ES2260794T3 - Estimulacion de los mecanismos de defensa del huesped contra los tumores. - Google Patents
Estimulacion de los mecanismos de defensa del huesped contra los tumores.Info
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Abstract
UN PROCEDIMIENTO PARA TRATAR LA ENFERMEDAD NEOPLASTICA EN UN MAMIFERO, POR LA ADMINISTRACION AL MAMIFERO DE UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA DE UN INTERFERON, POR CONTACTO NASOMUCOSO. LA CANTIDAD DE INTERFERON ADMINISTRADO ES MENOR QUE UNA CANTIDAD QUE INDUZCA UNA RESPUESTA PATOLOGICA CUANDO SE ADMINISTRA PARENTERALMENTE.
Description
Estimulación de los mecanismos de defensa del
huésped contra los tumores.
La presente invención se refiere a
procedimientos de estimulación de mecanismos de defensa del huésped
contra enfermedades patológicas en un mamífero huésped mediante la
administración de interferón a través la oromucosa. En particular,
la invención puede aplicarse a procedimientos para el tratamiento
del cáncer.
Los interferones alfa se utilizan ampliamente
para el tratamiento de un gran número de tumores malignos
hematológicos, incluyendo la leucemia de células pilosas, la
leucemia mielogénica crónica, los linfomas de grado bajo, los
linfomas cutáneos de células T y los tumores sólidos, tales como por
ejemplo el carcinoma de células renales, el melanoma, los tumores
carcinoides y el sarcoma de Kaposi asociado al SIDA (Gutterman,
J.U., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91:
1198-1205; WO 8803411). Los efectos antitumorales se
observan habitualmente a elevadas dosis, a menudo del orden de
decenas de millones de unidades de
interferón-\alpha (IFN-\alpha),
administradas mediante inyección parenteral. El
interferón-\alpha es un interferón de Tipo I, una
clase que también incluye los interferones \beta y \omega.
Aunque se han utilizado habitualmente diversas rutas de
administración para la administración de interferones de tipo I,
incluyendo la inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular,
tópica e intralesional, la ruta oral no se ha utilizado de forma
general porque los interferones son proteínas que se consideran que
son inactivadas por las enzimas proteolíticas y que no se absorben
de forma apreciable en su forma nativa en el tracto
gastrointestinal. De hecho, diversos estudios han sido incapaces de
detectar interferones en sangre después de su administración oral
(Cantell y Pyhäla, J. Gen. Virol., 1973, 20:
97-104; Wills et al., J. IFN Res.,
1984, 4: 399-409; Gilson et al., J.
IFN Res., 1985, 5: 403-408).
Ha habido varios informes anecdóticos sobre la
eficacia de dosis bajas de interferón administrado como un spray
nasal o como una formulación líquida oral en el tratamiento de una
diversidad de enfermedades, en particular la influenza. En una serie
de documentos de patente se ha descrito la utilización de dosis
bajas de interferón de origen de especies heterólogas administrado
oralmente para el tratamiento de la rinotraqueitis infecciosa
("fiebre de embarque") en el ganado y de la leucemia felina y
también para el tratamiento de otras enfermedades, para el aumento
de la eficacia de vacunas; para mejorar la eficacia de la
utilización de comida; y para la prevención de la teileriosis
bovina. Véase la patente EEUU Nº. 4.462.985, la patente australiana
Nº. 608519, la patente australiana Nº. 583332 y la patente EEUU Nº.
5.215.741, respectivamente. Adicionalmente, la patente EEUU Nº.
5.017.371 describe la utilización de interferón de esta manera para
el tratamiento de los efectos secundarios de la quimioterapia o
radioterapia del cáncer. En estos documentos, el interferón
utilizado era interferón-\alpha humano preparado
mediante el procedimiento de Cantell, administrado en una solución
salina tamponada de fosfato a una dosis de 0,41 a 5 IU por libra de
peso corporal. Aunque dichos documentos sugieren que dichas dosis
bajas de interferón administrado en la mucosa orofaríngea,
preferentemente en una forma adaptada para un contacto prolongado
con la mucosa oral, pueden ser eficaces para el tratamiento de una
amplia variedad de enfermedades, incluido el cáncer, la evidencia
experimental en el caso de enfermedades diferentes de la fiebre de
embarque, de la leucemia felina, del parvovirus canino y de la
teileriosis es muy anecdótica. En particular, no se presenta ningún
ensayo controlado adecuado de dicho tratamiento en ningún modelo
animal para los cánceres humanos.
En cambio, la invención descrita en el presente
documento se basa en el primer estudio controlado en un modelo
animal de la eficacia del interferón administrado vía oromucosal
para el tratamiento del cáncer.
La presente invención proporciona un
procedimiento para el tratamiento del cáncer en un humano a través
de la administración al humano de una cantidad terapéuticamente
efectiva de un interferón a través del contacto oromucosal. La
cantidad de interferón administrado es menor que la cantidad que
induce una respuesta patológica cuando se administra por vía
parenteral. En particular, la invención proporciona un procedimiento
para el tratamiento del mieloma múltiple, la leucemia de células
pilosas, la leucemia mielogénica crónica, el linfoma de grado bajo,
el linfoma cutáneo de células T, los tumores carcinoides, el cáncer
cervical, los sarcomas, incluyendo el sarcoma de Kaposi, los tumores
de riñón, los carcinomas, incluyendo el carcinoma de células
renales, el carcinoma celular hepático, el carcinoma nasofaríngeo,
los tumores malignos hematológicos, el cáncer colorectal, el
glioblastoma, los papilomas laríngeos, el cáncer de pulmón, el
cáncer de colon, el melanoma maligno o los tumores cerebrales,
incluyendo tumores cerebrales malignos. En una realización de la
invención, el procedimiento puede aplicarse de forma general para el
tratamiento de tumores de etiología no vírica.
La administración oromucosal puede implicar
administrar una dosis efectiva de interferón en una dosis única o
la dosis efectiva puede administrarse en varias dosis más pequeñas
durante un período de tiempo suficiente para obtener una
estimulación del sistema de defensa del huésped equivalente a la de
una dosis única. Asimismo, la dosis efectiva de interferón puede
administrarse de forma continua durante un período de tiempo
suficiente para obtener una estimulación del sistema de defensa del
huésped equivalente a la de una dosis única.
El procedimiento se pone en práctica
administrando desde aproximadamente 1 x 10^{4} IU hasta
aproximadamente 20 x 10^{6} IU de interferón, más preferentemente
desde aproximadamente 1 x 10^{4} IU hasta aproximadamente 1 x
10^{6} IU de interferón, siempre y cuando la dosis seleccionada
sea tal que no induzca una respuesta patológica parenteral, tal y
como se define en la presente invención, o que sea menor que la
cantidad que induce una respuesta patológica si se administra por
vía parenteral. Dichos intervalos de dosis se refieren en general al
interferón homólogo \alpha en el hombre. Para otro tipo de
interferones, la dosis que inducirá una respuesta patológica puede
diferir de la inducida mediante el interferón homólogo \alpha en
el hombre. Un médico que trate un paciente con un tipo particular de
interferón será capaz de identificar fácilmente el intervalo de
dosis adecuada para el paciente a tratar.
Una composición farmacéutica para su
administración oromucosal puede comprender una cantidad
terapéuticamente efectiva de cómo mínimo un interferón. La
composición puede proporcionarse como una disolución, comprimido,
pastilla, gel, jarabe, pasta o mediante un sistema de entrega
oromucosal de liberación controlada. Opcionalmente, la composición
puede contener tampones, estabilizadores, agentes espesantes,
potenciadores de la absorción, potenciadores de la viscosidad y
similares.
La composición farmacéutica puede proveerse en
una forma de unidad de dosificación que tenga de 1 x 10^{4} IU a
20 x 10^{6} IU de interferón, más preferentemente de 1 x 10^{4}
IU a 1 x 10^{6} IU de interferón.
El procedimiento puede llevarse a la práctica
como la única aproximación terapéutica o como adyuvante a una
quimioterapia o radioterapia o junto a otras citoquinas, tales como
la interleucina-2, 12 ó 15 o con inductores de
IFN.
El procedimiento se lleva a cabo utilizando un
interferón de Tipo I ó II, seleccionado entre \alpha, \beta,
\gamma, \omega e interferones consenso, más preferentemente con
un IFN-\alpha recombinante.
