ES2252859T3 - Composiciones de citoquina oromucosales y utilizacion de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Utilización de una citoquina estimulante de Th1 seleccionada de entre el grupo constituido por interleuquina- 2, interleuquina-12, interleuquina-15, interleuquina-18, factor â de necrosis tumoral y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) en la preparación de una composición oromucosal para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero que podría beneficiarse de la estimulación de Th1 mediante la estimulación de los mecanismos de defensa del huésped a través del contacto oromucosal, en el que la enfermedad o condición se selecciona de entre el grupo constituido por una condición neoplásica, una infección vírica, un trastorno alérgico, asma y dermatitis atópica.
Description
Composiciones de citoquina oromucosales y
utilización de las mismas.
La presente invención se refiere a la utilización
de citoquinas estimulantes de TH1 seleccionadas de entre el grupo
constituido por IL-2, IL-12,
IL-15, IL-18,
TNF-\beta y GM-CSF, en la
preparación de una composición para el tratamiento de una
enfermedad que resultaría beneficiada por la estimulación de Th1
mediante la estimulación de los mecanismos de defensa del huésped a
través del contacto oromucosal, en la que la enfermedad o condición
se selecciona de entre el grupo constituido por una condición
neoplásica, una infección vírica, un trastorno alérgico, asma y
dermatitis atópica.
Las interleuquinas (IL) son una clase diversa de
péptidos y proteínas secretadas cuya función principal es la
mediación en las interacciones locales entre células. La mayor parte
de la información concerniente a las IL proviene del trabajo
realizado con leucocitos, especialmente linfocitos.
En la actualidad está generalmente aceptado que
las células T CD4 pueden dividirse en dos subconjuntos
funcionalmente diferentes. Las células T ayudantes 1 (Th1) y las
células T ayudantes 2 (Th2), caracterizadas por el patrón de
citoquinas que producen. De esta manera, las células Th1 de ratón
producen interferón \gamma (IFN-\gamma), factor
\beta de necrosis tumoral (TNF \beta) e interleuquina 2
(IL-2), mientras que las células Th2 de ratón
producen IL-4, IL-5,
IL-6, IL-9, IL-10 e
IL-13. Las células Th1 y Th2 humanas presentan
patrones similares de secreción de citoquinas, aunque la síntesis
de IL-2, IL-6, IL-10
e IL-13 no se encuentra tan estrictamente
restringida a un solo subconjunto como en el ratón. Tanto las
células Th1 como las Th2 segregan varias otras citoquinas,
incluyendo IL-3, TNF \alpha, factor estimulante de
colonias de macrófagos-granulocitos
(GM-CSF), met-encefalina y
determinadas quimoquinas (CK). Continúan describiéndose nuevas
citoquinas, tales como IL-18 (Yoshimoto et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3948-3953,
1997), originalmente denominada factor inductor del interferón
gamma (IGIF), que potencia las respuestas de Th1, y es altamente
probable que en el futuro se descubran otras nuevas citoquinas que
influyen sobre la respuesta de Th1 o de
Th2.
Th2.
Los patrones de secreción de citoquinas de Th1 y
de Th2 corresponden a los fenotipos de efector activado producidos
durante una respuesta inmunológica. No existen en las células T
inactivas. De esta manera, cuando resultan estimuladas por primera
vez por un antígeno o por células presentadoras de antígeno (APC),
las células T CD4+ inactivas inicialmente sólo producen
IL-2 y después se diferencian en fenotipos que
segregan otras citoquinas. Se ha identificado una tercera clase de
células T CD4+, denominada células Th0, que consiste en células
efectoras parcialmente diferenciadas que presentan ambos patrones
de expresión de citoquinas, de Th1 y de Th2, y podrían representar
una etapa de transición a lo largo de la ruta de diferenciación en
células Th1 y Th2. También se ha identificado una cuarta clase de
células T CD4+ denominada células Th3, productoras de niveles
elevados de factor \beta (TGF \beta).
Las células Th1 y Th2 no sólo producen diferentes
conjuntos de citoquinas, resultando en propiedades funcionales
diferenciadas, sino que también expresan preferentemente
determinados marcadores de activación. De esta manera, las células
Th1 humanas expresan preferentemente el gen 3 de activación de los
linfocitos (LAG-3), un miembro de la superfamilia
de las inmunoglobulinas, mientras que las células Th2 humanas
expresan preferentemente CD30, un miembro de la familia de
receptores TNF. La expresión de LAG-3 se ve
potenciada por IFN-\gamma e inhibida por
IL-4, mientras que la expresión de CD 30 depende de
la presencia de IL-4. Las células Th1 también
expresan selectina E, ligandos de p-selectina y la
cadena \beta del receptor IL-12, que no son
expresados por las células Th2.
Los subconjuntos de células T citotóxicas (Tc)
CD8+ también pueden distinguirse a partir de las citoquinas que
producen. De esta manera, las células Tc1 segregan
IL-12 e IFN-\gamma, y las células
con un perfil Tc2 segregan IL-4 e
IL-5 y se encuentran en determinadas condiciones
patológicas, tales como la lepra lepromatosa y los individuos
infectados por VIH con niveles elevados de IgE.
Las funciones de las células Th1 y Th2 se
correlacionan bien con sus citoquinas características. De esta
manera, las células Th1 están implicadas en respuestas
inmunológicas mediadas por células (la activación de macrófagos, la
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la
hipersensibilidad de tipo retardado) y en la resistencia a la
infección por virus, y varias citoquinas de Th1 activan las
reacciones citotóxicas e inflamatorias. Las citoquinas Th2
potencian la producción de anticuerpos, particularmente las
respuestas de IgE, y también potencian la inmunidad mucosal a
través de la producción de factores de crecimiento y de
diferenciación para mastocitos y eosinófilos. De acuerdo con ello,
las células Th2 se han asociado a la producción de anticuerpos, a
las reacciones alérgicas y a la susceptibilidad a la infección por
virus.
Las citoquinas de Th1 y de Th2 son mutuamente
inhibitorias de la diferenciación y funciones efectoras del
fenotipo recíproco. De esta manera, IL-12 y
IFN-\gamma inhiben selectivamente la proliferación
de las células Th2 e IL-4 y IL-10
inhiben el desarrollo de las Th1. En muchos casos la utilización de
citoquinas o de anticitoquinas puede revertir la resistencia o la
susceptibilidad a la infección del huésped. Véase
"Th1-Th2 Paradigm", Sergio Romagani,
Immunology Today 18:6, (263-266), junio de 1997.
La interleuquina 2 (IL-2) es un
modificador de la respuesta biológica que activa las células T
citotóxicas y las células asesinas naturales (ver Kuziel, W.A. y
Gree, W.C., Interleukin-2 (1991), en: The Cytokine
Handbook, A. Thompson (editor), San Diego, California, Academic
Press, páginas 83-102). Por lo tanto, se ha
examinado IL-2 por su potencial terapéutico contra
los tumores malignos, las inmunodeficiencias y las infecciones
crónicas.
Básicamente IL-2 regula la
proliferación y diferenciación de los linfocitos T y de otras
células linfoides, mediante la unión a un receptor de superficie
celular de elevada afinidad compuesto de tres cadenas
polipeptídicas: alfa, beta y gamma (Waldmann, T.A., Immunol. Today
14:264, 1993). Los datos presentados por Vasily Gelfanov et
al. (Proceedings of the Keystone Symposium on Mucosal Immunity
S112:12, 1997) muestran que los linfocitos intraepiteliales
intestinales, que es conocido que difieren en varios aspectos
importantes respecto a las células T del sistema inmunológico
central, responden preferentemente a un factor de crecimiento de
células T recientemente identificado, la interleuquina 15
(IL-15), más que al clásico factor de crecimiento de
las células T, IL-2.
IL-15 interacciona con un
receptor heterotrimérico de superficie celular que consiste en
subunidades beta y gamma del receptor IL-2, así
como en una subunidad de unión a IL-15 de elevada
afinidad denominada IL-15R alfa. Debido a que las
subunidades beta y gamma del receptor IL-2 resultan
necesarias para la señalización por IL-2 o por
IL-15, no sorprende que se haya informado que estas
dos citoquinas comparten varias actividades biológicas (Kennedy,
M.K. y Park L.S., J. Clin. Immunol. 16:134-143,
1996).
Al igual que el interferón alfa,
IL-12 es uno de los reguladores principales de la
actividad de las células asesinas naturales (NK), que desempeña un
importante papel en la defensa del huésped frente a las células
neoplásicas (Kobayashi, M., J. Exptl. Med. 170:827, 1989).
