KR102220006B1

KR102220006B1 - 자가면역 - 관련 또는 염증성 장애를 치료하기 위한 저용량 ｉｌ２ 의 용도

Info

Publication number: KR102220006B1
Application number: KR1020137026950A
Authority: KR
Inventors: 다비 크라츠망; 다비 사두; 파뜨리스 까꾸; 미셸 로상즈와지; 에리아네 피아기오; 질베르 벤시몽; 끌로드 베르나르
Original assignee: 아시스땅스 퍼블리끄-오삐또 드 빠리; 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔); 쏘흐본느 유니베흐시테
Priority date: 2011-03-11
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2021-02-24
Also published as: JP6054889B2; JP2023029565A; MX347324B; DK2683395T3; AU2018206705A1; AU2016273847A1; AU2012228418A1; CN109432407A; AU2012228418B2; AU2020204023A1; DK3443979T3; US20230149512A1; AU2018206705B2; MX2013010342A; JP2014510725A; EP3443979A1; EP3443979B1; AU2020204023B2; KR20140053869A; ES2693645T3

Abstract

본 발명은 자가면역 및 염증성 질환의 신규한 치료 요법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 제 I 형 당뇨병 및 기타 자가면역 및/또는 염증성 질환의 치료를 위한 저용량 인터류킨-2 의 용도에 관한 것이다.

Description

자가면역 - 관련 또는 염증성 장애를 치료하기 위한 저용량 ＩＬ２ 의 용도 {USE OF LOW DOSE IL-2 FOR TREATING AUTOIMMUNE - RELATED OR INFLAMMATORY DISORDERS}

본 발명은 인간 질환의 신규한 IL-2-기반 요법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인간 대상에서 자가면역, 면역-관련, 또는 염증을 포함하는 염증성 질환의 저용량 IL-2 요법에 관한 것이다.

인터류킨-2 (Interleukin-2) (IL-2) 는 거의 30 년 전에 식별되었고 [1], 원래 시험관내에서 T 림프구를 자극하는 그것의 능력 때문에 T 세포 성장 인자로 호칭되었다. 그것은 분자량이 대략 13kda ~ 17kda [2] 등전점이 대략 6 ~ 8.7 으로 보고된 단백질이다.

IL-2 는 암 및 감염성 질환에서 효과기 면역 반응을 부스팅하기 위해 임상에서 사용되어 왔다 [3, 4]. 그것은 현재 암의 치료를 위한 인간에서의 사용이 승인되었다.

그것의 등록된 용도 (indications) 중 하나인, 신세포 암종 (renal cell carcinoma) (RCC) 의 보조 치료에서, 환자의 10% 미만이 치료에 반응한다. IL-2 의 이러한 제한된 효능은 현재 부분적으로, 항-종양 효과기 반응을 억제하는 것으로 알려진, 조절성 T 세포 (regulatory T cell) (Treg) 의 말초 생존 및 억제 기능에서도 IL-2 가 중요한 역할을 수행한다는 최근의 발견에 의해 설명된다 [5, 6].

사실, IL-2/IL-2 수용체 (IL-2R) 신호전달은 효과기 T 세포 (effector T cell) (Teff) 및 Treg 둘다의 면역 반응 동안 중요하다. 한편으로는, 광범위한 IL-2R 신호전달은 증강된 기능적 활성을 나타내는 말기 분화성 단수명 Teff 세포의 발달, 및 적절한 T 세포 기억의 유발에 필수적이다 [7]. 다른 한편으로는, IL-2/IL-2R 신호전달은 Treg 발달 및 항상성에 필수적이며, 이는 IL-2 녹-아웃 마우스가 Treg 를 결여한다는 사실로 나타난다. 특히, IL-2 또는 IL-2R 결핍 마우스는 효과기 면역 반응을 서서히 증가시킬 수 있으며, 이는 중증 T-세포 매개성 자가-면역 질환 (AID) 의 발달에 의해 명백히 입증된다.

