CN110433286B - 溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗及其制备方法，联用疫苗可通过两种方式实现，第一种是将溶瘤病毒试剂的产生的免疫应答反应，促进多肽试剂被抗原递呈细胞吞噬的效率并提高能特异性识别肿瘤新抗原的T细胞的数量与肿瘤浸润能力，从而增强抗癌疗效；第二种是将编码肿瘤新抗原的基因插入溶瘤病毒载体中，大量表达肿瘤新生抗原，并结合溶瘤病毒的肿瘤杀伤能力，进一步增强肿瘤病灶局部的免疫应答反应，提高杀伤型T细胞在肿瘤组织中的浸润程度，使局部产生免疫原反应，刺激效应细胞的产生达到抗癌效果；通过实验比较发现，第一种联用疫苗、第二种联用疫苗均具有良好的抑瘤效果，第二种联用疫苗具有显著的抑瘤效果。

Description

溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是一种溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗及其制备方法。
背景技术
长期以来，找到有效攻克肿瘤的方法一直是研究人员追求的目标，最大的困难之一在于广泛存在的肿瘤异质性。不仅仅在肿瘤组织内部，即使是同一种肿瘤类型，在不同患者间也存在着极大的差异。癌细胞在快速生长和增殖过程中，往往来不及修复DNA在复制过程中出现的错误，因此会出现许多新的突变蛋白，被称为肿瘤新生抗原(Neoantigen)。早期研究认为绝大多数肿瘤新抗原所携带的突变本身对肿瘤细胞的生长并没有影响，属于可被忽略的副产物。随着研究深入，近期科学家发现即使同种癌症患者身上的突变都不尽相同，新抗原也有所差别，可作为特异的标记物被免疫细胞识别。而个性化肿瘤疫苗的原理正是在于：通过发现患者体内特异性表达的肿瘤新生抗原，继而个性化激活免疫系统，实现真正的个体化精准治疗。
最新的两项独立研究表明，科学家们可以从肿瘤患者自身找到个性化治疗癌症的方法——个性化的肿瘤疫苗。2017年《自然》杂志分别发表了美国波士顿Dana-Farber癌症中心的Catherine Wu教授使用针对肿瘤新生抗原的个体化多肽疫苗和德国美因茨大学Ugur Sahin团队的使用针对肿瘤新生抗原的个体化RNA疫苗治疗黑色素瘤中晚期复发高危患者的研究文章。这两个实验的结果为个体化肿瘤新抗原疫苗的安全性、免疫原性、有效性及新抗原肿瘤疫苗与免疫检查点抑制剂疗法联用的潜在疗效提供了证据。
然而，以往多项肿瘤相关抗原(TAA)的肿瘤疫苗的临床试验结果显示出这些疫苗存在效力不强的问题。一方面，可能是由于这些肿瘤疫苗的免疫原性较低，需要使用合适的佐剂来产生有效的机体免疫反应。另一方面，很可能是由于在这些肿瘤患者体内存在的肿瘤为“冷”肿瘤或“排除型”肿瘤。目前，学者们通过对肿瘤中心和边界(浸润切缘，invasivemargin)两个区域中的CD3+和CD8+两种淋巴细胞进行量化统计，将肿瘤的免疫评分分为4级。免疫评分为0的肿瘤在中心和边界区域都未发现CD3+和CD8+淋巴细胞(对应表现为“冷”肿瘤)，而免疫评分为4的肿瘤在这两个区域都存在高密度的CD3+和CD8+淋巴细胞(对应表现为“热”肿瘤)。其它两种类型中的一种是“排除型(excluded)”，这类的肿瘤边缘存在大量CD3+和CD8+淋巴细胞，但是这些细胞无法浸润到肿瘤中心。另一种类型是“免疫抑制型(immunosuppressed)”，这类肿瘤的中心和边缘两个区域虽然都有淋巴细胞，但是密度较低。已有临床研究表明，免疫检查点抑制剂对于“冷”肿瘤和“排除型”肿瘤疗效甚微。同时，由于部分肿瘤的新抗原样本池太小而不能产生具有足够多样性的tumor-reactive CTLs，导致抗肿瘤效果低下。上述几个因素均会对个体化新抗原肿瘤疫苗的疗效带来负面影响。
溶瘤病毒是天然的或经过基因工程改造的病毒，其可选择性的感染肿瘤细胞并在胞内复制、杀死肿瘤细胞，使其裂解。尽管还需要对溶瘤病毒的作用机制进行更详尽地研究，且绝大部分的溶瘤病毒仍处于在研状态；但已有少数溶瘤病毒被批准上市。例如通过基因工程改造的人5型腺病毒(Ad5)得到的溶瘤腺病毒H101已于2006年被CFDA批准上市，商品名为安柯瑞，利用基因工程技术删除人5型腺病毒E1B-55kD和E3区部分基因片段而获得的一种溶瘤性腺病毒，该病毒可在肿瘤细胞中选择性复制而导致肿瘤细胞的裂解。以及国际上已经上市的通过改造HSV-I(单纯疱疹病毒1型)得到的插入GM-CSF基因的Talimogenelaherparepvec(T-Vec，商品名为Imlygic，别名OncoVex GM-CSF)。