IL-2, producida principalmente por los macrófagos,
también induce la liberación de interferón gamma por parte de las
células T activadas y por parte de las células NK, y actúa en
sinergia con IL-2 para producir células asesinas
activadas por linfoquinas (LAK) (Aragane et al., J. Immunol.
153:5366-5372, 1994). IL-12 junto
con IL-2 e interferón gamma desempeñan un papel
central en el desarrollo de las células T efectoras ayudantes de
tipo 1 (Th1). Con frecuencia una respuesta Th1 se asocia a la
resistencia a la infección y se ha demostrado que desempeña un papel
decisivo en la acción antivírica del interferón alfa 2 en pacientes
infectados por papilomavirus humano (Arany, I. y Tyring, K., J.
Interferon and Cytokine Res. 16:453-460, 1996).
La actividad antitumoral de IL-2
administrada sistémicamente se cree que se encuentra mediada
principalmente por células LAK (Natuk et al., J. Virol.
63:4969-4971, 1989). La actividad antivírica de
IL-2 administrada sistémicamente se cree que se
encuentra mediada principalmente por citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos mediada por macrófagos (ADCC), que
implica la inducción del interferón gamma en las células T ayudantes
(Kohe et al., J. Inf. Dis. 159:239-247) y a
través de las células LAK (Natuk et al., J. Virol.
63:4969-4971, 1989).
Las interleuquinas generalmente se administran
por vía parenteral. Sin embargo, la administración parenteral de
IL-2 se asocia con varios efectos secundarios
severos, tales como la toxicidad hematológica y la disfunción renal
(ver Haworth, C. y Feldmann, M., Applications of cytokines in human
immunotherapy, 1991, en: The Cytokine Handbook, A. Thompson
(editor), San Diego, California: Academic Press, páginas
301-324). Se han observado efectos tóxicos
similares con varias otras interleuquinas.
La IL-2 recombinante humana
administrada sistémicamente también se ha utilizado extensamente en
el tratamiento de varias enfermedades neoplásicas, incluyendo el
carcinoma de las células renales (Rozenberg et al., Ann.
Surg. 210:474, 1989) y el melanoma maligno (Rozenberg et al.,
New Engl. J. Med. 316:889, 1987) y en menor grado para el
tratamiento de determinadas enfermedades víricas, incluyendo la
hepatitis B crónica (Kakumu et al., Hepatology
8:487-492, 1988). En todos estos estudios se ha
observado una toxicidad considerable, incluyendo fiebre,
escalofríos, anorexia y fatiga (Kakumu et al., Hepatology
8:487-492, 1988).
Una serie de patentes y publicaciones de patente
indica en términos generales, inter alia, la posibilidad de
la administración oral de diversas interleuquinas. Por ejemplo, la
patente WO nº 91/16917 da a conocer IL-1 para el
tratamiento de las úlceras gástricas y la obesidad; la patente WO nº
92/11030 da a conocer IL-4 para potenciar la
respuesta inmunológica frente a inmunógenos en vacunas; la patente
US nº 5.601.814 da a conocer IL-6 para el
tratamiento del choque tóxico; la patente US nº 5.188.828 da a
conocer IL-6 para potenciar los niveles endógenos
de eritropoyetina; y la patente WO nº 96/25171 da a conocer
IL-12 para inhibir la angiogénesis. Sin embargo,
estas publicaciones generales no incluyen la absorción oral real del
ingrediente activo, ni tampoco ninguno de los ejemplos da a conocer
la absorción oral o la existencia de actividad proteica tras la
administración oral. Por ejemplo, aunque la patente US nº 5.449.515
da a conocer en términos generales la administración oral de
IL-4, también da a conocer que IL-4,
si se incorpora en una forma de dosificación oral, puede recubrirse
o administrarse con un material que evita su inactivación, y comenta
la utilización de diversos materiales para evitar la inactivación.
Las medidas propuestas incluyen inhibidores enzimáticos y la
incorporación de la interleuquina en liposomas (ver columna 3,
líneas 7 a 22). Resulta evidente que en dichas referencias se
contempla la administración por boca para el transporte hasta el
intestino delgado.
Koren S. y Fleischmann W.R. Jr., Journal of
Interferon Research 14(6):343-7, diciembre de
1994, describen la modulación de los recuentos de leucocitos
periféricos y de la función de la médula ósea en ratones libres de
patógenos mediante la administración oral de rhIL-2
y niveles establecidos de supresión del recuento de glóbulos
blancos similares a los conseguidos con una dosis subcutánea.
Concluyeron que IL-2 administrada oralmente puede
ejercer efectos sistémicos y conjeturaron que la administración oral
de IL-2 podría presentar un potencial terapéutico.
Marinaro, M., Boyaka, P.N., Finkelman, F.D., Kiyono, H., Jackson,
R.J., Jirillo, E. y McGhee, J.R., J. Exp. Med. 185(3),
páginas 415-27, 3 de febrero de 1997, establecieron
que la administración intragástrica pero no la parenteral de
IL-12 murina recombinante (rmIL-12)
redirige las respuestas de células T ayudantes tipo 2 (Th2) hacia
una vacuna oral sin que se alteren las respuestas IgA intestinales
mucosales. Los autores concluyeron que IL-12 puede
administrarse por la vía "oral" para la regulación de la
respuesta sistémica a una vacuna oral y sugirieron que la
IL-12 oral formulada para la administración en las
placas de Peyer del intestino delgado también puede ejercer efectos
inmunomoduladores a nivel mucosal.
Marinaro, M., Boyaka, P.N., Jackson, R.J.,
Finkelman, F.D., Kiyono, H., McGhee, J.R., J. Allergy Clin. Immunol.
99, nº 1, Pt. 2, S34, 1997, investigaron la administración
intranasal frente a la oral de IL-12 acomplejado
con liposomas. Descubrieron que la administración intranasal de
IL-12 exacerba las respuestas de tipo Th2, mientras
que la IL-12 oral redirige las respuestas de tipo
Th2 hacia las respuestas de tipo Th1. Ello demuestra que la
administración de IL-12 por dos vías mucosales
diferentes resulta en tipos opuestos de respuesta inmunológica,
mucosal y sistémica, a una vacuna oral.
Las publicaciones discutidas anteriormente dan a
conocer que la administración oral se refiere a la administración
por la boca para el transporte hasta el intestino delgado, en el que
la IL resulta finalmente absorbida.
Por lo tanto, al contrario que las enseñanzas de
la solicitud de patente europea EP 578.823, que da a conocer la
utilización explícita de formulación bucal de IL-2 o
de GM-CSF para el tratamiento del SIDA, resultó
inesperado descubrir que la administración de citoquinas
específicas de Th1 en la oromucosa presentaba un efecto drástico de
prolongación de la supervivencia de ratones tras retarlos con virus
y con tumores que normalmente resultan rápidamente letales.
La presente invención se refiere a la utilización
de citoquina estimulante de TH1 seleccionada de entre el grupo
constituido por IL-2, IL-12,
IL-15, IL-18,
TNF-\beta y GM-CSF, en la
preparación de una composición para el tratamiento de una
enfermedad que resultaría beneficiada de la estimulación de Th1
mediante la estimulación de los mecanismos de defensa del huésped a
través del contacto oromucosal, en el que la enfermedad o condición
se selecciona de entre el grupo constituido por una condición
neoplásica, una infección vírica, un trastorno alérgico, asma o
dermatitis atópica.
A continuación se describe la invención en
detalle únicamente como referencia mediante la utilización de las
definiciones y ejemplos siguientes.
El término "oromucosa" se refiere a la
mucosa de revestimiento de las cavidades oral y/o nasofaríngea. Para
los fines de los experimentos animales descritos en la presente
especificación, las expresiones "oromucosal",
"orofaríngea", "intranasal/oral", "intranasal más
oral" y "en/o" con referencia a la vía de administración de
la citoquina son sinónimos, y deben interpretarse como refiriéndose
a la administración de la preparación de citoquina profundamente en
la cavidad nasal u oral, de manera que la citoquina sea rápidamente
distribuida en la boca y garganta del mamífero receptor, de manera
que entre en contacto con el revestimiento mucosal de esta cavidad.
Aunque es el sitio de absorción, no el procedimiento de
administración, lo que resulta crítico, no resulta necesario que la
citoquina entre en contacto con la totalidad del revestimiento
mucosal de las cavidades nasal, oral y faríngea.
Cuando se utiliza en la presente memoria sin
calificación adicional, el término "citoquina" se refiere a una
citoquina específica de Th1, es decir, una citoquina que estimula
la actividad de las células Th1.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"interleuquina" se refiere a una proteína citoquina producida
por linfocitos y denominada IL-2,
IL-12, IL-15, IL-18.
