PT684842E - Composicao para o tratamento de tumores e para a imunizacao de organismos contra tumores - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DE TUMORES E PARA A IMUNIZAÇÃO DE ORGANISMOS CONTRA TUMORES A presente invenção tem como objecto uma composição para o tratamento de tumores e para a imunização de organismos contra tumores.

Muito recentemente, diversas equipas científicas demonstraram que a injecção localizada, em organismos atingidos por um tumor, de células tumorais singénicas produtoras de uma interleucina permitiam a rejeição desse tumor pelo organismo.

Isto foi evidenciado em relação à interleucina-2 por Bubenik et al. (Immunology Letters, 19, 279-282, 1988; Immunology Letters, 23, 287-292,1989) e confirmado nomeadamente por Fearon et al. (Cell., 60, 397-403, 1990) e por Ley et al. (European Journal of Immunology, 1991, 21 : 851-854; Res. Immunol., 1990,141 : 855-863).

Os autores destes artigos mencionam que a rejeição é acompanhada pela memorização da resposta. O animal fica assim vacinado contra o desenvolvimento posterior de um tumor do mesmo tipo, mesmo que este tenha sido enxertado num local diferente. Células cancerosas singénicas produtoras de lnterleucina-4 também foram testadas com resultados semelhantes, como relatam Golumbek (Science, 254, 713 - 716, 1991) e Tepper et al. (Cell, 57, 503-512, 1989), bem como células produtoras do factor de necrose dos tumores (TNF), como descrevem Blankenstein et al. (J. Exp. Med., 173, 1047-1052, 1991).

Também foi referida (Pardoll, Current Opinion in Oncology, Vol. 4, N°6,1124-1129,1992) a possibilidade de co-introduzir, em células tumorais provenientes do organismo a tratar, por um lado genes codificadores para citosinas e, por outro lado, genes suicidas como o gene da timidina-quinase do vírus do herpes (HSVTK). 1 O autor menciona que esta estratégia é particularmente complicada e necessitaria da transdução de 100% das células.

Esta estratégia foi não obstante testada no pedido de registo PCT/US 91/06 612, em nome de THE JOHN HOPKINS UNIVERSITY e THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM, que tem como objecto composições destinadas a potencializar a resposta imunitária contra um tumor, as quais compreendem células provenientes desse tumor: - que exprimem um polipéptido imunopotencializador; e - possuem um gene susceptível de matar essas células, ou gene suicida. 0 polipéptido imunopotencializador pode ser uma citosina, por exemplo uma interleucina 1 ou 2. O gene suicida pode ser por exemplo o gene da timidina-quinase.

As composições celulares objecto deste pedido de registo provêm do organismo a tratar e são portanto singénicas para esse organismo. Não incluem vírus.

Os sistemas descritos nestas publicações apresentam inconvenientes considerando a sua aplicação ao homem.

Com efeito, em todas estas publicações, as células produtoras de interleucinas são células do indivíduo ou de um indivíduo singénico, que foram modificadas para exprimirem a interleucina.

No caso de terapia humana, um inconveniente desta metodologia reside no facto de as células que exprimem a interleucina e injectadas no organismo correrem o risco de continuar a desenvolver-se mesmo depois da rejeição do tumor.

Para atenuar este inconveniente, foi testado um método de tratamento terapêutico que consiste em injectar no organismo células alogénicas ou xenogénicas que exprimem genes que lhes permitem produzir in vivo uma ou várias substâncias biologicamente activas, como lnterleucina-2 (ver o Pedido de Registo de Patente FR 91 14 119 de 15 de 2

Novembro de 1991 intitulado «Composition cellulaire pour le traitement des organismes humains ou animaux»).

Este método permite um tratamento transitório do organismo com estas substâncias porque as células, devido à sua natureza imunológica, são rejeitadas pelo organismo.

Este tratamento foi testado pela injecção, próximo de células tumorais (tumor LPB), de células alogénicas produtoras de lnterleucina-2, 9 dias depois da inoculação pelas células tumorais. Observa-se um efeito benéfico que se traduz pelo abrandamento do crescimento tumoral durante alguns dias.

Este efeito é transitório e nem sempre permite, nas condições utilizadas, induzir uma memorização imunitária específica da célula tumoral inoculada. Com efeito, nos animais tratados deste modo a inoculação posterior da mesma célula tumoral (tumor de Lewis) pode traduzir-se por um crescimento tumoral.

Além disso, o efeito observado, isto é, o abrandamento do crescimento tumoral, nem sempre é suficiente para provocar a eliminação no conjunto da massa tumoral.