单纯疱疹病毒HSV-1型，最初来源于从唇疱疹中分离出来的JS-1株。其经过遗传修饰后可选择性在肿瘤细胞中选择性复制。HSV-1是一种具有高度细胞裂解性的双链DNA病毒。它可以感染皮肤和周围神经，其中HSV-1进入潜伏状态并且可能在压力期间引起反复发热的水疱。T-VEC的设计是通过删除阻断抗原呈递的基因和神经毒力基因来预防发热水疱的发展。T-VEC利用表面凝集素进入肿瘤细胞并通过利用破坏的致癌和抗病毒途径进行繁殖，主要是蛋白激酶R(PKR)和I型干扰素(IFN)途径。病毒基因ICP34.5两个拷贝的删除减弱了病毒的致病性，并且使得病毒选择性地仅在肿瘤细胞内复制。病毒基因ICP47的删除降低了病毒抑制抗原呈递的能力。病毒基因ICP47缺失使得基因US11受ICP47前启动子的控制，替代了US11下游启动子，增强了病毒的肿瘤特异性。另一基因修改是插入编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的cDNA以刺激肿瘤微环境中细胞因子的表达，使得抗原呈递细胞的募集和成熟，用于刺激肿瘤特异性细胞毒性T细胞。ICP34.5编码基因由一组编码人GM-CSF的细胞巨化病毒启动子和牛生长激素pA的序列所替代。
已有研究表明溶瘤病毒具有将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤或刺激机体产生免疫活性的能力。尽管目前大部分的溶瘤病毒只能破坏部分肿瘤组织，但病毒对肿瘤细胞的杀伤过程同时具有改变肿瘤免疫抑制微环境以提高系统抗肿瘤能力的潜能。实验证明溶瘤病毒的感染可以阻断肿瘤细胞的凋亡过程(非炎症反应，无免疫佐剂性)，激活肿瘤细胞的坏死机制(促炎症反应，有免疫佐剂性)。溶瘤病毒造成的肿瘤细胞损伤，会导致促炎症的DAMP和PAMP反应，从而促进抗原递呈细胞的胞吞作用。受到病毒感染的肿瘤细胞除了其自身会激起固有免疫系统对受感染的肿瘤微环境的免疫监测；其被胞吞降解后得到的微生物特异性分子/核酸还会与固有免疫系统反应，产生会引发交叉致敏和适应性免疫力的细胞因子。另外，胞吞后的少部分核酸会与cGAS结合产生self-DAMPs，从而引发STING信号通路，生成交叉致敏所需的I型干扰素并产生针对肿瘤抗原的T细胞，提升抗肿瘤的T细胞活性。而且，溶瘤病毒能够使淋巴结内的DC细胞在通过细胞表面的MHC I类分子交叉递呈肿瘤抗原表位信号的同时通过MHC II类分子交叉递呈溶瘤病毒表位信号，从而大量扩增具有肿瘤杀伤特异性的杀伤型T细胞。
本发明根据这些理论基础，寻找一种能够增强肿瘤病灶局部的免疫应答反应，使“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤达到抗癌效果的联用肿瘤疫苗，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗及其制备方法，联用疫苗可通过两种方式实现，第一种是利用溶瘤病毒试剂的肿瘤杀伤产生肿瘤病灶局部的免疫应答反应，提高新生抗原多肽疫苗被抗原递呈细胞吞噬的效率以及能特异性识别肿瘤新抗原的T细胞的数量与肿瘤浸润能力，从而增强抗癌疗效；第二种是将编码肿瘤新抗原的基因插入溶瘤病毒载体中，改善抗原肽不能直接进入肿瘤内部的问题，并结合溶瘤病毒的肿瘤杀伤能力，进一步增强肿瘤病灶局部的免疫应答反应，提高杀伤型T细胞在肿瘤组织中的浸润程度，使局部产生免疫原反应，刺激效应细胞的产生，使“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤达到抗癌效果。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗，为由溶瘤病毒试剂与个性化新生抗原多肽疫苗的混合联用试剂。
前述的溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗的制备方法，制备过程包括如下内容：
a，选择具有增殖能力并能特异性识别并感染肿瘤细胞，但无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用的一种或多种溶瘤病毒用于联用肿瘤疫苗；
b，个体化肿瘤新生抗原多肽位点的鉴定，
将肿瘤患者的正常细胞DNA测序结果和肿瘤细胞DNA测序结果比对到人类参考基因组，从比对结果中鉴定出肿瘤细胞的体细胞突变；
