CN1259104C - 口粘膜细胞因子组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于口腔粘膜接触刺激哺乳动物宿主防御机制的药物组合物，它含有有效量的Th1或Th2刺激细胞因子，和用这种组合物进行治疗的方法。

Description

口粘膜细胞因子组合物及其应用
本发明涉及通过口粘膜施药Th1或Th2特异细胞因子刺激哺乳动物保护机制的方法，以及口粘膜投送Th1或Th2特异细胞因子的组合物。具体地说，本发明可应用于自身免疫、过敏性的、炎症的、细胞内细菌的、肿瘤的、神经病的、寄生虫的、和病毒的疾病的治疗方法。
白细胞介素(IL)是一类多组分的分泌型多肽和蛋白质。它们的主要功能是调解细胞局部相互作用。有关IL的绝大部分信息是来自白细胞，尤其是淋巴细胞的工作。
一般地讲，人们认为CD4T细胞能够分成两个功能不同的亚型，T辅助1(Th1)和T辅助2(Th2)细胞，它们以所产生的细胞因子的模式为特征。如鼠Th1细胞产生干扰素γ(IFN-γ)，肿瘤坏死因子β(TNFβ)、和白细胞介素2(IL-2)，而鼠Th2细胞产生IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10和IL-13。尽管，IL-2，IL-6，IL-10和IL-13的合成不象在鼠中紧紧限定在一个亚型，但是人的Th1和Th2细胞有类似的细胞因子分泌形式。由Th1和Th2分泌几种其它的细胞因子，包括：IL-3、TNFα，粒细胞巨噬细胞集落剌激因子(GM-CSF)，甲基-脑啡肽，一些趋化因子(CK)。另外一些新的细胞因子，例如IL-18(Yoshimoto等1997.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94，3948-3953)，原先被称作干扰素γ诱导因子(IGIF)，它具有加强Th1应答的作用，将继续予以描述。而且将来非常可能会发现另外的一些新的细胞因子，它们影响Th1或Th2的应答。
Th1和Th2细胞因子分泌的模式与免疫应答中产生的活性效应子表型一致。它们并不存在于幼稚细胞中。当通过抗原呈递细胞(APC)上的抗原首次剌激时，开始幼稚CD4+T细胞仅仅产生IL-2，然后分化成分泌其它细胞因子的表型。已经鉴定出第三类CD4+T细胞，被称为Th0细胞，它们由部分分化的效应子细胞组成，该效应子细胞表达Th1和Th2两类细胞所表达的细胞因子表达模式，并代表分化成Th1和Th2细胞的分化途径中的一个瞬时阶段。也鉴定出了第四类CD4+T细胞，被称为Th 3细胞，它产生高水平的转化生长因子β(TGFβ)。
Th1和Th2细胞不仅产生不同类型的细胞因子，产生不同功能性能，而且还优选表达一些活性的标记。这样，人Th1细胞优先表达淋巴细胞活性基因3(LAG-3)，一个免疫球蛋白超家族的成员，而人Th2细胞优先表达CD 30，一个TNF受体家族的成员。LAG-3的表达受IFNγ的作用而增强，受IL-4的作用而抑制，而CD 30的表达依赖于IL-4的存在。Th1细胞也表达E-选择蛋白，P-选择蛋白配基和IL-12受体的β-链，这些是Th2细胞所不能表达的。
CD8+T细胞毒性(Tc)细胞亚组基于它们产生的细胞因子也能予以区分。Tc1细胞分泌IL-12和IFNγ，具有Tc2外形的细胞分泌IL-4和IL-5而且发现它们存在于一些病理状态下，例如，具有很高的IgE水平的瘤型麻风和HIV感染个体。
Th1和Th2细胞以它们各自不同的细胞因子相互关联。Th1细胞参与细胞介导的免疫应答(巨噬细胞的激活、抗体依赖性细胞毒性，迟发型超敏反应)和阻止病素的感染，并且几种Th1细胞因子激活细胞毒性和炎症反应。Th2细胞因子加强抗体的产生，特别是IgE应答，并通过肥大细胞和嗜酸性粒细胞的生长和分化的因子的产生也增强粘膜的免疫性。因此，Th2细胞是与抗体产生，过敏反应和对病毒感染的敏感性有关。
Th1和Th2细胞因子对彼此表型的分化和效应子功能是互相抑制的。因而，IL-12和IFNγ选择性地抑制Th2细胞的增生，IL-14和IL-10抑制Th1的发育。在许多情况下，用细胞因子或抗细胞因子能够颠倒宿主的抗性或对感染的敏感性。参见，the Th1-Th2 paradigm，SergioRomagani，Immunology Today，June 1997，18：6(263-266)。
白细胞介素-2(IL-2)是一种生物学的应答修饰子，它能激活溶细胞T-细胞和天然杀伤细胞(参见Kuziel，W.A.和Gree，W.C.(1991)，白细胞介素-2，细胞因子手册(Interleukin-2，in The Cytokine Handbook，A.Thompson(Ed.)，San Diego，California，Academic Press，pages 83-102))。因此，已对IL-2对恶性肿瘤，免疫缺陷以及慢性感染具有的潜在的治疗作用进行了检测。
IL-2通过结合到有很高亲合力的α、β、γ三个肽链组成的细胞表面受体上调节T-淋巴细胞和另外的淋巴样细胞的增生和分化(Waldmann，T.A.，1993，Immunol.Today，14：264)。由Vasily Gelfanov等(Proceedings of the Keystone Symposium on Mucosal Immunity，1997，S112：12)提供的资料显示，肠内皮淋巴细胞(已知它在很多个重要的方面不同于中央免疫系统的T-细胞)优先响应最近鉴定的T-细胞生长因子，白细胞介素15(IL-15)，而不是传统的T-细胞生长因子，IL-2。
IL-15与一种异源三聚体细胞表面受体相互作用，它由IL-2受体的β和γ亚单位以及一种被称为IL-15Rα的特异性高亲和IL-15结合亚基组成。因为IL-2受体的β和γ亚单位需要由IL-2或IL-15呈递信号，已报导的这二个细胞因子共享许多共同的生物的活性就显得不足为奇(Kennedy，M.K.和Dark L.S.，1996，临床免疫学杂志(J.Clin，Immunol.)，16：134-143)。
与干扰素α一样，IL-12是天然杀伤细胞(NK)活性的主要调节者之一，在宿主对瘤细胞的防御中它起着重要作用(Kobayashi，M.，1989，实验医学杂志(J.Exptl.Med.)，170：827)。主要由巨噬细胞产生的IL-12通过激活T-细胞和NK细胞也能诱导释放γ-干扰素，而且与IL-2协同产生淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)(Aragane等，1994，免疫学杂志(J.Immunol.)，153：5366-5372)。IL-12与IL-2和γ-干扰素一起在Th1效应子细胞的发育中起着关键的作用。Th1应答常常与抵御感染联系在一起，而且已表明感染人乳头瘤病毒的病人用干扰素α2抗病毒作用时它起了决定性的作用(Arany，I.和Tyring，K.，1996，干扰素和细胞因子研究(J.Interferon and Cytokine Res.)，16：453-460)。
全身性施用的IL-2的抗肿瘤活性被认为主要是由LAK细胞介导(Natuk等，1989，病毒学杂(J.Virol.)，63：4969-4971)。全身性施用的IL-2的抗病毒活性被认为主要是由巨噬细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的，它涉及在辅助T-细胞中γ-干扰素的诱导(Kohe等，(J.Inf.Dis.)，159：239-247)，并通过LAK细胞(Natuk等，1989，病毒学杂志(J.Virol.)，63：4969-4971)。