La invención se describe a continuación en
detalle sólo a modo de referencia utilizando las siguientes
definiciones y ejemplos. Todas las patentes y publicaciones a las
cuales se hace referencia en el presente documento se han
incorporado expresamente como referencia.
Tal y como se utiliza en la presente invención,
"interferón" se refiere a un interferón de Tipo I o de Tipo
II, incluyendo aquéllos designados comúnmente como \alpha,
\beta, \gamma \omega, y las mezclas de los mismos, incluyendo
la secuencia consenso. Los interferones pueden adquirirse en una
amplia variedad de fuentes comerciales y se han aprobado para el
tratamiento de numerosas indicaciones. El interferón puede ser de
fuentes naturales, pero es preferentemente un producto recombinante.
Para los objetivos de la invención, el término "interferón"
incluye también los fragmentos polipeptídicos que tienen actividad
de interferón y las formas quiméricas o mutantes del interferón en
las cuales se han introducido modificaciones en la secuencia, por
ejemplo, para aumentar la estabilidad, sin afectar la naturaleza de
su actividad biológica, tal y como se describe en las patentes EEUU
Nº. 5.582.824, 5.593.667 y 5.594.107, entre
otras.
otras.
Opcionalmente, el interferón puede administrarse
al mismo tiempo que un inductor de la síntesis y liberación de
interferón. El inductor puede administrarse junto al interferón o
puede administrarse separadamente. Entre los inductores de
interferón se incluyen, por ejemplo, los polinucleótidos tipo poli
I:C; se utiliza preferentemente un interferón administrable
oralmente de bajo peso molecular. En el estado de la técnica se han
descrito algunos inductores adecuados, por ejemplo la Tilorona
(patente EEUU Nº. 3592819; Albrecht et al., J. Med.
Chem., 1974, 17: 1150-1156) y el derivado
de la quinolona Imiquimod (Savage et al., Brit. J.
Cáncer, 1996, 74: 1482-1486).
Los procedimientos y composiciones de la
invención pueden utilizarse opcionalmente conjuntamente con uno o
más tratamientos diferentes para la enfermedad específica, y el
médico o veterinario asistente será capaz de seleccionar fácilmente
dichos otros tratamientos que sean apropiados según las
circunstancias.
En una realización, la invención proporciona un
procedimiento para el tratamiento del cáncer en un humano, que
comprende la etapa de administración de interferón tal y como se ha
descrito anteriormente. El cáncer puede ser un cáncer en
metástasis.
Aunque el procedimiento de la invención puede
utilizarse sin un tratamiento simultáneo con otros agentes, se
contempla que esta realización de la invención será particularmente
útil en los siguientes marcos:
- a)
- como terapia adyuvante, después de cirugía, de quimioterapia o radioterapia realizadas mediante protocolos estándares
- b)
- para el tratamiento de cánceres sensibles a interferón, el procedimiento de la invención se utiliza aisladamente o conjuntamente con quimioterapia o radioterapia convencional; y
- c)
- para el tratamiento de cánceres resistentes a interferón, el procedimiento de la invención se utiliza aisladamente o más preferentemente conjuntamente con quimioterapia o radioterapia convencional.
Los procedimientos indicados anteriormente se
dirigen a la inducción y/o mantenimiento de la remisión de la
enfermedad. Por "conjuntamente con otro tratamiento" se
entiende que el interferón se administra antes, durante y/o después
de la radioterapia u otra quimioterapia. El protocolo más adecuado
dependerá de diversos factores, tal y como se describe
posteriormente.
En particular, se contempla que el procedimiento
de la invención se utilizará preferentemente conjuntamente con como
mínimo un tratamiento diferente seleccionado entre el grupo que
consiste en quimioterapia utilizando fármacos citoestáticos, una o
más citoquinas diferentes que tengan actividad
anti-cáncer pero que tengan un mecanismo de acción
diferente del interferón, agentes anti-angiogénicos
y agentes que potencien la actividad del interferón.
Preferentemente, la segunda citoquina es
interleucina-1 (IL-1),
interleucina-2 (IL-2),
interleucina-12 (IL-12), o
interleucina-15 (IL-15);
preferentemente el inhibidor de la angiogénesis es
AGM-1470 [éster (3R-(3\alpha,
4\alpha(2R*, 3R*), 5\beta,
6\beta))-5-metoxi-4-(2-metil-3-(3-metoxi-2-butenil)oxiranil)-1-oxaspiro(2,5)oct-6-ílico
del ácido(cloroacetil)-carbámico];
preferentemente el tratamiento potenciador del interferón es la
hipertermia o el butirato de arginina.
Entre los fármacos citoestáticos preferidos para
administrar conjuntamente con el interferón se incluyen, pero no se
limitan a, ciclofosfamida, cisplatino, carboplatino, carmustina
(BCNU;
N,N-bis(2-cloroetil)-N-nitrosourea),
metotrexato, adriamicina,
\alpha-difluorometilomitina y
5-fluorouracilo.
Los cánceres susceptibles a dicho procedimiento
incluyen, pero no se limitan a, cánceres que responden a la
administración parenteral de elevadas dosis de
IFN-\alpha, tales como tumores malignos
hematológicos, por ejemplo, el mieloma múltiple, la leucemia de
células pilosas, o la leucemia mielogénica crónica, los linfomas de
grado bajo, el linfoma de células T cutáneas, los tumores sólidos
tales como el carcinoma de células renales y el melanoma, los
tumores carcinoides o el sarcoma de Kaposi asociado al SIDA, en
particular los tumores de etiología no vírica.
En la preparación de las composiciones
farmacéuticas utilizadas en la presente invención, pueden
utilizarse diversos vehículos y excipientes para el IFN, de manera
evidente para un experto en la materia. Una tecnología de
formulación representativa se explica, inter alia, en
Rémington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, Mack
Publishing Co., Easton, PA, 1995 y sus ediciones predecesoras. La
formulación de IFN puede comprender potenciadores de la estabilidad,
tales como la glicina o la alanina, tal y como se describe en la
patente EEUU Nº. 4.496.537 y/o uno o más transportadores, tales como
la proteína transportadora. Por ejemplo, para el tratamiento en
humanos, se utiliza normalmente la albúmina del suero humano de
grado farmacéutico, opcionalmente junto a una disolución salina
tamponada de fosfato como diluyente. Si el excipiente de IFN es la
albúmina del suero humano, ésta puede derivarse del suero humano o
puede ser de origen recombinante. Normalmente, cuando se utiliza la
albúmina del suero, será de origen homólogo.
El IFN puede administrarse mediante cualquier
medio que proporcione un contacto del IFN con la cavidad oromucosal
del receptor. Así pues, se entenderá claramente que la invención no
se limita a cualquier tipo particular de formulación. El presente
documento describe la administración de IFN de forma profunda en la
cavidad oromucosal; esto puede conseguirse con líquidos, sólidos o
aerosoles, así como con gotas nasales o sprays nasales. Así pues, la
invención incluye, pero no se limita a, líquido, spray, jarabe,
pastilla, comprimidos bucales y formulaciones nebulizadoras. Un
experto en la materia reconocerá que para las formulaciones para
aerosol o nebulizador, el tamaño de partícula de la preparación
puede ser importante, y será consciente de procedimientos adecuados
según los cuales puede modificarse el tamaño de partícula.
Según un aspecto de la invención, el interferón
se administra en una única dosis diaria. Alternativamente, el
interferón se administra en diversas dosis más bajas, distribuidas a
lo largo del tiempo, de manera que el efecto neto es equivalente a
la administración de la dosis única mayor. Una aproximación para
dicho modo de entrega es a través de la disposición de un aparato
para la liberación sostenida o controlada adherido o implantado en
la cavidad oromucosal y diseñado para liberar interferón a lo largo
del tiempo en una cantidad equivalente a la de una única dosis
elevada.
Entre las formulaciones representativas del
interferón para su Utilización oromucosal se incluyen las
siguientes (todos los % son en peso/peso):
Comprimido: dextrosa BP 45%; gelatina BP 30%;
almidón de trigo BP 11%; carmelosa de sodio 5%; albúmina de huevo
BPC 4%; leucina USP 3%; propilenglicol BP 2%; y
IFN-\alpha2 1 x 10^{6} IU. El comprimido puede
utilizarse tal cual y dejar que se disuelva lentamente en la boca o
puede disolverse en agua y mantenerse en la boca en contacto con la
oromucosa, según sea necesario.