再对肿瘤进行RNA测序，确定并评估突变的等位基因的表达；
根据基因组比对结果预测患者自身的I型及II型HLA分型，并利用亲和力预测算法netMHCpan鉴定能与HLA结合的新生抗原；
根据与HLA的亲和力、突变的可信程度、突变频率筛选出一批突变位点，根据I型及II型HLA能够结合的多肽长度8-16个氨基酸，确定疫苗多肽的序列，多肽的数量范围为10～20条每个患者；
新生抗原突变位点筛选的标准为：亲和力小于500nM；突变事件经实验验证为阳性；突变频率大于等于0.1；
c，按照新生抗原多肽序列制备多肽试剂用于联用肿瘤疫苗。
前述的溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗的制备方法，多肽的制备方式包括：化学合成方式制备，通过转录和翻译核酸分子的方式制备，细菌或病毒为载体表达的方式制备。
溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗，为单用表达个体化新生抗原的溶瘤病毒试剂，将编码肿瘤新生抗原的基因插入溶瘤病毒载体中得到表达新生抗原的溶瘤病毒。
前述的溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗的制备方法，包括如下内容：
用质粒构建系统及病毒转染系统将新生抗原多肽的基因序列插入溶瘤病毒基因中得到表达新生抗原的溶瘤病毒，转染扩增得到表达新生抗原的溶瘤病毒，用于新生抗原和溶瘤病毒联用治疗效果验证。
前述的溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗的制备方法，包括如下具体内容：通过质粒构建系统构建新生抗原基因的质粒，然后通过病毒转染系统将带有新生抗原的基因整合到溶瘤病毒基因内，将病毒载体转染入细胞中获得第一代病毒种子液，取第一代病毒种子液经多次反复冻融使细胞破裂所释放的病毒感染生长至80％～90％密度的生产细胞中，感染2～4天后收集细胞和上清，所收集的细胞再经反复冻融后得到第二代表达新生抗原的溶瘤病毒，按照该方法扩增3～4轮，收获表达肿瘤新生抗原的溶瘤病毒。
本发明的有益之处在于：
本发明的第一种联用疫苗可利用溶瘤病毒试剂的肿瘤杀伤产生肿瘤病灶局部的免疫应答反应，提高新生抗原多肽疫苗被抗原递呈细胞吞噬的效率以及能特异性识别肿瘤新抗原的T细胞的数量与肿瘤浸润能力，从而增强抗癌疗效；
本发明的第二种联用疫苗是将编码肿瘤新抗原的基因插入溶瘤病毒载体中，大量表达肿瘤新生抗原，并结合溶瘤病毒的肿瘤杀伤能力，进一步增强肿瘤病灶局部的免疫应答反应，提高杀伤型T细胞在肿瘤组织中的浸润程度，使局部产生免疫原反应，刺激效应细胞的产生，使“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤达到抗癌效果；
通过实验比较发现，第一种联用疫苗：新生抗原多肽与溶瘤病毒联用的肿瘤疫苗、第二种：表达新生抗原溶瘤病毒的肿瘤疫苗，这两种均具有良好的抑瘤效果，第二种肿瘤联用疫苗具有显著的抑瘤效果。
附图说明
图1是本发明的表达肿瘤新生抗原的溶瘤病毒的制备方法的流程图；
图2是本发明的表达肿瘤新生抗原的溶瘤病毒的制备方法的示意图(Genomicplasmid:基因组的包装质粒，Shuttle plasmid：穿梭质粒，Cotransfect 293cells:共转染293细胞，Site specific recombination:位点特异性重组，PacI、loxP、frt、Cre、FLP等为酶切位点)；
图3各实验动物模型IFN-λ的百分占比；
图4是C57BL模型实验组ELISpot结果；
图5 PDX模型实验组ELISpot结果；
图6 C57BL/6模型各组CD8/CD4比率；
图7 C57BL/6模型各组肿瘤生长情况；
图8 PDX模型中NOD/SCID鼠的各组CD8/CD4比率；
图9是PDX模型中NSG鼠的各组CD8/CD4比率；
图10 C57BL/6模型各组肿瘤生长曲线；
图11 PDX模型中NOD/SCID鼠各组生存曲线；
图12 PDX模型中NSG鼠各组生存曲线；
图13是C57BL/6模型各组生存周期；
图14是PDX模型中NOD/SCID鼠各组生存周期；
图15是PDX模型中NSG鼠各组生存周期。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