La interleuquina puede ser de origen natural, pero preferentemente
es un producto recombinante. Para los fines de la invención, el
término "citoquina" también incluye polipéptidos o sus
fragmentos con actividad de citoquina, y las formas quiméricas o
mutantes de citoquina en las que se han introducido modificaciones
de secuencia, por ejemplo para potenciar la estabilidad, sin
resultar afectada la naturaleza de su actividad biológica. Otras
modificaciones, tales como las formas pegiladas y las proteínas de
fusión con inmunoglobulinas o con otras proteínas, también se
encuentran dentro del alcance de la invención.
La utilización de la composición oromucosal puede
implicar la administración de una dosis efectiva de citoquina en
una sola dosis, o la dosis efectiva puede administrarse en una
pluralidad de dosis menores a lo largo de un periodo de tiempo
suficiente para provocar una inmunoestimulación equivalente a la de
una sola dosis. De manera similar, la dosis de citoquina puede
administrarse continuamente a lo largo de un periodo de tiempo
suficiente para inducir un efecto equivalente al de una sola
dosis.
La invención se utiliza para el tratamiento de
una condición seleccionada de entre el grupo constituido por
infecciones bacterianas intracelulares, enfermedades neurológicas,
condiciones alérgicas, condiciones inflamatorias, enfermedades
neoplásicas, infecciones parasitarias e infecciones víricas,
comprendiendo la etapa de administrar al mamífero una cantidad
efectiva de citoquina específica de Th1 mediante contacto
oromucosal.
Aunque la invención puede utilizarse sin el
tratamiento simultáneo con otros agentes, se contempla que la
presente forma de realización de la invención resulte
particularmente útil en los contextos siguientes:
- a)
- como terapia adyuvante, posterior a la cirugía, quimioterapia o radioterapia (rayos X, rayos U.V.), dados por los protocolos estándar;
- b)
- para el tratamiento de las neoplasias sensibles a citolicina se utiliza el procedimiento de la invención, solo o en combinación con quimioterapia o radioterapia convencionales; y
- c)
- para el tratamiento de las neoplasias resistentes a citoquina se utiliza el procedimiento de la invención, solo o más preferentemente en combinación con quimioterapia o radioterapia convencionales.
En una tercera forma de realización la enfermedad
a tratar es una infección vírica. La infección vírica puede ser una
infección aguda o fulminante, tal como rinovirus, virus influenza,
virus del herpes zóster, fiebre dengue o encefalitis vírica,
incluyendo pero sin limitarse a ellos, encefalitis del virus del
sarampión, encefalitis de Murray Valley, encefalitis B japonesa,
encefalitis transmitida por garrapatas y encefalitis del herpes;
fiebres hemorrágicas, tales como virus Ébola, virus Marburg, fiebre
Lassa; infecciones por virus Hanta y otras infecciones víricas
consideradas de transmisión entre animal y hombre, tales como el
morbilivirus equino. En muchas de estas condiciones en la
actualidad no se dispone de tratamiento y/o de vacuna, y los
tratamientos de apoyo pueden resultar inadecuados.
Alternativamente, la condición vírica puede ser el resultado de
infección crónica, tal como hepatitis B, C, D u otras formas de
hepatitis vírica, o de infección por citomegalovirus (CMV), virus
de la inmunodeficiencia humana (VIH), papilomavirus humano (HPV) y
herpes simplex I y II (HSV I y II).
Nuevamente el procedimiento y forma de
dosificación de la invención pueden utilizarse en combinación con
otros tratamientos. Por ejemplo, para la infección por virus herpes
puede utilizarse aciclovir o ganciclovir. Para la infección por VIH
puede utilizarse acidotimidina (zidovudina) y uno o más de los otros
inhibidores de la transcriptasa inversa de VIH, y/o inhibidores de
proteasa de VIH.
En una cuarta forma de realización, la enfermedad
a tratar es la malaria, y nuevamente se administra una citoquina
tal como se ha indicado anteriormente. El organismo causativo de la
malaria puede ser Plasmodium malariae, Plasmodium
vivax, Plasmodium falciparum o Plasmodium ovale.
Está contemplado particularmente que el procedimiento de la
invención proteja frente a la progresión de la malaria a la forma
cerebral. Opcionalmente también puede utilizarse un fármaco
antimalaria, por ejemplo la cloroquina.
Un aspecto adicional de la invención es la
utilización de una composición farmacéutica para la estimulación
oromucosal de los mecanismos de defensa del huésped en un mamífero,
cuya composición comprende una citoquina estimuladora de Th1 y por
lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable útil para la
administración oromucosal.
Tal como se ha indicado anteriormente, en la
presente invención las formas de realización presentadas como
preferentes para la estimulación de los mecanismos de defensa del
huésped también constituyen formas de realización preferentes para
las utilización de las citoquinas de Th1 destinadas a la preparación
de un fármaco oromucosal para estimular los mecanismos de defensa
del huésped en un mamífero.
En otro aspecto, la invención proporciona una
composición farmacéutica para la administración oromucosal que
comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos una
citoquina Th1-específica, y un portador
farmacéuticamente aceptable adaptado para la administración
oromucosal. La composición puede proporcionarse en forma de
solución, comprimido, pastilla, gel, jarabe, pulverizador nasal,
gotas nasales, formulación inhalable, pasta o sistema de
administración oromucosal de liberación controlada. Opcionalmente la
composición puede contener tampones, estabilizantes, agentes
espesantes, potenciadores de absorción y de viscosidad y
similares.
La invención puede ponerse en práctica como único
enfoque terapéutico, o como complemento a terapia de radiación,
quimioterapia o tratamiento con uno o más otros agentes, o con
inductores de interferón o inductores de interleuquina. En algunas
circunstancias puede utilizarse más de una citoquina,
concomitantemente o posteriormente, para aprovechar los mecanismos
alternativos de acción.
Los resultados de los presentes solicitantes
hasta el momento indican que no se producen efectos secundarios
tóxicos significativos y, en el peor de los casos, sólo se producen
efectos secundarios menores con la administración oromucosal de las
citoquinas. De esta manera, el procedimiento de la invención también
permite la administración de una cantidad de una citoquina
Th1-específica que se encuentra en exceso de una
dosis de la misma citoquina inductora de una respuesta patológica
cuando se administra parenteralmente. Alternativamente, el índice
terapéutico de una citoquina Th1-específica puede
incrementarse administrando la citoquina oromucosalmente.
Las citoquinas oromucosales pueden administrarse
a una dosis inferior o igual o superior al nivel de dosis
parenteral al que se produce la estimulación de los mecanismos de
defensa del huésped. En una forma particularmente preferente de la
invención la dosis total se encuentra comprendida entre
aproximadamente 0,01 \mug/kg y aproximadamente 150 \mug/kg.
Opcionalmente la citoquina puede administrarse
con un inductor o potenciador de producción, activación o liberación
de citoquinas. El inductor puede administrarse en combinación con
la citoquina oromucosal, o puede administrarse separadamente. Los
inductores de IL son conocidos; por ejemplo, los lipopolisacáridos
bacterianos estimulan la liberación de una diversidad de IL y de
otras citoquinas.
La invención puede utilizarse opcionalmente
conjuntamente con uno o más tratamientos adicionales para la
condición específica, y el médico o veterinario responsable podrá
fácilmente seleccionar estos otros tratamientos según resulte
apropiado para las circunstancias.
La invención en el aspecto de que se relaciona
con el tratamiento de las condiciones neoplásicas está destinada a
inducir y/o a mantener la remisión de la enfermedad. La expresión
"conjuntamente con otro tratamiento" se refiere a que la
citoquina se administra previamente, durante y/o posteriormente a la
radioterapia quirúrgica y a otro tipo de quimioterapia. El
protocolo más adecuado dependerá de una diversidad de factores, tal
como se discute posterior-
mente.
mente.
En particular, se contempla que la invención se
utilice preferentemente en combinación con por lo menos otro
tratamiento seleccionado de entre el grupo constituido por
quimioterapia con fármacos citostáticos, una o más otras citoquinas
que presentan actividad anticáncer pero que presentan un mecanismo
de acción diferente al de la citoquina oromucosal, agentes
antiangiogénicos y agentes que potencian la actividad de citoquinas
específicas. Preferentemente la segunda citoquina es interferón
\alpha, interferón \beta, interferón \gamma, interferón
\omega o interferón de consenso; preferentemente el inhibidor de
angiogénesis es AGM-1470 [(3R-(3\alpha,4\alpha
(2R*, 3R*), 5\beta,
6\beta)-5-metoxi-4-(2-metil-3-(3-metoxi-2-butenil)oxiranil)-1-oxaspiro(2.5)oct-6-il
éster del ácido (cloroacetil)-carbámico].
Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos
del cáncer se encuentran antimetabolitos tales como
6-mercaptopurina, 5-fluorouracilo,
arabinósido citosina y los metabolitos y derivados de estos agentes.
Otros agentes quimioterapéuticos del cáncer son los antifolatos,
tales como metotrexato, o agentes derivados de productos naturales,
por ejemplo derivados de alcaloides vinca, tales como vinblastina,
vincristina y colchicina; adriamicina, daunorrubicina,
doxorrubicina, tenipósido o etopósido. Estos agentes
quimioterapéuticos del cáncer también incluyen fármacos anticáncer
de platino, tales como cisplatino y carboplatino. Además, los
agentes de la presente invención pueden administrarse con
ciclofosfamida, busulfona, procarbacina, dacarbacina, carmustina,
lomustina, mecloretamina, clorambucilo, hidroxiurea, nitrosourea y
sus derivados, melfalán, mitotona, taxol,
\alpha-difluorometilomitina y espirogermanio. Con
más frecuencia la resistencia multifármaco se observa en los
alcaloides vinca, las antraciclinas daunorrubicina, doxorrubicina y
adriamicina; y etopósido y tenipósido; con menor frecuencia con los
antimetabolitos y los demás agentes quimioterapéuticos.
Los fármacos citostáticos preferentes a
administrar conjuntamente con la citoquina incluyen, aunque sin
limitarse a ellos, ciclofosfamida, cisplatino, carboplatino,
carmustina (BCNU;
N,N-bis(2-clorometil)-N-nitrosourea),
metotrexato, adriamicina,
\alpha-difluorometilornitina y
5-fluorouracilo.
En la preparación de las composiciones
farmacéuticas de la presente invención puede utilizarse una
diversidad de vehículos y excipientes para la citoquina, como
resultará evidente al experto en la materia. La tecnología de
formulación representativa se da a conocer en, inter alia,
Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, Mack
Publishing Co., Easton, PA, 1995 y sus ediciones anteriores. La
formulación de citoquina puede comprender potenciadores de la
estabilidad, tales como glicina o alanina, tal como se describe en
la patente US nº 4.496.537 y/o uno o más portadores, tales como una
proteína portadora. Por ejemplo, para el tratamiento en el ser
humano, se utiliza frecuentemente la albúmina de suero humano de
grado farmacéutico, opcionalmente junto con solución salina
tamponada con fosfato como diluyente. En el caso de que el
excipiente para la citoquina sea albúmina de suero humana, ésta
puede derivarse de suero humano, o puede ser de origen
recombinante.
La citoquina puede administrarse por medios que
proporcionen el contacto de la citoquina con la cavidad oromucosal
del recipiente durante un periodo de tiempo suficiente para obtener
la estimulación deseada. Otras mucosas pueden responder de manera
similar. De esta manera, se entenderá claramente que la invención no
se encuentra limitada a ningún tipo particular de formulación. La
presente especificación describe la administración de una citoquina
en profundidad en la cavidad oromucosal; ello puede conseguirse con
líquidos, sólidos o aerosoles, así como con gotas o pulverizadores
nasales. De esta manera, la invención incluye, pero sin limitarse a
ellos, formulaciones de líquido, pulverizador, jarabe, pastillas,
comprimidos bucales y nebulizador. Un experto en la materia
reconocerá que, para las formulaciones de aerosol o de nebulizador,
el tamaño de partícula de la preparación puede resultar importante,
y conocerá procedimientos adecuados con los que puede modificarse el
tamaño de partícula. Se contemplan específicamente las
formulaciones micronizadas.
En un aspecto, la citoquina se administra en una
sola dosis. Alternativamente, la citoquina se administra en una
pluralidad de dosis menores, distribuidas en el tiempo, de manera
que el efecto neto es equivalente a la administración de una sola
dosis más elevada. Un enfoque a este modo de administración es a
través de la provisión de un dispositivo de liberación sostenida o
controlada adherido o implantado en la cavidad oromucosal y
diseñado para liberar la citoquina a lo largo del tiempo en una
cantidad equivalente a una sola dosis elevada.
\newpage
Una formulación de una citoquina para la
utilización oromucosal contiene lo siguiente (todos los % son en
p/p):
Comprimido: 45% de dextrosa BP; 30% de gelatina
BP; 11% de almidón de trigo BP; 5% de carmelosa sódica BP; 4% de
albúmina de huevo BPC; 3% de leucina USP; 2% de propilenglicol BP y
1% de citoquina. El comprimido puede utilizarse tal como está y
dejar que se disuelva lentamente en la boca, o puede disolverse en
agua y mantenerse en la boca en contacto con la oromucosa según
resulte necesario.
Puede prepararse una pasta de citoquina, tal como
se describe en la patente US nº 4.675.184 a partir de 45% de
glicerina, 2% de sodio CMC; 25% de tampón citrato (pH 4,5), agua
destilada hasta el 100%, y 1% de citoquina. La pasta de citoquina
puede adherirse a la mucosa bucal.
De manera similar, pueden prepararse unas
gárgaras o un jarabe mediante la adición de la cantidad deseada de
citoquina a una formulación de lavado bucal o de jarabe para tos
disponibles comercialmente.
Dentro de los intervalos específicos de dosis a
los que se ha hecho referencia anteriormente, el tratamiento en
cada caso individual dependerá de la naturaleza de la condición, el
estado de la enfermedad, la terapia anterior, otra terapia
preexistente, el estado general de salud del mamífero, la
sensibilidad del sujeto a la citoquina, etc., y por lo tanto queda
a la discreción del médico o del veterinario, a la luz de todas
estas circunstancias. La duración del tratamiento evidentemente
será diferente según la condición tratada, por ejemplo el
tratamiento de un cáncer de crecimiento lento, tal como el cáncer de
próstata, sería previsible que implicará un curso de tratamiento
diferente que el tratamiento de un cáncer de crecimiento rápido, tal
como el carcinoma hepatocelular. De manera similar, una infección
aguda, tal como la provocada por el virus Ébola, sería previsible
que implicase un curso de tratamiento diferente que para una
condición crónica, tal como la hepatitis.
La dosis efectiva que se da a conocer en la
presente memoria es aquélla que puede generar una respuesta
patológica en el mamífero cuando se administra parenteralmente,
pero que resulta efectiva y no tóxica, o menos tóxica, cuando se
administra oromucosalmente. Una respuesta patológica puede ser
aguda, crónica o acumulativa, y puede manifestarse por cambios en
la química de la sangre, tal como leucopenia, depresión de la médula
ósea u otros parámetros histológicos. Tal como se utiliza en la
presente memoria, una respuesta patológica incluye efectos
secundarios adversos, tales como fiebre, escalofríos, anorexia,
fatiga, malestar o síntomas similares a la gripe, reacciones
vasculares, tales como flebitis y reacciones inflamatorias locales
en el sitio de la inyección. Estas respuestas variarán
considerablemente dentro de la población de pacientes en vista de
las variaciones individuales de sensibilidad a las citoqui-
nas.
nas.
Para muchos pacientes, se prevé que las dosis
oromucosales serán superiores a las que es conocido que se toleran
en los protocolos parenterales autorizados existentes. En una forma
de realización, la dosis total puede administrarse a lo largo del
tiempo en múltiples dosis más bajas, o incluso puede administrarse
continuamente o en pulsos desde un dispositivo de liberación
controlada adherido o implantado en la oromucosa.
Se preparó interferón \alpha/\beta murino a
partir de cultivos de células C243-3 inducidas con
virus de la enfermedad de Newcastle (NCV) y se purificaron tal como
se ha descrito anteriormente (Tovey et al., Proc. Soc. Exp.
Biol. Med. 146:406-415, 1974). La preparación
utilizada en el presente estudio (lote nº T638) presentaba un
título de 1x10^{6} IU/ml y una actividad específica de 5 x
10^{7} IU/mg de proteína según ensayo en células L929 de ratón
retadas con virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Tovey et
al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 146:406-415,
1974) y se estandarizaron frente a la preparación de referencia
internacional de interferón \alpha/\beta murino del US National
Institutes of Health
(G-002-9004-5411).
Se adquirió interleuquina 2
(IL-2) murina recombinante de R&D Systems, Inc.