Puede prepararse una pasta de interferón, tal y
como se describe en la patente EEUU Nº. 4.675.184, a partir de
glicerina 45%, CMC sódica 2%, tampón citrato (pH 4,5) 25%, agua
destilada hasta el 100% y 1x 10^{6} IU de
IFN-\alpha2. La pasta de interferón puede
adherirse a la mucosa bucal.
Asimismo, puede preparase una formulación para
hacer gárgaras o un jarabe añadiendo la cantidad deseada de
interferón a una formulación de enjuague bucal comercial o a una
formulación de jarabe para la tos comercial.
Dentro de los intervalos de dosificación
específicos a los que se ha hecho referencia anteriormente, el
tratamiento óptimo en cualquier caso individual dependerá de la
naturaleza de la enfermedad en cuestión, el estadio de la
enfermedad, la terapia previa, otra terapia en continuación, el
estado general de salud del paciente, la sensibilidad del sujeto al
interferón, etc, y por lo tanto, será a criterio del médico,
teniendo en cuenta dichas circunstancias. La extensión del
tratamiento variará, evidentemente, dependiendo de la enfermedad que
se está tratando, por ejemplo, el tratamiento de un cáncer de
crecimiento lento, tal como cáncer de próstata, se espera que
implicará un curso de tratamiento diferente que el tratamiento de un
cáncer con crecimiento rápido, tal como el carcinoma celular
hepático.
La dosis efectiva descrita en el presente
documento es aquella que no genera una respuesta patológica en el
paciente cuando se administra vía parenteral. Una respuesta
patológica puede ser aguda, crónica o cumulativa y puede
manifestarse por cambios en la química de la sangre, como la
leucopenia, por una depresión de la médula ósea y otros parámetros
histológicos. En el sentido utilizado en el presente documento, una
respuesta patológica incluye efectos secundarios adversos, como
fiebre, malestar o síntomas similares a la gripe, reacciones
vasculares, como la flebitis y reacciones de inflamación local en el
sitio de inyección. Dichas respuestas variarán considerablemente
entre la población de pacientes dependiendo de las variaciones
individuales en la sensibilidad al interferón. Un análisis simple
para identificar una dosis baja aceptable de interferón para la
terapia individual es inyectar al paciente la dosis aceptable
putativa, basada en consideraciones de edad, peso, indicación,
progresión, etc. y determinar si la inyección produce una respuesta
patológica tal como se ha definido en el presente documento, siendo
la irritación local en el sitio de inyección el criterio más fácil
de establecer. Si no se observa respuesta adversa, puede
administrarse la misma dosis vía oromucosal. Si hay una respuesta
no deseada, el proceso se repite a una dosis inferior, hasta que se
identifica una dosis no patológica.
Para muchos pacientes, se espera que las dosis
oromucosales serán aproximadamente las mismas que las que se sabe
que son bien toleradas y efectivas en protocolos parenterales
existentes aprobados. Por lo tanto, para los objetos de
especificidad, una dosis baja aceptable de interferón será de
aproximadamente 1 x 10^{4} IU a aproximadamente
20 x 10^{6} IU de interferón por día, más preferentemente de aproximadamente 1 x 10^{4} IU a aproximadamente 1 x 10^{6} IU de interferón por día, siempre y cuando la dosis sea tal que no induzca una respuesta patológica si se administra vía parenteral. En una realización de la invención, la dosis total puede administrarse en múltiples dosis más bajas a lo largo del tiempo, o puede entregarse de forma continua o de forma pulsátil a partir de un aparato de entrega controlada adherido o implantado en la oromucosa.
20 x 10^{6} IU de interferón por día, más preferentemente de aproximadamente 1 x 10^{4} IU a aproximadamente 1 x 10^{6} IU de interferón por día, siempre y cuando la dosis sea tal que no induzca una respuesta patológica si se administra vía parenteral. En una realización de la invención, la dosis total puede administrarse en múltiples dosis más bajas a lo largo del tiempo, o puede entregarse de forma continua o de forma pulsátil a partir de un aparato de entrega controlada adherido o implantado en la oromucosa.
Se preparó IFN-\alpha/\beta
de ratón (Mu IFN-\alpha/\beta) a partir de
cultivos de células C243-3 inducidas con el virus de
la enfermedad de Newcastle (NDV) y se purificaron tal y como se ha
descrito previamente (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol.
and Med., 1974, 146: 809-815). La
preparación utilizada en este estudio tenía una valoración de 4 x
10^{6} Unidades Internacionales (IU)/ ml y una actividad
específica de 5 x 10^{7} IU/mg de proteína, ensayado sobre células
929 de ratón estimuladas con el virus de la estomatitis vesicular
(VSV), tal como se ha descrito previamente (Tovey et al.,
Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1974, 146:
809-815). La preparación se estandarizó contra la
preparación de referencia internacional de
IFN-\alpha/\beta murino de los Institutos
Nacionales de la Salud (NIH)
(G-002-9004-541).
Se preparó IFN-\alpha
1-8 humano recombinante (Hu
IFN-\alpha; BDBB lote nº. CPG
35269-1, Ciba-Geigy, Basilea,
Suiza) y se purificó tal y como se ha descrito previamente (Meister
et al., J. Gen. Virol., 1986, 67:
1633-1643). La preparación utilizada en este estudio
tenía una valoración de 70 x 10^{6} IU/ml sobre células WISH
humanas homólogas estimuladas con VSV tal como se ha descrito
previamente (Tovey et al.,Nature, 1977, 267:
455-457) y una valoración de 1 x 10^{6}
IU/ml sobre células L929 de ratón heterólogas. La preparación se estandarizó contra la preparación de referencia internacional NIH de IFN-\alpha humano (G-023-901-527) y contra el estándar NIH IFN-\alpha/\beta murino (G-002-9004-5411). La actividad específica de la preparación IFN era de 2 x 10^{8} IU/mg.
IU/ml sobre células L929 de ratón heterólogas. La preparación se estandarizó contra la preparación de referencia internacional NIH de IFN-\alpha humano (G-023-901-527) y contra el estándar NIH IFN-\alpha/\beta murino (G-002-9004-5411). La actividad específica de la preparación IFN era de 2 x 10^{8} IU/mg.
Se compró interferón-\alpha
murino recombinante en Life Technologies Inc. La preparación
utilizada en este estudio (lote nº. HKK404) tenía una valoración de
6 x 10^{6} IU/ml y una actividad específica de 6 x 10^{8} IU/mg
de proteína, ensayado sobre células 929 de ratón estimuladas con el
virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Tovey et al.,
Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1974, 146:
406-415).
Se compró interferón \beta murino recombinante
en R&D Systems, Inc. La preparación utilizada en este estudio
(lote nº. 1976-01S) tenía una valoración de 3,2 x
10^{4} IU/ml y una actividad específica de 8 x 10^{6} IU/mg de
proteína, ensayado sobre células 929 de ratón estimuladas con el
virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Tovey et al.,
Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1974, 146:
406-415).
Se compró interferón-\gamma
murino recombinante en R&D Systems Inc. La preparación utilizada
en este estudio (2580-03SA) tenía una valoración de
2 x 10^{5} IV/ml y una actividad específica de 1 x 10^{7} IU/mg
de proteína, ensayado sobre células 929 de ratón estimuladas con el
virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Tovey et al.,
Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1974, 146:
406-415).
Todas las preparaciones de interferón se
valoraron simultáneamente en el mismo ensayo y se estandarizaron
contra la preparación de referencia internacional de interferón
\alpha/\beta murino de los Institutos Nacionales de la
Salud(G-002-9004-5411).
Tanto el interferón \alpha/\beta murino como
los interferones murinos recombinantes se diluyeron en el excipiente
Fe-
rimmune^{TM} antes de su administración.
rimmune^{TM} antes de su administración.
Las preparaciones de interferón se diluyeron en
solución salina tamponada de fosfato (PBS) que contenía albúmina
del suero bovino (BSA). La fracción V de la albúmina del suero
bovino (grado RIA; libre de inmunoglobulinas; número de catálogo
A7888; Sigma; EEUU) se disolvió hasta una concentración final de 100
\mug/ml en PBS (pH 7,4) y se esterilizó por filtración (0,2 \mu,
Millex-GV, Millipore, EEUU).