本发明的联用疫苗有两种方案，其一是新生抗原多肽与溶瘤病毒联用的肿瘤疫苗，为由溶瘤病毒试剂与个性化新生抗原多肽疫苗的混合联用试剂。原理是利用溶瘤病毒试剂的肿瘤杀伤产生肿瘤病灶局部的免疫应答反应，提高新生抗原多肽试剂被抗原递呈细胞吞噬的效率以及能特异性识别肿瘤新抗原的T细胞的数量与肿瘤浸润能力，从而增强抗癌疗效。用其评估其联用的抑瘤作用；其二是表达新生抗原溶瘤病毒，为单用表达个体化新生抗原的溶瘤病毒试剂，将编码肿瘤新生抗原的基因插入溶瘤病毒载体中得到表达新生抗原的溶瘤病毒。用其评估其联用的抑瘤作用。
以下用实验验证第一种联用疫苗、第二种联用疫苗的抑制肿瘤效果；
实施例一：样本构建及制备；
主要包括4个样本构建及制备，制备过程包括如下内容：
1、新生抗原多肽的鉴定及制备
1.1个体化肿瘤新生抗原多肽位点的鉴定
将C57BL6小鼠/肿瘤患者的正常细胞DNA测序结果和B16F10细胞/患者肿瘤细胞及接种成瘤的瘤体/患者瘤体6个测序样本的DNA测序结果分别比对到小鼠/人类参考基因组从比对结果中鉴定出肿瘤细胞的体细胞突变；
再对三个测序样本进行RNA测序，确定并评估突变的等位基因的表达；
根据基因组比对结果预测C57BL6小鼠/临床患者自身的I型及II型HLA分型，并利用亲和力预测算法netMHCpan鉴定能与HLA结合的新生抗原；
根据与HLA的亲和力、突变的可信程度、突变频率筛选出一批突变位点，根据I型及II型HLA能够结合的多肽长度8-16个氨基酸，确定疫苗多肽的序列，多肽的数量范围为10～20条，从而得到新生抗原多肽序列。
新生抗原突变位点筛选的标准为：亲和力小于500nM；突变事件经实验验证为阳性；突变频率大于等于0.1。
小鼠和患者多肽鉴定结果如表1和表2所示。
表1小鼠多肽信息
Figure BDA0002169584160000061
表2黑色素瘤患者多肽信息
Figure BDA0002169584160000071
1.2肿瘤新生抗原多肽的合成与纯化；
设计的多肽序列委托多肽生产公司代生产，主要质控指标：纯度≥95％，内毒素≤10EU/mg，无菌。生产工艺为常规的多肽制备方法：依次开展多肽合成、切割、纯化、冻干工艺，最终得到目标多肽。多肽冻干粉-20℃下密封避光保存。
2、溶瘤病毒
选择具有增殖能力并能特异性识别并感染肿瘤细胞，但无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用的一种或多种溶瘤病毒，溶瘤病毒除了能够直接杀伤肿瘤细胞外，还可以通过多种途径全面刺激机体产生抗肿瘤免疫反应。作为一种实施例，可选用已产品化的溶瘤病毒产品H101(上海三维生物技术有限公司)。实际操作中不限于这一种溶瘤病毒。
3、溶瘤病毒与新生抗原多肽疫苗的混合联用
溶瘤病毒与新生抗原多肽疫苗的混合联用方法为：将选定的溶瘤病毒按照相应剂量进行瘤内注射，每4天1次，共4次。同时将分组混合制备得到的肿瘤疫苗于溶瘤病毒注射点附近进行注射，每4天1次，共4次。随后同时进行3次溶瘤病毒增强免疫和3次多肽疫苗增强免疫。需要说明的是本发明是一种辅助工具产品，可以作为商品，并非一种疾病的治疗方法。
4、表达肿瘤新生抗原的溶瘤病毒(Neo-Oncolytic)的制备；
制备总流程如图1、2所示：
图2中，
Genomic plasmid:基因组的包装质粒，
Shuttle plasmid：穿梭质粒，
Cotransfect 293cells:共转染293细胞，
Site specific recombination:位点特异性重组，
PacI、loxP、frt、Cre、FLP等为酶切位点。
参照所有多肽对应基因的序列，全部串联到一条序列上面，每两个多肽位点中间使用T2A序列(GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT)连接，当表达肿瘤新生抗原时，每条肿瘤新生抗原表达出来后被相应的剪切成一条一条的多肽，所有的多肽序列构建成穿梭质粒。
通过Cre/loxP获得重组病毒，为了避免在细菌中重组，这个过程发生在293细胞中。将克隆了新生抗原基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293细胞，利用Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。使用这个系统有多种优势，包括操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高(一般大于104vp/cell)、目的基因的表达水平高(因为mCMV启动子比hCMV启动子强若干倍)等。鉴于这些特点，本样本使用AdMax包装系统制备表达肿瘤新生抗原的溶瘤病毒(Neo-Oncolytic)。
