ES2322605T3

ES2322605T3 - Tratamiento de la mucositis oral e intestinal mediante la administracion de il-18 humano.

Info

Publication number: ES2322605T3
Application number: ES05789011T
Authority: ES
Inventors: Judithann Lee; Kimberly A. Dede
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 2004-08-20
Filing date: 2005-08-18
Publication date: 2009-06-23
Anticipated expiration: 2025-08-18
Also published as: ZA200700524B; AU2005277404A1; CA2577777A1; JP4912306B2; PL1793859T3; PT1793859E; ES2372728T3; DK1793859T3; RU2007110166A; SI1793859T1; EP2161032A2; ATE426410T1; CY1108991T1; EP1793859A2; KR20070050924A; EP2161032A3; EP1793859A4; EP2161032B1; EP1793859B1; WO2006023623A2

Abstract

El uso del polipéptido IL-18 humano (SEC ID Nº.1) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico de cicatrización de una herida, en el que el polipéptido IL-18 humano está en combinación con un transportador, y en el que la herida es mucositis oral.

Description

Tratamiento de la mucositis oral e intestinal mediante la administración de IL-18 humano.

Referencia cruzada a la solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional anterior de patente de Estados Unidos, número de serie 60/603,012, que se presentó el 20 de agosto de 2004, los contenidos de la cual se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.

Campo de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones. La invención se dirige a

1.: El uso del polipéptido IL-18 humano (SEC ID Nº.1) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico de cicatrización de heridas, en el que el polipéptido IL-18 humano está en combinación con un transportador y en el que la herida es una mucositis oral.

2.: El uso del polipéptido IL-18 humano (SEC ID Nº.1) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico de cicatrización de heridas, en la que el polipéptido IL-18 humano está en combinación con un transportador y en el que la herida es una mucositis intestinal.

Antecedentes de la invención

La razón de este interés es la relativa facilidad para dirigir la proteína terapéutica segregada hacia dentro de su lugar de acción (fluidos corporales o la membrana celular). Las proteínas segregadas y las regiones extracelulares de proteínas transmembranales pueden administrarse directamente en los fluidos corporales, o pueden dirigirse a los fluidos corporales o membranas siguiendo un camino natural. El camino natural para la secreción proteica hacia el interior del espacio extracelular es el retículo endoplásmico en eucariotas y la membrana interior en procariotas (Palade, Science, 189, 347 (1975); Milstein y col., Nature New biol, 239, 117 (1972); Blobel y col., J. Cell. Biol., 67, 835 (1975)). Por otro lado, no hay un camino natural conocido para trasladar una proteína del exterior de la célula al citosol (con la excepción de la pinocitosis, un mecanismo de intrusión de toxinas del veneno de serpientes en células). Por consiguiente, dirigir proteínas terapéuticas al interior de las células presenta en la técnica dificultades extremas.

El IL-18 es una citoquina novedosa descubierta recientemente. El IL-18 humano activo contiene 157 residuos de aminoácidos. Posee actividades biológicas potentes, incluyendo la inducción de la producción de interferón-\gamma por linfocitos T y esplenocitos, la potenciación de la actividad citolítica de las células NK y la promoción de la diferenciación de linfocitos T CD4^{+} vírgenes en linfocitos Th1. Además, el IL-18 humano aumenta la producción de GM-CSF y disminuye la producción de IL-10. Se ha demostrado que el IL-18 tiene habilidades inductoras del interferón-\gamma más potentes que el IL-12, y parece que posee receptores diferentes y que utiliza un camino distinto de transducción de señal.

Los linfocitos T CD4^{+} son los elementos reguladores centrales de todas las respuestas inmunitarias. Se dividen en dos subconjuntos, Th1 y Th2. Cada subconjunto se define por su capacidad para segregar diferentes citoquinas. Interesantemente, los inductores más potentes de la diferenciación son las mismas citoquinas. El desarrollo de los linfocitos Th2 a partir de precursores vírgenes es inducido por el IL-4. Anteriormente al descubrimiento del IL-18, se pensaba que el IL-12 era la citoquina inductora Th1 principal. El IL-18 es también una citoquina inductora Th1 y es más potente que el IL-12 en la estimulación de la producción de interferón-\gamma.

Los linfocitos Th1 segregan IL-2, interferón-\gamma y TNF-\beta. El interferón-\gamma, la firma de la citoquinas Th1, actúa directamente sobre macrofagos potenciando sus actividades microbiocidas y fagocíticas. Como resultado, los macrófagos activados pueden destruir eficazmente patógenos intracelulares y células tumorales. Los linfocitos Th2 producen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, que actúan facilitando el desarrollo de linfocitos B en células productoras de anticuerpos. Resumiendo, los linfocitos Th1 son sobre todo los responsables de la inmunidad mediada por células, mientras que los linfocitos Th2 son responsables de la inmunidad humoral.

La cicatrización es una combinación de efectos altamente coordinados que implica a distintos tipos de células, componentes de la matriz extracelular y múltiples mediadores solubles, incluyendo factores del crecimiento y citoquinas. La cicatrización puede activarse por el traumatismo, microbios o productos químicos que han provocado la lesión hística. Aunque la restauración de la integridad del tejido es una respuesta inmunológica innata del anfitrión, hay situaciones durante las cuales se malogra el proceso de cicatrización. Se han usado varios factores de crecimiento para intentar prevenir la mucositis en pacientes de cáncer sometidos a radiación o quimioterapia con éxito limitado. Peterson, Adv. Stud. Med., 4(4B): S299-S310, (2005). Un factor estimulante de colonias de granulocitos (Neupogen) tiene un efecto modesto sobre la incidencia y la gravedad de mucositis en dos de cada cuatro estudios que implicaron a pacientes de cáncer sometidos a tratamiento. Un factor estimulante de colonias de macrófagos granulocíticos (Sargramostim) indujo una disminución modesta de la gravedad de la mucositis inducida por radiación y quimioterapia, aunque los resultados fueron inconsistentes. Tanto el factor estimulante de colonias de granulocitos como el factor estimulante de colonias de macrófagos granulocíticos han demostrado sólo un efecto en la prevención de la mucositis oral. El factor de crecimiento de queratinocitos (Palifermin) se ha mostrado como el más prometedor en la prevención de mucositis, previniendo tanto la incidencia como la duración de la musositis oral. Con la emergencia de agentes que actúan contra la mucositis de modo patofisiológico, los médicos ya no necesitan modificar los regimenes de radiación o quimioterapia, pero adaptarán el protocolo a la inclusión de un agente que pueda prevenir la incidencia de mucositis. De forma clara existe en la técnica la necesidad de desarrollar nuevas proteínas terapéuticas para potenciar la cicatrización, de modo particular para tratar: heridas cutáneas, heridas quirúrgicas, úlceras de las piernas, úlceras diabéticas, mucositis, en particular mucositis gastrointestinal y oral, y lesiones pulmonares.