IL-2 신호전달 이상의 이러한 상이한 결과는 현재 IL-2/IL-2R 신호전달의 정량적 및 정성적 차이 둘다가 Treg 및 Teff 를 조절하는 사실에 의해 설명된다. Treg 는 그의 발달 및 말초 항상성을 지지하기 위해 낮은 IL-2/IL-2R 신호전달 역치를 요구하는 것으로 보인다 [6]. 마우스 및 인간에서 IL-2 투여는 Treg 의 현저한 증식 및 활성화를 초래하는 것으로 밝혀졌다 [3, 4, 8].

요즘, IL-2 는 오로지 암 면역요법에만 계속 이용되고 있고, 인간 자가-면역 질환에서, 더욱 일반적으로는, 원치 않는 면역 반응에 의해 야기되는 인간 질환에서 연구된 적이 없다. 이는 그러한 치료와 연관된 인지되고 예상되는 위험 때문이다. 실제로, Teff 를 자극하는 IL-2 의 능력은 질환을 매개하여 질환을 악화시키는 바로 그 효과기 T 세포를 활성화시킬 위험을 수반한다.

본 발명의 목적은 인간 대상에서 원치 않는 면역 반응을 감소 또는 예방하는 방법으로서, 상기 대상에게 효과기 T 림프구 (Teff) 를 실질적으로 유도하지 않으면서 조절성 T 림프구 (Treg) 를 자극하기에 효율적인 양의 인터류킨-2 (IL-2) 를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 인간 대상에서 원치 않는 면역 반응을 감소 또는 예방하는 방법으로서, 상기 대상에게 IL-2-연관 부작용을 실질적으로 유도하지 않으면서 조절성 T 림프구 (Treg) 를 자극하기에 효율적인 양의 인터류킨-2 (IL-2) 를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 인간 대상에서 원치 않는 면역 반응을 감소 또는 예방하는 방법으로서, 상기 대상에게 효과기 T 림프구 (Teff) 및 IL-2-연관 부작용을 실질적으로 유도하지 않으면서 조절성 T 림프구 (Treg) 를 자극하기에 효율적인 양의 인터류킨-2 (IL-2) 를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 인간 대상에서 원치 않는 면역 반응을 감소 또는 예방하는 방법으로서, 상기 대상에게 상기 대상 내의 조절성 T 림프구 (Treg) 와 효과기 T 림프구 (Teff) 사이의 균형 (또는 비) (Treg/Teff 균형) 을 Treg 를 향해 이동시키기에 효율적인 양의 인터류킨-2 (IL-2) 를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 인간 대상에서 원치 않는 면역 반응을 감소 또는 예방하는 방법으로서, 상기 대상에게 상기 대상 내의 조절성 T 림프구 (Treg) 와 효과기 T 림프구 (Teff) 사이의 균형 (또는 비) 을 증가시키기에 효율적인 양의 인터류킨-2 (IL-2) 를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 신규한 IL-2-기반 요법 (IL-2-based therapy) 을 제안한다. 본 발명은 IL-2 가 특이적 Treg 증식/활성화에 의해 작용하는 신규한 부류의 면역-조절성 및 항-염증성 약물 (immuno-regulatory and anti-inflammatory drug) 로서 사용될 수 있음을 최초로 보여준다.

본 발명의 추가의 목적은 인간 대상에서 자가면역, 면역-관련 또는 염증성 (autoimmune, immune-related or inflammatory disorder) 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 대상에게 상기 대상 내의 조절성 T 림프구 (Treg) 와 효과기 T 림프구 (Teff) 사이의 균형 (Treg/Teff 균형) 을 Treg 를 향해 이동시키기에 효율적인 양의 인터류킨-2 (IL-2) 를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 인간 대상에서 자가면역, 면역-관련 또는 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 대상에게 효과기 T 림프구 (Teff) 를 실질적으로 유도하지 않으면서 조절성 T 림프구 (Treg) 를 자극하고/거나, 염증을 감소시키기에 효율적인 양의 인터류킨-2 (IL-2) 를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 그러한 장애의 치유적 또는 예방적 치료에 사용될 수 있다. 더욱 특히, 본 발명의 방법은 대상에서 자가면역, 면역-관련 또는 염증성 장애의 발생 또는 발달을 예방한다.

IL-2 는 전형적으로 반복적으로 투여된다.