大约10天后293细胞产生表达抗原肽的溶瘤腺病毒Ad-Neoantigen，收集细胞和上清。取收集的腺病毒细胞液经3次反复冻融后感染一皿直径10cm生长至80％～90％密度的AD-293细胞，37℃感染2～3天后收集细胞和上清，再经反复冻融后获得第二代病毒液。按照该方法扩增3～4轮，收获大量腺病毒。
实施例二：鼠源药效模型评估溶瘤病毒与新生抗原多肽疫苗联用的药效；
1、鼠源肿瘤模型构建——C57-B16F10黑色素瘤模型；
选择C57BL/6小鼠，由北京维通利华采购，雌性，6～8周。接种B16-F10鼠源黑色素瘤肿瘤细胞。肿瘤细胞接种前计数，保证细胞活率95％以上。将收获的B16-F10黑色素瘤细胞按细胞量为7×104cells/只进行背部皮下注射。
2、抑瘤效果评估
2.1肿瘤模型分组；
小鼠成瘤后的2天，选取50-60只肿瘤体积相近且平均肿瘤直径约为0.5厘米的小鼠入组，随机分为四组，每组至少10只，分别是阴性对照佐剂组、多肽组、溶瘤病毒组、多肽联合溶瘤病毒组。
2.2肿瘤模型给药；
2.2.1多肽组给药；
将纯化的13条多肽(表1)溶于1ml PBS制得1mg/肽/ml(×10条肽)浓度的多肽溶液1ml。当C57BL/6小鼠肿瘤瘤体长至50mm3后的每4天进行一次多肽免疫，共4次，多肽给药体积为100μL/只。随后每间隔7天，再次进行1次多肽疫苗增强免疫，共3次。
多肽疫苗免疫方案为：将分组混合制备得到的肿瘤疫苗分别皮下注射于小鼠的四肢和颈背部五个部位，每个部位接种20μl疫苗，每天1次。
给药途径为皮下注射。每次多肽注射前半个小时，在注射点旁边位置注射的GM-CSF作为疫苗佐剂。GM-CSF注射量为10μg/50μl/只。
2.2.2溶瘤病毒组给药；
将浓度为5×108pfu/ml的病毒H101(上海三维生物技术有限公司)按照50μl/只的注射剂量给荷瘤小鼠瘤内给药。注射时间间隔为每4天注射一次，共注射4次。随后每间隔7天，进行1次溶瘤病毒增强免疫，即将选定的溶瘤病毒按照0.5×1012vp-1.5×1012vp/天的剂量进行瘤内注射，共3次。
2.2.3第一种联用疫苗组给药——多肽联合溶瘤病毒组
将选定的溶瘤病毒按照0.5×1012vp-1.5×1012vp/天的剂量进行瘤内注射，每4天1次，连续施用4次。随后每间隔7天，进行1次溶瘤病毒增强免疫，共3次。
均在注射溶瘤病毒的同一天进行个体化肿瘤新生抗原多肽疫苗的注射。将分组混合制备得到的肿瘤疫苗于溶瘤病毒注射点附近进行注射，每4天1次，共4次。随后每间隔7天，再次进行1次多肽疫苗增强免疫，共3次。
每次多肽注射前半个小时，在注射点旁边位置注射GM-CSF作为疫苗佐剂。GM-CSF注射量为10μg/50μl/只。
2.2.4第二种联用疫苗组给药——表达新生抗原溶瘤病毒组
将浓度为5×108pfu/ml带有肿瘤新生抗原的溶瘤病毒载体Neo-Oncolytic按照50μl/只的注射剂量给荷瘤小鼠瘤内给药。当小鼠肿瘤瘤体长至50mm3后，每4天注射一次，共注射4次。随后每间隔7天，进行1次溶瘤病毒增强免疫，共3次。
每次病毒注射前，注射GM-CSF于疫苗中作为佐剂。GM-CSF注射量为10μg/50μl/只。
2.2.5阴性对照佐剂组；
阴性对照佐剂(GM-CSF)组给药方法与多肽组给药方法大体一致，只是不需要注射多肽疫苗。
2.3取样检测及指标评估；
末次给药后1周收获小鼠脾脏细胞、外周血以及肿瘤细胞用于检测机体各项免疫指标。
记录并对比实验组和对照组中以及对比不同肿瘤模型组别中所有小鼠的生存周期，具体需要对比的参数包括但不仅限于：总生存期(OS)、中位生存期(MS)、无进展生存期(PFS)等。通过对比阴性对照佐剂组(Control)、多肽组(Peptide)、溶瘤病毒组(H101)、多肽联合溶瘤病毒组(Pep+H101)、表达新生抗原溶瘤病毒组(Neo-Oncolytic)的各项结果，证明采用表达新生抗原溶瘤病毒组进行治疗能取得优于其它四组治疗的良好抑瘤效果。
结果如图3、4、6、7、10、13所示。
实施例三：人源化药效模型上溶瘤病毒与新生抗原多肽疫苗联用的药效评估；
1、人源性肿瘤模型构建
1.1免疫重建人源化PDX小鼠模型构建——人源化NOD/SCID小鼠PDX模型