白细胞介素一般是肠胃外施药。然而，IL-2肠胃外施药伴随许多严重的副作用，诸如：血中毒和肾功能异常(参见Haworth，C.和Felamann，M.，1991，细胞因子在人免疫治疗上的应用，细胞因子手册，A.Thompson(Ed.)，San Diego，California：Academic Press，Pages 301-324)。也观察到另外一些白细胞介素具有类似的毒性。
全身性施用的重组人IL-2也被用于治疗许多肿瘤疾病，包括肾细胞癌(Rozenberg等，1989.Ann.Surg.，210：474)和恶性黑色素瘤(Rozenberg等，1987，New Engl.J.Med.，816：889)。但较少用于某些病毒病治疗，包括慢性乙型肝炎(Kakumu，等，1988，Hepatology，8：487-492)。在所有的这些研究中遇到了一些值得考虑的毒性，包括发热、发冷、厌食和疲劳(Kakumu等，1988，Hepatology，8：487-492)。
一系列的专利和专利公开以概括性的术语特别提到各种白细胞介素口服药的可能性。例如，WO 91/16917公开了IL-1用于肠溃疡和肥胖的治疗；WO 92/11030公开了IL-4用于增强对疫苗免疫原的免疫应答；美国专利No.5,601,814公开了IL-6用于治疗中毒休克；美国专利No.5,188,828公开了IL-6用于增强内源的促红细胞生成素的水平；和WO 96/25171公开了IL-12用于抑制血管形成。然而，这些一般地公开实际上不包含活性组分口的吸收，也没有任何一个例子包含口的吸收或口的投送后蛋白质活性的报导。例如，虽然美国专利No.5,449,515概括性地公开了口服投送IL-4，也公开了如果制备成口服形式，IL-4可被一种防止它失活的材料包被，或者与这种材料一起施用，并讨论了各种用于防止这种失活的材料。提出的措施包括酶抑制剂和将白细胞介素包裹在脂质体中(参见Column 3，第7-22行)。很明显，这些参考文献预想到了通过口腔向小肠投送的施用形式。
Koren S.和Fleischmann W.R.Jr.，“干扰素研究杂志”，14(6)：343-7，Dec.1994，描述了在无病原的小鼠中通过口服rhIL-2对外周血白细胞计数和骨髓功能的调节，并且断定白细胞计数的抑制水平类似于通过皮下施药得到的水平。他们断定口服IL-2能产生全身性效应，推测口服IL-2具有潜在的治疗作用。Marinaro，M.，Boyaka，P.N.，Finkelman，F.D.，Kiyono，H.，Jackson，R.J.，Jirillo，E.，和McGhee，J.R.，J.Exp.Med.，Feb 3 1997，185(3)，第415-27页，断定重组鼠IL-12(rmIL-12)经胃内而不是胃肠外给药造成对口服疫苗进行Th2型应答，而不致敏肠粘膜IgA的应答。作者断定IL-12能够通过口通道给药，以调节对口服疫苗的全身性响应，并且建议为了向小肠的派伊尔氏淋巴集结投送而配制的IL-12也可在粘膜水平施加免疫调节效应。
Marinaro，M.，Boyaka，P.N.，Jackson.R.J.，Finkelman，F.D.，Kiyono，H.，McGhee，J.R.，过敏临床免疫杂志(J.Allergy Clin.Immunol)99，No.1Pt.2，S34，1997对与脂质体复合的IL-12由鼻内投送相对于口投送进行了研究。他们发现鼻内投送IL-2增强Th2-型的应答，而口服IL-2使Th2型应答改变为Th1型应答。这表明两种不同粘膜途径投送IL-12对口服疫苗产生粘膜和系统免疫应答的相反类型。
但是，所有的这些专利和文献“口服投送”显然是指通过口服药投送到小肠，而IL实际上在小肠被吸收。
我们惊奇地发现在将小鼠用通常情况下快速致死的病毒和肿瘤至敏后，通过口腔粘膜施用Th1细胞因子可有效延长小鼠的存活时间。
本发明提供了TH1或TH2刺激细胞因子在制备通过与哺乳动物口粘膜接触而刺激宿主防御机制的药物中的用途，所述哺乳动物具有会受益于TH1刺激或TH2刺激的疾病，所述口粘膜接触是以提供与受体口粘膜腔接触足以获得所需的刺激的时间的方式进行，其中通过与具有会受益于TH1刺激的疾病的哺乳动物口粘膜接触而刺激宿主防御机制的TH1刺激细胞因子选自IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、TNF-β和GM-CSF，且其中通过与具有会受益于TH2刺激的疾病的哺乳动物口粘膜接触而刺激宿主防御机制的TH2刺激细胞因子选自IL-4、IL-5、IL-10和IL-13。
本发明提供了一种在哺乳动物中刺激宿主防御机制的方法，它是通过口腔粘膜施用Th1或Th2特异性细胞因子进行的，其剂量最好是诱导宿主防御机制刺激效应的剂量，也就是Th1或Th2细胞因子在制备用于在哺乳动物中刺激宿主防御机制的口腔粘膜药物中的应用，用于口腔粘膜投送细胞因子的组合物和用细胞因子治疗疾病的方法。
本发明也提供了一种哺乳动物中刺激免疫应答的方法，包含通过口粘膜接触施用免疫刺激量的Th1或Th2特异细胞因子的步骤，也就是Th1或Th2细胞因子在制备用于在哺乳动物中刺激宿主防御机制的口腔粘膜药物中的应用。
在本发明以及下文中，作为优选的实施方案提出的刺激宿主防御机制或者免疫应答的方法也是Th1或Th2细胞因子在制备口腔粘膜药物中的应用的优选的实施方案。
优选Th1细胞因子选自下组：干扰素-α，-β，-ω，-γ，IL-2，IL-12，IL-15，IL-18，GM-CSF和肿瘤坏死因子β(lymphotoxin)。优选Th2细胞因子选自下组：IL-4，IL-5，IL-10，和IL-13。优选的细胞因子是由重组DNA技术产生的。
本发明的组合物和方法可用于治疗人和非人哺乳动物疾病，包括伴随人的动物，例如狗和猫，以及家畜，例如马、牛和羊。
本发明方法也允许特异性细胞因子Th1和Th2在一种特别的剂量下施用，这种特别的剂量在通过胃肠外途径施用相同的细胞因子时为可诱导病理效应的过量。或者，本发明提供了一种通过细胞因子的口腔粘膜施用提高Th1或Th2细胞因子的治疗指数的方法。
下文将参照下列定义和实施例对本发明进行详细描述。本文中提及的所有的专利和文献引入本文作为参考。
“口粘膜”是指排布在口腔和/或鼻咽腔的粘膜。对于本发明说明书中描述的动物实验，有关细胞因子施用途径的术语“口粘膜的”，“口咽的”，“鼻内的/口腔的”，“鼻内的加口腔的”和“在/或”为同义词，表示细胞因子制剂被施用至鼻腔或口腔的深处，以便细胞因子迅速地分布到受体哺乳动物的口和喉，从而与腔体的粘膜衬里相接触。虽然吸收位点，而不是施用方法起着关键的作用，细胞因子不需要与鼻、口、和咽喉的腔体的整个粘膜衬里相接触。
当用于本文而没有进一步的限定时，“细胞因子”是指Th1或Th2特异性细胞因子，即刺激Th1或Th2细胞活性的细胞因子。
“白细胞介素”是指由淋巴细胞产生的一种细胞因子蛋白质，包括但不限于通常被称为IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-18的细胞因子和其混合物。白细胞介素可以由天然来源得到，但优选重组产生的。本发明中“细胞因子”也包括具有细胞因子活性的多肽及其片断，以及其中导入了序列变化的嵌合或突变形式的细胞因子，以提高例如其稳定性，而不影响其生物学活性。其它的变化，例如pegylated形式，与免疫球蛋白或其它的蛋白质的融合蛋白质也属于本发明的范围。
