表位抗原筛选结果，最佳16个表位抗原如下：
对于上述疫苗动物实验的总结如下：
疫苗处理后19只老鼠中的13只老鼠肿瘤体积缩小归零，占比达到68％。筛选出16个最佳表位抗原，分别克隆到2个载体。
进行第二次动物实验
分组：
对照组。
#3号DNA疫苗组(预防性)。
第0天皮下接种2x105CEA-CT26细胞到雌性Balb/c老鼠，每组5只。
#3号DNA疫苗给药时间：8次，第-7，0，3，7，13，19，25和31天给药，50ug DNA每只老鼠每次，肌肉注射。
鼠源PD-1抗体(RMP1-14)给药7次，腹腔注射：第-3天，2mg/kg；第2天，4mg/kg；第5天，6mg/kg；第10天，8mg/kg；第16,22,28天，10mg/kg
#3号普通mRNA疫苗组(预防性)。
第0天皮下接种2x105CEA-CT26细胞到雌性Balb/c老鼠，每组5只。
#3号DNA疫苗给药时间：1次，第-7天给药，50ug DNA每只老鼠每次，肌肉注射。
#3号普通mRNA疫苗给药时间：7次，第0，3，7，13，19，25和31天给药，50ug#3号普通mRNA/Lipoplex每只老鼠每次，静脉注射。
鼠源PD-1抗体(RMP1-14)给药7次，腹腔注射：第-3天，2mg/kg；第2天，4mg/kg；第5天，6mg/kg；第10天，8mg/kg；第16,22,28天，10mg/kg
#3号修饰mRNA疫苗组(预防性)。
第0天皮下接种2x105CEA-CT26细胞到雌性Balb/c老鼠，每组5只。
#3号DNA疫苗给药时间：1次，第-7天给药，50ug DNA每只老鼠每次，肌肉注射。
#3号修饰mRNA疫苗给药时间：7次，第0，3，7，13，19，25和31天给药，50ug#3号修饰mRNA/Lipoplex每只老鼠每次，静脉注射。
鼠源PD-1抗体(RMP1-14)给药7次，腹腔注射：第-3天，2mg/kg；第2天，4mg/kg；第5天，6mg/kg；第10天，8mg/kg；第16,22,28天，10mg/kg。
预防性疫苗处理后肿瘤消失老鼠第二次癌细胞接种。
挑选6只经过DNA或者mRNA疫苗处理后肿瘤归零老鼠重新接种，第49天左前腿皮下接种2x105CEA-CT26细胞，右前腿皮下接种2x105CT26细胞，没有其它处理，观察是否结瘤。同时用4只雌性Balb/c老鼠用同样方式接种，作为对照。
预防性疫苗处理后肿瘤消失老鼠第三次癌细胞接种。
上述6只肿瘤归零老鼠重新接种，第77天右后腿皮下接种1x106H22细胞，没有其它处理，观察是否结瘤。同时用4只雌性Balb/c老鼠用同样方式接种，作为对照。
#3号普通mRNA疫苗组(治疗性)。
第0天皮下接种2x105CEA-CT26细胞到雌性Balb/c老鼠，每组5只。
#3号普通mRNA疫苗给药时间：7次，第14，17，24，27，33，39和45天给药，50ug#3号普通mRNA/Lipoplex每只老鼠每次，静脉注射。
鼠源PD-1抗体(RMP1-14)给药6次，腹腔注射：第16天，4mg/kg；第19天，6mg/kg；第24天，8mg/kg；第30,36,42天，10mg/kg
#3号修饰mRNA疫苗组(治疗性)。
第0天皮下接种2x105CEA-CT26细胞到雌性Balb/c老鼠，每组5只。
#3号修饰mRNA疫苗给药时间：7次，第14，17，24，27，33，39和45天给药，50ug#3号普通mRNA/Lipoplex每只老鼠每次，静脉注射。
鼠源PD-1抗体(RMP1-14)给药6次，腹腔注射：第16天，4mg/kg；第19天，6mg/kg；第24天，8mg/kg；第30,36,42天，10mg/kg
如图11所示，#3号DNA疫苗组，4只老鼠肿瘤完全消失，TGI＝100％。
如图12所示，#3号普通mRNA疫苗组，5只老鼠，3只肿瘤完全消失，另外2只老鼠展示肿瘤生长抑制，TGI＝96％。
如图13所示，#3号修饰mRNA疫苗组，5只老鼠，2只肿瘤完全消失，另外3只老鼠展示肿瘤生长抑制，TGI＝88％。
如图14所示，经过上述疫苗处理后肿瘤消失后的9只老鼠中挑选出6只小鼠在第一次接种后第49天左前腿皮下接种2x105CEA-CT26细胞，右前腿皮下接种2x105CT26细胞，没有其它处理，观察是否结瘤。同时用4只雌性Balb/c老鼠用同样方式接种，作为对照。第77天重新接种H22肝癌细胞，没有其它处理，观察是否结瘤。同时用4只雌性Balb/c老鼠用同样方式接种，作为对照。
如图15所示，#3号普通mRNA疫苗组，4只老鼠，2只肿瘤完全消失，另外2只老鼠肿瘤体积小，TGI＝95％。
如图16所示，#3号修饰mRNA疫苗组，5只老鼠肿瘤体积减小，TGI＝78.6％
如图17所示，2号mRNA疫苗组在胰腺癌MuPrime模型(mPA6115)展示41％肿瘤生长抑制效率。
皮下接种鼠源胰腺癌瘤块(mPA6115)到雌性C57BL/6老鼠，每组4只。肿瘤体积长到80-110立方毫米时开始给药。
2号mRNA疫苗给药时间：5次，第0，3，7，10和14天给药，10ug 2号mRNA/Lipoplex每只老鼠每次，静脉注射。
鼠源PD-1抗体(RMP1-14)给药3次，腹腔注射：第二天，第五天和第十一天，10mg/kg。
如图18所示，mRNA疫苗组在小鼠体重正常，而顺铂处理组小鼠体重稍微减少。
序列表
<110> 太仓美诺恒康生物技术有限公司
<120> mRNA疫苗及其试剂盒、应用
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp
1 5 10 15
Claims (7)
1.一种mRNA疫苗，其特征在由隔开的：
Kras的表位抗原基因序列，和
Survivin的表位抗原基因序列，和
CEA的表位抗原序列
制备得到，
其中，Kras的表位抗原基因序列选自SEQ ID No：1、2、3、8、10和15中的一个或多个，Survivin的表位抗原基因序列选自SEQ ID No：4、5、11、24、26中的一个或多个，Kras的表位抗原基因序列选自SEQ ID No：6、7、13、19、20中的一个或多个。
2.如权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7所述的表位抗原基因序列制备得到。
3.如权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于由SEQ ID NO：10、11、13、15、19、20和24所述的表位抗原基因序列。
4.如权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于表位抗原基因序列之间由连接肽隔开。
5.一种试剂盒，其特征在于包括：
权利要求1~4所述的mRNA疫苗，和
PD-1抗体。
6.权利要求1~4所述的mRNA疫苗在制备肿瘤药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为结肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、肾癌、白血病、肺癌、白淋巴瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、浆细胞瘤和前列腺癌。
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