약 0.05 ~ 약 2 백만 국제 단위 (millions international unit) (MIU)/㎡/일, 바람직하게는 약 0.1 또는 0.2 ~ 약 1 MIU/㎡/일 의 용량 (dose) 으로 또는 약 3.5 MIU/일 미만의 용량으로 투여되는, 청구항 1 에 따른 자가면역, 면역-관련 또는 염증성 장애의 치료에서 사용하기 위한 인터류킨-2.

바람직한 구현예에서, 그것은 약 3 MIU/일 의 용량으로 또는 약 2 MIU/일 미만의 용량으로, 바람직하게는 약 0.1 MIU ~ 약 2 MIU/일, 바람직하게는 약 0.3 MIU ~ 약 1 MIU/일 의 용량으로 투여된다.

치료는 바람직하게는 적어도 인터류킨-2 가 하루에 한 번 3 연속일 이상 동안, 바람직하게는 3 ~ 7 연속일 동안, 더 바람직하게는 4 ~ 5 연속일 동안 투여되는 첫번째 과정을 포함할 수 있다. 바람직하게는 그 후에 2 ~ 4 주 후에 유지 용량이 뒤따른다. 유지 용량은 한 주에 한 번, 또는 한 달에 한 번 또는 두 번 투여될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 치료는 적어도 인터류킨-2 의 약 0.2 MIU/㎡ 의 용량이 하루에 한 번 3 연속일 이상 동안, 바람직하게는 3 ~ 7 연속일 동안, 더 바람직하게는 4 ~ 5 연속일 동안 투여되는 첫번째 과정을 포함하며, 그 후 1 ~ 3 주 후에 약 0.2 MIU/㎡ 의 유지 용량이 뒤따르며, 유지 용량은 매 1 ~ 3 주 마다 반복될 수 있다. 바람직한 양상에서, 대상은 약 0.3 MIU 를 0.2 MIU/㎡ 의 일일 용량으로서 투여받는 성체이다.

또다른 바람직한 구현예에서, 치료는 적어도 인터류킨-2 의 약 0.6 MIU/㎡ 의 용량이 하루에 한 번 3 연속일 이상 동안, 바람직하게는 3 ~ 7 연속일 동안, 더 바람직하게는 4 ~ 5 연속일 동안 투여되는 첫번째 과정을 포함하며, 그 후 2 ~ 4 주 후에 약 0.6 MIU/㎡ 의 유지 용량이 뒤따르며, 유지 용량은 매 2 ~ 4 주 마다 반복될 수 있다. 바람직한 양상에서, 대상은 약 1 MIU 를 0.6 MIU/㎡ 의 일일 용량으로서 투여받는 성체이다.

또다른 바람직한 구현예에서, 치료는 적어도 인터류킨-2 의 약 1.8 MIU/㎡ 의 용량이 하루에 한 번 3 연속일 이상 동안, 바람직하게는 3 ~ 7 연속일 동안, 더 바람직하게는 4 ~ 5 연속일 동안 투여되는 첫번째 과정을 포함하며, 그 후 약 1 ~ 2 달 후에 약 1.8 MIU/㎡ 의 유지 용량이 뒤따르며, 유지 용량은 매 1 ~ 2 달 마다 반복될 수 있다. 바람직한 양상에서, 대상은 약 3 MIU 를 1.8 MIU/㎡ 의 일일 용량으로서 투여받는 성체이다.

일반적으로 말하면, IL-2 가 D/10 ~ 20xD, 바람직하게는 D/5 ~ 10xD 의 용량으로 투여되는 것이 바람직하며, 여기서 D 는 Treg 의 증식을 유도하지 않으면서 Treg 중 CD25 의 발현의 상향-조절을 유발하는 최소 용량이다. 바람직하게는 CD25 의 발현의 상향-조절은 33% 이상, 바람직하게는 50% 이상이다.

본 발명은 인간 대상에서 효과기 T 림프구 (Teff) 를 실질적으로 유도하지 않으면서 조절성 T 림프구 (Treg) 를 자극한다. 본 발명의 방법은 상기 대상 내의 Treg/Teff 균형을 증가시키는 것 또는 강력한 억제성 Treg 세포 집단을 증가시키는 것을 가능하게 만든다.