Observar-se-á que, em todas as experiências descritas no estado da técnica, a ausência de crescimento tumoral é geralmente medida num animal saudável e muito raramente em tumores preexistentes. Assim, GOLUMBEK et al. [(1991) Science, 254, 713-716] e PORGADOR et al. [(1992) Câncer Res. 52, 3679-3686] injectaram, em ambos os casos, uma composição com o objectivo de tratar um tumor preexistente mas, no momento do tratamento o tumor preexistente não era nem visível nem possível de distinguir macroscopicamente.

Numa abordagem diferente, TROJAN et al. [(1992) Proc. Natl. Acad. Sei.. EUA, 89, 4874-4878, (1993) Science, 259, 94-97] modificaram a imunogenicidade de um tumor num rato (glioma) transfectando as células tumorais com um vector codificador para um ADN complementar anti-sentido do IFG1 (Factor 1 de Crescimento Semelhante à Insulina -Insuline-like Growth Factor 1). Os autores mencionam que a injecção destas células modificadas se traduz pela ausência de tumorigenicidade e por um efeito à distância 3 sobre um tumor preexistente. Contudo, esta abordagem está limitada a células tumorais que segregam IGF como factor autócrino de crescimento e requer a manipulação de cada célula tumoral para gerar uma resposta imunitária especifica.

Outra proposta baseada na infecção de células tumorais por um retrovirus portador do gene codificador para a timidina-quinase do herpes foi testada em dois modelos. No primeiro modelo, Culver et al. [(1992) Science, 256, 1550-1552] desenvolvem uma abordagem terapêutica na qual se injectam, num glioma (tumor cerebral) de rato, células xenogénicas que produzem um vector retroviral, no qual foi inserido o gene codificador para a timidina-quinase do herpes. Depois da produção local de partículas virais TK\ que vão infectar as células de crescimento rápido (células tumorais) o tratamento sistémico com Ganciclovir (Merck Index, referência 4262) induz uma regressão maciça da massa tumoral preexistente. Contudo, a eficácia deste tipo de tratamento não é total visto que, na experiência descrita, só em onze animais dos catorze tratados se observa uma regressão tumoral completa, macroscópica e microscópica. Além disso, o número de células tumorais injectadas é pequeno (4 x 104 células) e o tratamento (injecção de células fibroblásticas produtoras de partículas virais TK+) é efectuado muito cedo (a partir do quinto dia) depois da inoculação das células tumorais. O principal inconveniente continua contudo a ser que não se observou neste modelo qualquer memória imunitária em relação a uma inoculação secundária das mesmas células tumorais. O segundo modelo desenvolve uma abordagem relativamente semelhante à referida acima. Tumores hepáticos preexistentes e macroscópicos são tratados por injecção intratumoral de fibroblastos xenogénicos produtores de partículas virais que exprimem o gene TK do vírus do herpes e que infectam selectivamente as células tumorais. Depois de um período de transdução do gene TK para as células tumorais in vivo, a grande maioria da massa tumoral é eliminada por um tratamento com Ganciclovir (GVC). Contudo, os principais inconvenientes continuam a ser os mesmos, nomeadamente a ausência de garantia quanto à eliminação total das células tumorais e à memorização.

Estas duas abordagens recorrem a células xenogénicas capazes de exprimir partículas virais que podem transduzir o gene TK para as células tumorais. A segunda abordagem, comparada com a desenvolvida por Culver et al., é mais eficaz porque reproduz uma 4 situação de metastases hepáticas de um cancro primário do cólon e intervém num núcleo tumoral bem desenvolvido e visível macroscopicamente.

Numa outra técnica descrita no pedido de registo PCT/US 92/06 188 (UNIVERSIDADE DE ROCHESTER), doentes atingidos por cancros são reinjectados com as suas próprias células cancerosas nas quais foi introduzido um gene suicida.

Os ensaios descritos neste pedido de registo mostram que o tratamento com este tipo de composição celular transgénica e depois com a substância relativa ao gene suicida permite provocar a destruição no organismo não só das células objecto do pedido de registo mas também das outras células cancerosas. A destruição das células transgénicas no organismo provoca assim a destruição das outras células cancerosas não transgénicas. As composições descritas neste pedido de registo não incluem vírus.

Finalmente, foi recentemente desenvolvida [MIR et al. (1992), Compte-Rendu de 1’Académie des Sciences de Paris, série III, 314, 539-544] uma técnica baseada na utilização combinada de impulsos eléctricos e de injecções locais de células alogénicas ou xenogénicas que segregam lnterleucina-2. A electroquimioterapia consiste, segundo MIR et al., (Eur. J. Câncer 1991, 27, 68-72) em injectar bleomicina localmente e aplicar impulsos eléctricos próximo do tumor. A utilização combinada destes dois métodos potencializa o efeito anti-tumoral observado em relação a cada um dos dois métodos utilizados individualmente.