Resumen de la invención

En un aspecto, esta solicitud describe un procedimiento de cicatrización de una herida en un paciente con necesidad de ello, que comprende la etapa de administrar la paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido IL-18 humano (SEC ID Nº.1). En otro aspecto, la herida a tratar se elige del grupo de: heridas cutáneas, heridas quirúrgicas, úlceras de las piernas, úlceras diabéticas, mucositis gastrointestinal, mucositis oral y lesiones pulmonares.

En un segundo aspecto, esta solicitud describe un procedimiento de cicatrización de tales heridas en un paciente con necesidad de ello, que comprende la etapa de administrar la paciente una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del polipéptido IL-18 humano (SEC ID Nº.1) y un transportador.

Descripción breve de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de IL-18 humano nativo (SEC ID Nº.1).

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de IL-18 murino (SEC ID Nº.2).

La Figura 3 muestra la secuencia del factor-\beta de crecimiento derivado de las plaquetas murino (PDGF-\beta) (SEC ID Nº.3). El PDGF-\beta de un ratón maduro se forma por la eliminación de un péptido señal (-20- -1) y de los propéptidos N-terminal (1-61) y C-terminal (171-221) (subrayados).

La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos del KGF humano (SEC ID Nº.4).

La Figura 5 muestra el efecto de la administración tópica de IL-18 murino (SEC ID Nº.2) codificado en adenovirus en la cicatrización en ratones ob/ob. Cada punto de datos representa la media para cada grupo de tratamiento.

La Figura 6 muestra el efecto en la cicatrización de la proteína modificada murina IL-18 (SEC ID Nº.2) administrada diariamente de modo sistémico por inyección intraperitoneal en ratones ob/ob.

La Figura 7 muestra el efecto de la administración tópica diaria de IL-18 humano (SEC ID Nº.1) en la cicatrización en ratones ob/ob. Cada punto de datos representa la media para cada grupo de tratamiento.

Descripción de la invención

Los polipéptidos humanos se divulgan en los documentos EP 0692536A2, EP0767178A1 y WO 97/2441. La secuencia de aminoácidos del IL-18 humano se expone en SEC ID Nº.1. Los polipéptidos IL-18 humanos son polipéptidos inductores de interferón-\gamma y cumplen un papel esencial en la inducción de inmunidad mediada por células, incluyendo la inducción de la producción de interferón-\gamma por linfocitos T y esplenocitos, el potenciamiento de la actividad citolítica de las células NK y la promoción de la diferenciación de de linfocitos T CD4^{+} vírgenes en linfocitos Th1.

El IL-18 puede usarse para cicatrizar heridas en un paciente, incluyendo, pero no limitándose a: heridas cutáneas, heridas quirúrgicas, úlceras de las piernas, úlceras diabéticas, úlceras por presión, mucositis, en particular mucositis gastrointestinal y mucositis oral, y lesiones pulmonares. La cicatrización concierne a la regeneración de células dañadas por células del mismo tipo. El proceso de cicatrización implica la coordinación sistemática de los siguientes eventos celulares: proliferación, migración, diferenciación y remodelación. Las citoquinas, quemoquinas, factores de crecimiento y moléculas de adhesión funcionan como mediadores celulares, que coordinan las células particulares implicadas en estas actividades. Kampfer y col., Molec. Med. 6(12): 10160-1027 (2000). La interleuquina IL-18 (IL-18), una citoquina proinflamatoria, puede inducir el factor de necrosis tumoral alfa, la interleuquina 1 beta, y las quemoquinas CC y CXC, que pueden cumplir un papel durante la fase inflamatoria del proceso de cicatrización. Puren y col., J. Clin. Invest. 101: 711-721 (1998). Se han identificado varios tipos de células diferentes que sintetizan IL-18, incluyendo queratinocitos y macrófagos activados, las cuales cumplen un papel en la cicatrización. Cultivos in vitro de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimulas con Con A tratadas con IL-18 humano han inducido la producción del factor estimulante de colonias de monocitos granulocíticos (GM-CSF). Ushio y col.,J. Immunol. 156: 4274-4279 (1996). Adicionalmente, se ha demostrado que el IL-18 induce la producción del interferón-\gamma (IFN-gamma) por linfocitos T y células NK. Se ha puesto de manifiesto que el factor estimulante de colonias de monocitos granulocíticos promueve la cicatrización (Arnold y col., J. Wound Care 54: 400-402 (1995), y ha sido en el centro médico tratando pacientes con úlceras venosas crónicas de las piernas. DaCosta y col., Wound Rep. Reg. 7: 17-25 (1999). En un modelo de escisión murina de cicatrización, hemos demostrado que el IL-18 promueve la cicatrización. El mecanismo por el que el IL-18 promueve la cicatrización puede deberse a la naturaleza proinflamatoria de la citoquina, o como un agente inductor de factores del crecimiento, como el factor inductor de colonias de monocitos granulocíticos.

Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por procedimientos bien conocidos, incluyendo la precipitación de sulfato de amonio o etanol, la extracción ácida, la cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, la cromatografía en fosfocelulosa, la cromatografía de interacción hidrofóbica, la cromatografía de afinidad, la cromatografía en hidroxilapatita, la cromatografía en lectinas y la cromatografía líquida de alta eficacia. Se pueden emplear técnicas bien conocidas de replegado de proteínas para regenerar conformaciones activas cuando se desnaturaliza el polipéptido durante la síntesis intracelular, el aislamiento y/o la purificación. Los procedimientos para purificar y producir IL-18 humano activo se exponen en el documento WO 01/098455.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende los polipéptidos IL-18 humanos (SEC ID Nº.1). Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto y pueden comprender adicionalmente un transportador farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente. Tales transportadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua o aceites, incluyendo aquellos de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, etc. Se puede usar agua como transportador cuando la composición farmacéutica se administra de forma intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de glicerina y de dextrosa pueden emplearse también como transportadores líquidos, por ejemplo para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticamente adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sucrosa, gelatina, malta, arroz, harina, carbonato cálcico, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerina, talco, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerina, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede también contener pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes o de agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación mantenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con los aglutinantes y transportadores tradicionales, tales como los triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir los transportadores habituales, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. En el documento REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, por E. W. Martin, se describen ejemplos de transportadores farmacéuticos adecuados. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, a menudo in forma purificada, junto con una cantidad adecuada de transportador para proporcionar la forma para una administración apropiada al paciente. La formulación debe adaptarse a la forma de administración.

La composición puede formularse en conformidad con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada a la administración intravenosa a los seres humanos. De modo típico, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en amortiguadores acuosos isotónicos estériles. Si es adecuado, la composición puede incluir también un agente solubilizante y un anestésico local, tal como lignocaína, para aliviar el dolor en la sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran bien de forma separada o bien mezclados juntos en una forma de dosificación unidad, por ejemplo, como un polvo seco liofilizado, o un concentrado carente de agua, en un recipiente sellado herméticamente, tal como una ampolla o un sobrecito, indicando la cantidad de principio activo. Si la composición es para administrar por infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contenga agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Si la composición se administra por inyección puede proporcionarse una ampolla de solución salina o agua para inyección estéril, para poder mezclar los ingredientes antes de la administración.

Consecuentemente, el polipéptido puede usarse en la elaboración de un medicamento. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse como soluciones o como polvos liofilizados para administración parenteral. Los polvos pueden reconstituirse mediante la adición de un diluyente adecuado u otro transportador farmacéuticamente aceptable antes de su uso. La formulación líquida puede ser una solución acuosa, isotónica, amortiguada. Ejemplos de diluyentes adecuados son una solución salina isotónica normal, una solución de acetato de sodio o amonio amortiguada o una solución estándar de dextrosa al 5% en agua. Tal formulación es especialmente adecuada para administración parenteral, pero puede usarse también para administración oral o contenida en un inhalador o nebulizador dosificado para insuflación. Puede ser deseable añadir excipientes, tales como polivinilpirrolidona, gelatina, hidroxi celulosa, acacia, polietilenglicol, manitol, cloruro de sodio o citrato de sodio, a tales composiciones farmacéuticas.

De forma alternativa, el polipéptido puede estar encapsulado, comprimido o preparado en una emulsión o jarabe para la administración oral. Se pueden añadir transportadores líquidos o sólidos aceptables para mejorar o estabilizar la composición, o para facilitar la preparación de la composición. Los transportadores sólidos incluyen almidón, lactosa, sulfato de calcio dihidrato, alabastro, estearato de magnesio o ácido esteárico, talco, pectina, acacia, agar o gelatina. Los transportadores líquidos incluyen jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, solución salina y agua. El transportador puede incluir también un material de liberación mantenida, tal como monoestearato de glicerina o diestearato de glicerina, sólo o junto con una cera. La cantidad de transportador sólido varía, pero se encontrará entre aproximadamente 20 mg y 1 g por unidad posológica. Las preparaciones farmacéuticas se elaboran siguiendo las técnicas farmacéuticas convencionales, que implican moler, mezclar, granular; y comprimir, si es adecuado, para las formas comprimidas; o moler, mezclar y llenar para las formas de cápsulas de gelatina duras. Si se usa un transportador líquido, la preparación puede estar en forma de jarabe, elixir, emulsión, o en suspensión acuosa o no acuosa. Tal formulación líquida puede administrarse directamente a la boca (p.o.) o utilizarse para rellenar una cápsula de gelatina blanda.

Los polipéptidos IL-18 humanos pueden prepararse como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz de polipéptido como un ingrediente activo en un transportador farmacéuticamente aceptable. En las composiciones de la invención se puede emplear una suspensión o solución acuosa que contenga el polipéptido, amortiguada al pH fisiológico, en una forma lista para la inyección. Las composiciones para administración parenteral comprenderán, habitualmente, una solución del polipéptido de la invención o un combinado del mismo disuelto en un transportador farmacéuticamente aceptable, tal como un transportador acuoso. Se puede emplear una variedad de transportadores acuosos, por ejemplo solución salina al 0,4%, solución de glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente carentes de materia particulada. Estas soluciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables en la medida en que se necesite aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes para ajustar el pH y amortiguadores, etc. La concentración del polipéptido de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente 0,5%, generalmente o al menos aproximadamente 1% hasta 15 ó 20% en peso y se seleccionará primordialmente sobre la base de volúmenes de fluido, viscosidades, etc., en consonancia con el modo particular de administración seleccionado.

Por lo tanto, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular puede prepararse para contener 1 ml de agua amortiguada estéril, y entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 100 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 50 ng y aproximadamente 30 mg, o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg, de un polipéptido de la invención. De modo similar, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa podría prepararse para contener aproximadamente 250 ml de solución de Ringer estéril, y de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg, o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg de un polipéptido de la invención. Los procedimientos concretos para preparar composiciones administrables de forma parenteral son bien conocidos o serán evidentes para los expertos en la técnica y se describen de modo más preciso en, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 15TH ED., Mack Publishing Company, Easton,
Pennsylvania.