口腔粘膜施用可包含通过单一剂量施用有效剂量的细胞因子，或者该有效剂量可在足以引发与单一剂量相当的免疫刺激的时间内分多次小剂量施用。同样，细胞因子的剂量可在足以诱导与单一剂量相当的效果的时间内连续施用。
本发明提供一种治疗选自下组的疾病的方法：胞内细菌感染，神经疾病、过敏、炎症、肿瘤疾病、寄生虫感染和病毒感染，包括向哺乳动物通过口粘膜接触施用有效量的Th1特异性细胞因子的步骤。
而且，本发明提供了一种通过口粘膜施用Th2细胞因子治疗自身免疫疾病的方法，这些疾病包括但不限于类风湿性关节炎，I型糖尿病，红斑狼疮，多发性硬化症，以及牛皮癣。
炎症，例如结肠炎溃疡和Crohn氏病；胞内细菌感染，包括Listeria；真菌细菌感染，例如麻疯病和肺结核；神经疾病，包括多样性硬皮症和amyotrophic lateral sclerosis；寄生虫疾病，例如疟疾，血吸虫病和利什漫原虫病；和CMV感染和过敏，包括哮喘和遗传过敏性皮炎，可以通过口粘膜施用细胞因子予以治疗。
本发明还提供了一种治疗肿瘤疾病的方法，这些肿瘤疾病包括，例如，多种骨髓瘤，毛细胞白血病，慢性骨髓的白血病，低等淋巴腺瘤，皮肤的T-细胞淋巴腺瘤，类癌肿瘤，子宫颈癌；肉瘤，包括Kaposi氏肉瘤；癌，包括肾细胞癌，肝细胞癌，鼻咽癌，血液恶性肿瘤，结肠癌，成胶质细胞瘤，喉乳头状瘤，肺癌，结肠癌，恶性黑色素瘤；和脑肿瘤，包括恶性脑瘤。
虽然本发明的方法可以在没有同时使用其它药物进行治疗的情况下使用，但预想到本发明的这一实施方案特别适用于以下情况：
a)通过标准程序进行手术，化疗，或放射疗法(X-射线，紫外线UV)后作为辅助治疗；
b)用于治疗细胞因子敏感性瘤，本发明的方法可以单独使用或者与常规的化疗或放疗结合使用。
c)用于治疗耐细胞因子性瘤，本发明的方法可以单独使用或最优选与常规的化疗或放疗协同使用。
在第三个实施方案中被治疗的疾病是病毒感染。这种病毒感染可以是急性或暴发性的感染，例如：鼻病毒，流感，带状疱疹，登革热或病毒脑炎，包括但不限于麻疹病毒脑炎，河谷脑炎、日本B脑炎、森林脑炎和疱疹脑炎；出血热，诸如；Ebola病毒，马尔堡病毒、拉沙热；汉坦病毒感染和被认为是由动物传染到人的其它病毒的感染，例如：马传麻疹病毒。对于其中的许多病症目前还无法治疗或没有可使用的疫苗，而且辅助治疗也无济于事。或者病毒性疾病可导致慢性感染，例如乙型肝炎，丙型肝炎，丁型肝炎，或其它形式的病毒性感染，或巨细胞病毒(CMV)，人免疫缺陷型病毒(HIV)，人乳头状瘤(HPV)，和单纯疱疹病毒I和II(HSV I& II)。
本发明的方法和药剂形式司以与其它治疗结合使用。例如，对于疱疹病毒感染可以使用无环鸟苷或9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基鸟嘌呤]治疗。对于HIV感染可以使用叠氮胸苷(zidovudine)或一种或多种其它的HIV反转录酶抑制剂，和/或HIV蛋白酶抑制剂进行治疗。
在第四个实施方案中，被治疗的疾病是疟疾，如上文所述施用细胞因子。疟疾的病原体可以是三日疟原虫，间日疟原虫，恶性疟原虫，或卵型疟原虫。本发明的方法特别预想到防止疟疾发展到大脑。可任选使用一种抗疟疾的药物，例如氯奎。
本发明的另一个方面是一种药物组合物在哺乳动物口腔粘膜刺激宿主防御机制中的应用，该组合物包含Th1或Th2刺激细胞因子和至少种用于口腔粘膜投送的药学可接受的赋形剂。
如前文所述，在本发明中，作为优选的用于刺激宿主防御机制的方法而提出的实施方案也是Th1或Th2细胞因子在制备用于在哺乳动物中刺激宿主防御机制的口腔粘膜药物中的应用的优选实施方案。
在另一方面，本发明提供了一种口腔粘膜施用的药物组合物，包含至少一种治疗有效量的Th1或Th2特异细胞因子，和适于口腔粘膜施用的药学上可接受的载体。该组合物可以是一种溶液，片剂，锭剂，胶体，糖浆，鼻喷雾剂，鼻滴液，可吸入的配剂，膏，或可控制释放的口腔粘膜投送系统。可任选择的，该组合物可含有缓冲液、稳定剂、增稠剂、吸附剂和增粘剂等。
本方法可以作为单独地作为治疗方案进行实施，或作为放疗，化疗的辅助治疗，或者与一种或多种其它试剂或与干扰素诱导剂或白细胞介素诱导剂一起治疗。在一些情况下，可同时或随后施用多种细胞因子，以利用多种作用机制。
截至目前，我们的结果表明，口腔粘膜施用细胞因子没有显著的毒性，在最差的情况下，仅有轻微的副作用。因而，本发明的方法允许施用Th1或Th2特异性细胞因子的量当胃肠外途径使用相同的细胞因子时为可诱导病理应答的过量剂量。或者，本发明提供了一种通过口腔粘膜施用细胞因子提高特异细胞因子Th1或Th2的治疗指数的方法。
口腔粘膜细胞因子的施用剂量可以低于，等于或高于宿主防御机制产生时胃肠外的剂量水平。具体地说，本发明的优选形式为，总剂量大约是从0.01μg/kg到约150μg/kg。
该细胞因子可任选地与诱导剂，或细胞因子的产生、激活、或释放的增效剂一起施用。诱导剂可以与口粘膜细胞因子一起施用，或分开施用。IL诱导剂是已知的；例如，细菌脂多糖刺激多种IL和其它的细胞因子的释放。
对于特定的疾病，本发明的多种方法，用途和组合物可任选地与一种或多种其它的治疗相组合，在这种情况下，参与治疗的医生和兽医会容易地选择这种其它的治疗。
有关肿瘤疾病的治疗方法的目的在于诱导和/或保持疾病的消退状态。“与其它的治疗相组合”是指在外科手术、放疗或化疗之前，在进行的过程中和/或之后施用细胞因子。最适合的方案依赖于下述的各种因素。
具体地说，优选本发明的方法与选自下组的至少一种其它的治疗相组合：使用细胞静止药物、一种或多种具有抗癌活性但与口腔粘膜细胞因子的作用机制不同的作用机制的其它的细胞因子、抗生血管生成剂、和增强特异的细胞因子的活性的制剂的化疗。优选的第二细胞因子是干扰素α，β，γ，ω或共有的干扰素；优选的血管形成抑制剂是AGM-1470[(氯乙酰)一氯甲基酸(3R-(3α，4α，(2R*，3R*)，5β，6β))-5-甲氧-4-(2-甲基-3-(3-甲氧-2-丁烯基)环氧乙烷基)-1-噁螺环(2，5)辛-6-基酯]。
癌的化疗试剂的实例是一些抗代谢物，例如6-巯基嘌呤，5-氟尿嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷，和这些试剂的代谢物和衍生物。其它的癌的化疗试剂是抗叶酸盐类(antifolates)，例如氨甲喋呤，或从天然产物中得到的试剂，如长春花生物碱，诸如：长春花碱、vincristine和秋水仙碱得到的；亚德里亚霉素，道诺红霉素，doxorubicin，teniposide或etoposide。这种癌症的化疗试剂也包括铂抗癌药物，例如cisplatin和carboplatin。此外本发明的试剂可与环磷酸胺，丁基砜，前卡巴肼，十卡巴肼，亚硝基脲氮芥，lomustine，甲基氯乙胺(mechlorethamine)，苯丁酸氮芥，羟基脲，亚硝基脲及其衍生物，苯丙氨酸氮芥，mitotone，紫杉醇，α-二氟甲基鸟氨酸，和螺锗一起施用。通常使用长春花生物碱，蒽环化的道诺红霉素，doxorubicin和亚德里亚霉素；和鬼臼亚乙苷(etoposide)和表鬼臼毒噻吩糖苷(teniposide)观察到多药物抗性，用抗代谢物和其它的化疗试剂较少观察到多药物抗性。
优选的与细胞因子结合施用的细胞静止药物包括但不限于环磷酸胺，cisplatin，carboplatin，亚硝基脲氮芥(BCNU；N，N-双(2-氯乙基)-N-亚硝基脲)，氨甲蝶呤，亚德里亚霉素，α-二氟甲基鸟氨酸，和5-氟尿嘧啶。