(Minneapolis, MN). La preparación utilizada en el presente estudio
(lote nº MX056111) era de pureza superior al 97% según determinación
mediante SDS-PAGE y presentaba una ED50 de entre
0,1 y 0,4 ng/ml, medida en un ensayo de proliferación celular
utilizando una línea de células T citotóxicas murinas dependiente
de IL-2, CTLL-2 (Gearing, A.J.H. y
C.B. Bird, Lymphokines and interferons, a practical approach,
Clements, M.J., Morris, A.G. y A.J.H. Gearing (editores), IRL Press,
página 296, 1987).
Se adquirió interleuquina 12
(IL-12) murina recombinante de R&D Systems, Inc.
La preparación utilizada en el presente estudio (lote nº PB017011)
era de pureza superior al 97% según determinación mediante
SDS-PAGE y presentaba una ED50 de entre 0,05 y 0,2
ng/ml, medida tal como anteriormente.
Se adquirió interleuquina 15
(IL-15) murina recombinante de Protein Institute
Inc. La preparación utilizada en el presente estudio (lote nº
P200-15) era de pureza superior al 98% según
determinación mediante SDS-PAGE y análisis de
secuencias N-terminales. La preparación presentaba
un ED50 inferior a 0,5 ng/ml, correspondiente a una actividad
específica de 2 x 10^{6} unidades/mg.
Se adquirió interleuquina 18
(IL-18) murina de Protein Institute Inc. La
preparación utilizada en el presente estudio (lote nº P
200-18) era de pureza superior al 98% según
determinación mediante SDS-PAGE y análisis de HPLC.
La preparación utilizada en el presente estudio presentaba una ED50
de entre 0,1 y 5 ng/ml.
Se adquirió factor estimulante murino
recombinante de colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CSF) de Protein Institute Inc. La preparación
utilizada en este estudio (lote nº P 300 M-03) era
de pureza superior al 98% según determinación mediante
SDS-PAGE y análisis de secuencias
N-terminales. La preparación presentaba una ED50 de
0,1 ng/ml.
Previamente a la administración se diluyeron en
excipiente Ferimmune^{TM}, interferón \alpha/\beta murino,
IL-2, Il-4, IL-5,
IL-10, Il-12, Il-13,
IL-15, Il-18 murinos recombinantes y
GM-CSF.
Las preparaciones de citoquina se diluyeron en
solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía albúmina
de suero bovino (BSA) o en el excipiente patentado que se indica
posteriormente. La fracción V de la albúmina de suero bovino (grado
RIA; libre de inmunoglobulinas, nº de cat. A7888; Sigma, USA) se
disolvió a una concentración final de 100 \mug/ml en PBS (pH 7,4)
y se esterilizó mediante filtración (0,2 \mum,
Millex-GV, Millipore, USA).
En la mayoría de experimentos descritos en la
presente memoria, las preparaciones de citoquina se diluyeron en un
excipiente patentado. El excipiente utilizado contenía lo siguiente,
suministrado en forma de comprimidos (Ferimmune^{TM}, Pharma
Pacific):
\vskip1.000000\baselineskip
| % en p/p | mg/comprimido | |||
| Dextrosa (glucosa) BP** | \; \; \; 44,67*** | 55,84 | ||
| Gelatina BP** | 30,06 | 37,58 | ||
| Almidón de trigo BP** | 11,31 | 14,14 | ||
| Carmelosa sódica BP** | 4,96 | 6,20 | ||
| Albúmina de huevo BPC** | 4,03 | 5,04 | ||
| Leucina USP | 3,00 | 3,75 | ||
| Propilenglicol BP | 1,88 | 2,35 | ||
| Dextrano 40** | 0,06 | 0,08 | ||
| (en forma de inyección BP de Dextrano 40) | ||||
| Fosfato sódico BP | 0,03 | 0,04 | ||
| Cloruro sódico BP | 0,01 | 0,01 | ||
| Fosfato ácido sódico BP | 0,01 | 0,01 | ||
| Total | 100,02 | 125,04 | ||
| ** \hskip0,1cm calculado sobre base anhidra | ||||
| *** \begin{minipage}[t]{150mm}derivado de 44,64% de dextrosa (glucosa anhidra) BP y 0,03% de glucosa BP (en forma de inyección BP de Dextrano 40)\end{minipage} |
Se disolvió un solo comprimido de excipiente
Ferimmune^{TM} (lote nº B095002, fecha de caducidad: septiembre
de 1997) en 1,5 ml de PBS en un tubo micrófugo Eppendorf de 2 ml
durante tres horas a temperatura ambiente en un mezclador giratorio
(de tambor vertical). A continuación la suspensión se centrifugó a
16.000 g durante 15 minutos y se recuperó el sobrenadante. Se
preparó el excipiente Ferimmune^{TM} diariamente inmediatamente
antes de su utilización.
Los experimentos preliminares mostraron que la
aplicación de 5 \mul de cristal violeta en cada fosa nasal de un
ratón adulto normal utilizando una micropipeta Eppendorf P20 resultó
en una distribución casi inmediata del pigmento sobre la totalidad
de la superficie de la cavidad orofaríngea. La tinción de la cavidad
orofaríngea todavía resultaba evidente unos 30 minutos después de
la aplicación del pigmento. Por lo tanto, se utilizó este
procedimiento de administración en todos los experimentos
posteriores.
Lote: nº de lote 095001
Fecha de caducidad: diciembre de 1997
Preparación: se propagó la cepa JH del virus EMCV
en células L929 de ratón utilizando los procedimientos descritos en
Gresser I., Bourali C., Thomas M.T., Falcoff E., Effect of repeated
inoculation of interferon preparations on infection of mice with
encephalomyocarditis virus, Proc. Soc. Exp. Biol. Med.
127:491-6, febrero de 1968.
Caracterización: el stock de virus utilizado en
el presente estudio presentaba un título de 5 X 108.62 TCID50 en
células L929 de ratón.
Se obtuvo del Dr. E. Affabris, Roma, el clon
resistente al interferón \alpha/\beta llamado 3CI8, de células
de eritroleucemia de Friend (FLC) y que se describe en detalle en
Affabris et al., 1982 (Virology 120:441-452).
Seguidamente estas células se mantuvieron mediante cultivo in
vivo. En resumen, se inocularon ratones DBA/2 mediante
inyección intraperitoneal (ip) con aproximadamente 100 LD50 de
células 3C18 y una semana después se recogieron las células
tumorales del peritoneo de los ratones, se realizaron recuentos y
otros ratones nuevamente se inocularon con 100 LD50 de células
3C18. Este procedimiento se repitió para 60 a 100 cultivos. Se ha
demostrado que las células 3C18 utilizadas en los cultivos in
vivo números 60 a 100 son altamente metastásicos en el hígado y
en el bazo (Gresser et al., Int. J. Cancer
39:789-792, 1987). El fenotipo de resistencia IFN
se confirmó rutinariamente mediante cultivo in vitro de las
células cultivadas in vivo en presencia de interferón
\alpha/\beta (Belardelli et al., Int. J. Cancer
30:813-820, 1982).
Los ratones utilizados en el presente estudio se
obtuvieron de una colonia específica libre de patógenos (IFFA
CREDO, Francia). Se criaron en una instalación animal específica
libre de patógenos en el Institut Federatif CNRS en Villejuif
siguiendo normas EEC.
Se infectaron grupos de diez ratones Swiss macho
de 6 semanas de edad con 100 LD50 de virus de la encefalomiocarditis
(EMCV). Una hora después de la infección con el virus, los ratones
o se dejaron sin tratar, o se trataron una vez al día durante 4
días por vía intranasal/oral con IL-2 murina
recombinante o IL-12 murina recombinante en un
volumen de 10 \mul de excipiente Ferimmune o con 10 \mul de
excipiente solo (control), o mediante inyección intraperitoneal
(IP) en 200 \mul de excipiente, o con 200 \mul de excipiente
solo.
El tratamiento de ratones adultos con 2 \mug de
IL-2 murina recombinante al día durante 4 días por
vía intranasal/oral resultó en un incremento del porcentaje de
animales que sobrevivían a la infección con una dosis letal de
EMCV. Hasta el 40% de los animales tratados vivían 100 días después
de la infección con una dosis letal de EMCV, bajo condiciones en
las que todos los animales sin tratar, o todos los animales
infectados por virus tratados con excipiente habían muerto a los 6
días.
