JPH08507757A - 腫瘍の治療並びにヒトと動物の免疫化に使用する組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 腫瘍の治療及びヒト又は動物の免疫化のための組成物であって、一以上のイムノモジュレーター（immunomodulators）をインビボで産生する少なくとも１つの遺伝子を生物体において一時的に発現する細胞、ウイルス又はバクテリアと、ウイルス、又はウイルスを産生する細胞であって、該ウイルスが、好ましくは、治療された生体の分裂中の細胞に感染し、分裂中の細胞中における発現がそれらの破壊を惹起する少なくとも１つの遺伝子をそれらのゲノム中に有しているものとの相乗的な組み合わせを含む組成物。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍の治療並びにヒトと動物 の免疫化に使用する組成物 本発明は、腫瘍の治療と腫瘍に対する生物の免疫化に使用する組成物に関する 。 ごく最近、インターロイキンを生成する相乗作用性（synergistic）の腫瘍細 胞を、腫瘍を有する生物に対し局所的に注入することにより、生物がこの腫瘍を 排除することできることが、多くの科学研究チームにより確認されている。 このことは、インターロイキン−２については、ブベニク（Bubenik）らによ り示され（Immunology Letters，19,278-282，1988；Immunology Letters，23,2 87-292,1989）、フィアロン（Fearon）ら（Cell.，60,397-403，1990）およびレ イ（Ley）らにより確認されている（European Journal of Immunology，1991，2 1：851-854；Res.Immunol.，1990，141：855-863）。 これら報告の著者は、上記の排除後には、その応答が記憶されることを報じて いる。従って、同種の腫瘍が他の部位に移植されたとしても、動物は、該同種の 腫瘍のその後の成長に対して予防接種された（vaccinated）ことになる。 ゴルムベク（Golumbek Science，254,713-716，1991）およびテパー（Tepper ）ら（Cell，57,503-512，1989）が報告している様に、インターロイキン−４を 生成する相乗作用性（synergistic）のガン細胞についても、試験が行われ、同 様の結果が得られており、さらに腫瘍壊死因子（TNF）を生成する細胞について も、ブランケンスタイン（Blankenstein）らにより記述されている（J.Exp.Med. ，173,1047-1052，1991）。 治療を受けるべき生物から得られた腫瘍細胞に対し、サイトカイニンをコード する遺伝子とヘルペス ウィルス由来のチミジン−キナーゼ遺伝子（HSVTK）の 様な自殺遺伝子（suicide gene）とを併せて導入する可能性も、提案されている （Pardoll、Current Opinion in Oncology，Vo1.4，No.6，1124-1129，1992）。 この著者は、この戦略は、特に複雑であり、１００％の細胞形質導入を必要と すると述べている。 それにもかかわらず、この戦略は、ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシテ ィーおよびザ ユニバーシティー オブ テキサス システムによりなされた出 願番号No.92/05262 PCT/US 91/06 612において、試験されている。この出願は腫 瘍に対する免疫応答を活性化する（potentialize）ことを目的とする組成物に関 し、該組成物 は、この腫瘍から得られた以下の特性を有する細胞を含んでいる： −免疫活性化ポリペプチドを発現し、且つ −これらの細胞を破壊するであろう遺伝子、又は自殺遺伝子を有する。 免疫活性化ポリペプチドは、インターロイキン１または２の様なサイトカイニ ンであっても良い。自殺遺伝子は、例えば、チミジン−キナーゼ遺伝子である。 この出願の対象である細胞組成物は、治療されるべき生物から得られるので、 この生物に対して相乗的作用を有する。該組成物は、ウィルスを含まない。 上記の刊行物に記載されたシステムは、ヒトに適用するためには、種々の問題 点を有している。 これらの全ての刊行物において、インターロイキンを生成する細胞は、個体ま たは相乗的作用を有する個体からの細胞であり、インターロイキンを発現する様 に予め修飾されている。 ヒトの治療にとってのこの方法の問題点の１つは、生物に注入されたインター ロイキン発現細胞が、腫瘍を排除した後でさえ、成長し続けるかも知れないとい うリスクである。 この問題点を解消するために、一つの治療方法が、テ ストされている。