在本发明的药物组合物的制备中，可使用多种细胞因子的载体和赋形剂，这对本领域的普通技术人员是公知的。代表性的配制技术描述于Remington：“药学的科学和实践”，19th ed.，Mack出版公司，Easton，PA，1995，及其以前的版本。细胞因子配方可包含稳定增强剂，如，甘氨酸或丙氨酸，如美国专利No.4,496,537所述，和/或一种或多种载体，如载体蛋白质。例如，用于人的治疗，通常使用药品级人血清白蛋白，可选择磷酸盐缓冲液作为稀释剂一起使用。当细胞因子的赋形剂是人血清白蛋白时，人血清白蛋白可以是从人血清中得到的，或通过重组得到的。
细胞因子可以通过使细胞因子以足以得到所需的刺激的时间与受体的口腔粘膜接触的方式施用。其它的粘膜可能有相似的应答。这样，应当理解，本发明并不限于任何特定类型的配方。本发明说明书中描述了将细胞因子施用到口腔粘膜的深处；这可通过液体，固体，或雾，以及鼻用滴液、喷雾实现。为此本发明包括，但并不限于，液体、喷雾、糖浆、锭剂、口腔药片和喷雾配方。本领域的技术人员会认识到喷雾或喷雾器配方中的颗粒大小是重要的，并且将会知道用适当的方法改变颗粒的大小。优选使用微粒化的配方。
一方面，将细胞因子以单一的剂量施用。或者，该细胞因子可以在一段时间内以低剂量多次施用，并使其总体效果等同于高剂量单次施用。这种投送方式的一个方案是通过提供植入口腔的持续或控制释放器械，以在一段时间内释放细胞因子，其使用量等同于高剂量单次施用。
用于口腔粘膜施用的细胞因子的一个配方示于下文(所有的％是指w/w)：
片剂：葡萄糖(英国药典BP)45％；明胶(BP)30％；小麦淀粉(BP)11％；carmellose sodium(BP)5％；蛋白蛋白(BPC)4％；亮氨酸(USP)3％；丙二醇(BP)2％；细胞因子1％。该片剂在口中能慢慢地溶解或在水里被溶解以及按需要含在口中并与口粘膜接触。
按美国专利No.4,675,184，由甘油45％，羧甲基纤维素钠(CMCNa)2％，柠檬酸缓冲液(pH4.5)25％，加蒸溜水至100％，和1％的细胞因子配制细胞因子膏剂。细胞因子膏剂可粘附在口粘膜上。
同样的，在可从商业途径获得的漱口液或止咳糖浆中加入所需量的细胞因子，以制备成含漱剂或糖浆。
在上述特定的剂量范围内，个案的治疗依赖于疾病的性质，疾病的发展阶段，原先的治疗，其它的后续治疗，哺乳动物的总体健康状态，患者对细胞因子的敏感性等，因此，应当由医生或兽医根据这些情况进行判断。治疗时间当然要根据所治疗的疾病而变化，例如，治疗象前列腺癌那样的生长缓慢的癌与治疗生长迅速的癌，如肝细胞癌相比要涉及不同的治疗疗程。同样的，治疗急性感染，例如由Ebola病毒引起的急性感染与慢性感染，如肝炎相比要涉及不同的疗程。
本文中公开的有效剂量为党胃肠外施用时在哺乳动物中产生病理应答但当通过口腔粘膜施用时为有效的并且是无毒性的或者毒性较小的剂量。病理应答可以是急性的，慢性的，或累积性的，并且可以表现为血液化学的改变，例如白细胞减少，骨髓抑制，或其它组织学参数变化。在本文中，病理学应答包括逆副效应，例如发烧、发冷、厌食、疲劳、不适或类流感的症状，血管的反应，例如静脉炎，以及注射部位局部炎症。考虑到对细胞因子敏感性的个体差异，这种应答在患者人群中会有较大的变化。
对于许多患者来说，口腔粘膜剂量将超过现存的已获批准的胃肠外施用方案中的可耐受的剂量。在一个实施方案中，总剂量可在一段时间内被分成多个低剂量施用，或者甚至可以从一个粘附在或被植入口腔粘膜的控释器械上连续施用或以间断的方式使用。
简而言之，本发明涉及：
一种用于在哺乳动物中刺激宿主防御机制的方法，该方法包含通过口腔粘膜接触向哺乳动物施用刺激量的Th1或Th2刺激细胞因子。
一种在哺乳动物中刺激免疫应答的方法，包括通过口腔粘膜接触向哺乳动物施用刺激量的Th1或Th2剌激细胞因子。
一种所说的方法，其中所说的量按每公斤体重是从0.01μg至约150μg细胞因子。
所述的方法，其中细胞因子的有效量是以一个单一剂量施用的。
所述的方法，其中细胞因子的有效量是在一段足以引发与单一剂量产生的刺激相当的刺激的时间内以多个小剂量的形式施用的。
一种用于在哺乳动物中刺激宿主防御机制的方法，该方法包含通过口腔粘膜接触向哺乳动物施用刺激量的Th1刺激细胞因子。
一种在哺乳动物中刺激免疫应答的方法，包括通过口腔粘膜接触向哺乳动物施用刺激量的Th1刺激细胞因子。
一种所说的方法，其中所说的量按每公斤体重是从0.01μg至约150μg细胞因子。
所述的方法，其中细胞因子的有效量是以一个单一剂量施用的。所述的方法，其中细胞因子的有效量是在一段足以引发与单一剂量产生的刺激相当的刺激的时间内以多个小剂量的形式施用的。
所述的方法，其中细胞因子的有效量是在一段足以引发与单一剂量产生的刺激相当的刺激的时间内连续施用的。
一种用于在哺乳动物中治疗肿瘤疾病的方法，该方法包含通过口腔粘膜接触向哺乳动物施用有效量的Th1刺激细胞因子，以及一种所说的方法，其中细胞因子包括干扰素-α，干扰素-β，干扰素-ω，干扰素-γ，白细胞介素-2，白细胞介素-12，白细胞介素-15，白细胞介素-18，肿瘤坏死因子β，或者粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
一种用于治疗病毒感染的方法，该方法包含通过口腔粘膜接触向哺乳动物施用有效量的Th1剌激细胞因子，以及一种所说的方法，其中细胞因子包括干扰素-α，干扰素-β，干扰素-ω，干扰素-γ，白细胞介素-2，白细胞介素-12，白细胞介素-15，白细胞介素-18，肿瘤坏死因子β，和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
一种用于在哺乳动物中治疗过敏性疾病的方法，该方法包含通过口腔粘膜接触向哺乳动物施用有效量的Th1细胞因子，以及一种所说的方法，其中细胞因子选自：干扰素-α，干扰素-β，干扰素-ω，干扰素-γ，白细胞介素-2，白细胞介素-12，白细胞介素-15，白细胞介素-18，肿瘤坏死因子β，和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
一种用于治疗哮喘的方法，该方法包含通过口腔粘膜接触向哺乳动物施用有效量的Th1细胞因子，以及一种所说的方法，其中细胞因子选自：干扰素-α，干扰素-β，干扰素-ω，干扰素-γ，白细胞介素-2，白细胞介素-12，白细胞介素-15，白细胞介素-18，肿瘤坏死因子β，和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
一种用于治疗特应性皮炎的方法，该方法包含通过口腔粘膜接触向哺乳动物施用有效量的Th1细胞因子，以及一种所说的方法，其中细胞因子选自：干扰素-α，干扰素-β，干扰素-ω，干扰素-γ，白细胞介素-2，白细胞介素-12，白细胞介素-15，白细胞介素-18，肿瘤坏死因子β，和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
一种用于在哺乳动物中刺激宿主防御机制的方法，该方法包含通过口腔粘膜接触向哺乳动物施用刺激量的Th2刺激细胞因子。
一种在哺乳动物中刺激免疫应答的方法，包括通过口腔粘膜接触向哺乳动物施用刺激量的Th2刺激细胞因子。
一种所说的方法，其中所说的量按每公斤体重是从0.01μg至约150μg细胞因子。
所述的方法，其中细胞因子的有效量是以一个单一剂量施用的。
所述的方法，其中细胞因子的有效量是在一段足以引发与单一剂量产生的刺激相当的刺激的时间内以多个小剂量的形式施用的。