Los polipéptidos de la invención, si se preparan en una preparación farmacéutica, pueden presentarse en formas de dosificación unidad. La dosis terapéuticamente eficaz adecuada puede determinarse fácilmente por los expertos en la técnica. Tal dosis puede, si es adecuado, repetirse en los intervalos de tiempo apropiados seleccionados de modo adecuado por un médico durante el periodo de respuesta.

De modo adicional, se pueden emplear opcionalmente ensayos in vitro para facilitar la identificación de los intervalos posológicos óptimos. La dosis concreta a emplear en la formulación dependerá también de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad o el trastorno, y debe decidirse de acuerdo con el juicio del médico y las particularidades de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse de las curvas de dosis y respuesta derivadas de los sistemas de ensayo con modelo animal o in vitro.

Para polipéptidos, la dosis administrada a un paciente es típicamente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal del paciente, o de modo alternativo, de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal del paciente. Generalmente, los polipéptidos humanos tienen una vida media más larga dentro del cuerpo humano que los polipéptidos de otras especies, debido a la respuesta inmunitaria a los polipéptidos extraños. Por ello, es a menudo posible una dosis inferior de polipéptidos humanos y una administración menos frecuente. Además, la dosis y la frecuencia de administración de polipéptidos de la invención puede reducirse potenciando la absorción y la penetración hística (por ejemplo, en el cerebro) de los polipéptidos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lapidación.

La solicitud describe un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de la composición farmacéutica de la invención. De modo opcional, puede haber una notificación en forma prescrita por una agencia gubernamental en asociación con tal(es) recipiente(s), regulando la elaboración, el uso o la comercialización de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la autorización por parte de la agencia de la elaboración, el uso o la comercialización para administración en humanos. En otra realización de la invención, se proporciona un kit con la cantidad adecuada de recipientes necesarios para cumplir los requisitos posológicos para el tratamiento de una indicación particular.

En otra realización, el compuesto o composición puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat y col., en LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pág. 353-365(1989); Lopez-Berestein, ibid., pág. 317-327; véase en general la referencia anterior).

En todavía otra realización, el compuesto o composición puede dispensarse en un sistema de liberación controlada. En una realización puede usarse una bomba (véase Langer, anterior; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987); Buchwald y col., Surgery 88:507 (1980); Saudek y col., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). En otra realización se pueden usar materiales poliméricos (véase MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORAMANCE, Smolen and Ball (eds.), Willey, New York (1984); Ranger y col., J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); véase también Levy y col., Science 228:190 (1985); During y col., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard y col., J. Neurosurg. 71:105 (1989). En todavía otra realización, un sistema de liberación controlado puede situarse en la proximidad de una diana terapéutica, es decir, el cerebro, por lo que precisa sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, anterior, vol. 2, p. 115-138 (1984)). Otros sistemas de liberación controlados se abordan en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

Los polipéptidos IL-18 humanos (SEC ID Nº.1) se pueden administrar por cualquier vía interna apropiada y puede repetirse la administración las veces que sea necesario, por ejemplo, con una frecuencia de de una a tres veces al día entre 1 día y aproximadamente tres semanas a una de una vez por semana o por cada dos semanas. De modo alternativo, los péptidos pueden modificarse para reducir la densidad de carga y permitir por ello la biodisponibilidad oral. La dosis y la duración del tratamiento se refiere a la duración relativa de las moléculas de la presente invención en la circulación humana, y pueden ser ajustadas por un experto en la técnica, dependiendo de la enfermedad tratada y del estado de salud general del paciente.

La invención proporciona un procedimiento de tratamiento, mediante la administración a un paciente humano de una cantidad eficaz de un compuesto o composición farmacéutica de la invención que comprende el polipéptido IL-18 humano (SEC ID Nº.1). El compuesto puede estar sustancialmente purificado (por ejemplo, careciendo de modo sustancial de sustancias que limiten sus efectos o produzcan efectos secundarios no deseados). Pueden emplearse formulaciones o procedimientos de administración como los descritos anteriormente cuando el compuesto comprenda un polipéptido; se pueden seleccionar formulaciones y vías de administración adicionales apropiadas entre las descritas más adelante en el presente documento.

Se conocen varios sistemas de administración y pueden usarse para administrar un compuesto de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, encitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y col., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), la construcción de un ácido nucleico como parte de un retroviral o de otro vector, etc. Los procedimientos de introducción incluyen, pero no están limitados a, vías intradérmicas, intramusculares, intraperitoneales, intravenosas, subcutáneas, intranasales, epidurales y orales. Los compuestos o composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección embolada, por absorción a través del recubrimiento epitelial o mucocutánea (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal o intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

Puede ser deseable administrar los compuestos o composiciones farmacéuticas de modo local en la zona que necesita el tratamiento. Tal administración puede lograrse, por ejemplo, y no como limitación, por infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo junto con un vendaje después de la cirugía, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, siendo dicho implante un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. Si se administra una proteína, es aconsejable usar materiales que no absorban la proteína.

El modo de administración de un polipéptido de la invención puede usar cualquier vía adecuada que administre el agente al anfitrión. Los polipéptidos y composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, de modo subcutáneo, intramuscular, intravenoso o intranasal, o para la administración tópica, si se usa para la cicatrización de heridas cutáneas. Para tratar mucositis, los polipéptidos pueden administrarse al paciente por vía parenteral.

La presente invención puede realizarse en otras formas específicas, sin desviarse del espíritu o los atributos esenciales de la misma y, en consecuencia, se debe hacer referencia como indicación del alcance de la invención a las reivindicaciones adjuntas, en vez de a las especificaciones precedentes o a los ejemplos siguientes.

Glosario

Las definiciones siguientes se proporcionan para facilitar el entendimiento de determinados términos usados frecuentemente en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, el término "transportador" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o vehículo junto con el cual se administra la sustancia terapéutica.

El término "aislado" significa modificado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural, es decir, si existe de modo natural ha sido modificado o extraído de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo no esta "aislado", tal como se emplea el término en el presente documento. Además, un polinucleótido o polipéptido que es introducido en un organismo mediante transformación, manipulación genética o por cualquier procedimiento recombinante diferente está "aislado" incluso si está todavía presente en dicho organismo, pudiendo estar este organismo vivo o no.