Contudo, a electroquimioterapia apresenta o grave inconveniente, mesmo em combinação com a utilização de células segregadoras de interleucina-2, de só ser de fácil aplicação a tumores em que pelo menos um dos seus núcleos é acessível.

Conclui-se portanto claramente do estado da técnica analisado acima que os métodos descritos nem sempre são eficazes, em particular contra tumores preexistentes, e que não fornecem sistematicamente uma memória imunitária específica desse tumor, ou apenas permitem um tratamento local dos tumores.

Os requerentes dedicaram-se portanto a descobrir uma composição que permita obter por um lado o desaparecimento rápido de um tumor, seja qual for a sua localização, e por outro lado a imunização específica e a longo prazo do organismo contra o tumor tratado.

Assim, demonstraram de modo surpreendente que a combinação de meios de segregação de imunomoduladores e de vectores conducentes especificamente ao suicídio das células tumorais permite, na maioria dos casos, obter o desaparecimento rápido e definitivo do tumor e a imunização específica a longo prazo do organismo contra esse tumor. A presente invenção tem portanto como objecto uma composição destinada a tratar os tumores de organismos humanos ou animais e a imunizá-los contra esse tumor, em que a referida composição compreende, em associação sinérgica: - células, vírus ou bactérias que exprimem transitoriamente no organismo pelo menos um gene que lhes permite produzir in vivo um ou vários imunomoduladores, e - vírus, ou células produtoras de vírus, em que os referidos vírus infectam, se possível, preferencialmente as células em divisão do organismo a tratar e são portadores no seu genoma de pelo menos um gene cuja expressão nas células em divisão vai provocar a sua morte.

De modo vantajoso, a composição tal como descrita acima, é composta por células que produzem in vivo um ou vários imunomoduladores e que produzem ainda vírus portadores no seu genoma de pelo menos um gene cuja expressão nas células em divisão vai provocar a sua morte.

As células utilizadas nestas composições serão de preferência células alogénicas ou xenogénicas, para permitir a sua eliminação dos organismos tratados. Elas próprias poderão ser infectadas por ou produtoras de vírus portadores no seu genoma de pelo menos um gene cuja expressão em células em divisão vai provocar a sua morte, tal como definida acima. 6 A referida composição pode assim compreender células em que o vírus utilizado para infectar as células do organismo em divisão é responsável pela produção do imunomodulador.

De forma vantajosa, os imunimoduladores são lnterleucina-2. lnterleucina-4, Interleucina-7, TNF (Factor de Necrose dos Tumores - Tumor Necrosis Factor), Interferon-gama, GM-CSF (Factor de Estimulação de Colónias - Colony Stimulating Factor -granulomonocitário), sozinhos ou combinados.

Estes imunimoduladores podem ser expressos, além das células e bactérias acima citadas, a partir de genes contidos no genoma de vírus, como retrovírus, vírus Pox (vírus da vacina, Canary Pox), Adenovírus, bem como vírus defectivos associados aos Adenovírus (AAV).

As bactérias podem ser bactérias intracelulares produtoras de um imunomodulador.

Observar-se-á que os imunomoduladores podem ser fornecidos por qualquer meio, além das células, das bactérias ou dos vírus, que permita a difusão de imunomoduladores no organismo: um desses meios é por exemplo uma microbomba enxertada e que liberte imunomoduladores no organismo.

Os vírus que infectam preferencialmente as células em divisão do organismo tratado e que são portadores no seu genoma de pelo menos um gene cuja expressão nas células em divisão vai provocar a sua morte, ou agentes de lise, são de preferência retrovírus, vírus Pox ou Adenovírus. Estes vírus serão tanto mais vantajosos quanto podem apresentar a propriedade de infectar ou matar preferencialmente e na sua maior parte as células do organismo que se dividem.

Podem ser fornecidos por células escolhidas para serem eliminadas rapidamente no organismo, nomeadamente alogénicas ou xenogénicas. O gene cuja expressão nas células em divisão vai provocar a sua morte é de preferência o gene de uma timidina-quinase ou de uma citosina desaminase. A morte das células 7 portadoras destes genes será induzida fornecendo-lhes respectivamente Ganciclovir e 5-fluoro-citidina. A presente invenção abrange ainda a utilização da composição acima descrita para a fabricação de um medicamento para o tratamento dos tumores e cancros e para a imunização do organismo contra estas doenças.

De forma vantajosa, todos os elementos da composição são administrados simultaneamente. Podem apresentar-se simultaneamente ou independentemente.