所述的方法，其中细胞因子的有效量是在一段足以引发与单一剂量产生的刺激相当的刺激的时间内连续施用的。
一种用于在哺乳动物中治疗自体免疫疾病的方法，该方法包含通过口腔粘膜接触向哺乳动物施用有效量的Th2刺激细胞因子，以及一种所说的方法，其中细胞因子选自：白细胞介素-4，白细胞介素-5，白细胞介素-10，白细胞介素-13。
所述的方法，其中细胞因子包括重组细胞因子。
Th1或Th2细胞因子在制备用于在哺乳动物中刺激宿主防御机制的口腔粘膜药物中的应用。
一种用于在哺乳动物中口腔粘膜刺激宿主的防御机制的药物组合物，该组合物含有TH1或TH2剌激细胞因子和至少一种用于口腔粘膜投送的药学上可接受的赋形剂。
一种适于口腔粘膜施用的单位剂量形式的药物组合物，包含约0.01μg至约10000μg的TH1或TH2刺激细胞因子和药学上可接受的载体，并且所说的组合物含有约10μg至约10000μg的细胞因子。
所说的组合物包含TH1细胞因子。
所说的组合物包含TT12细胞因子。
细胞因子配方
天然鼠干扰素-α/β
天然鼠干扰素-α/β是由用Newcastle Disease Virus(NCV)病毒诱导的C243-3细胞培养物制备的，并按以前的描述(Tovey等，Proc.Exp.Biol.Med.，1974，146：406-415)进行纯化。本研究中使用的制备物(批号：T638)的效价是1×106IU/ml，比活是5×107IU/mg蛋白，这是用Vesicular Stomatitis Virus(VSV)病毒至敏鼠L929细胞进行测定的(Tovey等，Proc.Exp.Biol.Med.，1974，146：406-415)，而且与美国国家卫生院(NIH)的鼠干扰素α/β国际参考制剂的标准(G-002-9004-5411)进行标准化。
重组鼠白细胞介素-2
重组鼠白细胞介素2(IL-2)购自R&D Systems，Inc.(Minneapolis，MN)。本研究中使用的制剂(批号：MX056111)的纯度用SDS-PAGE测定大于97％，用IL-2依赖性鼠细胞毒T-细胞系CTLL-2的细胞增殖检测测得的ED50是0.1-0.4ng/ml。
重组鼠白细胞介素-4
重组鼠白细胞介素-4(IL-4)购自蛋白质研究公司(Protein InstituteInc.Paris，France)。本研究中使用的制剂(批号No.P200M-04)，用SDS-PAGE和N-末端序列分析测得的纯度大于98％。该制剂的ED50是2.0ng/ml。
重组鼠白细胞介素-5
重组鼠白细胞介素-5购自R&D Systems Inc.。本研究使用的制剂(批号No.405-ML-025)用SDS-PAGE测定纯度大于97％，ED50是0.04至0.15ng/ml。
重组鼠白细胞介素-10
重组鼠白细胞介素-10(IL-10)购自蛋白质研究公司(ProteinInstitute Inc.)。本研究使用的制剂(批号No.P200M-10)用SDS-PAGE和N-末端序列分析测得的纯度大于98％。该制剂的ED50是2.0ng/ml。
重组鼠白细胞介素-12
重组鼠白细胞介素-12(IL-12)购自R&D Systems Inc.。本研究使用的制剂(批号No.PB01711)用SDS-PAGE测定纯度大于97％，ED50是0.05至0.2ng/ml，测定方法同上。
重组鼠白细胞介素-13
重组鼠白细胞介素-13(IL-13)购自R&D Systems Inc.。本研究使用的制剂(批号No.413-ML-025)用SDS-PAGE测定纯度大于97％，ED50是3至6ng/ml。
重组鼠白细胞介素-15
重组鼠白细胞介素-15(IL-15)购自蛋白质研究公司(ProteinInstitute Inc.)。本研究使用的制剂(批号No.P200-15)用SDS-PAGE和N-末端序列分析测得的纯度大于98％。该制剂的ED50小于0.5ng/ml，相应于比活2×106单位/mg。
重组鼠白细胞介素-18
重组鼠白细胞介素-18(IL-18)购自蛋白质研究公司(ProteinInstitute Inc.)。本研究使用的制剂(批号：P200-18)用SDS-PAGE和HPLC分析测得的纯度大于98％。本研究使用的制剂的ED50是5ng/ml。
重组鼠的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
重组鼠的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)购自蛋白质研究公司(Protein Institute Inc.)。本研究使用的制剂(批号No.P300M-03)用SDS-PAGE和N-末端序列分析测得纯度大于98％。该制剂的ED50为0.1ng/ml。
鼠的干扰素α/β，重组鼠IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-18，和CM-CSF在施用前用FerimmuneTM赋形剂处理。
赋形剂
用含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)或如下所述的专用赋形剂稀释细胞因子制剂。牛血清白蛋白V部分(RIA级；无免疫球蛋白；产品号No.A7888；Sigma，USA)用pH7.4的PBS缓冲液稀释，最终浓度为100μg/ml，而且通过过滤除菌(0.2μm，Millex-GV，Millipore，USA)。
本文描述的大多数实验中，细胞因子制剂是用专用赋形剂进行稀释。所使用的赋形剂如下所示，以片剂的形式(FerimmuneTM，PharmaPacific)提供：
  ％w/w   mg/片
  葡萄糖BP**   44.67***   55.84
  白明胶BP**   30.06   37.58
  小麦淀粉BP**   11.31   14.14
  Carmellose Sodium BP**   4.96   6.20
  卵白蛋白BPC**   4.03   5.04
  亮氨酸USP   3.00   3.75
  丙二醇BP   1.88   2.35
  葡聚糖40**(医用葡聚糖BP)   0.06   0.08
  磷酸钠BP   0.03   0.04
  氯化钠BP   0.01   0.01
  磷酸二氢钠BP   0.01   0.01
  总计   100.02   125.04
**以无水计算
***得自44.64％的葡萄糖(无水葡萄糖)BP和0.03％的葡萄糖(葡萄糖40注射级BP)
将一个FeximmuneTM片剂赋形剂(批号：B09002，失效日1997年9月)溶解在一个2ml Eppendorf离心管中的1.5ml PBS中，并在室温下在一个旋转(底对底)混合器上振荡3小时。然后将悬浮液在16000g离心15分钟，回收上清液。在使用之前每日制备FerimmuneTM赋形剂。
II投送系统
初步的试验表明用P20安培道夫微量吸管向普通成年鼠的每一鼻孔施用5μl结晶紫，结果立即产生遍布整个口咽腔的表面的着色分布。施用染料30分后口咽腔的着色仍然是明显的。在所有其后的实验中都是采用这种施药的方法。
III实验材料
(1)脑心肌炎病毒EMCV
批号：No.095001
有效期：1997年12月
制备：EMCV株系JH是在鼠L929细胞上按照Gresser I，Bourali C，Thomas MT，Falcoff E，感染脑心肌炎病毒鼠反复接种干扰素制剂的效果，Proc Soc Exp Biol Med 1968 Feb；127：491-6中所述的方法进行繁殖的。