この方法は、インビボで１または２以上の生物学的に活性な物 質、例えばインターロイキン−２を生産させることのできる遺伝子を発現する同 種異系の（allogeneic）或いは異種の（xenogeneic）細胞を生物に注入すること からなる（1991年11月15日出願のフランス特許出願FR 91 14 119：「ヒトまたは 動物生物体の治療のための細胞組成物」参照）。 この方法は、上記の物質による生物の過渡的な治療を可能とする。何故ならば 、細胞が、その免疫学的な性質の故に、生物により排除されるからである。 この治療は、腫瘍細胞（LPB腫瘍）の接種９日後に、腫瘍細胞の近傍に、イン ターロイキン−２を生成する同種異系細胞を注入することにより、テストされた 。数日間にわたり、腫瘍成長が減少するという有利な結果が観察された。 これは、採用された条件下での一過性の効果であり、接種された腫瘍細胞に特 異的な免疫記憶を常に発生させるものではない。この手法で治療された動物にお いて、同じ腫瘍細胞（Lewis腫瘍）の引き続く接種は、腫瘍を成長させ得る。 さらに、観察された効果、すなわち腫瘍成長の減少は、全腫瘍状塊（entire t umorous mass）を消滅させるには 必ずしも十分なものではなかった。 注目すべき点は、従来技術に関連して述べた全ての実験において、腫瘍成長の 不存在は、通常健康な動物について測定されており、予め定着した腫瘍（pre-es tablished tumours）については、殆ど測定されていないことである。例えば、 ゴルムベクら（（1991）Golumbek et al．Science，254，713-716）およびポル ガドール（（1992）Porgador et al．Cancer Res．52；3679-3686）は、いずれ の場合にも、予め定着した腫瘍の治療を目的として組成物を注入しているが、治 療の時点で、予め定着した腫瘍は、肉眼で確認されていないし、肉眼的にも検出 されていない。 異なるアプローチにより、トロージャンら（TROJAN et al．（1992）Proc．Na t1．Acad．Sci.，USA，B9，4874-4878，（1993）Science，259，94-97）は、IGF １（インスリン様成長因子１）に対する相補性アンチセンスDNAをコードするベ クターで腫瘍細胞をトランスフェクトすることにより、ラット（glioma）におけ る腫瘍の免疫原性を修飾している。著者によれば、これらの修飾された細胞の注 入は、発癌性（tumorigenicity）の消滅をもたらし、定着した腫瘍に対し間接的 な効果を発揮する。しかしながら、このアプローチは、オートクリン成長因子と してのIGFを分泌する腫瘍細胞に限られており、特異的な免疫応答を発生させる ためには、各腫瘍細胞の操作を必要とする。 ヘルペスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子を含むレトロウィルスを腫瘍 細胞に接種するという他の提案が、２種のモデルについて試験されている。第１ のモデルにおいては、カルバーら（Culver et al，（1992）Science，256，1550 -1552）治療学的なアプローチを開発した。この方法では、ラット グリオーマ （脳腫瘍）に、ヘルペスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子を挿入したレト ロウィルスベクターを生成する異種の細胞が注入される。急速に成長する細胞（ 腫瘍細胞）に感染するTK⁺ウィルス粒子が局所的に生成した後、ガンシクロヴィ ル（Ganciclovir：Merck Index，参照番号4262）で全身的に治療することにより 、予め定着した腫瘍状塊（pre-established tumourous mass）の大きな退縮が起 こる。しかしながら、報告された実験によれば、治療された１４動物体の中で１ １動物体においてのみ、完全な肉眼的および顕微鏡的な腫瘍の退縮が認められた に過ぎないので、この種の治療は完全に効果的であるとは言えない。さらに、少 数の腫瘍細胞（４×１０⁴個の細胞）が注入され、治療（TK⁺ウィルス粒子を産生 する繊維芽細胞の注入） が、腫瘍細胞の接種後の極く早い時期（５日目以降）に行われている。しかしな がら、このモデルの大きな問題点は、同じ腫瘍細胞の第二次接種に対する免疫記 憶が観察されないという点にある。 第２のモデルは、上記に比較的類似したアプローチを展開している。肉眼的に 確立された、定着した肝腫瘍が、ヘルペスウィルスのTK遺伝子を発現し且つ選択 的に腫瘍細胞に感染するウィルス粒子を生産する異種繊維芽細胞の腫瘍内注入に より、処置される。インビボでの腫瘍細胞へのTK遺伝子の形質導入期間後、ガン シクロヴィル（Ganciclovir）での治療により、腫瘍状塊の大部分は、消滅した 。