IL-2 는 또한 인간 대상에서 염증을 감소 또는 예방하기 위해 투여된다.

본 발명은 원치 않는 면역 반응과 연관되는 또는 그에 의해 야기되는 임의의 상태의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 그것은 HCV-관련 혈관염 (HCV-related vasculitis), 포도막염 (uveitis), 근염 (myositis), 제 I 형 당뇨병 (type I diabetes), 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematous), 전신성 혈관염 (systemic vasculitis), 건선 (psoriasis), 알레르기 (allergy), 천식 (asthma), 크론병 (Crohn's disease), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 류머티스성 관절염 (Rheumathoid Arthritis), 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 자가면역 갑상선 질환 (autoimmune thyroid disease), 신경-변성 질환 (neuro-degenerative diseases), 알츠하이머병 (Alzeihmer disease), 이식편 대 숙주 질환 (graft-versus-host disease), 자연 유산 (spontaneous abortion) 및 동종이식편 거부 (allograft rejection) 를 제한 없이 포함하는, 염증성, 면역-관련 또는 자가면역 질환을 치료하기에 특히 적합하다.

발명의 또다른 주제는 IL-2 로 치료되는, 자가면역, 면역-관련 또는 염증성 장애가 있는 환자에서 IL-2 섭생법 또는 용량이 수정되어야 하는지 여부를 결정하는 방법으로서, Treg 의 양 및/또는 Treg 중 CD25 발현 수준을 모니터링하는것을 포함하는 방법이며, 여기서 대조군 값보다 열등한 Treg 의 양 및/또는 Treg 중 CD25 발현 수준은 IL-2 의 용량이 증가되어야 함을 의미한다.