特征：本研究中使用的病毒贮存液在鼠L929细胞测得的滴度是5×108.62TCID50。
(2)弗兰德红白血病细胞
弗兰德红白血球细胞(FLC)的抗干扰素-α/β-抗性克隆，3C18，是从Dr.E.Affabris，Rome得到的，并描述于Affabris等，1982年(病毒学，120：441-452)。其后将这些细胞维持在体内传代。简而言之，用大约100倍半至死剂量的3C18通过腹膜注射接种鼠DBA/2，一周后从鼠腹膜收获瘤细胞，计数后用100LD50的3C18细胞接种另外的鼠。这一程序重复60至100次传代。已经表明用第60次至100次传代的3C18细胞对肝和脾有高的转移性(Gresser等，Int.J.Cancer，198739：789-792)。常规地用体内传代的细胞在体外在干扰素-α/β存在的情况下进行培养，证实了IFN抗性的表型(Belardelli等，Int.J.Cancer，198230：813-820)。
IV.实验动物
本发明使用的鼠得自特别无病原的品系(IFFA CREDO，法国)。按照EEC标准，将它们饲养在法国国家研究院(CNRS)Federatif研究所无病原菌的动物房中。
实施例1
IL-2和IL-12对致死剂量的脑心肌炎病毒的(EMCV)接种的小树的作用
用100倍半致死剂量的脑心肌炎病毒(EMCV)感染十组六周龄的瑞士雄鼠。病毒感染一小时后，对这些鼠或者不予治疗，或者通过鼻/口的途径用10μl的Ferimmune赋形剂中的重组鼠IL-2或重组鼠IL-12，或单独用10μl赋形剂(对照)，或用200μl的赋形剂腹内膜注射，或单独用200μl赋形剂进行治疗，每日一次，共四天。
通过鼻/口的途径每天用2μg重组鼠IL-2治疗成年鼠共4天结果增加了用EMCV致死剂量注射的动物存活的百分数。高达40％被治疗的动物在用致死剂量的EMCV感染100天后仍然存活，在所有未经治疗的或者用赋形剂治疗的状况下，病毒感染的动物在第6天死亡。
通过鼻/口途径用重组鼠IL-2治疗的成年小鼠从感染致死剂量的EMCV存活的百分比显著提高。从致死剂量的EMCB存活的动物的百分比的提高依赖于通过鼻/口途径施用的IL-2的剂量。因而，通过鼻/口途径用1微升的重组鼠IL-2治疗成年小鼠，每天一次，共4天，得到的动物的存活率为60％。IL-2治疗的动物在用致死剂量的EMCV感染100天后仍然存活和健康，而没有治疗的，或赋形剂治疗的病毒感染的动物在第6天死亡。相比之下，通过鼻/口途径每天用0.1微克的重组鼠IL-2治疗成年鼠，共4天，并没有明显地提高致死剂量的EMCV感染的动物的存活率。
通过鼻/口途径每天用0.1或1μg的重组鼠IL-2进行治疗的动物没有表现可检测到的任何毒性的征兆。然而，通过鼻/口途径用3μg重组IL-2高剂量治疗动物，观察到急毒性征兆，表现为战栗、嗜睡、竖毛。
通过鼻/口途径用重组鼠的IL-12治疗成年瑞士鼠也发现能够提高用致死剂量的EMCV感染动物的存活百分率，尽管与相同剂量的重组IL-2相比程度较低。这样，通过鼻/口途径每天用2μg重组鼠IL-2治疗成年瑞士鼠，共4天，结果用致死剂量的EMCV感染的动物在100天时的存活率为大约20％。
临床观察表明，所有的在100天时存活的用IL-2和IL-12治疗的动物将仍然存活。
类似地，通过腹内膜途径用重组鼠IL-2治疗成年鼠，结果用致死剂量的EMCV感染的动物存活的百分数的提高取决施药剂量。这样通过腹内膜途径每天用0.1μg重组鼠IL-2共4天治疗动物并没有明显提高病毒感染的动物的存活率，而通过腹内膜途径每天用1μg或3μg的重组鼠IL-2共4天治疗鼠，导致用致死剂量的EMCV感染的动物分别有40％和70％存活。
本文中给出的这些实验结果表明，口粘膜途径提供了一种以高剂量的IL-2并具有可接受的毒性的施药方法。这样，通过鼻/口途径每日用0.1或1μg的重组鼠的IL-2对动物治疗4天没有表现出任何可检测的毒性征兆。根据体重(成年鼠0.025公斤，成人体重60公斤)，这分别相当于大约0.24mg和2.4mg对于人的剂量，或者相当于通过胃肠外途径施用IL-2的最高耐受量的24和240倍(Huland等，1994，J.Cancer Res.，Clin.Oncol.，120，221-228)。
实验结果表明，口粘膜途径提供了一种没有明显毒性的施用IL-2和IL-12的有效方法。这些结果对临床使用IL-2和IL-12作为抗毒剂有重要的指导作用。
实施例2
IL-2和IL-12对用高转移性的弗兰德白血病细胞接种的小鼠的作用
将十组6周龄的DBA/2小鼠在第0天用大约等于20000倍半致死剂量的105弗兰德白血病细胞(抗干扰素克隆3C18)通过静脉内接种。将接种瘤的鼠或者不予以治疗，或者通过鼻/口途径用10μl Ferimmune赋形剂中的重组鼠IL-2或重组鼠IL-12或仅用10μl的赋形剂(对照)每天治疗二次，共20天。
通过鼻/口途径用2μg的重组鼠IL-2，每天二次治疗成年鼠共治疗二十天，结果导致用大约20000倍半致死剂量的弗兰德白血病细胞接种的动物存活时间显著延长。尽管不用IL-2治疗，接种肿瘤的动物可存活32天以上，但通过鼻/口途径用2μg的重组鼠IL-2，每天二次治疗成年鼠DBA/2共治疗二十天，其存活时间的延长相对于没任何治疗或赋形剂治疗的接种肿瘤的动物(平均天数，13.8±0.13天)具有统计学上的显著性(治疗过的死亡平均天数，22.6±2.08天)。
通过鼻/口途径用重组鼠IL-12治疗成年DBA/2鼠也发现用致死剂量的弗兰德白血病细胞接种动物的存活时间延长，尽管比用相同量的IL-2存活程度较低。尽管不用IL-12治疗，肿瘤接种动物的存活时间可超过20天，通过鼻/口途径用2μg的重组鼠IL-12，每天施药二次共施药20天治疗成年鼠DBA/2，与未经治疗的或用赋形剂治疗的接种肿瘤细胞的动物(平均死亡天数，13.8±0.13天)相比，存活时间的延长在统计学上具有显著性(平均死亡天数，15.9±0.56天)。
实验结果表明，重组鼠的IL-2对用高度转移性的弗兰德白血病细胞接种的鼠在通过鼻/口途径施药后有明显抗肿瘤活性。这些结果值得引人注目的是，按照以前的报道，全身性施用的重组IL-2对提高通过静脉内接种弗兰德白血病细胞的小鼠的存活时间没有任何效果(Belardelli等，1989，Int.J.Cancer，44：1108-116)。这些结果也表明口粘膜途径提供了有效的无明显毒性的施药IL-2的方法。
实施例3
IL-2和IFN的组合对用致死剂量的EMCV接种的小鼠的效果
将十组，六周龄雄性瑞士鼠用100倍EMCV的半致死剂量接种。病毒感染一小时后，将这些小鼠或者不进行治疗，或者通过鼻/口或腹膜内途径施用赋形剂FerimmuneTM中的1.0μg的重组鼠IL-2，103IU的鼠干扰素α/β，或相同剂量的重组鼠IL-2和鼠干扰素α/β，或用单独的等体积的赋形剂(对照)治疗4天，每天一次。或者，用相同剂量的重组鼠IL-2，鼠干扰素α/β，或重组鼠IL-2和鼠干扰素α/β通过腹膜内注射治疗小鼠。
为了测定重组鼠的IL-2与鼠的干扰素α/β在一起施用是否产生附加的或甚至是协同的抗病毒效果，先通过鼻内/口途径用重组鼠IL-2进行治疗，30分钟后用干扰素α/β进行治疗。通过鼻/口途径用重组鼠IL-2与鼠干扰素α/β通过鼻/口途径一起施用提高了致死剂量的EMCV感染的动物的存活百分数。因而，通过鼻/口途径用1μg的重组鼠IL-2接着用103IU的鼠干扰素α/β对成年鼠进行一天一次，共计4天的治疗导致用致死剂量的EMCV感染的动物有80％的存活率。