Também é possível administrar os dois principais componentes de modo desfasado no tempo. Assim, de forma vantajosa, administram-se primeiro os vírus, ou células produtoras de vírus, que infectam de preferência as células do organismo em divisão e que são portadores no seu genoma de pelo menos um gene cuja expressão nas células em divisão vai provocar a sua morte, depois os substractos, cuja metabolização pelas células em divisão vai provocar a sua morte. A esta fase de eliminação da massa tumoral segue-se uma fase de imunização do organismo contra esse tumor por administração das células, dos vírus ou das bactérias que exprimem os imunomoduladores. A composição de acordo com a invenção pode ser introduzida por qualquer meio ao alcance do perito e em particular por injecção com uma seringa para fins médicos.

De forma vantajosa este tratamento é local mas também pode ser sistémico. A presente invenção é ilustrada pelo exemplo que se segue em referência à figura única anexa que representa a tabela do vector retroviral pMTK. EXEMPLO:

Tratamento de ratos aue apresentam tumores com células que segregam lnterleucina-2 e que produzem o retrovírus PMTK 8

Ratos C56 BL/6 apresentando tumores foram tratados com uma composição contendo células alogénicas produtoras de lnterleucina-2 e o retrovírus PMTK portador do gene da timidina-quinase do virus HSV1.

As injecções foram efectuadas perto dos tumores. O vector pMTK (ver a figura) apresenta as características seguintes: LTR-5’ - Mov3 até ao local BamH1 (-350 do início da transcrição), - Mov13 do local BamH1 (-350) até ao local Kpn1 (+ 30) - Mov9 do local Kpn1 (+ 30) até ao ponto Pst1 (+ 560) (contém a sequência de condicionamento) - A sequência não codificadora em 3’ do local Cla1 (+ 7674) até U3 (+ 7817) provém de Mov3. LTR-3' - Mov3 até ao local BamH1 posicionado em 7910 (ou - 350),

Movi 3 até ao fim de U5.

Uma linhagem celular de condicionamento CRIP é co-transfectada pelo plasmídeo pMTK ( 20 pg) e pelo plasmídeo pWLNeO (1pg). Foram isolados vários clones em selecção G418. O título do clone seleccionado é de 5.10S partículas infecciosas/ml, medidas pela capacidade de conferir uma resistência em HAT (Hipoxantina, Aminopterina, Timidina) para células L TK\ A infecção das células L TK~ é realizada com diluições sucessivas do produto à tona que contém as partículas virais. 9

Lisboa, -β Μ 2001

Por INSTITUT PASTEUR; INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MED1CALE (INSERM); UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE; ASSISTANCE PUBLIQUE, HOPITAUX DE PARIS

Arco da Conceição, 3, 11Q0 LJSBOA 10

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição destinada a tratar tumores de organismos humanos ou animais e a imunizar estes organismos contra tumores, em que a referida composição compreende, em associação sinérgica: - células alogénica9 ou xenogénicas para os organismos tratados, vírus ou bactérias que exprimem transitoriamente no organismo pelo menos um gene que lhes permite produzir in vivo um ou vários imunomoduladores, e - vírus, ou células alogénicas ou xenogénicas para os organismos tratados produtoras dos vírus, em que os referidos vírus infectam preferencialmente as células em divisão do organismo tratado e contêm no seu genoma pelo menos um gene cuja expressão nas células em divisão vai provocar a sua morte.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por as células produzirem in vivo um ou vários imunomoduladores e produzirem além disso vírus portadores no seu genoma de pelo menos um gene cuja expressão nas células em divisão vai provocar a sua morte.
3. 3. Composição de acordo com uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada por os imunomoduladores serem lnterleucina-2, lnterleucina-4, lnterleucina-7, TNF, Interferon-gama, GM-CSF sozinhos ou combinados.
4. 4. Composição de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por os vírus serem, portadores de um gene que exprime timidina-quinase ou citosina-desaminase.
5. 5. Composição de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por os vírus serem retrovírus, Adenovírus, vírus associados aos Adenovírus ou vírus Fox.
6. 6. Utilização da composição de acordo com uma das reivindicações 1 a 5 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de tumores e cancros e/ou para a imunização do organismo contra estas doenças. 1
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por os diferentes componentes da composição estarem presentes simultaneamente ou independentemente.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por os vírus, ou as células produtoras dos vírus, que infectam preferencialmente as células de organismos em divisão e contêm no seu genoma pelo menos um gene cuja expressão nas células em divisão vai provocar a sua morte serem administrados anteriormente ou simultaneamente com a administração das células, vírus ou bactérias que produzem os imunomoduladores.
9. 9. Utilização de acordo com uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada por as células, vírus ou bactérias que produzem os imunomoduladores serem substituídos por qualquer outro meio que permita a difusão de imunomoduladores no organismo, por exemplo uma microbomba. Lisboa, ' 6 JUN. 2001 Por INSTITUT PASTEUR; INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM); UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE; ASSISTANCE PUBLIQUE, HOPITAUX DE PARIS

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