しかしながら、上記と同様な大きな問題点、すなわち、腫瘍細胞の完全な消滅 と免疫記憶に関する保証が存在しないという問題点は、依然として残っている。 これら２つのアプローチは、腫瘍細胞中にTK遺伝子の形質導入を行いうるウィ ルス粒子を発現することができる異種細胞を用いる。第２のアプローチは、カル バーら（Culver et al）により開発された方法に比して、より効果的である。そ の理由は、その方法が、第一次結腸ガンの肝臓転移の状況を模倣しており、肉眼 的に観察できる十分に進行した腫瘍部位に適用できるからである。 特許出願第93/02556 PCT/US 92/06 188号（ユニバーシ ティ オブ ロチェスター）に記載された他の方法においては、ガン患者には、 自殺遺伝子が導入されている患者自身のガン細胞が再注入される。 この出願に開示されたテストによれば、自殺遺伝子に関連する物質で形質転換 されたこの種の細胞組成物による治療は、生体中の適用対象である細胞のみなら ず、他のガン細胞の破壊をももたらす。生体中の形質転換細胞の破壊は、さらに 、他の非形質転換ガン細胞の破壊をももたらす。この出願に記載された組成物は 、ウィルスを全く含まない。 最後に、電気インパルスとインターロイキン−２を分泌する同種異系または異 種細胞との組合せ使用に基づく技術が最近開発された（ミルら（MIR et al）.、 Compte-Rendu de L′Academie des Sciences de Paris，serie III，314，539-5 44，1992）。 ミルらによれば（Eur.J.Cancer 27，68-72，1991）、電気化学的療法は、ブレ オマイシンを局所的に注入し、電気インパルスを腫瘍近傍に付与することにより 行われる。 これら２つの方法の併用は、それぞれの方法を個別に行う際に観察される抗腫 瘍効果を改善させる。 しかしながら、電気化学的療法は、インターロイキン −２を分泌する細胞を併用する場合にも、少なくとも１つの接近可能部位を有す る腫瘍にのみ容易に適用できるという欠点を有している。 従って、上記で解析した技術の現状から、上述した方法は、特に定着した腫瘍 に対しては、必ずしも効果的であるとは言えないこと、その腫瘍に対して特異的 な免疫記憶を系統的に与えるものではないこと、換言すれば、腫瘍の局部的治療 を可能とするに過ぎないことが明らかである。 従って、本発明者は、第一に腫瘍が何処に存在していようとも、その急速な消 滅を達成でき、第二に治療された腫瘍に対して生体の長期的で特異的な免疫化を 達成できる組成物を見出すことを目的として、研究を重ねてきた。 その結果、本発明者は、驚くべきことに、イムノモジュレーター分泌手段と腫 瘍細胞を特異的に自殺に導くベクターとの組合せにより、腫瘍の急速で、決定的 な消滅とこの腫瘍に対する生物の特異的な長期免疫化を非常に多くの場合に達成 できることを見出した。 従って、本発明の主題は、ヒト又は動物の生物体における腫瘍の治療及びこの 腫瘍に対してそれらを免疫化するために使用される組成物であって、該組成物は 、 − 細胞、ウイルス又はバクテリアであって、一以上のイムノモジュレータ ー（immunomodulators）をインビボでそれらに産生させる少なくとも１つの遺伝 子を生物体において一時的（transiently）に発現する細胞、ウイルス又はバク テリア、及び − ウイルス、又はウイルスを産生する細胞（該ウイルスは、可能であれば 、好ましくは、治療された生物体の分裂中の細胞に感染し、分裂中の細胞中にお ける発現がそれらの破壊を惹起する少なくとも１つの遺伝子をそれらのゲノム中 に有している） の相乗的な組み合わせを含有する。 上記したような組成物は、一以上のイムノモジュレーターをインビボで産生し 、加えて、分裂中の細胞中における発現がそれらの破壊を惹起する少なくとも１ つの遺伝子をそれらのゲノム中に有しているウイルスを産生する細胞を、含有し ているのが有利である。 これら組成物において使用される細胞は、治療された生物体から除去されるよ うに、同種異系の又は異種の細胞であるのが好ましい。それらは、それら自身が 、上記のような、その分裂中の細胞中での発現がそれらの破壊を惹起する少なく とも一つの遺伝子をそれらのゲノム中に有しているウイルスにより感染され、又 は、該ウイルス の生産体であってもよい。 従って、該組成物は、生物体の分裂中の細胞に感染させるのに使用するウイル スが、イムノモジュレーターの産生の原因となっているような細胞を含有するこ とができる。 上記イムノモジュレーターは、インターロイキン−２、インターロイキン−４ 、インターロイキン−７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン−ガンマ 、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子；Granulocyte-Macr ophage Colony Stimulating Factor）の単独又は組み合わせであるのが有利であ る。 