取病人黑色素瘤样本，必要时将样本冻存在冻存液(10％DMSO和90％FBS)中。组织块切成2mm×2mm×2mm大小。将非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷型(NOD/SCID)小鼠麻醉，背部皮肤制作小切口(～5mm)并扩张成一皮下通道，将新鲜处理后的2mm×2mm×2mm黑色素瘤塞入，切口用组织胶闭合。按照标准操作程序(SOP)，在60分钟内完成从黑色素瘤样本离体到接种到皮下的PDX建模(P0)，将PDX小鼠进行传代扩增，三代(P3)小鼠进行免疫重建并开展药效学实验。
将带有PDX的NOD/SCID小鼠(雌，4～6周)经亚致死性辐照处理，破坏小鼠自体骨髓造血功能。再通过尾静脉注射将浓度为4×107/0.5ml成熟的人外周血单核细胞(PBMC)植入免疫缺陷小鼠体内重建人的免疫系统，即hPBMC型。24天后取血，流式检测hCD45+和mCD45+的细胞比例，确定血液中人/鼠细胞的嵌合比率，入组小鼠需满足hCD45+细胞占比≥20％的标准，成功重建免疫系统的人源化PDX小鼠。
1.2免疫重建人源化PDX小鼠模型构建——人源化NSG小鼠PDX模型
取病人黑色素瘤样本，必要时将样本冻存在冻存液(10％DMSO和90％FBS)中。组织块切成2mm×2mm×2mm大小。将高度免疫缺陷NOD/SCID/IL-2rg(NSG)小鼠麻醉，背部皮肤制作小切口(～5mm)并扩张成一皮下通道，将新鲜处理后的2mm×2mm×2mm黑色素瘤塞入，切口用组织胶闭合。按照标准操作程序(SOP)，在60分钟内完成从黑色素瘤样本离体到接种到皮下的PDX建模(P0)，将PDX小鼠进行传代扩增。
将带有PDX的NSG小鼠(雌，4～6周)经亚致死性辐照处理，破坏小鼠自体骨髓造血功能。再通过尾静脉注射将浓度为4×107/0.5ml成熟的人外周血单核细胞(PBMC)植入免疫缺陷小鼠体内重建人的免疫系统，即hPBMC型。24天后取血，流式检测hCD45+和mCD45+的细胞比例，确定血液中人/鼠细胞的嵌合比率，入组小鼠需满足hCD45+细胞占比≥20％的标准，成功重建免疫系统的人源化PDX小鼠。
2、人源化PDX肿瘤模型——黑色素瘤模型上各组的抑瘤效果评估；
2.1肿瘤模型分组；
成功重建免疫系统的人源化PDX小鼠，选取25-30只肿瘤体积相近且平均肿瘤直径约为0.5厘米的小鼠入组，随机分为5组，每组至少5只，分别是阴性对照佐剂组、多肽组、溶瘤病毒组、多肽联合溶瘤病毒组和表达新生抗原溶瘤病毒组。
2.2肿瘤模型给药；
2.2.1多肽组给药；
将纯化的10条患者多肽(表2)溶于1ml PBS制得1mg/肽/ml(×10条肽)浓度的多肽溶液1ml。当小鼠肿瘤瘤体长至50mm3后，每4天进行一次多肽免疫，共4次，多肽给药体积为100μL/只。随后每间隔7天，再次进行1次多肽疫苗增强免疫，共3次。
多肽疫苗免疫方案为：将分组混合制备得到的肿瘤疫苗分别皮下注射于小鼠的四肢和头颈部五个部位，每个部位接种20μl疫苗，每天1次。
给药途径为皮下注射。每次多肽注射前半个小时，在注射点旁边位置注射GM-CSF作为疫苗佐剂。GM-CSF注射量为10μg/50μl/只。
2.2.2溶瘤病毒组给药；
将浓度为5×108pfu/ml病毒载体H101(上海三维)按照50μl/只的注射剂量给荷瘤小鼠瘤内给药。当小鼠肿瘤瘤体长至50mm3后，每4天注射一次，共注射4次。随后每间隔7天，进行1次溶瘤病毒增强免疫，即将选定的溶瘤病毒按照0.5×1012vp-1.5×1012vp/天的剂量进行瘤内注射，共3次。
2.2.3第一种联用疫苗：多肽联合溶瘤病毒组给药；
将选定的溶瘤病毒按照0.5×1012vp-1.5×1012vp/天的剂量进行瘤内注射，每4天1次，连续施用4次。随后每间隔7天，进行1次溶瘤病毒增强免疫，共3次。
均在注射溶瘤病毒的同一天进行个体化肿瘤新生抗原多肽疫苗的注射。将分组混合制备得到的肿瘤疫苗于溶瘤病毒注射点附近进行注射，每4天1次，共4次。随后每间隔7天，再次进行1次多肽疫苗增强免疫，共3次。
每次多肽注射前半个小时，在注射点旁边位置注射GM-CSF作为疫苗佐剂。GM-CSF注射量为10μg/50μl/只。
2.2.4第二种联用疫苗：表达新生抗原溶瘤病毒组给药；
将浓度为5×108pfu/ml带有肿瘤新生抗原的溶瘤病毒载体Neo-Oncolytic按照50μl/只的注射剂量给荷瘤小鼠瘤内给药。当小鼠肿瘤瘤体长至50mm3后，每4天注射一次，共注射4次。随后每间隔7天，进行1次溶瘤病毒增强免疫，共3次。