El tratamientos de ratones adultos con
IL-2 murino recombinante por vía intranasal/oral
resultó en un incremento marcado en el porcentaje de animales que
sobrevivían a la infección con una dosis letal de EMCV. El
incremento del porcentaje de animales que sobrevivían a la
infección con una dosis letal de EMCV dependía de la dosis de
IL-2 administrada por vía intranasal/oral. De esta
manera, el tratamiento de ratones adultos con 1 \mul de
IL-2 murina recombinante al día durante 4 días por
vía intranasal/oral resultó en la supervivencia del 30% de los
animales tratados con una dosis letal de EMCV, mientras que el
tratamiento de animales con 3 \mug de IL-2 murina
recombinante durante 4 días por vía intranasal/oral resultó en la
supervivencia del 60% de los animales. Los animales tratados con
IL-2 vivían y se encontraban bien 100 días después
de la infección con una dosis letal de EMCV, bajo condiciones en
las que todos los animales sin tratar, o todos los animales
infectados por virus tratados con excipiente habían muerto a los 6
días. Por el contrario, el tratamiento de ratones adultos con 0,1
\mug de IL-2 murina recombinante al día durante 4
días por vía intranasal/oral no incrementó significativamente la
supervivencia de animales infectados con una dosis letal de
EMCV.
Los animales tratados con 0,1 o con 1 \mug de
IL-2 murino recombinante al día durante 4 días por
vía intranasal/oral no mostraron ningún indicio detectable de
toxicidad. Sin embargo, se observaron indicios de toxicidad aguda,
incluyendo temblores, letargia y pelaje erizado, en animales
tratados por vía intranasal/oral con 3 \mug de
IL-2 recombinante, la dosis más elevada de
IL-2 evaluada.
El tratamiento de ratones Swiss adultos con
IL-12 murina recombinante por vía intranasal/oral
también se descubrió que incrementaba el porcentaje de animales que
sobrevivían a la infección con una dosis letal de EMCV, aunque en
menor grado que la misma cantidad de IL-2
recombinante. De esta manera, el tratamiento de ratones Swiss
adultos con 2 \mug de IL-12 murina recombinante al
día durante 4 días por vía intranasal/oral resultó en el día 100 en
la supervivencia de aproximadamente el 20% de los animales
infectados con una dosis letal de EMCV.
Las observaciones clínicas sugieren que todos los
animales tratados con IL-2 y con
IL-12 que vivían transcurridos 100 días
sobrevivirían.
De manera similar, el tratamiento de ratones
adultos con IL-2 murina recombinante por vía
intraperitoneal resultó en un incremento dependiente de la dosis en
el porcentaje de animales que sobrevivía a la infección con una
dosis letal de EMCV. De esta manera, el tratamiento de animales con
0,1 \mug de IL-2 murina recombinante al día
durante 4 días por vía intraperitoneal no incrementó
significativamente la supervivencia de los animales infectados por
virus, mientras que el tratamiento de ratones con 1 ó 3 \mug de
IL-2 murina recombinante al día durante 4 días por
vía intraperitoneal resultó en la supervivencia de entre el 40% y el
70%, respectivamente, de los animales infectados con una dosis
letal de EMCV.
Los resultados de los experimentos presentados en
la presente memoria sugieren que la vía oromucosal proporciona un
medio efectivo de administración de dosis muy elevadas de
IL-2 con toxicidad aceptable. De esta manera, los
animales tratados con 0,1 o con 1 \mug de IL-2
murina recombinante al día durante 4 días por vía intranasal/oral
no mostraron ningún indicio detectable de toxicidad. Basado en el
peso corporal (0,025 kg para un ratón adulto y un peso corporal
adulto humano de 60 kg), ello corresponde a una dosis humana
aproximada equivalente de 0,24 y 2,4 mg respectivamente, o 24 y 240
veces la dosis máxima tolerada de IL-2 administrado
parenteralmente (Huland et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol.
120:221-228, 1994).
Los resultados de estos experimentos sugieren que
la vía oromucosal proporciona un medio efectivo de administrar
IL-2 y IL-12 sin toxicidad aparente.
Estos resultados presentan implicaciones importantes para la
utilización clínica de IL-2 e IL-12
como agentes antivíricos.
Grupos de diez ratones DBA/2 de 6 semanas de edad
se retaron intravenosamente con 10^{5} células de leucemia de
Friend (clon resistente al interferón 3C18), equivalentes a
aproximadamente 20.000 LD50 en el día 0. Los ratones inoculados con
tumor o se dejaron sin tratar, o se trataron dos veces al día
durante como máximo 20 días por vía intranasal/oral con
IL-2 murina recombinante o con IL-12
murina recombinante, en un volumen de 10 \mul de excipiente
Ferimmune, o con solo 10 \mul de excipiente (control).
El tratamiento de ratones adultos con 2 \mug de
IL-2 murino recombinante dos veces al día durante 20
días por vía intranasal/oral resultó en un incremento marcado en el
tiempo de supervivencia de los animales inoculados con
aproximadamente 20.000 LD50 de células de leucemia de Friend. De
esta manera, aunque ninguno de los ratones inoculados con tumor y
tratados con IL-2 sobrevivieron más de 32 días, el
tratamiento de ratones DBA/2 adultos con 2 \mug de
IL-2 murina recombinante dos veces al día durante 20
días por vía intranasal/oral resultó en un incremento
estadísticamente significativo en el tiempo de supervivencia (día
medio de la muerte, 22,6 \pm 2,08 días) en comparación con
animales tanto no tratados como tratados con excipiente solo (día
medio de la muerte, 13,8 \pm 0,13 días).
El tratamiento de ratones DBA/2 adultos con
IL-12 murino recombinante por vía intranasal/oral
también se encontró que incrementaba el tiempo de supervivencia de
animales inoculados con una dosis letal de células de leucemia de
Friend, aunque en menor grado que con la misma cantidad de
IL-2 recombinante. De esta manera, aunque ninguno
de los animales inoculados con tumor y tratados con
IL-2 sobrevivió más de 20 días, el tratamiento de
ratones DBA/2 adultos con 2 \mug de IL-12 murina
recombinante dos veces al día durante como máximo 20 días por vía
intranasal/oral resultó en un incremento estadísticamente
significativo del tiempo de supervivencia (día medio de la muerte,
15,9\pm0,56 días) en comparación con los animales inoculados con
tumor tanto no tratados como tratados con excipiente (día medio de
la muerte, 13,8 \pm 0,13 días).
Los resultados de los experimentos demuestran que
la IL-2 murina recombinante muestra una marcada
actividad antitumoral en ratones inoculados con células de leucemia
de Friend altamente metastásicas, tras la administración por vía
intranasal/oral. Estos resultados son notables, debido a que la
IL-2 recombinante administrada sistémicamente se ha
informado anteriormente que resulta completamente infectiva en el
incremento del tiempo de supervivencia de ratones inoculados
intravenosamente con células de leucemia de Friend (Belardelli et
al., Int. J. Cancer 44:1108-1116, 1989). Los
resultados también sugieren que la vía oromucosal proporciona un
medio efectivo de administración de IL-2 sin
toxicidad aparente.
Se infectaron grupos de diez ratones Swiss macho
de 6 semanas de edad con 100 LD50 de EMCV. Una hora después de la
infección con virus, los ratones o se dejaron sin tratar o se
trataron una vez al día durante 4 días por vía intranasal/oral o
vía intraperitoneal con 1,0 \mug de IL-2 murina
recombinante, 10^{3} IU de interferón \alpha/\beta murino, o
la misma dosis de IL-2 murina recombinante e
interferon \alpha/\beta murino, en el excipiente
Ferimmune^{TM}; o con un volumen igual de excipiente solo
(control). Alternativamente, los ratones se trataron mediante
inyección intraperitoneal con la misma dosis de IL-2
murina recombinante, interferón \alpha/\beta murino o
IL-2 murina recombinante e interferón
\alpha/\beta murino.
Con el fin de determinar si la administración de
IL-2 murina recombinante, en combinación con
interferón \alpha/\beta murino resultaría en un efecto
antivírico aditivo o incluso sinérgico, los animales se trataron
inicialmente por vía intranasal/oral con IL-2
murina recombinante, seguido 30 minutos después de interferón
\alpha/\beta murino. El tratamiento de ratones adultos con
IL-2 murina recombinante junto con interferón
\alpha/\beta murino por vía intranasal/oral resultó en un
incremento aditivo en el porcentaje de animales que sobrevivían a
la infección con una dosis letal de EMCV. De esta manera, el
tratamiento de ratones adultos una vez al día durante 4 días por
vía intranasal/oral con 1 \mug de IL-2 murino
recombinante seguido de 10^{3} IU de interferón \alpha/\beta
murino resultó en la supervivencia del 80% de los animales
infectados con una dosis letal de EMCV.