通过腹内膜途径使用1.0μg的重组鼠IL-2，30分钟后用103 IU的干扰素α/β治疗成年鼠导致用致死剂量的EMCV感染的动物有80％的存活。
通过鼻内/口的途径或腹内膜的途径用1μg的重组鼠IL-2，1000IU的干扰素α/β，或者重组鼠IL-2和干扰素α/β两者结合，治疗四天，每天一次，动物没有表现出任何可检出的中毒的征兆。
实施例4
Th1和Th2细胞因子对用致死剂量的EMCV接种的小鼠的效果
将10组，6周龄的瑞士雄鼠用100倍致死剂量的EMCV进行感染。病毒感染后，将鼠或者不予治疗，或者通过鼻内的/口途径用在体积为10μl的Freimmune赋形剂中的鼠IFN α/β，重组鼠IL-2，IL-4，IL-10，IL-12，或IL-15或单独用10μl的赋形剂作对照每天治疗一次，共计4天。
成年鼠通过鼻/口的途径用鼠干扰素α/β进行治疗导致用EMCV致死剂量感染的动物存活的百分数明显提高。用致死剂量的EMCV感染的动物用1000IU的鼠干扰素α/β治疗后，其中的百分之五十在86天时仍然存活，在所有没有接受治疗或者用赋形剂治疗的情况下，感染病毒的动物七天死亡。通过鼻/口途径每天用1μl的重组鼠的IL-2对成年鼠治疗4天导致致死剂量的EMCV感染的动物的存活率明显提高。病毒感染后86天，用重组鼠IL-2通过鼻/口途径治疗的结果是30％的动物仍然存活。同样，通过鼻/口途径用1μg的重组鼠IL-15对成年鼠每天一次共计4天的治疗导致致死剂量的EMCV感染的动物有30％的存活率。用1μg的重组鼠GM-CSF通过鼻/口途径对成年鼠治疗4天每天一次导致用致死剂量的EMCV感染的动物也有20％的存活率。
通过鼻/口途径用重组鼠IL-12治疗成年的瑞士鼠也被发现提高了用致死剂量的EMCV感染的动物的存活率，尽管比施用相同量的IL-2或IL-15存活程度较低。用1μg的重组鼠IL-12通过鼻/口途径每天一次通过鼻口内的/口的途径对成年鼠治疗4天导致用致死剂量的EMCV感染的动物大约有20％的存活率。
临床观察表明，所有干扰素治疗的，IL-2，IL-12和IL-15治疗的和GM-CSF治疗的在86天存活的动物将继续存活，并具有正常的寿命。
相反，用1μg重组鼠IL-4或IL-10通过鼻/口途径每天一次对动物治疗4天没有使用致死剂量的EMCV感染的动物的存活率显著提高。所有的IL-4和IL-10治疗的鼠在病毒感染后8天死亡，也就是说在病毒感染动物未经治疗或用赋形治疗的24小时内。
实施例5
Th1和Th2细胞因子对用致死剂量的EMCV接种的动物的效果
将10组，6周龄瑞士鼠用100倍LD50的EMCV进行感染。病毒感染后，将鼠或者不予治疗，或者通过鼻/口途径用体积为10μl的Ferimmune赋形剂中的鼠IFN α/β，重组鼠IL-5，IL-13，或IL-18，或单独用10μl的赋形剂作为对照，每天治疗一次，共计4天。
成年鼠通过鼻/口途径用鼠干扰素α/β进行治疗导致用致死剂量的EMCV感染的动物存活率明显提高。在致死剂量的EMCV感染后52天，用1000IU的鼠干扰素α/β治疗的动物百分之五十仍然存活，在所有没有接受治疗或者用赋形剂治疗的情况下，感染病毒的动物在第六天死亡。通过鼻/口途径每天用1μg的重组鼠IL-18对成年鼠治疗4天导致用致死剂量的EMCV感染的动物存活率也产生明显的提高。病毒感染后52天，通过鼻/口途径用重组鼠IL-18治疗的动物，其中20％存活。
临床观察表明，所有的在第52天存活的用干扰素和IL-18治疗的动物将仍然存活，并具有正常的寿命。
相反，通过鼻/口途径用1μg的重组鼠IL-5，或IL-13治疗4天每天施药一次，导致EMCV的致死剂量感染的动物的存活率没有明显提高。所有用IL-5和IL-13治疗的鼠在病毒感染后低9天死亡，即在病毒感染的动物未经治疗或用赋形剂治疗的72小时内。
通过鼻/口途径，用1000IU的IFN α/β或1μg的重组鼠IL-5，IL-13或IL-18每天一次治疗4天，没有一个动物表现出可检测到的中毒征兆，表明口腔粘膜途径提供了一种有效的没有明显毒性的施用细胞因子的方法。
IL-4和IL-10，两者都是Th2反应的有效刺激子，在通过鼻/口途径施用后发现它们缺乏抗病毒的活性，表明在口腔粘膜施用后在诱导Th1的活性和诱导抗病毒活性之间存在密切的联系。
实施例6
IFN对用豚草花粉致敏的鼠的效果
本研究中所使用的干扰素α/β制剂(批号：RT6)用泡状口炎病毒(Vesicular Stomatitis virus，VSV)接种的鼠L929细胞测得的滴度是1×107IU/ml，比活是5×107IU/mg蛋白。(Tovey等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1974，146：406-415)
施药前将鼠IFN α/β溶在牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲液赋形剂(BSA/PBS)中。
将四组，八周龄瑞士或Balb/c雄鼠用200μg非脱脂无热原豚草花粉变应原(Greer Laboratories，Lenoir，USA)以明矾(Imject Alum，PierceLaboratories)为辅剂在第0天和第4天通过腹膜内注射进行免疫。然后，在第11天通过气管内途径用CoCa氏缓冲液(0.085M NaCl，0.064MNaHCO3，pH8.1)中的200μg的豚草变应原将小鼠致敏。用1000IU在10μl模拟干扰素中的鼠IFNα/β，或单独地用10μl模拟干扰素(Tovey等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1974，146：406-415)通过口腔粘膜途径从0到第6天每天一次进行试验组动物的治疗。另外的组用200μl的模拟干扰素中的103IU的鼠IFN α/β或单独的200μl模拟干扰素(对照)通过腹膜内的方式从0始至第六天每天一次进行治疗。也用10μl或200μl模拟干扰素中的1000IU鼠IFN α/β，或单纯用10μl或200μl模拟干扰素(对照)分别通过口粘膜或腹内膜途径治疗试验组动物，在第11天治疗2次，第12天治疗一次。将其它一些组的试验动物在第0天至第六天和第11天至第12天进行上述治疗。在第十四天将所有的试验动物杀死，并收集外周血样和支气管肺泡(BAL)的洗涤样。
将外周血样收集在含有EDTA(B.D.，产品号No.367624)的真空管中，在4℃，800xg离心10分钟，收集血清，用酶连免疫吸附测定(ELISA)分析豚草花粉特异抗体IgG或IgE的存在。
总而言之，用PBS按1∶100预稀释血清样品，再用0.1M NaHCO3 pH8.5在豚草花粉(20μg/ml)包被的微孔滴度板(Maxisorb，Nunc)中进行系列稀释。用碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG或生物素结合的大鼠单克隆抗小鼠IgE抗体，接着用碱性磷酸酶结合的链霉抗生素分别地检测豚草特异性IgG或IgE。用平行的样品测定平均光吸收(405nm)。
在第0天和第4天通过腹膜内注射用无热源豚草花粉变应原免疫8周龄Balb/c雄鼠，接着在11天通过气管内接种，在第14天测定，产生了高水平的IgG或IgE豚草花粉特异性抗体。