これらイムノモジュレーターは、上記した細胞及びバクテリアに加えて、レト ロウイルス、ポックス（Pox）ウイルス（痘苗ウイルス（vaccine virus）、カナ リアポックス（Canary Pox））、アデノウイルス及び欠損アデノウイルス随伴ウ イルス（defective Adenovirus associated viruses；ＡＡＶ）等の、ウイルス ゲノム上に存在する遺伝子から発現されてもよい。 上記バクテリアは、イムノモジュレーターを産生する細胞内バクテリアであっ てもよい。 イムノモジュレーターは、細胞、バクテリア又はウイルスに加えて、生物体に おいてイムノモジュレーターの 放出を可能とするどのような手段によってもたらされてもよいことが分かるであ ろう；一つのそのような手段としては、例えば、生物体においてイムノモジュレ ーターを放出する移植されたマイクロポンプ（micropump）である。 好ましくは、治療された生物体の分裂中の細胞に感染し、分裂中の細胞中にお ける発現がそれらの破壊を惹起する少なくとも１つの遺伝子をそれらのゲノム中 に有しているウイルス、換言すれば溶解剤（lysis agent）は、レトロウイルス 、ポックスウイルス（Pox virus）又はアデノウイルスであるのが好ましい。こ れらウイルスは、好ましくは生物体の分裂中の細胞のほとんどを感染し又は破壊 する特性を有しているならば、なおさら有利である。 それらは、生物体において迅速に除去されるように選択された細胞によって、 特に同種異系又は異種（allo-or xenogeneic）の細胞によって、もたらされこと ができる。 分裂中の細胞中における発現がそれらの破壊を惹起する遺伝子は、チミジンキ ナーゼ又はシトシンデアミナーゼの遺伝子であるのが好ましい。これら遺伝子を 有する細胞の破壊は、それらに、それぞれ、ガンシクロビール（Ganciclovir） 及び５−フルオロシチジンを供給することによって誘導される。 本発明は、また、腫瘍及び癌を治療するための及びこれら疾病に対して生物体 を免疫化するための医薬品の製造への上記組成物の使用にも関する。 該組成物のすべてのエレメントを同時に投与するのが有利である。それらは、 同時に又は別個に投与することができる。 また、前記二つの主成分を、時間を遅らせて投与することも可能である。従っ て、好ましくは、生物体の分裂中の細胞に感染し、分裂中の細胞中における発現 がそれらの破壊を惹起する少なくとも１つの遺伝子をそれらのゲノム中に有して いるウイルス又はウイルスを産生する細胞を最初に投与し、次いで、分裂中の細 胞による代謝がそれらの破壊を惹起する物質を投与するのが有利である。 腫瘍状塊（tumourous mass）のこの除去段階に続いて、イムノモジュレーター を発現する細胞、ウイルス又はバクテリアの投与によりこの腫瘍に対する生体の 免疫化段階がある。 本発明に係る組成物は、当業者に利用可能などのような手段によっても、特に 、メディカルイメージング（medical imaging）の下でのシリンジ注射（syringe injection）により導入できる。 この治療は、局所治療であるのが有利であるが、全身的なものであってもよい 。 本発明を、レトロウイルスｐＭＴＫベクターマップを示す添付の単一の図を参 照して実施例により説明する。 実施例： インターロイキン−２を分泌し、ＰＭＴＫレトロウイルスを産生する細胞を用 いた腫瘍を有するマウスの治療 腫瘍を有するＣ５６ ＢＬ／６マウスを、ＨＳＶＩウイルスのチミジンキナー ゼ遺伝子を有するＰＭＴＫレトロウイルス及びインターロイキン−２を産生する 同種異系（allogeneic）細胞を含む組成物で処置した。 注射は、腫瘍の近傍に行なった。 上記ｐＭＴＫベクター（図面参照）は、下記の特徴を有する： ＬＴＲ−５’− ＢａｍＨ１部位（転写のスタート から−３５０）までのＭｏｖ３ − ＢａｍＨ１部位（−３５０）から Ｋｐｎ１部位（＋３０）までの Ｍｏｖ１３ − Ｋｐｎ１部位（＋３０）から Ｐｓｔ１部位（＋５６０）までの Ｍｏｖ９（パッケージング配列を 含んでいる） − Ｃｌａ１部位（＋７６７４）の ３’からＵ３（＋７８１７）まで の非コーディング配列は、 Ｍｏｖ３に由来する ＬＴＲ−３’− ７９１０（又は−３５０）に位置す るＢａｍＨ１部位までのＭｏｖ３ − Ｕ５の末端までのＭｏｖ１３ ＣＲＩＰパッケージング細胞系を、ｐＭＴＫプラスミド（２０μｇ）とｐＷＬ ＮｅＯプラスミド（１μｇ）とで共−トランスフェクトする。数クローンがＧ４ １８セレクションで単離された。 