每次病毒注射前，注射GM-CSF于疫苗中作为佐剂，GM-CSF注射量为10μg/50μl/只。
2.2.5阴性对照佐剂组；
阴性对照佐剂(GM-CSF)组给药方法与多肽组给药方法大体一致，只是不需要注射多肽疫苗。
2.3取样检测及指标评估；
末次给药后1周收获外周血以及肿瘤细胞用于检测机体各项免疫指标。
记录并对比实验组和对照组中以及对比不同肿瘤模型组别中所有小鼠的生存周期，具体需要对比的参数包括但不仅限于：总生存期(OS)、中位生存期(MS)、无进展生存期(PFS)等。通过对比阴性对照佐剂组(Control)、多肽组(Peptide)、溶瘤病毒组(H101)、多肽联合溶瘤病毒组(Pep+H101)和表达新生抗原溶瘤病毒组(Neo-Oncolytic)的各项结果，证明采用表达新生抗原溶瘤病毒组进行治疗能取得优于其它四组治疗的良好抑瘤效果。
结果如图3、5、8、9、11、12、14、15所示。
本发明的第一种联用疫苗可利用溶瘤病毒试剂的肿瘤杀伤产生肿瘤病灶局部的免疫应答反应，提高新生抗原多肽试剂被抗原递呈细胞吞噬的效率以及能特异性识别肿瘤新抗原的T细胞的数量与肿瘤浸润能力，从而增强抗癌疗效；
本发明的第二种联用疫苗是将编码肿瘤新抗原的基因插入溶瘤病毒载体中，大量表达肿瘤新生抗原，并结合溶瘤病毒的肿瘤杀伤能力，进一步增强肿瘤病灶局部的免疫应答反应，提高杀伤型T细胞在肿瘤组织中的浸润程度，使局部产生免疫原反应，刺激效应细胞的产生，使“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤达到抗癌效果。
通过实验比较发现，第一种联用疫苗：新生抗原多肽与溶瘤病毒联用的肿瘤疫苗、第二种疫苗：表达新生抗原溶瘤病毒的肿瘤疫苗，这两种均具有良好的抑瘤效果，第二种联用疫苗具有显著的抑瘤效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 杭州纽安津生物科技有限公司
<120> 溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗及其制备方法
<141> 2019-08-16
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> mutant peptide
<400> 1
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1 5 10 15
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His Gly Thr Thr His Ser Leu Val Ile His Asp
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Ala Gln Ala Glu Arg Leu Ala Arg Ala Glu Glu
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1 5 10 15
Met Lys Gly Leu Cys Glu Lys Pro Leu Ala Ser
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Ala Asp Leu Arg Ser Asn Thr Gly Gly Gln Ala
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1 5 10 15
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Phe Arg Arg Lys Ala Phe Leu His Trp Tyr Thr Gly Glu Ala Met Asp
1 5 10 15
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Gly Phe Ser Gln Pro Leu Arg Arg Leu Val Leu His Val Val Ser Ala
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Met Lys Gly Leu Cys Glu Lys Pro Leu Ala Ser
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His Asn Trp Asp Phe Glu Pro Arg Lys Val Ser