从0至6天和在第11天至12天，每天一次用1000IU的鼠IFNα/β通过口粘膜途径对动物治疗，与用模拟干扰素治疗的动物相比，导致IgE变应原特异抗体的产生出现了明显地抑制作用。口粘膜干扰素治疗尽管比抑制IgE应答的程度较低但还是抑制了变应原特异抗体IgG应答。用1000IU的鼠IFN α/β通过口粘膜的途径仅从0至6天或仅在11天至12天给动物施药，与合并施药的结果相比，抗体产生的抑制作用不明显。
用1000IU的鼠IFN α/β，从0至第6天和11-12天，或仅在11至12天通过口粘膜途径每天一次对动物进行治疗，与用1000IU的鼠IFNα/β通过动物腹内膜注射相比，导致对IgE变应原特异性的抗体形成产生了较大的抑制作用。
用1000IU的鼠IFNα/β，从0至第6天加上第11至第12天，每天一次通过口粘膜途径对动物进行治疗，与用模拟干扰素治疗的动物相比，导致存在于外周血的嗜曙红细胞的数目产生了三倍的抑制。用1000IU的鼠IFNα/β通过口粘膜的途径进行动物治疗与用1000IU的鼠IFNα/β腹膜内注射动物相比，导致嗜署红细胞的数目产生了二倍以上的显著抑制。用1000IU鼠IFNα/β仅在第11和第12天通过口粘膜或腹膜内途径对动物进行治疗，结果没有对存在于外周血中循环的嗜曙红细胞的数目产生任何可检到的抑制作用，而且在口粘膜干扰素治疗的情况下相对于用模拟干扰素治疗，其嗜曙红细胞的百分数甚至略有增加。
口粘膜的IFNα治疗对变应原特异性IgE应答，和变应原诱导的嗜曙红细胞量，与以前报导的在相同的变应原诱导的哮喘动物模型中用IL-12测试相比好像是不太明显(Sur等，J.Immunol，1996，157，4173-4180)。对于较高剂量的IFN可能会观察到比本文描述的使用相对低的单一的1000IU剂量具有较大的效果，按体重的比例比Sur等使用的IL-12低200倍(J.Immunol.，1996，157，4173-4180)。当在过敏阶段的早期进行治疗时，尽管IL-12是变应原诱导的特应性哮喘的动物模型中被测定为最有效的细胞因子之一，但是，在肺部超敏炎症响应的疾病发展的后期进行治疗，IL-12在降低变应原特异性IgE反应中总体上是无效的。相反，口粘膜干扰素α治疗，即使在疾病的发展后期开始治疗，在降低变应原特异性IgE应答中它也是有效的。还有，肾癌患者临床使用IL-12具有很大的毒性(Cohen，J.，Science，1995，270，908)。
本研究的结果表明用普通的人的豚草花粉变应原致敏的动物中，通过口粘膜的IFNα治疗明显地降低了变应原特异性IgE应答和变应原诱导的嗜曙红细胞量。口粘膜的IFN治疗特应性哮喘的效果表明口粘膜IFNα治疗可以在哮喘病的治疗上得到应用，尽管由鼠的模型外推到临床环境，甚至当使用普通的人的变应原时还是应当持慎重态度。
Th1特异性细胞因子在口粘膜途径施药后的表现表明口腔粘膜施用细胞因子可被用于诱导全身性Th1活性，已知它在防御病毒感染和肿瘤疾病中其着重要的作用。
口腔粘膜施用生物活性的但具有较差的耐受性的Th1细胞因子对于治疗病毒和肿瘤疾病是相当重要的。口腔粘膜施用Th1细胞因子也可用于治疗诸如哮喘和适应性皮炎的疾病。口腔粘膜施用Th2细胞因子已显示出在治疗对口腔粘膜Th1细胞因子应答的癌症和病毒疾病中是无效的。这一结果与已知的Th1和Th2在宿主防御机制中的作用相一致。对Th2细胞因子应答的疾病是那些具有Th1过刺激的特征的疾病，例如，自身免疫疾病类。口腔粘膜施用Th2细胞因子可应用于治疗类风湿关节炎，I型糖尿病，狼疮，多发性硬化症和牛皮癣。

Claims (22)

1.TH1或TH2刺激细胞因子在制备通过与哺乳动物口粘膜接触而刺激宿主防御机制的药物中的用途，所述哺乳动物具有会受益于TH1刺激或TH2刺激的疾病，所述口粘膜接触是以提供与受体口粘膜腔接触足以获得所需的刺激的时间的方式进行，其中通过与具有会受益于TH1刺激的疾病的哺乳动物口粘膜接触而刺激宿主防御机制的TH1刺激细胞因子选自IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、TNF-β和GM-CSF，且其中通过与具有会受益于TH2刺激的疾病的哺乳动物口粘膜接触而刺激宿主防御机制的TH2刺激细胞因子选自IL-4、IL-5、IL-10和IL-13。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞因子为TH1刺激细胞因子，和所述哺乳动物为具有会受益于TH1刺激的疾病的哺乳动物。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述会受益于TH1刺激的疾病选自肿瘤疾病、病毒性疾病、过敏性疾病、哮喘和特应性皮炎。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述疾病选自肿瘤疾病和病毒性疾病。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述疾病为肿瘤疾病。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述疾病为病毒性疾病。
7.根据权利要求3所述的用途，其中所述疾病选自过敏性疾病、哮喘和特应性皮炎。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述疾病为过敏性疾病。
9.根据权利要求7所述的用途，其中所述疾病为哮喘。
10.根据权利要求7所述的用途，其中所述疾病为特应性皮炎。
11.根据权利要求2所述的用途，其中所述药物包含待治疗的哺乳动物每公斤体重约0.01μg至约150μg的有效量的细胞因子。
12.根据权利要求2-11中任何一项所述的用途，其中所述药物含有有效量的细胞因子，所述细胞因子的量非常大，以至于如果胃肠外施用将会产生病理反应。
13.根据权利要求2-11中任何一项所述的用途，其中所述有效量的细胞因子以单剂量施用。
14.根据权利要求2-11中任何一项所述的用途，其中所述有效量的细胞因子是在一段足以产生与单一有效量产生的刺激相当的刺激的时间内以多个剂量的形式施用的，每个剂量小于有效量。
15.根据权利要求2-11中任何一项所述的用途，其中所述有效量的细胞因子是在一段足以产生与单一有效量产生的刺激相当的刺激的时间内连续施用的。
16.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞因子为TH2刺激细胞因子，和所述哺乳动物为具有会受益于TH2刺激的疾病的哺乳动物。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述会受益于TH2刺激的疾病为自身免疫性疾病。
18.根据权利要求16所述的用途，其中所述药物包含待治疗的哺乳动物每公斤体重约0.01μg至约150μg的有效量的细胞因子。
19.根据权利要求16-18中任何一项所述的用途，其中所述药物含有有效量的细胞因子，所述细胞因子的量非常大，以至于如果胃肠外施用将会产生病理反应。
20.根据权利要求16-18中任何一项所述的用途，其中所述有效量的细胞因子以单剂量施用。
21.根据权利要求16-18中任何一项所述的用途，其中所述有效量的细胞因子是在一段足以产生与单一有效量产生的刺激相当的刺激的时间内以多个剂量的形式施用的，每个剂量小于有效量。
22.根据权利要求16-18中任何一项所述的用途，其中所述有效量的细胞因子是在一段足以产生与单一有效量产生的刺激相当的刺激的时间内连续施用的。
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