選択されたクローンの強度（strength）は、Ｌ ＴＫ⁺細胞に対するＨＡＴ耐 性（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を付与する能力により測定し て１ｍｌ当たり、５×１０⁵の感染性粒子であった。Ｌ ＴＫ⁺細胞の感染は、ウ イルス粒子を含有する上澄み液を連続希釈して行う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/76 7431−4Ｃ 38/00 38/21 38/45 Ｃ１２Ｎ 15/09 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/52 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 ウニベルシテ ピエール エ マリー キ ュリー フランス国 エフ―75252 パリ セデッ クス 05 プラス ジュシユー ４ (71)出願人 アシスタンス プブリク−オピトウ ドゥ パリ フランス国 エフ―75004 パリ アベニ ュ ビクトリア ３ (72)発明者 ロト， クロード フランス国 エフ―75116 パリ リュ ラロ 26 (72)発明者 クリルスキー， フィリップ フランス国 エフ―75001 パリ リュ ドゥ モンパンシエ １ (72)発明者 ミール， ルイ フランス国 エフ―91370 ベリエール― ル―ビュイソン アレー デ ボーベパン 22 (72)発明者 クラッツマン， ダビド フランス国 エフ―75013 パリ リュ デュ タージュ 11 (72)発明者 ザルツマン， ジャン−ルー フランス国 エフ―75011 パリ ブール バール ヴォルテール 18

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ヒト又は動物の生物体における腫瘍の治療及び腫瘍に対してこれら生物 体を免疫化するために使用される組成物であって、 − 細胞、ウイルス又はバクテリアであって、一以上のイムノモジュレータ ーをインビボでそれらに産生させる少なくとも１つの遺伝子を生物体において一 時的に発現するもの、及び − ウイルス、又はウイルスを産生する細胞であって、該ウイルスが、好ま しくは、治療された生物体の分裂中の細胞に感染し、分裂中の細胞中におけるそ の発現がそれらの破壊を惹起する少なくとも１つの遺伝子をそれらのゲノム中に 有しているもの の相乗的な組み合わせを含有する組成物。 ２． 上記細胞が、一以上のイムノモジュレーターをインビボで産生し、加え て、分裂中の細胞中におけるその発現がそれらの破壊を惹起する少なくとも１つ の遺伝子をそれらのゲノム中に有しているウイルスを産生することを特徴とする 請求項１に記載の組成物。 ３． 上記細胞が、治療された生体に対して、同種異系（allogeneic）又は異 種（xenogeneic）であることを特徴とする請求項１及び２のいずれかに記載の組 成物。 ４． 上記イムノモジュレーターが、インターロイキン−４、インターロイキ ン−７、ＴＮＦ、インターフェロン−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦの単独又は組み合わ せであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の組成物。 ５． 上記ウイルスが、チミジンキナーゼ又はシトシンデアミナーゼを発現す る遺伝子を有していることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の組成 物。 ６． ウイルスが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウ イルス又はポックスウイルスであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか に記載の組成物。 ７． 腫瘍及び癌の治療及び／又はこれら疾病に対する生物体の免疫化のため の医薬品の製造への請求項１乃至６のいずれかに記載の組成物の使用。 ８． 上記組成物の各成分が、同時に又は別個に存在する請求項７に記載の使 用。 ９． 好ましくは、生物体の分裂中の細胞に感染し、分裂中の細胞中における その発現がそれらの破壊を惹起する少なくとも１つの遺伝子をそれらのゲノム中 に有している、ウイルス、又はウイルス産生細胞が、イムノモジュレーターを産 生する細胞、ウイルス又はバクテリア の投与の前に又は同時に投与される請求項７に記載の使用。 １０． イムノモジュレーターを産生する細胞、ウイルス又はバクテリアが、 マイクロポンプのような、生体においてイムノモジュレーターの放出を可能とす る任意の他の手段によって置き換えられている請求項５乃至９のいずれかに記載 の使用。