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Ser Arg Ala Ile Pro Phe Gly Thr Met Val Ala
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<400> 21
Asn His Ser Gly Leu Val Thr Phe Gln Ala Phe Ile Asp Val Met Ser
1 5 10 15
Arg Glu Thr Thr Asp Thr Asp Thr Ala Asp Gln
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<210> 22
<211> 27
<212> PRT
<213> mutant peptide
<400> 22
Ile Pro Ser Gly Thr Thr Ile Leu Asn Cys Phe His Asp Val Leu Ser
1 5 10 15
Gly Lys Leu Ser Gly Gly Ser Pro Gly Val Pro
20 25
<210> 23
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<212> PRT
<213> mutant peptide
<400> 23
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1 5 10 15
Ile Phe Glu Asn Pro Val Asp Trp Lys Glu Lys
20 25
<210> 24
<211> 54
<212> DNA
<213> Carrier plasmid
<400> 24
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54

Claims (1)

1.溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，溶瘤病毒与新生抗原联用的肿瘤疫苗为单用表达个体化新生抗原的溶瘤病毒试剂，将编码肿瘤新生抗原的基因串联插入溶瘤病毒载体中得到表达新生抗原的溶瘤病毒；
所述肿瘤新生抗原的鉴定的方法是：
将肿瘤患者的正常细胞 DNA 测序结果和肿瘤细胞 DNA 测序结果比对到人类参考基因组，从比对结果中鉴定出肿瘤细胞的体细胞突变；
再对肿瘤进行RNA测序，确定并评估突变的等位基因的表达；
根据基因组比对结果预测患者自身的I型及II型HLA分型，并利用亲和力预测算法netMHCpan鉴定能与HLA结合的新生抗原；
根据与HLA的亲和力、突变的可信程度、突变频率筛选出一批突变位点，根据I型及II型HLA能够结合的多肽长度8-16个氨基酸，确定疫苗多肽的序列，多肽的数量范围为10~20条，从而得到新生抗原多肽序列；
新生抗原突变位点筛选的标准为：亲和力小于500nM；突变事件经实验验证为阳性；突变频率大于等于0.1；
制备方法包括如下内容：
通过质粒构建系统构建新生抗原基因的质粒，然后通过病毒转染系统将带有新生抗原的基因整合到溶瘤病毒基因内，将病毒载体转染入细胞中获得第一代病毒种子液，取第一代病毒种子液经多次反复冻融使细胞破裂所释放的病毒感染生长至80%～90%密度的生产细胞中，感染2～4天后收集细胞和上清，所收集的细胞再经反复冻融后得到第二代表达新生抗原的溶瘤腺病毒，按照该方法扩增3～4轮，收获表达肿瘤新生抗原的溶瘤病毒。
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Oncolytic adenovirus drives specific immune response generated by a polyepitope pDNA vaccine encoding melanoma neoantigens into the tumor site;Alessandra Lopes1et al.;《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》;20190710;第7卷;摘要、结果和讨论，表1 *

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