El término "mucositis", tal como se usa en el presente documento, significa la destrucción del recubrimiento epitelial de un órgano, por ejemplo en el intestino, la vejiga, la boca, como resultado de irradiación o quimioterapia.

Tal como se usa en el presente documento, el término "farmacéutico" incluye las aplicaciones veterinarias de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a esa cantidad de agente terapéutico que es útil para aliviar la enfermedad seleccionada.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobada por una agencia reguladora del Gobierno Federal o un gobierno estatal de los Estados Unidos o presente en la lista de la Farmacopea de los Estados Unidos o en otra farmacopea reconocida de modo general para uso en animales y, más particularmente, en humanos. "Polipéptido" se refiere a cualquier polipéptido que comprende dos o más aminoácidos unidos entre ellos por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteros peptídicos. "Polipéptido" se refiere tanto a cadenas cortas, denominados comúnmente péptidos, oligopéptidos u oligómeros, y a cadenas largas, llamados generalmente proteínas. Los polipéptidos pueden contener otros aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos codificadores de genes. "Polipéptidos" incluye secuencias de aminoácidos modificadas tanto por procesos naturales, tal como el proceso postraslacional, o por técnicas de modificación química bien conocidas en la técnica. Tales modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monográficos más detallados, así como en una voluminosa bibliografía de investigación. Las modificaciones pueden estar presentes en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo la columna vertebral peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los terminales carboxilo o amino. Se agradecerá que el mismo tipo de modificación esté presente en el mismo o varios grados en varios sitios de un polipéptido dado. También puede contener un polipéptido dado varios tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados como consecuencia de una ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, sin o con ramificaciones. Los polipéptidos cíclicos, ramificados o cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos naturales de postraslación o pueden elaborarse por procedimientos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, biotinilación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o de un derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, unión cruzada, ciclización, formación de enlace disulfuro, demetilación, formación de uniones covalentes cruzadas, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación del ancla GPI, hidroxilación, yodinación, mutilación, miristoilación, oxidación, proceso proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia, tales como arginilación y ubiquitinación (véase, por ejemplo, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ª ed, T. E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12, in POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEIN, B.C. Johnson, ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter y col., Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990; Rattan y col., Ann. NYAcad. Sci., 663: 48-62 (1992)).

La unión covalente de compuestos biológicamente activos a polímeros solubles en agua es uno de los procedimientos de modificación y control de la biodistribución, la farmacocinética y, a menudo, la toxicidad de estos compuestos (Duncan, R. y Kopecek, J. (1984) Adv. Polym. Sci. 57:53-101). Se han usado muchos polímeros solubles en agua para lograr estos efectos, tales como el ácido (poli)siálico, dextrano, poli(N-(2-hidroxipropil)metacrilamida) (PHPMA), poli (N-vinilpirrolidona)(PVP), poli(vinilalcohol) (PVA), poli(etilenglicol-co-propilenglicol), poli(N-acriloil morfolina) (PAcM) y poli(etilenglicol) (PEG) (Powell, G. M. (1980) Polietilenglicol. En R. L. Davidson (Ed.) HANDBOOK OF WATER SOLUBLE GUMS AND RESINS. McGraw-Hill, New York, capítulo 18). El PEG posee un conjunto ideal de propiedades: muy baja toxicidad (Pang, S. N.J. (1993) J. Am. Coll. Toxicol. 12:429-456), solubilidad excelente en solución acuosa (Powell, anterior), baja inmunogenicidad y antigenicidad (Dreborg, S. y Akerblom, E.B. (1990) Crit.Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:315-365). Se han descrito en la bibliografía científica proteínas terapéuticas conjugadas-PEG o "PEGiladas" que contienen cadenas simples o múltiples de polietilenglicol en la proteína (Clark, R. y col. (1996) J. Biol. Chem. 271:21969-21977; Hershfield, M.S. (1997) Biochemistry and immunology of poly(ethylene glycol)-modified adenosine deaminase (PEG-ADA). En J. M. Harris y S. Zalipsky (Eds) Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, DC, p145-154; Olson, K. y col. (1997) Preparation and characterization of poly(ethylene glycol)ylated human growth hormone antagonist. En J. M. Harris y S. Zalipsky (Eds) Poly(ethylene glycol):Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, DC, p170-181).

Tal como se usa en el presente documento, el término "cicatrización" significa el proceso de reparación del tejido que implica la cicatrización de una herida, incluyendo, pero no limitándose a, cerrar la herida.

Ejemplo 1

Modelo de cicatrización escisional

Ratones diabéticos, tales como la cepa ob/ob, manifestaron una cicatrización retardada de heridas. Stallmeyer y col., Diabetologia 44: 471-479 (2001). Los ratones ob/ob son una cepa de ratones que existe de forma natural que tiene una deleción del gen ob/ob, el cual codifica leptina. La leptina se une a un receptor de citoquina clase I, obRb, y activa una cascada de señalización intracelular que induce la pérdida de apetito. Debido a que los ratones ob/ob no pueden producir leptina, son obesos, teniendo el doble de peso que los ratones normales C57/B16. Los ratones obesos también poseen otros defectos metabólicos, incluyendo termogénesis reducida, hiperfagia, fertilidad disminuida e inhibición de la hormona del crecimiento. Ring y col., Endocirnol. 141 (1): 446-449 (2000). El retardo pronunciado en la cicatrización de heridas en ratones ob/ob se ha atribuido a su fenotipo similar al diabético.