도 1: HCV 관련 자가면역 혈관염의 생물학적 마커에 대한 저용량 IL-2 의 효과
HCV 바이럴 로드 (viral load) (패널 A), 크리오글로불린 (cryoglobulin) (패널 B) 및 C4 보체 혈청 수준 (complement serum levels) (패널 C) 의 시간 경과 변화가 나타나 있다. 데이타는 평균 ± 표준 오차로서 표현되어 있다 (n=10, *: P<0.05, **P<0.01, ***: P<0.001).
도 2: 림프구 아집단에 대한 저용량 IL-2 의 효과
CD4⁺ T 세포 중 CD4⁺CD25^hiCD127^-Foxp3⁺ 및 CD8⁺ T 세포 중 CD8⁺CD25⁺Foxp3⁺ 의 백분율 (패널 A), 전체적 Treg/Teff 비 (패널 B), CD19⁺ 총 B 세포 및 변연부 B 세포 (Marginal zone B cells) (패널 C) 및 NK 세포 및 CD56^bright NK 세포 (패널 D) 의 절대수의 시간 경과 변화가 나타나 있다. 데이타는 평균 ± 표준 오차로서 표현되어 있다 (n=10, *: P<0.05, **P<0.01, ***: P<0.001).
도 3: 유세포분석법에 의한 CD4 ⁺ Treg 의 표현형 특성
CD3⁺CD4⁺ T 부분집합의 식별을 위한 대표적 림프구 게이트 (gate) 가 나타나 있다. CD3⁺ CD4⁺ T 세포 중, Treg 는 CD25^highCD127^-FoxP3⁺ 세포로서 식별되었다.
도 4: IL-2 치료 하의 HCV 관련 자가면역 혈관염 환자에서 Treg 세포의 억제 활성
FACS 정제된 Treg 이 동종이계 자극 하에 상이한 비 (1/1 ~ 1/8) 로 자가 효과기 T 세포 증식을 억제하는 그들의 능력에 대해 검정되었다. 결과는 cpm 으로 표현되어 있다. 제시된 실험은 4 를 나타낸다.
도 5: 유세포분석법에 의한 CD8 ⁺ Treg 의 표현형 특성분석
CD3⁺CD8⁺ Treg 의 식별을 위한 대표적 림프구 게이트가 나타나 있다. CD3⁺CD8⁺ T 세포 중, Treg 는 CD25⁺FoxP3⁺ 세포로서 식별되었다.
도 6: 유세포분석법에 의한 CD19 ⁺ B 세포 부분집합 특성분석
B 세포 부분집합 집단이 나이브 (naive) (IgD⁺CD27^-), 기억 (IgD^- CD27⁺), 변연부 (IgD⁺CD27⁺) 로서 정의되었다.
도 7: 저용량 IL-2 는 PBMC 의 전사체 분석 (transcriptome analyses) 에 의해 드러나는 염증의 전체적 감소를 유도함
IL-2 치료 전 및 후의 계층적 군집화 (hierarchical clustering) (패널 A) 는 주로 B 세포 관련 유전자 및 전염증 (proinflammatory) 유전자에 영향을 미치는 유전자 하향조절을 강조한다. 데이타 마이닝 (data mining) 은 NFKB 경로를 감소된 전염증 반응에서 중심으로 식별했다 (패널 B). IL-2 치료된 환자에서 하향-조절된 유전자가 빨간색 박스로 기호화되어 있다. 전사 서명 (transcriptional signature) 에 존재하는 유전자 (패널 A) 가 채워진 둥근 박스 (filled round-box) 로 도식적으로 표현되어 있다. 2 개의 유전자 산물 사이의 전사후 활성화 (예를 들어 인산화, 절단 등에 의해) 가 뾰족한 화살표로 표시되어 있고, 채워진 화살표는 직접적 전사 활성화를 나타낸다. 점선 화살표는 간접적 신호전달을 나타낸다.
표 (패널 C) 는 이들 데이타의 ICA 의 결과를 나타낸다. 염증, 면역 반응, 및 자가면역 (제 I 형 진성 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스, 자가면역 갑상선 질환), 이식 (이식편 대 숙주 질환 및 동종이식편 거부) 또는 염증성 감염-관련 병증 (pathologies) (샤가스 질환, 레슈마니아증, 헬리코박터 파이로리 감염, 말라리아, 아메바증, 시겔라증, 모두 높은 정도의 염증을 특징으로 함) 과 관련된 GO 텀 (GO term) 및 KEGG 경로가 유의하게 강화된 IL-2-치료된 군에서의 상향- 또는 하향-조절된 서명의 수가 나타나 있다. 대조군으로서, 동일한 수의 무작위로 뽑힌 GO 텀이 세포-주기 관련 GO 텀 및 대조군 병증과 함께 시험되었다. 각각의 GO 텀 또는 KEGG 경로에 대해, Khi2 검정 p-값은 전체적 상향- (2527) 또는 하향- (3429) 조절된 서명과 비교시 상향- 또는 하향-조절된 서명에 대한 가능한 강화 편향을 나타낸다.
도 8: 저용량 IL-2 는 제 I 형 당뇨병 환자에서 Treg 를 유도함.
도 8 은 5 일 동안 0.33, 1 또는 3 MIU/일 IL-2 (Proleukin®) 를 투여받은 환자에서의 Treg/T_CD4 비를 보여준다. 피크 Treg 증가는 상이한 용량에서 비교적 유사하지만, 효과의 지속시간은 용량-의존적이고, 유지 치료의 일정을 결정하기 위한 정보를 제공한다 (즉, 용량이 적을수록, 유지 주사 사이의 지연이 더 짧음).
도 9: 저용량 IL-2 는 C-펩티드 생성을 감소시키지 않았음.
도 9A 는 5 일 동안 IL-2 (Proleukin®) 를 투여받은 환자에서의 Treg/T_CD4 비를 보여준다. 도 9B 는 동일한 환자에서 IL-2 의 투여 전 및 후의 혈청 C-펩티드의 농도를 보여준다. 치료 동안 Treg 의 증가가 있으며, 이는 2 달에서의 C 펩티드 생성의 증가와 상관관계가 있다.

본 발명은 예상외로 인간 자가면역 환자에서 저용량 IL-2 면역요법을 통한 유해 사건의 발생이 없는 그리고 Teff 의 증식이 없는 매우 강력한 억제성 Treg 의 생체내 증식을 최초로 보여준다.