En los experimentos descritos en la presente
patente, las preparaciones de interferón se diluyeron en un
excipiente apropiado. El excipiente utilizado es como sigue,
proporcionado en forma de comprimidos (Ferimmune^{TM}, Pharma
Pacific):
\hskip0,4cm % peso/peso | mg/comprimido | |||
Dextrosa (Glucosa) BP** | \hskip0,9cm 44,67*** | 55,84 | ||
Gelatina BP** | 30,06 | 37,58 | ||
Almidón de trigo BP** | 11,31 | 14,14 | ||
Carmelosa de sodio BP** | 4,96 | 6,20 | ||
Albúmina de huevo BPC** | 4,03 | 5,04 | ||
Leucina USP | 3,00 | 3,75 | ||
Propilenglicol BP | 1,88 | 2,35 | ||
Dextrano 40** (como inyección de Dextrano 40 BP) | 0,06 | 0,08 | ||
Fosfato de sodio BP | 0,03 | 0,04 | ||
Cloruro de sodio BP | 0,01 | 0,01 | ||
Fosfato ácido de sodio BP | 0,01 | 0,01 | ||
Total | 100,02 | 125,04 | ||
** \, Calculado sobre una base anhidra | ||||
*** Derivado de: | ||||
\hskip1,5cmDextrosa (Glucosa) BP (anhidra) \hskip2,14cm 44,64% | ||||
\hskip1,5cmGlucosa BP (como inyección de Dextrano 40 BP) 0,03%. |
Se disolvió un único comprimido en 1,5 ml de una
solución salina tamponada de fosfato, centrifugada a 16.000 g
durante 15 min, y entonces se filtro en condiciones estériles (0,2
\mu, Millex-GV, Millipore, EEUU) y se almacenó a
4ºC antes de su utilización. El excipiente se preparó el día antes
de su utilización.
Algunos experimentos preliminares mostraron que
la aplicación de 5 \mul de cristal violeta a cada ventana de la
nariz de un ratón adulto normal utilizando una micropipeta Eppendorf
P20 provocó una distribución casi inmediata del tinte a lo largo de
la superficie completa de la cavidad orofaríngea. La tinción de la
cavidad orofaríngea todavía era evidente 30 minutos aproximadamente
después de la aplicación del tinte. Se obtuvieron resultados
esencialmente similares utilizando IFN-\alpha
1-8 humano recombinante marcado con ^{125}I
aplicado de la misma manera. Este procedimiento de administración se
utilizó por tanto en todos los experimentos posteriores.
Para los objetos de los experimentos animales
descritos en la presente descripción, se entiende claramente que
las expresiones "oromucosal" u "orofaríngea" o
"intranasal/oral" o "intranasal más oral" o "in/or"
en relación a la ruta de administración del IFN deben significar la
administración profunda de la preparación IFN en la cavidad nasal,
de manera que se distribuya rápidamente en la cavidad oromucosal, es
decir, la boca y la garganta del mamífero receptor, de manera que
haga contacto con la mucosa que recubre dicha cavidad.
Se obtuvo el clon
IFN-\alpha/\beta resistente, 3C18, o las células
de eritroleucemia de Friend (FLC) a partir de Dr. E. Affabris, Roma
y se describe con detalle en Affabris et al., 1982,
(Virology, 120: 441-452). Dichas
células se mantuvieron posteriormente mediante pasajes in
vivo. Brevemente, se inoculó aproximadamente 100 LD_{50} de
células 3C18 a ratones DBA/2, mediante inyección peritoneal (ip) y
una semana después, se recolectaron las células tumorales a partir
del peritoneo del ratón, se contaron y se inoculó de nuevo otros
ratones con 100 LD_{50} de células 3C18. Dicho procedimiento se
repitió de 60 a 100 pasajes. Se ha mostrado que las células 3C18
utilizadas en el pasaje in vivo
60 a 100 son altamente metastáticos para el hígado y el bazo (Gresser et al., Int. J. Cáncer, 1987, 39: 789-792). El fenotipo de la resistencia IFN se confirmó rutinariamente cultivando in vitro en presencia de IFN-\alpha/\beta las células sometidas a los pasajes in vivo (Belardelli et al., Int. J. Cáncer, 1982, 30: 813-820).
60 a 100 son altamente metastáticos para el hígado y el bazo (Gresser et al., Int. J. Cáncer, 1987, 39: 789-792). El fenotipo de la resistencia IFN se confirmó rutinariamente cultivando in vitro en presencia de IFN-\alpha/\beta las células sometidas a los pasajes in vivo (Belardelli et al., Int. J. Cáncer, 1982, 30: 813-820).
Las composiciones de interferón de la presente
invención también son activas contra el clon L1210R6 de las células
de linfoma L1210 aisladas en nuestro laboratorio (Gresser et
al., 1974, Interferon and cell división - interferón y
división celular -. IX. Interferon-resistant L1210
cells: Characteristics and Origin - células L1210 resistentes a
interferón: características y origen -. J. Nat. Cáncer Inst.,
52: 553-559) y contra el tumor transplantable EL4
derivado de ratones inoculados con el carcinógeno químico
1-2 dimetilbenzantreína (Gorer, P.A., 1950,
Br. J. Cáncer, 4: 372-381).
Los ratones utilizados en el presente estudio se
obtuvieron a partir de una colonia específica libre de patógenos
(IFFA CREDO, Francia). Se albergaron en una instalación animal
específica libre de patógenos en el Institut Federatif CNRS en
Villejuif, según los estándares EEC.
Se ensayó el interferón según un procedimiento
convencional. Brevemente, se diluyeron muestras (20 \mul) en 80
\mul
de Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM) (Gibco, Francia) que contenía un 2% de Suero de Ternero Fetal inactivado por calor (FCS) (Gibco, Francia) y se añadió a cada pozo de una placa de microvaloración (Falcon, número de catálogo 3072) utilizando una micropipeta multicanal (Finnpipette, Labsystem, 50-300 \mul). Se añadieron células WISH o células L929 (2 x 10^{4} células/pozo) en 100 \mul de MEM que contenía un 2% de FCS y se incubó durante una noche a 37ºC en una atmósfera de aire con un 5% de CO_{2} (incubador de CO_{2} Forma 3029). Se examinó entonces la presencia de cualquier señal de toxicidad en las células utilizando un microscopio invertido Olympus IM GLDW equipado con un objetivo 10X. Las muestras que no mostraron una toxicidad detectable se sometieron entonces a diluciones al doble en serie empezando por una dilución inicial 1:10 en un volumen total de 200 \mul de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS, transfiriendo 100 \mul de material diluido con una micropipeta multicanal en un microplato que contenía 100 \mul por pozo de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS. También se prepararon diluciones a la mitad en serie apropiadas del estándar de referencia NIH IFN-\alpha humano (G-023-901-527) o el estándar de referencia NIH IFN-\alpha/\beta murino (G-002-9004-5411). Entonces, si era apropiado se añadió a cada placa las células WISH o las células L929 (2 x 10^{4} células/pozo) en 100 \mul de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS y se incubó durante una noche a 37ºC en una atmósfera de aire con un 5% de CO_{2}. Entonces se comprobó cualquier señal de toxicidad las monocapas celulares y en el caso de ausencia de cualquier toxicidad aparente, el cultivo se aspiró y se substituyó por 200 \mul de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS que contenía 100 TCID50 de VSV (2 x 10^{-4} VSV23 para las células WISH o 10-5 VSV23 para las células L929). Entonces se incubaron las placas durante una noche a 37ºC en una atmósfera de aire con un 5% de CO_{2}. Entonces se examinó el efecto citopático vírico en las monocapas celulares utilizando un microscopio invertido Olympus IM ULWD. Se determinaron las valoraciones de interferón a partir del recíproco de la dilución, que dio un 50% de protección contra el efecto citopático vírico específico y se expresó en unidades de referencia internacional/ml (IU/ml).
de Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM) (Gibco, Francia) que contenía un 2% de Suero de Ternero Fetal inactivado por calor (FCS) (Gibco, Francia) y se añadió a cada pozo de una placa de microvaloración (Falcon, número de catálogo 3072) utilizando una micropipeta multicanal (Finnpipette, Labsystem, 50-300 \mul). Se añadieron células WISH o células L929 (2 x 10^{4} células/pozo) en 100 \mul de MEM que contenía un 2% de FCS y se incubó durante una noche a 37ºC en una atmósfera de aire con un 5% de CO_{2} (incubador de CO_{2} Forma 3029). Se examinó entonces la presencia de cualquier señal de toxicidad en las células utilizando un microscopio invertido Olympus IM GLDW equipado con un objetivo 10X. Las muestras que no mostraron una toxicidad detectable se sometieron entonces a diluciones al doble en serie empezando por una dilución inicial 1:10 en un volumen total de 200 \mul de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS, transfiriendo 100 \mul de material diluido con una micropipeta multicanal en un microplato que contenía 100 \mul por pozo de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS. También se prepararon diluciones a la mitad en serie apropiadas del estándar de referencia NIH IFN-\alpha humano (G-023-901-527) o el estándar de referencia NIH IFN-\alpha/\beta murino (G-002-9004-5411). Entonces, si era apropiado se añadió a cada placa las células WISH o las células L929 (2 x 10^{4} células/pozo) en 100 \mul de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS y se incubó durante una noche a 37ºC en una atmósfera de aire con un 5% de CO_{2}. Entonces se comprobó cualquier señal de toxicidad las monocapas celulares y en el caso de ausencia de cualquier toxicidad aparente, el cultivo se aspiró y se substituyó por 200 \mul de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS que contenía 100 TCID50 de VSV (2 x 10^{-4} VSV23 para las células WISH o 10-5 VSV23 para las células L929). Entonces se incubaron las placas durante una noche a 37ºC en una atmósfera de aire con un 5% de CO_{2}. Entonces se examinó el efecto citopático vírico en las monocapas celulares utilizando un microscopio invertido Olympus IM ULWD. Se determinaron las valoraciones de interferón a partir del recíproco de la dilución, que dio un 50% de protección contra el efecto citopático vírico específico y se expresó en unidades de referencia internacional/ml (IU/ml).
Ejemplo
1
Para establecer si el
IFN-\alpha administrado por la ruta intranasal /
oral (in/or) aumenta la supervivencia de ratones estimulados con
células FLC altamente metastásicas, se estimularon vía intravenosa
(iv) grupos de seis ratones macho DBA/2 de 7-8
semanas de edad con 1 x 10^{5} FLC en el día 0.
Cada grupo de ratones se trató dos veces por día
durante 10 días consecutivos mediante la ruta in/or con 104 IU de
una mezcla natural de subtipos IFN-\alpha murinos
múltiples (Mu IFN-\alpha) en 10 \mul
BSA-PBS o con un volumen igual de una preparación
simulada de IFN, la cual se obtuvo y se purificó de la misma manera
que la preparación e IFN excepto por la omisión del inductor de
virus. La preparación simulada de IFN no mostró actividad IFN
detectable cuando se ensayó en paralelo con la preparación Mu
IFN-\alpha purificada. Los resultados se muestran
en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo | Tratamiento | Día de muerte | Día medio de muerte \pm SE |
1 | IFN-\alpha Mu simulado | 9, 9, 10, 10, 10, 10 | 9,6 \pm 0,2 |
2 | IFN-\alpha Mu 10^{4} IU | 28, 31, 36, >100, >100 | 31,7 \pm 2,3** |
** Calculado sólo para los animales muertos. |
La detección oromucosal de 104 IU de
IFN-\alpha Mu dos veces al día aumentó
dramáticamente el tiempo de supervivencia de ratones a los que se
les había inyectado FLC. De hecho, 2 de 5 ratones se curaron
efectivamente, ya que estaban vivos y se encontraban bien 100 días
después de su estimulación con 2 x 10^{4} LD_{50} de FLC, a
pesar de cesar el tratamiento de IFN-\alpha
después de sólo 20 días. Los resultados de varios análisis
controlados en grupos de 10 ratones DBA/2 adultos infectados con 2 x
10^{4} LD_{50} de FLC y tratados vía oromucosal con 10^{3} IU
de IFN-\beta murino recombinante ó 10^{3} IU de
IFN-\gamma murino recombinante fueron
similares.
Ejemplo
2
Para confirmar los resultados del Ejemplo 1, se
llevó a cabo un ensayo más amplio. Ciento cincuenta ratones DBA/2
hembra de 8 semanas de edad se estimularon iv con 1 x 10^{5} FLC
(2 x 10^{4} FLC LD_{50}) en el día 0. Los ratones se trataron
con el tipo y dosis de IFN indicado, administrado mediante la ruta
in/or en un volumen de 10 \mul dos veces al día
durante 10 días consecutivos. Eran 10 ratones en cada grupo de tratamiento. Los resultados se recogen en la Tabla 2.
durante 10 días consecutivos. Eran 10 ratones en cada grupo de tratamiento. Los resultados se recogen en la Tabla 2.
Grupo | Tratamiento | Dosis | Excipiente | Día medio de muerte \pm SE |
1 | Ninguno | - | Ninguno | 9,5 \pm 0,2 |
2 | IFN-\alpha Mu simulado | - | BSA/PBS | 9,6 \pm 0,2 |
3 | IFN-\alpha Mu | 10^{4} IU | BSA/PBS | 29,4 \pm 25,6%* |
4 | IFN-\alpha Mu | 10^{3} IU | BSA/PBS | 11,6 \pm 0,2 |
5 | IFN-\alpha Mu | 10^{2} IU | BSA/PBS | 10,3 \pm 0,2 |
6 | IFN-\alpha 1-8 Hu | 10^{4} IU | BSA/PBS | 18,2 \pm 0,8 |
7 | IFN-\alpha 1-8 Hu | 10^{3} IU | BSA/PBS | 13,1 \pm 0,8 |
8 | IFN-\alpha 1-8 Hu | 10^{2} IU | BSA/PBS | 11,4 \pm 0,5 |
IU: unidades de referencia internacional | ||||
BSA/PBS: 100 \mug/ml de BSA en PBS pH 7,4 | ||||
IFN-\alpha Mu: mezcla natural de los subtipos de IFN-\alpha murinos | ||||
IFN-\alpha Hu: único isotipo de IFN-\alpha humano recombinante | ||||
*: algunos de los animales de este grupo todavía estaban vivos 100 días después del tratamiento |
IFN-\alpha administrado
mediante la ruta in/or muestra una marcada actividad
anti-tumoral en ratones estimulados iv con FLC. De
hecho, algunos ratones tratados con IFN pueden considerarse curados,
dado que todavía estaban vivos más de 100 días después de la
inoculación de 100.000 FLC en un sistema en el cual de 4 a 5 células
FLC son suficientes para matar al animal.
Las preparaciones puras de una sola subespecie
de IFN-\alpha recombinante,
IFN-\alpha 1-8, de una mezcla
natural de múltiples subtipos de IFN-\alpha, de
IFN-\alpha Mu, de IFN-\beta
murino recombinante y de IFN-\gamma murino
recombinante muestran una marcada actividad
anti-tumoral en este modelo si se administran
mediante la ruta in/or, lo cual sugiere fuertemente que la actividad
anti-tumoral observada de las preparaciones de IFN
administradas por vía oromucosal se debe, de hecho, al componente
IFN de dichas preparaciones.
Ejemplo
3
El efecto de IFN administrado in/or se comparó
con el de IFN administrado mediante rutas convencionales. Se
estimularon ratones DBA/2 hembra de ocho semanas de edad iv con 1 x
10^{5} FLC (2 x 10^{4} FLC LD_{50}) en el día 0. Los ratones
se trataron dos veces al día durante 10 días consecutivos con
10^{4} IU de IFN-\alpha Mu (la dosis óptima es
como se ha determinado en el Ejemplo 2) administrado mediante la
ruta indicada. Habían 6 ratones en cada grupo d tratamiento y en
cada caso, el excipiente para el IFN-\alpha Mu era
BSA en PBS. Los resultados se recogen en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo | Tratamiento | Ruta | Día medio de muerte \pm SE |
1 | Ninguno | - | 9,6 \pm 0,2 |
2 | IFN-\alpha Mu | Intranasal / oral | 30 \pm 25,85%* |
3 | IFN-\alpha Mu | oral | 18,5 \pm 2,0 |
4 | IFN-\alpha Mu | gástrica | 13,5 \pm 1,3 |
5 | IFN-\alpha Mu | subcutánea | 23,5 \pm 1,6 |
6 | IFN-\alpha Mu | intramuscular | 23,7 \pm 1,8 |
7 | IFN-\alpha Mu | intravenosa | 25,0 \pm 1,2 |
8 | IFN-\alpha Mu | intraperitoneal | 26,7 \pm 4,1 |
IU: unidades de referencia internacional | |||
BSA/PBS: 100 \mug/ml de BSA en PBS pH 7,4 | |||
*: \begin{minipage}[t]{150mm}algunos de los animales de este grupo todavía estaban vivos 100 días después de la inoculación de las células FLC\end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
La ruta de administración oromucosal (ó in/or)
es como mínimo tan efectiva como las rutas parenterales utilizadas
comúnmente, como por ejemplo iv, inyección intramuscular (im) y
subcutánea (sc), si no es más efectiva. La ruta in/or era de hecho
tan efectiva como la inyección ip, la cual se considera la ruta más
efectiva en ratones estimulados iv con FLC. En contraste con lo
anterior, la administración de la misma dosis de IFN directamente en
la boca mostró ser menos efectivo que la administración combinada
intranasal y oral, mientras que la introducción de IFN directamente
en el estómago de los animales mediante un tubo era
considerablemente menos efectiva.