Los modelos de una cicatrización deficiente de heridas permiten la oportunidad de explorar el efecto de citoquinas específicas, tales como el IL-18, y de factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), sobre la cicatrización. La aplicación tópica del PDGF-\beta ha mostrado una mejora en la cicatrización de heridas en ratones diabéticos de cepa db/db. Greenlaugh y col., Am. J. Pathol. 136: 1235-1246 (1990). La cepa db/db es similar de forma fenotípica a la cepa ob/ob, pero los ratones db/db carecen de receptor de leptina. Las heridas de los ratones ob/ob exhiben un marcado retraso en la infiltración celular, formación de tejido de granulación y cicatrización retardada. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDFGF-[]) es tanto un mitógeno y un quimioatrayente para células de músculos lisos y fibroblastos, y causa una rápida reepitelialización de heridas en ratones ob/ob. Aunque la interleuquina - 18 (IL-18) no se ha usado previamente como agente terapéutico en un modelo de cicatrización, varios estudios han mostrado los niveles de expresión aumentados, pero no la producción de proteínas, del IL-18 en heridas de ratones ob/ob. Kampfer y col., J. Invest. Derm 113(3): 369-74 (1999). Ya que el IL-18 es una citoquina proinflamatoria (Kampfer y col, Eur. Cytokine Netw. 11: 626-33 (2000)), cumple un papel en la cicatrización estimulando la infiltración celular en las heridas.

Para determinar el efecto de la administración tópica de IL-18 o PDGF-\beta en la cicatrización se anestesiaron ratones hembras ob/ob de entre diez y quince semanas de edad usando una mezcla de quetamina (90 mg/kg)/xilacina (10 mg/kg). Se mostró la sobreexpresión de PDGF mediada por adenoviral para corregir la cicatrización de heridas isquémicas en un modelo de oreja de conejo. Liechty y col., J. Invest. Dermatol. 113: 375-383 (1999). Liechty y col. demostraron que la replicación de adenovirus deficientes libera de modo eficaz el trasgén PDGF-\beta directamente a las células de la zona herida. Se afeitó la parte trasera superior de cada ratón, y se estableció un campo estéril usando paños alternos de alcohol y betadina. Se hicieron heridas en forma de escisión circular de grosor completo de 6 mm de diámetro usando un sacabocados estéril para biopsia, dando como resultado dos heridas por ratón. En la administración tópica se aplicó directamente sobre la zona herida adenovirus (1x10^{10} partículas virales/herida) que codifican un IL-18 murino (SEC ID Nº.2), un PDGF-\beta murino (aminoácidos 1-61 y 171-221 de SEC ID Nº.3), o un control (adenovirus CMV.NulI vacío). Se aplicó también directamente en las heridas un control salino. Se aplicó a continuación a las heridas una capa de polaxamer (Pluronic 127 en 10% de amortiguador fosfato salino), que se cubrió con un vendaje estéril transparente. Para determinar la velocidad de cierre de las heridas se trazó la circunferencia de las heridas sobre la película transparente en intervalos de dos días. Al finalizar el estudio, cuando habían cicatrizado todas las heridas, se escanearon ópticamente las películas transparentes, y se determinó el área superficial usando el software Scio Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, EEUU). El resultado de este experimento se muestra más adelante en la Figura 5.

El adenovirus control, Ad.mPDGF-\beta (aminoácidos 1-61 y 171-221 de SEC ID Nº.3) se generó usando un método directo de clonación (Sukmanm A. J., Kallarakal, A. Fomwald, J., Kozarsky, K. F., Appelbaum, E., Shatzman, A.R. y Lu, Q. 2002. Generation of recombinant adenovirus vectors by a direct cloning approach. In Gene Cloning and Expression Technilogies, M.P. Weiner y Q. Lu (EDs). P. 341-355 Eaton Publishing, Westborough, MA). De modo breve, el ORF para PDGF-\beta murino se amplificó por PCR y se clonó en los sitios XbaI/SwaI de pAC2XS, situando el gen bajo el control del promotor CMV IE. El ADN clon molecular purificado del vector de adenovirus se linearizó por digestión con enzima de restricción Pacl para exponer los ITRs y se transfectó en células HEK293 para el rescate de adenovirus. Los adenovirus se amplificaron y purificaron por bandeo CsCl como está descrito (Engelhardt, J. 1999. Methods for adenovirus-mediated gene transfer to airway epithelium. In Methods in Molecular Medicine, Gene Therapy Protocols, P. Robbins (Ed.) p. 169-184. Humana Press, Totowa). Se desalaron los adenovirus concentrados usando una columna de Biogel (Bio-Rad) y guardándolos en 1xPBS con 10% de glicerina a -80ºC. Se generó la construcción de Ad.m.-IL-18 usando los procedimientos descritos en Osaki y col., Gene Therapy 6: 808-815 (1999).

Para la administración tópica de las construcciones de proteínas en un vector adenovirus, tanto el Ad.m.-PDGF-[] (aminoácidos 1-61 y 171-221 de SEC ID Nº.3) y Ad.m-IL-18 (SEC ID Nº.2) se mejoró de forma notable el cierre de heridas en el modelo de cicatrización escisional ob/ob. El Ad.m.-PDGF-\beta (aminoácidos 1-61 y 171-221 de SEC ID Nº.3), la proteína de control positivo, y el Ad.m.-IL-18 (SEC ID Nº.2) lograron un 50% de cierre con referencia al día cero en 7,5 días y 9,5 días respectivamente frente al control del vector (Ad.CMV.NulI), el cual logró un 50% de cierre con respecto al día cero a los 20 días de realizar la herida. De modo adicional, el Ad.m-IL-18 (SEC ID Nº.2) y el Ad.m-PDGF-\beta (aminoácidos 1-61 y 171-221 de SEC ID Nº.3) aceleraron el cierre total de las heridas el día 20. En el momento de la conclusión del estudio en el día 22 tras la realización de las heridas no se habían curado totalmente ni los grupos de solución salina ni los de control de vector. Habiéndose demostrado el efecto positivo de la aplicación tópica de Ad.IL-18 en el modelo de cicatrización escisional, se ensayó la administración sistémica de la proteína IL-18 murina (SEC ID Nº.2).