IL-2 는 오로지 암 면역요법에만 이용되고, 인간에서의 인간 자가-면역 질환에서 단독으로 연구된 적이 없다. 실제로, Teff 를 자극하는 IL-2 의 능력은 자가-면역을 매개하는 바로 그 효과기 T 세포를 활성화시킬 위험을 수반한다. 여기에서, 우리는 면역 활성화-관련 유해 사건이 관찰되지 않았음을 보여주는 임상적 증거와 일치하는, IL-2 가 Teff 를 유도하지 않으면서 Treg 를 유도하는 조건 하에 사용될 수 있다는 생물학적 증거를 보여준다. 본 발명에 따르면, IL-2 는 Treg/Teff 균형을 명백히 Treg 에 유리한 방향으로 기울어지게 하며, 이는 또한 IL-2 요법 동안 전체적으로 감소된 염증 상황으로 뒷받침된다.

HCV-관련 환자에서의 첫번째 시험에서, 본 발명자들은 저용량 IL-2 이 잘 관용되고, Treg 세포의 극적 및 선별적 증가를 유도하고, 환자의 80% 에서 임상적 개선을 초래함을 밝혔다.

5-일 1.5 MIU/일 과정 치료에서, Treg 의 유의한 증가가 모든 환자에서 관찰되었으며 (2 배 증가), 부작용이 없었다. 3 MIU/일 의 부가적 5-일 과정 후, Treg 의 추가의 증가가 관찰되었다.

우리의 결과는 과립구, 적혈구, 또는 간 효소의 유의한 변화 없이 치료가 잘 관용되었음을 보여준다. 게다가, 1.5 MIU/일 의 투여량에서, 부작용 예컨대 무력증 (asthenia), 주사 자리에서의 일시적 국소 반응 (transient local reactions at injection sites), 독감-유사 증후군 (flu-like syndrome), 근육통 (myalgia) 또는 고혈압 (hypertension) 이 관찰되지 않았다.

중요하게, 전체 치료 및 추적 동안, 병원성 T 세포의 활성화를 시사하는 생물학적 또는 임상적 징후가 존재하지 않았다.

5 일 동안의 1.5 MIU/일 의 과정은 지금까지 인간에서의 Treg 유도 목적을 위한 효능 및 안전성이 입증된 최저 IL-2 용량을 나타낸다.

또한, 본 발명은 IL-2 의 현저한 항-염증 활성을 최초로 밝혔다. 우리의 무감독 전사체 분석 (unsupervised transcriptome analyses) 은 많은 자가-면역 및 염증성 질환, 뿐만 아니라 면역-관련 질환 예컨대 이식편 대 숙주 질환 및 동종이식편 거부와 연관되는 서명/경로의 분명한 하향-조절을 보여줬다. 인간에서 IL-2 를 사용하여 Teff 를 자극하지 않으면서 Treg 를 자극하는 것이 가능함을 보여주는 이러한 연구로, 본 발명자들은 저용량 IL-2 치료가 모든 이들 질환에 대한 예방 및 치료 패러다임을 완전히 바꿀 것임을 제안한다.

본 발명자들은 또다른 자가면역 질환, 즉 제 I 형 당뇨병에서 저용량 IL-2 의 시험을 추가로 진행하여, 자가면역, 면역-관련 또는 염증성 장애를 치료함에 있어서 저용량 IL-2 의 이익을 확인했다.

그러므로 본 발명은 IL-2 를 사용하여 자가면역, 면역-관련 또는 염증성 장애를 치료하는 것에 대한 새로운 치료적 접근법을 제공한다. 본 발명은 IL-2 가, 저용량에서, 자가면역, 면역-관련 또는 염증성 장애를 갖는 대상에서 효과기 T 세포를 실질적으로 활성화시키지 않으면서 억제성 Treg 세포 집단을 효과적으로 활성화 또는 증식시킬 수 있음을 개시한다.

대상은, 연령 또는 성별에 상관없이, 임의의 인간 환자이다. 특정 구현예에서, 환자는 어린이, 또는 청소년이다.