El tratamiento de ratones adultos con 1,0 \mug
de IL-2 murino recombinante seguido 30 minutos
después de 10^{3} IU de interferón \alpha/\beta murino por
vía intraperitoneal resultó en la supervivencia del 80% de los
animales infectados con una dosis letal de EMCV.
Los animales tratados una vez al día durante 4
días con 1 \mug de IL-2 murina recombinante,
10^{3} IU de interferón \alpha/\beta, o ambos,
IL-2 murina recombinante e interferón
\alpha/\beta, por vía intranasal/oral o por vía
intraperitoneal, no mostraron ningún indicio detectable de
toxicidad.
Se infectaron grupos de diez ratones Swiss macho
de 6 semanas de edad con 100 LD50 de EMCV. Tras la infección con el
virus, los ratones se dejaron sin tratar o se trataron una vez al
día durante 4 días por vía intranasal/oral con IFN \alpha/\beta
murino, IL-2, IL-4,
IL-10, IL-12 o IL-15
murina recombinante en un volumen de 10 \mul de excipiente
Ferimmune, o con 10 \mul de excipiente solo (control).
El tratamiento de ratones adultos con interferón
\alpha/\beta murino por vía intranasal/oral resultó en un
marcado incremento del porcentaje de animales que sobrevivían a la
infección con una dosis letal de EMCV. De esta manera, el 50% de
los animales tratados con 10^{3} IU de interferón \alpha/\beta
murino se encontraban vivos 86 días después de la infección con una
dosis letal de EMCV, bajo condiciones en las que los animales
infectados por virus no tratados o tratados con excipiente habían
muerto a los 7 días. El tratamiento de ratones adultos con 1 \mul
de IL-2 murina recombinante al día durante 4 días
por vía intranasal/oral también resultó en un marcado incremento en
el porcentaje de animales que sobrevivían a la infección con una
dosis letal de EMCV. De esta manera, el 30% de los animales
tratados con IL-2 murina recombinante por vía
intranasal/oral se encontraban vivos 86 días después de la
infección por virus. De manera similar, el tratamiento de ratones
adultos con 1 \mug de IL-15 murina recombinante al
día durante 4 días por vía intranasal/oral también resultó en la
supervivencia del 30% de los animales infectados con una dosis letal
de EMCV. El tratamiento de ratones adultos con 1 \mug de
GM-CSF murino recombinante al día durante 4 días por
vía intranasal/oral también resultó en la supervivencia del 20% de
los animales infectados con una dosis letal de EMCV.
El tratamiento de ratones Swiss adultos con
IL-12 murina recombinante por vía intranasal/oral
también se encontró que incrementaba el porcentaje de animales que
sobrevivía a la infección con una dosis letal de EMCV, aunque en
menor grado que la misma cantidad de IL-2 o
IL-15 recombinantes. De esta manera, el tratamiento
de ratones Swiss adultos con 1 \mug de IL-12
murina recombinante al día durante 4 días por vía intranasal/oral
resultó en la supervivencia de aproximadamente el 20% de los
animales infectados con una dosis letal de EMCV.
Las observaciones clínicas sugieren que todos los
animales tratados con interferón, tratados con IL-2,
tratados con IL-12, tratados con
IL-15 y tratados con GM-CSF que se
encontraban vivos a los 86 días sobrevivirán una duración normal de
vida.
Por el contrario, el tratamiento de animales con
1 \mug de IL-4 o IL-10 murinas
recombinantes al día durante 4 días por vía intranasal/oral no
resultó en un incremento significativo de la supervivencia de los
animales infectados con una dosis letal de EMCV. De esta manera, la
totalidad de los ratones tratados con IL-4 y con
IL-10 habían muerto 8 días después de la infección
por virus, es decir, con una diferencia de menos de 24 horas con
los animales infectados por virus sin tratar o tratados con
excipiente.
Se infectaron grupos de diez ratones Swiss de 6
semanas de edad con 100 LD50 de EMCV. Tras la infección por virus,
los ratones se dejaron sin tratar o se trataron una vez al día
durante 4 días por vía intranasal/oral con IFN \alpha/\beta
murina, IL-5, IL-13 o
IL-18 murinas recombinantes en un volumen de 10
\mul de excipiente Ferimmune o con 10 \mul de excipiente solo
(control).
El tratamiento de ratones adultos con interferón
\alpha/\beta murino por vía intranasal/oral resultó en un
marcado incremento del porcentaje de animales que sobrevivían a la
infección con una dosis letal de EMCV. De esta manera, el 50% de
los animales tratados con 10^{3} IU de interferón \alpha/\beta
murino se encontraban vivos 52 días después de la infección con una
dosis letal de EMCV, bajo condiciones en las que la totalidad de
los ratones infectados por virus sin tratar o tratados con
excipiente habían muerto a los 6 días. El tratamiento de ratones
adultos con 1 \mug de IL-18 murina recombinante al
día durante 4 días por vía intranasal/oral también resultó en un
marcado incremento en el porcentaje de animales que sobrevivían a la
infección con una dosis letal de EMCV. De esta manera, el 20% de
los animales tratados con IL-18 murina recombinante
por vía intranasal/oral se encontraban vivos 52 días después de la
infección por virus.
Las observaciones clínicas sugieren que la
totalidad de los animales tratados con interferón y tratados con
IL-18 que se encontraban vivos a los 52 días
sobrevivirán una duración normal de vida.
Por el contrario, el tratamiento de los animales
con 1 \mug de IL-5 o IL-13 murinas
recombinantes al día durante 4 días por vía intranasal/oral no
resultó en un incremento significativo de la supervivencia de los
animales infectados con una dosis letal de EMCV. De esta manera, la
totalidad de los ratones tratados con IL-5 y con
IL-13 habían muerto 9 días después de la infección
por virus, es decir, con una diferencia de menos de 72 horas con
los animales infectados por virus no tratados o tratados con
excipiente solo.
Ninguno de los animales tratados con 1.000 IU de
IFN \alpha/\beta o con 1 \mug de IL-5,
IL-13 o IL-18 murinas recombinantes
al día durante 4 días por vía intranasal/oral mostraba indicios
detectables de toxicidad, sugiriendo que la vía oromucosal
proporciona un medio efectivo de administrar citoquinas, en ausencia
de toxicidad aparente.
Se encontró que IL-4 e
IL-10, ambos potentes estimulantes de la reactividad
de Th2, carecían de actividad antivírica tras la administración por
vía intranasal/oral, enfatizando la estrecha asociación existente
entre la capacidad de inducir reactividad Th1 y la inducción de
actividad antivírica tras la administración oromucosal.
La preparación de \alpha/\beta utilizado en
el presente estudio (lote nº RT6) presentaba un título de 1 x
10^{7} IU/ml y una actividad específica de 5 x 10^{7} IU/mg de
proteína según ensayo con células L929 de ratón retadas con virus
de la estomatitis vesicular (VSV) (Tovey et al., Proc. Soc.
Exp. Biol. Med. 146:406-415, 1974).
Se introdujo IFN \alpha/\beta murina en el
excipiente albúmina de suero bovino/solución salina tamponada con
fosfato (BSA/PBS) previamente a su administración.
Se inmunizaron mediante inyección intraperitoneal
grupos de cuatro ratones Swiss o Balb/c macho de 8 semanas de edad
en los días 0 y 4 con 200 \mug de alérgeno polen de ambrosía no
desgrasado libre de pirógenos (Greer Laboratories, Lenoir, USA) en
adyuvante Alum (Imject Alum, Pierce Laboratories). A continuación
los ratones se retaron por vía intratraqueal con 200 \mug de
alérgeno de ambrosía en manteca de cacao (NaCl 0,085 M, NaHCO_{3}
0,064 M, pH 8,1) en el día 11. Los grupos de animales se trataron
por vía oromucosal con 1.000 IU de IFN \alpha/\beta murina en
un volumen de 10 \mul de interferón falso o con 10 \mul de
interferón falso solo (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol.
Med. 146:406-415, 1974) una vez al día entre los
días 0 y 6 inclusive. Se trataron otros grupos de animales
intraperitonealmente con 10^{3} IU de IFN \alpha/\beta murina
en un volumen de 200 \mul de interferón falso o con 200 \mul de
interferón falso solo (control) una vez al día desde el día 0 al día
6 inclusive. Los grupos de animales también se trataron por vía
oromucosal o intraperitoneal con 1.000 IU de IFN \alpha/\beta
murina en un volumen de 10 \mul o de 200 \mul de interferón
falso, respectivamente, o con 10 \mul o con 200 \mul de
interferón falso solo (control) únicamente dos veces en el día 11 y
una vez en el día 12. Se trataron otros grupos de animales tal como
anteriormente en los días 0 a 6 y 11 a 12. La totalidad de los
animales fueron sacrificados el día 14 y se recogieron muestras de
sangre periférica y de lavado broncoalveolar
(BAL).