Ejemplo
4
Se sabe que el IFN-\alpha
induce la expresión de diversas proteínas celulares después de la
unión de la proteína a su receptor de la superficie celular. Se
piensa que dichas proteínas proporcionan un marcador útil de la
acción del IFN.
Evaluamos el efecto de
IFN-\alpha administrado vía la ruta in/or sobre la
expresión de tres proteínas inducidas por IFN, los antígenos MHC de
clase I, el antígeno Ly 6A/E y la
2'-5'-oligoadenilato sintetasa.
El tratamiento de los ratones
DBA-2 (H-2K^{d}) con hasta 20.000
IU de IFN-\alpha Mu mediante la ruta in/or no
aumentó significativamente la expresión de
H-2-K^{d} en los linfocitos,
monocitos o granulocitos de la sangre periférica en condiciones en
las cuales una cantidad tan pequeña como 20 IU de
IFN-\alpha Mu administrado ip aumentó marcadamente
la expresión de los antígenos
H-2-K^{d} tanto sobre los
monocitos como sobre los granulocitos de la sangre periférica. De
hecho, la expresión de los monocitos se suprimió ligeramente.
De forma similar, el tratamiento de ratones con
hasta 20.000 IU de IFN-\alpha vía la ruta in/or
no tuvo un efecto significativo sobre la expresión de los antígenos
Ly6 A/E, la expresión de los cuales aumenta marcadamente sobre la
superficie de un a diversidad de células linfoides después del
tratamiento parenteral con IFN tipo I (Dumont et al., J.
Immunol., 1986, 137: 201-210). Se
obtuvieron resultados similares con 200 ó 200.000 IU de
IFN-\alpha Mu o IFN-\alpha
1-8 Hu vía la ruta in/or.
El tratamiento de ratones Swiss o DBA/2 con una
cantidad tan pequeña cono 20 IU de IFN-\alpha Mu
inyectado ip dio como resultado un aumento marcado en la actividad
2'-5'-oligoadenilato sintetasa tanto
en las células mononucleares periféricas como en los esplenocitos.
En contraste con lo anterior, en el mismo experimento, el
tratamiento de ratones con hasta 20.000 IU de
IFN-\alpha Mu vía la ruta in/or no aumentó
significativamente la expresión de la actividad
2'-5'-oligoadenilato sintetasa.
Además, el tratamiento con 200 ó 200.000 IU de
IFN-\alpha Mu o IFN-\alpha
1-8 Hu mediante la ruta in/or no tuvo un efecto
significativo sobre la actividad
2'-5'-oligoadenilato sintetasa en
cualquiera de los tiempos analizados hasta 10 días después del
inicio del tratamiento con IFN.
\newpage
Ejemplo
5
Para examinar la biodisponibilidad y la
farmacocinética de IFN, se trataron ratones que tenían la relación
en volumen fármaco-sangre más favorable para dichos
estudios, con una única dosis elevada de
IFN-\alpha recombinante marcado hasta la
radioactividad específica más alta posible con ^{125}I.
Se disolvió una preparación pura de 70 x
10^{6} IU de IFN-\alpha 1-8 Hu
en 1,4 ml de PBS y se yodinó tal y como se ha descrito en Mogensen
et al. (Int. J. Cáncer., 1981, 28:
575-582) utilizando una modificación del
procedimiento de la cloramina-T descrito por Hunter
y Greenwood (Nature, 1962, 194:
495-496).
El IFN-\alpha
1-8 Hu marcado con ^{125}I (lote nº.
CGP35269-1) mostró una actividad biológica de 2 x
10^{7} IU/ml cuando se ensayó sobre las células WISH humanas
estimuladas con VSV y 1 x 10^{6} IU/ml cuando se ensayó sobre las
células de ratón L929 estimuladas con VSV.
Se inyectaron iv, ip o se trataron in/or ratones
Swiss hembra de seis a siete semanas de edad con 2 x 10^{7} IU,
equivalente a 1 x 10^{6} IU murino, de
IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I
(1,0369 x 10^{7} cpm/ratón). En los tiempos indicados, se
sacrificaron tres ratones por grupo, se extrajo la sangre y se
determinó el volumen. Se extrajo riñón, hígado, pulmón, bazo y
estómago/esófago, se secó y se pesó con una precisión de \pm 1,0
\mug. La radiactividad de cada muestra se determinó
individualmente utilizando un contador gamma. Entonces se separó la
sangre completa mediante centrifugación (800 g x 10 min., 4ºC), se
recogió el suero, se contó y se congeló a -80ºC. Entonces se analizó
el contenido de IFN en suero utilizando un bioensayo estándar sobre
células humanas WISH y sobre células de ratón L929, tal y como se ha
descrito más arriba. A continuación, el material radioactivo
presente en las muestras de suero se aisló mediante
inmunoprecipitación de afinidad y se analizó mediante
SDS-PAGE.
Se detectaron niveles de radioactividad muy
altos (> 2 x 10^{6} cpm/ml) en la sangre periférica de los
animales 5 minutos después de la inyección de 1,0369 x 10^{7}
cpm/ratón de IFN-\alpha 1-8 Hu
marcado con ^{125}I mediante iv bolus. Entonces, la cantidad de
radioactividad presente en la sangre completa declinó
progresivamente a 15 y 30 minutos. Los niveles de radioactividad
detectados en la sangre periférica de los animales 5 minutos después
de la inyección ip de 1,0369 x 10^{7} cpm de
IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I era
aproximadamente veinte veces menor que los niveles detectados
después de una inyección iv bolus. Los niveles de radioactividad
aumentaron entonces progresivamente a 15 y 30 minutos después de la
inyección. Los niveles de radioactividad detectados en la sangre de
los animales a 5, 10 ó 15 minutos después de la administración in/or
de IFN-\alpha 1-8 ^{125}I fueron
significativamente menores que los detectados a un tiempo
determinado después de la inyección ip de la misma cantidad de IFN
radiomarcado. Por las tres rutas de administración, se detectaron
mayores niveles de radioactividad en el suero que en la sangre
completa después de la administración in/or de
IFN-\alpha 1-8 marcado con
^{125}I. Los niveles menores de radioactividad detectados por ml
de sangre completa en comparación con el mismo volumen de suero
reflejan un volumen efectivamente mayor de suero contado después de
la separación del componente celular de la sangre completa.
Se analizó la presencia de IFN biológicamente
activo en las muestras de suero de todos los ratones del estudio
utilizando un bioensayo estándar, tal como se ha descrito más
arriba, y mostró niveles fácilmente detectables de IFN
biológicamente activo en el suero de todos los animales que se
habían inyectado bien iv o ip con IFN-\alpha
1-8 Hu ^{125}I en todos los tiempos analizados. En
contraste con lo anterior, no se detectó IFN biológicamente activo
en el suero de cualquiera de los animales en cualquier tiempo
analizado después de la administración in/or de IFN, a pesar de la
presencia de niveles relativamente elevados de radioactividad en el
suero de dichos animales.
Para determinar si el material radioactivo
detectado en el suero de los animales tratados con
IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I
representa de hecho el IFN nativo, las muestras se
inmunoprecipitaron con proteína A-G azarosa, para
precipitar las inmunoglobulinas presentes en las muestras, tratadas
con un anticuerpo policlonal purificado por afinidad
anti-IFN-\alpha y se volvieron a
inmunoprecipitar. Entonces se sometieron las muestras a una
electroforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida
(SDS-PAGE) tal como se ha descrito más arriba.