인터류킨-2 (IL-2)

본 발명의 맥락 내에서, 용어 "IL-2" 는 포유류 출처 예컨대 예를 들어, 인간, 마우스, 랫트, 영장류, 및 돼지를 포함하는 IL-2 의 임의의 출처를 지정하고, 천연이거나, 미생물 숙주에 의해 생성된 재조합 IL-2 폴리펩티드를 포함하여, 재조합 또는 합성 기술에 의해 수득될 수 있다. IL-2 는 천연 폴리펩티드 서열이거나 그것을 포함하거나, 천연 IL-2 폴리펩티드의 활성 변이체일 수 있다. 바람직하게는 IL-2 폴리펩티드 또는 활성 변이체는 인간 출처에서 유래하고, 재조합 인간 IL-2, 특히 미생물 숙주에 의해 생성된 재조합 인간 IL-2 를 포함한다.

IL-2 의 활성 변이체가 문헌에서 공개된 바 있다. 천연 IL-2 의 변이체는 조각, 유사체, 및 그의 유도체일 수 있다. "조각" 은 온전한 폴리펩티드 서열의 오직 일부를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. "유사체" 는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실이 있는 천연 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 뮤테인 및 슈도펩티드가 유사체의 구체적 예이다. "유도체" 는, 예컨대 글리코실화된, 인산화된, 또다른 폴리펩티드 또는 분자에 융합된, 중합된, 등, 또는 IL-2 의 특성 (예를 들어, 안정성, 특이성 등) 을 개선하는 화학적 또는 효소적 개질 또는 부가를 통해, 임의의 개질된 천연 IL-2 폴리펩티드 또는 조각 또는 그의 유사체를 포함한다. 참조 IL-2 폴리펩티드의 활성 변이체는 일반적으로 참조 IL-2 폴리펩티드의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 일치성이 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상이다.

변이체 IL-2 폴리펩티드가 활성인지 여부를 확인하는 방법이 당해 기술분야에서 입수가능하고, 본 발명에서 구체적으로 기재되어 있다. 활성 변이체는, 가장 바람직하게는, Treg 를 활성화시키는 변이체이다.

IL-2 변이체의 예가, 예를 들어, EP109748, EP136489, US4,752,585; EP200280, 또는 EP118,617 에서 개시되어 있다.

바람직하게는 우리는 재조합 IL-2, 즉, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 IL-2 를 사용한다 [9]. IL-2 를 인코딩하는 재조합 DNA 를 발현하는데 사용되는 숙주 유기체는 원핵 (박테리아 예컨대 대장균) 또는 진핵 (예를 들어, 효모, 곰팡이, 식물 또는 포유류 세포) 일 수 있다. IL-2 의 생성 과정이 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는, US4,656,132; US4,748,234; US4,530,787; 또는 US4,748,234 에서 기재된 바 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 인간 기원의 IL-2, 또는 그의 활성 변이체, 더욱 바람직하게는 재조합적으로 제조된 것을 사용한다. 인간 IL-2 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이, 예를 들어, 각각, Genbank ref 3558 또는 P60568 에 개시되어 있다. 본 발명은 더욱 바람직하게는 인간 IL-2 를 사용한다.

본 발명에서 사용되는 IL-2 는 본질적으로 순수한 형태일 것이며, 예를 들어, 순도가 95% 이상, 더 바람직하게는 순도가 96, 97, 98 또는 99% 이다.

본 발명에서 사용되는, IL-2 는 전형적으로 Teff 억제제와 조합되거나 동시-투여되지 않는다. 그러나, 바람직하거나 요구되지는 않지만, 약물 조합이 고려될 수 있다.

IL-2 는 단량체 또는 다량체 형태로 사용될 수 있다.

IL-2 는, 제약용을 포함하여, 상업적으로 입수가능하고, 인간 환자에서의 사용에 대해 승인되었다. 적합한 상업적 형태는, 예를 들어,

- Proleukin® (aldesleukin), 대장균에서 생산된 비글리코실화 des-알라닐-1, 세린-125 인간 인터류킨-2,

삭제

- Roncoleukin®, 효모에서 생산된 재조합 인간 IL-2

를 포함한다.