Para determinar el efecto de la administración sistémica de IL-18 murina (SEC ID Nº.2), se anestesiaron ratones ob/ob hembras de diez a quince semanas de edad usando una mezcla de quetamina (90 mg/kg)/xilacina (10 mg/kg). Dos horas antes de realizar la herida, se administró a los ratones inyecciones peritoneales de la proteína IL-18 murina (SEC ID Nº.2) a concentraciones múltiples (0,1 mg/0,5 ml a 100 \Boxg/0,5 ml) o del vehículo (PBS carente de calcio y magnesio). Se afeitó la parte trasera superior del ratón, y se estableció un campo estéril usando paños alternos de alcohol y betadina. Se hicieron heridas en forma de escisión circular de grosor completo de 6 mm de diámetro usando un sacabocados estéril para biopsia, dando como resultado dos heridas por ratón. Se aplicó solución salina directamente sobre las heridas, que se cubrieron con una vendaje transparente estéril. Para determinar la velocidad de cierre de las heridas se trazó la circunferencia de las heridas sobre la película transparente en intervalos de dos días. Al finalizar el estudio, cuando habían cicatrizado todas las heridas, se escanearon ópticamente las películas transparentes, y se determinó la el área superficial usando el software Scio Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, EEUU). A lo largo de la duración de los estudios sistémicos se vigiló la ganancia o pérdida de peso de los ratones. Los resultados de este experimento se muestran más adelante en la Figura 6.

Para la administración sistémica de una proteína purificada, la IL-18 murina (SEC ID Nº.2) se potenció la velocidad de cierre de heridas de un modo dependiente de la dosis, sobre un intervalo posológico de 0,1 mg a 100 mg/ratón/día. Las dosis más eficaces fueron 50 y 100 mg/ratón/día, que lograron un 50% de cierre, referido al día cero, a los 8 y 9 días respectivamente frente al control del vehículo, que logró el 50% de cierre, referido al día cero, el día 16. La velocidad del cierre total se aumentó para los tratamientos con m-IL-18 (SEC ID Nº.2) relativos al control PBS.

Tanto la administración tópica como la sistémica de IL-18 murino (SEC ID Nº.2) potenciaron el cierre de heridas en el modelo de cicatrización escisional ob/ob. El PDGF se usó como control positivo en nuestros estudios de cicatrización murina. El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante fue aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos para el tratamiento de las úlceras del pie diabético. Wieman y col. Am. J. Surg. 176:745-795 (1998). Muchas enfermedades físicas están causadas por lesiones hísticas, que trastornan la organización natural del tejido, dando como resultado una herida. Las indicaciones reivindicadas en este documento de patente son todas ejemplos de lesiones hísticas, que pueden curarse por tratamiento con IL-18 humano (SEC ID Nº.1).

Ejemplo 2

Aplicación tópica diaria de IL-18 humano a una herida escisional

Ya que el IL-18 murino (SEC ID Nº.2) fue eficaz en el modelo de cicatrización escisional cuando se administró tópicamente como una construcción de adenovirus, se realizó un estudio usando proteína IL-18 (SEC ID Nº.1) humana purificada que se aplicó diariamente directamente sobre la herida del ejemplo 1 anterior. La proteína IL-18 humana (SEC ID Nº.1) se aplicó como 10 mg/30 ml/herida. El amortiguador fosfato salino (PBS) se usó como control del diluyente. Los resultados aparecen en la Figura 7 posterior, que muestra que el IL-18 (SEC ID Nº1) humano aceleró la cicatrización respecto la control PBS. En centros médicos se ha usado el PDGF humano de modo tópico para tratar las úlceras del pie diabético. Wieman y col. Am. J. Surg. 176:745-795 (1998).

Ejemplo 3

Modelo de mucositis intestinal

Las terapias contra el cáncer, tales como la quimioterapia o la radiación, causan a menudo daños citotóxicos al tracto gastrointestinal por destrucción de criptas. Esta pérdida de criptas provoca úlceras que se desarrollan a lo largo de zonas desnudas epiteliales, causando mucositis gastrointestinal. Una afección estrechamente relacionada, la mucositis oral, se produce cuando el recubrimiento epitelial de la boca es dañado por agentes citotóxicos provocando el desarrollo de úlceras. Si una proteína, como el factor de crecimiento de queratinocito humano (KGF) (SEC ID Nº.4), es activa en el modelo de mucositis intestinal, puede actuar como un factor mitogénico estimulando la proliferación y diferenciación del epitelio. Potten y col., Cell Growth Differ. 12: 265-75 (2001). De modo alternativo, el KGF humano (SEC ID Nº.4) puede actuar como inhibidor del ciclo celular que induce el arresto de células madre antes de la lesión citotóxica, para proteger de este modo las células madre, lo que a su vez prolonga la supervivencia de las criptas. Farrell y col., Cancer Res. 58: 933-39 (1998). De modo similar, en la mucositis oral, las terapias que reducen la sensitividad de las células madre a lesiones citotóxicas y/o mejoran la respuesta regenerativa postexposición tendrán un efecto clínico reduciendo los efectos secundarios de los actuales protocolos de tratamiento de cáncer. Sonis, et al., J. Am. Dent. Assoc. 97: 468-472 (1978).

Se empleó un protocolo de ensayo para determinar el papel del IL-18 humano en la mucositis: el ensayo de supervivencia de la criptas.

A. Ensayos de supervivencia de las criptas - Modelo de mucositis intestinal

El protocolo descrito a continuación fue adaptado de EpiStem, Ltd., Incubator Building, Grafton Street, Manchester, M13 9XX, UK.

Se utilizaron 30 ratones BDF1 machos adultos (10 a 12 semanas de edad). Se alojaron todos en jaulas durante 2 semanas para estabilizar los ritmos cardíacos (Potten y col., 1977, Cell Tissue Kinet., 10, 557). Los ratones se mantuvieron en jaulas individuales ventiladas (TVCs) en una unidad de barrera SPF con un ciclo de luz:oscuridad de 12 horas. Se permitió a los animales acceso ad libitum a alimentos y agua a lo largo del ensayo. Todos los procedimientos fueron certificados de acuerdo con el Acta 1986 (Procedimientos con Animales) de la U.K. Home Office (Ministerio del Interior del Reino Unido). Se asignaron aleatoriamente 6 animales por grupo, entre los siguientes 6 grupos: (1) solución salina inyectada ip, pre y posirradiación; (2) fármaco inyectado ip preirradiación y solución salina inyectada posirradiación; (3) solución salina inyectada ip preirradiación y fármaco inyectado posirradiación; (4) fármaco inyectado pre y posirradiación; (5) controles no tratados; (6) KFG humano (SEC ID Nº.4) inyectado ip preirradiación y solución salina inyectada posirradiación (control positivo).