El análisis SDS-PAGE del
material radioactivo en el suero después de la inyección iv o ip de
IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I reveló
una sola banda homogénea que migraba con una movilidad
electroforética idéntica a la correspondiente sin inyección de
IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I. El
peso molecular aparente del material se estimó aproximadamente de
20000 Daltons, que corresponde exactamente al peso molecular del
IFN-\alpha 1-8 Hu nativo. En
contraste con lo anterior, ninguna de las muestras de suero de ratón
tratadas in/or con IFN-\alpha 1-8
^{125}I contenía material con un peso molecular aparente similar
al del IFN nativo, incluso cuando se cargó una cantidad idéntica de
material radioactivo en cada
gel.
gel.
La distribución en tejido del material
radiomarcado reveló niveles muy altos de radioactividad en los
riñones, elevados niveles en el hígado, pulmón y bazo de los
animales 5 minutos después de la inyección iv de
IFN-\alpha 1-8 ^{125}I. Se
descubrió entonces que el nivel de radioactividad presente en cada
uno de dichos cuatro órganos disminuía progresivamente a los 15 y 30
minutos. En contraste con lo anterior, el nivel de radioactividad en
el estómago aumentó progresivamente a los 15 y 30 minutos, hasta
alcanzar un nivel comparable al presente en el suero de los animales
30 minutos después de una inyección iv bolus.
La administración de
IFN-\alpha 1-8 ^{125}I mediante
inyección ip dio como resultado picos de radiactividad en todos los
tejidos examinados a los 15 minutos, seguido por una declinación a
los 30 minutos. De forma similar, la administración in/or de
IFN-\alpha 1-8 Hu ^{125}I dio
como resultado picos de radioactividad en todos los tejidos
estudiados después de 15 minutos, con cierta declinación en los
niveles de radioactividad presente a los 30 minutos. Los niveles de
radioactividad presente en el estómago/esófago eran de un orden de
magnitud mayor que los detectados en cualquier otro órgano después
de la administración in/or de IFN-\alpha
1-8 marcado con ^{125}I y era marcadamente mayor
que los niveles presentes en dichos tejidos después de la
administración parenteral de la misma cantidad de
IFN-\alpha 1-8 Hu radiomarcado
tanto por la ruta iv como por la ruta ip.
Ejemplo
6
Para la determinación precisa de la
farmacocinética de IFN-\alpha 1-8
Hu, se trataron ratones iv, ip o in/or con 1,0369 x 10^{7}
cpm/ratón de IFN-\alpha 1-8 Hu
marcado con ^{125}I y se determinaron los niveles de
radioactividad presentes en la sangre completa y en el suero a una
serie de tiempos a lo largo de un período de 24 horas.
El perfil farmacocinética de
IFN-\alpha 1-8 Hu marcado con
^{125}I presente en la sangre de los ratones después de una
inyección iv bolus seguía estrechamente una curva de eliminación
logarítmica. Lo anterior estaba de acuerdo con los resultados de un
estudio previo realizado en ratones utilizando una molécula muy
relacionada, \alpha humano A/D (Bgl) humano recombinante
(Bohoslawed et al., J. IFN Res., 1986, 6:
207-213). La cantidad de material biodisponible,
calculado a partir del área bajo la curva de concentración versus
tiempo, era también similar a la de \alpha A/D humano. Se observó
una curva de eliminación con consumo de tiempo bifásica después de
una inyección iv bolus de IFN-\alpha
1-8 ^{125}I, lo cual es característico de las
substancias que se eliminan a través de los riñones, de acuerdo con
los resultados del Ejemplo 4. La farmacocinética de
IFN-\alpha 1-8 marcado con
^{125}I después de la inyección ip se asemejaba mucho a la
descrita previamente para IFNs administrados im.
Se encontraban presentes en el suero de todos
los animales niveles fácilmente detectables de IFN biológicamente
activo después de una inyección iv bolus o de una inyección ip de
IFN-\alpha 1-8 marcado con
^{125}I.
El modelo de eritroleucemia de Friend constituye
un análisis preclínico severo de la actividad
anti-tumoral, dado que FLC es altamente maligno y
conlleva metástasis de hígado y bazo cuando se inyecta iv. De hecho,
los resultados obtenidos utilizando este modelo fueron la base para
la adopción de la inyección parenteral de
IFN-\alpha para el tratamiento de los cánceres
humanos. Así pues, en todos los experimentos llevados a cabo en este
estudio, todos los animales no tratados y los animales tratados con
preparaciones control murieron entre 10 y 11 días después. La
inyección de sólo 4 ó 5 células FLC mataría un ratón si no se
proporciona ningún tratamiento. En contraste con lo anterior,
algunos animales tratados con RFN-\gamma murino
mediante la ruta oromucosal todavía vivían más de 100 días después
de la inoculación de 10^{5} FLC y pueden considerarse curados.
De hecho, a juzgar por los trabajos previos, el
IFN-\alpha administrado mediante la ruta
oromucosal parece ser más efectivo que la ciclofosfamida, el
5-fluorouracilo o el metotrexato administrados por
vía parenteral, aumentando el tiempo de supervivencia sólo algunos
días en animales inyectados con FLC (Gresser et al., J.
Natl. Cáncer Inst., 1988, 80: 126-131).
Otros fármacos, por ejemplo el cisplatino, la vincristina, la
doxorubicina, la bleomicina o el etoposido no son efectivos contra
este tumor (Gresser et al., J. Natl. Cáncer Inst.,
1988, 80: 126-131).
De forma similar, IFN-\alpha
administrado mediante la ruta oromucosal parece ser más efectivo
contra FLC que otras citoquinas como IL-1\beta,
IL-2 y TNF-\alpha administrados
sistémicamente, que exhiben muy poca actividad en este
modelo.
modelo.
Trabajos previos han mostrado que IFN
administrado vía parenteral es uno de los fármacos
anti-tumorales más activos en este modelo y que la
terapia con IFN es efectiva incluso cuando se inicia después de que
las metástasis de tumor ya estén presentes en el hígado (Gresser
et al., Int. J. Cáncer, 1987, 39:
789-792). Los presentes resultados muestran que la
administración de IFN mediante la ruta oromucosal es igual o incluso
más efectiva.
Las inyecciones diarias de
IFN-\alpha administrado junto a una dosis única de
ciclofosfamida aumentó marcadamente la supervivencia de ratones AKR
que presentaban linfoma en comparación con animales tratados con
cualquier agente aislado, si la terapia empezaba antes del
diagnóstico del linfoma (Gresser et al., Eur. J.
Cáncer, 1978, 14: 97-99). También se ha
descrito en varios modelos de tumor animal
pre-clínicos una terapia de combinación exitosa
utilizando IFN-\alphaZ\beta y BCNU,
cis-DDP (cisplatino), metotrexato, adriamicina y
\alpha-difluorometil ornitina. También se ha
descrito que la terapia de combinación con
5-fluorouracilo (5-FU) e IFN es
beneficiosa en el tratamiento del cáncer de colon metastático en
humanos (Ernstoff et al., Journal of Clinical
Oncology, 1989, 7: 1764-1765). Sin
embargo, existen otros estudios que han descrito una actividad
anti-tumoral disminuida si se combinaba la terapia
IFN con la utilización de ciclofosfamida (Marquet et al.,
Int. J. Cáncer, 1983, 31: 223-226; Lee
et al., Biochem. Pharmacol., 1984, 33:
4339-3443), adriamicina (Blackwill et al.,
Cáncer Res., 1984, 44: 904-908) o
5-FU (Marquet et al., 1985, 109:
156-158), es decir, precisamente los mismos fármacos
que han mostrado ejercer un efecto beneficioso al utilizarse en
combinación con la terapia IFN parenteral. Las combinaciones entre
IFN y otros agentes de quimioterapia pueden analizarse fácilmente
utilizando los procedimientos descritos en la presente
invención.
La terapia combinada
interleucina-1 (IL-1) y
IFN-\alpha/\beta da como resultado un efecto
anti-tumor sinergístico en ratones a los que se les
ha inyectado FLC (Belardelli et al., Int. J. Cáncer,
1991, 49: 274-278). El mismo tratamiento
ejerce también un efecto anti-tumoral marcado contra
una variante metastásica (p11-R-Eb)
del linfoma Eb, contra el cual cualquier agente solo no es efectivo
(Gabriele et al., Invasión Metástasis, 1993,
13: 147-162). De todas las citoquinas
analizadas, se encontró que IL-1 es la más efectiva
si se combina con la terapia de IFN de Tipo I parenteral.