(BAL).
Se recogieron muestras de sangre periférica en
tubos de vacío que contenían EDTA (B.D., nº de catálogo 367624), se
centrifugaron a 800 x g durante 10 minutos a 4ºC, el suero se
recogió y se analizó para la presencia de anticuerpo IgG o IgE
específico para polen de ambrosía utilizando un ensayo de
inmunosorción ligado a enzima (ELISA).
En resumen, se diluyeron previamente 1:100
muestras de suero en PBS y además se diluyeron seriadamente en
placas de microtitulación (Maxisorb, Nunc), se recubrieron con polen
de ambrosía (20 \mug/ml) en NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,5. Se
detectaron los IgG o IgE específicos para ambrosía utilizando IgG de
cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina o
IgE monoclonal de rata anti-ratón conjugada con
biotina seguido de estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina,
respectivamente. Se determinó la absorbancia media (a 405 nm) en
muestras dobles.
La inmunización de ratones Balb/c macho de 8
semanas de edad con alérgeno polen de ambrosía libre de pirógenos
mediante inyección intraperitoneal en los días 0 y 4 seguido del
reto intratraqueal en el día 11, resultó en niveles elevados de
anticuerpo IgG e IgE específico de polen de ambrosía determinados a
los 14 días.
El tratamiento de animales por vía oromucosal con
1.000 IU de IFN \alpha/\beta murino una vez al día entre los
días 0 y 6 inclusive, y en los días 11 y 12, resultó en una
inhibición marcada de la producción de anticuerpo IgE
alérgeno-específico en comparación con los animales
tratados con interferón falso. El tratamiento oromucosal con
interferón también inhibió la respuesta de anticuerpo IgG
alérgeno-específico aunque en menor grado que la
respuesta de IgE. El tratamiento de animales por vía oromucosal con
1.000 IU de IFN \alpha/\beta murino en los días 0 a 6
únicamente, o en los días 11 a 12 únicamente resultó en una
inhibición menos marcada de la producción de anticuerpo que el
tratamiento combinado.
El tratamiento de animales por vía oromucosal con
1.000 IU de IFN \alpha/\beta murino una vez al día entre los
días 0 y 6 inclusive, y en los días 11 a 12, o en los días 11 y 12
únicamente, resultó en una inhibición mayor de la producción de
anticuerpos IgE alérgeno-específicos que en animales
inyectados intraperitonealmente con 1.000 IU de IFN
\alpha/\beta murino.
El tratamiento de animales por la vía oromucosal
con 1.000 IU de IFN \alpha/\beta murino una vez al día entre
los días 0 y 6 inclusive, y en los días 11 a 12 resultó en una
inhibición tres veces mayor del número de eosinófilos presentes en
sangre periférica en comparación con los animales tratados con
interferón falso. El tratamiento de animales por vía oromucosal con
1.000 IU de IFN \alpha/\beta murino resultó en una inhibición
dos veces más marcada del número de eosinófilos que en animales
inyectados intraperitonealmente con 1.000 IU de IFN
\alpha/\beta murino. El tratamiento de animales por vía
oromucosal o intraperitoneal con 1.000 IU de IFN \alpha/\beta
murino en los días 11 y 12 únicamente no resultó en ninguna
inhibición detectable del número de eosinófilos circulantes
presentes en sangre periférica y en el caso del tratamiento por vía
oromucosal con interferón incluso podría haber causado un ligero
incremento en el porcentaje de eosinófilos en comparación con los
animales tratados con interferón falso.
El efecto de la terapia oromucosal con
IFN-\alpha sobre la respuesta de IgE
alérgeno-específico y el reclutamiento de
eosinófilos inducido por alérgeno aparentemente era menos marcado
que el previamente indicado para IL-12 sometido a
ensayo en el mismo modelo animal de asma atópica inducida por
alérgeno (Sur et al., J. Immunol.
157:4173-4180, 1996). Sin embargo, es probable que
se observen efectos correspondientemente mayores a dosis más
elevadas de IFN que la dosis única relativamente baja de 1.000 IU
utilizada en los estudios descritos en la presente memoria, que, en
base peso, es 200 veces menor que la dosis de IL-12
utilizada por Sur et al. (J. Immunol.
157:4173-4180, 1996). Aunque IL-12
es una de las citoquinas más efectivas sometidas a ensayo en
modelos animales de asma atópica inducida por alérgeno al iniciar la
terapia en etapa temprana durante el periodo de sensibilización
alérgica, sin embargo IL-12 resulta totalmente
ineficaz en la reducción de la respuesta de IgE
alérgeno-específica cuando se inicia la terapia
tarde en el desarrollo del proceso de la enfermedad, durante el
periodo de respuesta inflamatoria hipersensible en los pulmones.
Por el contrario, la terapia oromucosal con interferón alfa
aparentemente resultó más efectiva en la reducción de la respuesta
de IgE alérgeno-específica incluso al iniciar la
terapia en etapa tardía del desarrollo de la enfermedad. Además, la
utilización clínica de IL-12 en pacientes con cáncer
renal se asocia con toxicidad sustancial (Cohen J., Science
270:908, 1995).
Los resultados de los estudios informados en la
presente memoria muestran que la terapia oromucosal con
IFN-\alpha redujo marcadamente tanto la respuesta
de IgE alérgeno-específica como el reclutamiento de
eosinófilos inducido por alérgeno en animales sensibilizados al
alérgeno polen de ambrosía, frecuente en el ser humano. El efecto
de la terapia oromucosal con interferón sobre dos de las
características definitorias del asma atópica sugiere que la
terapia oromucosal con IFN-\alpha podría encontrar
aplicación en el tratamiento del asma, aunque debe extrapolarse con
precaución desde el modelo de roedor a un contexto clínico, incluso
cuando se utiliza un alérgeno frecuente en el ser humano.
La demostración de que las citoquinas
Th1-específicas muestran una actividad marcada tras
la administración por vía oromucosal indica que la administración
oromucosal de citoquinas puede utilizarse para inducir reactividad
sistémica de Th1, que es conocido que desempeña un papel importante
en la defensa del huésped frente a la infección por virus y la
enfermedad neoplásica.
La administración oromucosal de citoquinas de Th1
biológicamente activas pero mal toleradas resulta de una
importancia potencialmente considerable en el tratamiento de las
enfermedades tanto víricas como neoplásicas. La administración
oromucosal de citoquinas Th1 también podría encontrar aplicación en
el tratamiento de enfermedades tales como el asma y la dermatitis
atópica. La administración oromucosal de citoquinas de Th2 se ha
demostrado que resulta ineficaz en el tratamiento del cáncer y de
las condiciones víricas que responden a las citoquinas de Th1
oromucosales. Esta observación es consecuente con los papeles
conocidos de Th1 y Th2 en los mecanismos de defensa del huésped.
Por lo tanto, las condiciones que previsiblemente pueden responder a
las citoquinas Th2 son aquéllas caracterizadas por la
sobreestimulación de Th1, tales como las enfermedades
autoinmunológicas.
Claims (8)
1. Utilización de una citoquina estimulante de
Th1 seleccionada de entre el grupo constituido por
interleuquina-2, interleuquina-12,
interleuquina-15, interleuquina-18,
factor \beta de necrosis tumoral y factor estimulante de colonias
de granulocitos-macrófagos (GM-CSF)
en la preparación de una composición oromucosal para el tratamiento
de una enfermedad en un mamífero que podría beneficiarse de la
estimulación de Th1 mediante la estimulación de los mecanismos de
defensa del huésped a través del contacto oromucosal, en el que la
enfermedad o condición se selecciona de entre el grupo constituido
por una condición neoplásica, una infección vírica, un trastorno
alérgico, asma y dermatitis atópica.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo constituido
por una condición neoplásica y una infección vírica.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dicha enfermedad es una condición neoplásica.
4. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dicha enfermedad es una infección vírica.
5. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicha enfermedad se selecciona de entre el grupo constituido
por un trastorno alérgico, asma y dermatitis atópica.
6. Utilización según la reivindicación 5, en la
que dicha enfermedad es un trastorno alérgico.
7. Utilización según la reivindicación 5, en la
que dicha enfermedad es asma.
8. Utilización según la reivindicación 5, en la
que dicha enfermedad es dermatitis atópica.
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