Se indujo la lesión intestinal usando una dosis única de radiación con rayos X de 13 Gy de exposición corporal total. La mejor dosis de intervalo medio para empezar fue de 13 Gy, ya que habría detectado cualesquiera efectos protectores potenciales de un compuesto de ensayo. (Withers y col. 1969, Rad. Res., 38, 598). Todos los animales se pesaron una vez al día desde el inicio del tratamiento hasta el momento del sacrificio. Los animales se sacrificaron 4 días posirradiación. Se extrajo el intestino delgado y se fijó en fijador de Carnoy. Todos los tejidos se procesaron por histología (incrustada en parafina). Usando el material fijador de Carnoy se registraron el número de criptas intestinales supervivientes en cada grupo de tratamiento y se corrigió el tamaño usando un control no tratado, como el "ClonoQuant^{TM}". Por cada ratón se registraron 10 cortes transversales de intestino y se evaluó la cantidad media de criptas por corte transversal (Farrell y col., 1998, Cancer Res., 548, 933). Se midieron también las anchuras de cripta para corregir los errores registrados debidos al tamaño. Tras la corrección de tamaño se registró la cantidad media de criptas por corte transversal, por grupo. El protocolo de inyección usado se muestra en la Tabla 1. Las proteínas se adquirieron en PeproTech, número de catálogo 100-19.

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TABLA 1

1

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Para este protocolo todas las inyecciones se administraron a las 09:00 horas. La irradiación se efectuó a las 15:00 horas.

El efecto del IL-18 murino (SEC ID Nº.2) sobre la criptas intestinales supervivientes tras la irradiación se determinó en el estudio 04/135C, que se realizó bajo contrato por EpiStem Ltd. Él sistema CLONOQUANT® de EpiStem identificó y cuantificó las criptas regeneradas en los cortes transversales del intestino delgado. Tras la lesión citotóxica las criptas regeneradas proliferaron rápidamente y fueron fácilmente distinguibles de las criptas muertas. El KGF humano (SEC ID Nº. 4) se dosificó a 6,25 mg/kg/día y se adoptó como control positivo del estudio. El IL-18 murino (SEC ID Nº2) se dosificó a 5 mg/kg/día. Los datos del número de criptas supervivientes por circunferencia de criptas se divulgan más adelante en la Figura 6.

La Tabla 2, dada a continuación, resume los datos del modelo de mucositis inducida por radiación. El control positivo para el estudio de mucositis inducida por radiación, el KGF humano (SEC ID Nº.4), demostró una actividad buena cuando se dosificó tres días antes de la irradiación. El grupo KGF humano (SEC ID Nº.4) mostró un aumento del cuádruple en el número de criptas supervivientes en relación con el grupo de control salino. El IL-18 murino (SEC ID Nº.2) tiene una actividad comparable al KGF humano (SEC ID Nº.4) si se dosifica tres días antes de la irradiación, mostrando un aumento del triple en la supervivencia de criptas. Cuando el IL-18 murino (SEC ID Nº.2) se dosificó tanto antes como después de la irradiación, el número de criptas supervivientes en relación con el control salino aumentó el doble. Cuando se dosificó IL-18 murino (SEC ID Nº.2) sólo posirradiación, disminuyó la efectividad, dando como resultado un aumento de sólo 1,6 veces en las criptas supervivientes. En consecuencia, la dosificación de IL-18 murino (SEC ID Nº.2) tres días antes de la irradiación fue el régimen más eficaz.

Aunque la quimioterapia y la radioterapia pueden ser tratamientos exitosos para destruir células cancerosas, a menudo se destruye también tejido sano. Si se compromete el recubrimiento epitelial del tracto gastrointestinal, se puede producir ulceración y destrucción de criptas, con consecuencias dolorosas para el paciente, incapaz de comer y susceptible a infección. De modo adicional, el desarrollo de mucositis puede conducir al paciente a una falta de cumplimiento en la finalización de la totalidad del régimen de radioterapia o quimioterapia. En modelos murinos, el KGF causa una mejora en la lesión del epitelio oral o del tracto gastrointestinal inducida por la quimioterapia o la radiación. Se ha demostrado que el KGF [humano] recombinante reduce la mucositis oral en pacientes con cáncer colorectar metastático que toman fluororacilo más leucovorin. Meropol y col., J.Clin. Oncol. 21:1452-1458 (2003). En el modelo de mucositis inducida por radiación, se ha demostrado la eficacia del IL-18 murino (SERC ID Nº.2) en la protección de criptas intestinales, y puede usarse como un tratamiento paliativo en humanos. Ya que el IL-18 ha mostrado un efecto positivo en el tratamiento de mucositis inducida por radiación, puede también curar el epitelio dañado evidente en la mucosidad oral.

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TABLA 2

2

<110> DEDE, Kimberly

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LEE, Judithann

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<120> PROCEDIMIENTOS DE CICATRIZACIÓN DE HERIDAS ADMINISTRANDO IL-18 HUMANO

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<130> PU60998

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<140> ADJUNTO

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<141> 2005-08-05

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<150> 60/603,012

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<151> 2004-08-20

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<160>4

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 157

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 1

4

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<210> 2

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<211> 157

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

5

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<210> 3

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<211> 241

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<220>

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<221> SIGNAL

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<222> (-241)...(20)

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<400> 3

6

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<210> 4

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<211> 164

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

7

Claims

1. El uso del polipéptido IL-18 humano (SEC ID Nº.1) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico de cicatrización de una herida, en el que el polipéptido IL-18 humano está en combinación con un transportador, y en el que la herida es mucositis oral.

2. El uso del polipéptido IL-18 humano (SEC ID Nº.1) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico de cicatrización de una herida, en el que el polipéptido IL-18 humano está en combinación con un transportador, y en el que la herida es mucositis intestinal.