La terapia combinada con el inhibidor de la
angiogénesis AGM-1470 [éster (3R-(3\alpha,
4\alpha(2R*, 3R*), 5\beta,
6\beta))-5-metoxi-4-(2-metil-3-(3-metoxi-2-butenil)oxiranil)-1-oxaspiro(2.5)oct-6-ílico
del ácido(cloroacetil)-carbámico]
administrado junto a IFN-\alpha/\beta dio como
resultado un efecto anti-tumor marcadamente
aumentado en comparación con el observado con cualquier agente solo
(Brem et al., J. Pediatric Surgery, 1993, 28:
1253-1257).
Se ha demostrado que la hipertermia aumenta la
acción anti-tumor del
IFN-\alpha/\beta contra el carcinoma de pulmón
de Lewis (Yerushalmi et al., Proc. Soc. Exp. Biol.
Med., 1982, 169: 413-415). El butirato de
arginina también ha mostrado potenciar la acción
anti-tumor del IFN-\alpha (Chany y
Cerutti, Int. J. Cáncer, 1982, 30:
489-493).
La comparación del grado de protección obtenido
cuando se administra un tipo y una dosis determinados de IFN
mediante la ruta oromucosal en comparación con los resultados
obtenidos siguiendo la administración sistémica (inyección ip)
mostró que la administración parenteral de IFN en algunos casos era
marginalmente más efectiva y en otros casos no más efectiva que la
administración oromucosal.
Los resultados del estudio piloto con
biomarcador mostraron bastante claramente que ninguno de los tres
biomarcadores analizados (antígeno MHC clase I, antígeno Ly6 A/E y
actividad 2'-5'-oligoadenilato
sintetasa) refleja adecuadamente la muy marcada actividad
antitumoral que exhibe IFN-\alpha administrado
mediante la ruta oromucosal.
Es destacado el contraste entre el muy marcado
aumento en la expresión de las tras proteínas inducidas por IFN
observado en todos los experimentos llevados a cabo después de la
inyección ip de una cantidad tan pequeña como 20 IU de
IFN-\alpha y la ausencia de cualquier efecto
detectable después de la administración de hasta 20.000 IU de
IFN-\alpha vía la ruta oromucosal.
Aunque no podemos excluir la posibilidad de
observar en un tiempo más temprano o intermedio un efecto sobre uno
u otro de los biomarcadores, esto parece ser improbable, ya que IFN
actúa sobre la trascripción de los genes que codifican dichas
proteínas y por lo tanto no se espera observar un efecto sobre
cualquiera de dichos biomarcadores hasta varias horas después del
tratamiento con IFN.
De nuevo, aunque no podemos excluir la
posibilidad de observar un efecto sistémico sobre una u otra de las
numerosas proteínas inducidas por IFN después del tratamiento con
IFN-\alpha mediante la ruta oromucosal, esto
parece improbable, dado que esto implicaría una regulación
diferencial sobre la expresión de ciertos genes inducidos por IFN.
Sin embargo, es completamente posible que pueda observarse
localmente un efecto sobre un biomarcador de IF, por ejemplo en los
linfocitos nasales, después de la administración de
IFN-\alpha vía la ruta oromucosal.
De acuerdo con la ausencia de un efecto
detectable sobre los biomarcadores estudiados, no se observó ningún
efecto consistente sobre cualquiera de los parámetros químicos
hematológicos o de la sangre monitorizados durante la terapia IFN
oromucosal, incluso en animales tratados con hasta 20.000 IU de
IFN-\alpha.
Se encontraron niveles fácilmente detectables de
material radiomarcado tanto en sangre completa como en el suero de
los animales después de la administración oromucosal de
IFN-\alpha 1-8 marcado con
^{125}I. Estos resultados contrastan con los resultados de los
estudios previos, los cuales no fueron capaces de detectar IFN en el
suero de los animales incluso después de la administración oral de
grandes cantidades de IFN no marcado. Sin embargo, el material
radioactivo detectado tanto en sangre completa como en el suero
después de la administración oromucosal era biológicamente inactivo.
Además, los resultados del análisis SDS-PAGE
mostraron que este material era de bajo peso molecular y que más
probablemente reflejaba la absorción de los productos de degradación
después de la digestión de IFN en el estómago y en el intestino
delgado. El análisis de la distribución de tejido del material
radiomarcado después de la administración oromucosal reveló niveles
marcadamente mayores de radioactividad en el estómago que en
cualquiera de los otros órganos analizados. Nuestros resultados
muestran bastante claramente que aunque el IFN biológicamente activo
no se absorbió después de la administración oromucosal, sin embargo
este tratamiento ejerce una actividad antitumoral estadísticamente
significativa in vivo.
Sin pretender limitarse a cualquier mecanismo
propuesto para el efecto beneficioso observado, nuestros resultados
sugieren que el IFN administrado vía oromucosal ejerce su efecto
contra las células cancerígenas vía un novedoso mecanismo no
definido actualmente, el cual no implica una acción directa del IFN
administrado exógenamente o la inducción de IFN endógeno. Esto queda
respaldado por la ausencia de niveles detectables de IFN circulante
o de los tres biomarcadores analizados, Parece que este mecanismo
puede actuar al menos parcialmente mediante la estimulación del
abundante tejido linfoide que rodea las cavidades nasofaríngeas y la
cavidad oral. Dado que hemos demostrado que el IFN oromucosal es
como mínimo de eficacia comparable al IFN administrado
sistémicamente, nuestros resultados proporcionan un fuerte soporte
para la administración de IFN mediante la ruta oromucosal en el
tratamiento del cáncer. Esto puede tener importantes implicaciones
para la utilización clínica del IFN.
Claims (15)
1. Utilización de interferón humano para la
preparación de un medicamento en el tratamiento del cáncer en un
humano mediante la administración por contacto con el recubrimiento
mucoso de la boca y la garganta del humano receptor de desde
10^{4} IU hasta 20 x 10^{6} IU de interferón por día.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
cual dicho cáncer es un mieloma múltiple, una leucemia de células
pilosas, una leucemia mielogénica crónica, un linfoma de grado bajo,
un linfoma cutáneo de células T, un tumor carcinoide, un cáncer
cervical, los sarcomas, incluyendo el sarcoma de Kaposi, el tumor de
riñón, los carcinomas, incluyendo el carcinoma de células renales,
el carcinoma celular hepático, el carcinoma nasofaríngeo, los
tumores malignos hematológicos, el cáncer colorectal, el
glioblastoma, el papiloma laríngeo, el cáncer de pulmón, el cáncer
de colon, el melanoma maligno o los tumores cerebrales, incluyendo
el tumor cerebral maligno.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en
la cual el medicamento comprende una única dosis de interferón.
4. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en
la cual el medicamento comprende un conjunto de dosis más pequeñas
de interferón suficientes para obtener una respuesta equivalente a
la de una dosis única, sin inducir una respuesta patológica.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 - 4, en la cual el medicamento proporciona una
administración continua de una dosis de interferón durante un
período de tiempo suficiente para obtener una respuesta
antineoplástica equivalente a la de una dosis única, sin inducir una
respuesta patológica.
6. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 - 5, en la cual el medicamento comprende otra
citoquina o un inductor de interferón.
7. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la cual el medicamento se adapta a la
administración de 1 x 10^{4} a 1 x 10^{6} IU de interferón por
día.
8. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la cual el medicamento incluye otro
agente terapéutico para la terapia simultánea, separada o
secuencial.
9. Utilización según la reivindicación 8, en la
cual el agente terapéutico se selecciona entre el grupo que consiste
en agentes citostáticos, agentes anti-cáncer y
agentes anti-angiogénicos.
10. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en la cual el interferón es un interferón de
Tipo I.
11. Utilización según la reivindicación 10, en
la cual el interferón se selecciona entre el grupo que consiste
en
IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\omega, IFN consenso y mezclas de los mismos.
IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\omega, IFN consenso y mezclas de los mismos.
12. Utilización según la reivindicación 11, en
la cual el interferón de Tipo I es IFN-\alpha.
13. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 - 9 en la cual el interferón es un interferón de
Tipo II.
14. Utilización según la reivindicación 13, en
la cual el interferón de Tipo II es
IFN-\gamma.
15. Utilización según la reivindicación 10 ó 13,
en la cual el interferón es un material recombinante.
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