인터류킨-2 는 단독으로 또는 임의의 기타 치료적 활성제와의 조합으로 사용될 수 있다.

바람직한 구현예에서, IL-2 는 제 I 형 당뇨병의 예방 또는 치료에 사용될 때 라파마이신과의 조합으로 투여되지 않는다.

조절성 T 세포

조절성 T 세포는 면역억제 활성을 갖는 T 림프구이다. 자연적 Treg 는 CD4+CD25+Foxp3+ 세포로서 특징지어진다. Treg 에서 유전적 결함을 나타내는 인간 및 마우스는 여러 T-세포 매개성 기관-특이적 자가면역 질환을 발달시킨다. 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 제 1 형 당뇨병, 다발성 경화증, 포도막염 및 근염을 포함하는, 많은 인간 자가면역 질환에서 Treg 정량적 또는 정성적 결함이 기술된 바 있다. 반대로, Treg 의 부가 (addition)/회복 (restoration) 은 이들 질환의 대부분의 동물 모델에서 임상적 개선을 유도한다.

Treg 는 또한 염증성 질환의 통제에서 주요한 역할을 수행하지만, 그러한 질환에서의 그것의 작용 방식은 잘 이해되지 않고 있다. 실제로, 대부분의 염증성 질환에서, Treg 고갈은 질환을 악화시키지만, Treg 부가는 그것을 감소시킨다. 이는 예를 들어 죽상동맥경화증의 상황에서 밝혀져 있다. 이러한 질환이 주로염증성 질환인 것은 아니지만, 그것의 발달은 염증성 구성요소/루프를 수반한다. 죽상동맥경화증을 자발적으로 발달시키는 아포리포단백질 E (ApoE) 결핍 마우스에서, Treg 고갈은 플라크 (plaque) 형성을 유의하게 악화시켰지만, 폴리클로날 Treg 의 주사는 질환을 유의하게 개선시켰다.

대부분의 Treg 는 CD4+ 세포이지만, 억제 활성을 갖는 CD8+ Foxp3+ T 림프구의 희귀한 집단이 또한 존재한다.

효과기 T 세포

본 출원의 맥락 안에서, "효과기 T 세포" (또는 "Teff") 는, 하나 이상의 T 세포 수용체 (TCR) 를 발현하고 효과기 기능 (예를 들어, 세포독성 활성, 사이토카인 분비, 항-자기 인지 등) 을 수행하는, Treg 이외의 종래의 T 림프구를 의미한다 (때때로 문헌에서 Tconv 로도 언급됨). 본 출원에 따른 인간 Teff 의 주요 집단은 CD4+ T 헬퍼 림프구 (예를 들어, Th0, Th1, Th17) 및 CD4+ 또는 CD8+ 세포독성 T 림프구를 포함하고, 그들은 자기 또는 비-자기 항원에 특이적일 수 있다.

자가면역 질환의 특정 상황에서, Teff 세포는 질환의 원인이 되는 또는 질환에 연루되는 T 세포 집단을 포함한다. 예를 들어, T 세포의 그러한 집단은 자기 항원 예컨대 갑상선 항원, 관절 항원, β-랑게르한스섬 항원 등을 인지하는 T 림프구를 포함한다. GVHD 질환에서, Teff 세포는 이식편으로부터의 T 림프구를 포함한다.

Treg 의 선별적 증식

본 발명의 맥락 안에서, Treg 의 자극 (또는 유도 또는 활성화 또는 증식) 은 환자에서, IL-2 수용체의 알파-사슬인, CD25 와 같은 Treg 의 활성을 반영하는 분자의 발현에 의해 또는 억제 검정에 의해 시험되는 활성, 수 또는 Teff 에 상대적인 Treg 세포의 비율의 임의의 증가를 의미한다. 비율의 증가는 치료 전의 수준과 비교시 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 40% 이상, 더욱더 바람직하게는 60% 이상이다. 특정 바람직한 구현예에서, 자극은 Treg/Teff 균형의 Treg 를 향한 이동, 또는 Treg/Teff 비의 증가를 의미한다.

본 발명의 본질적 양상은 실제로, 자가면역, 면역-관련 또는 염증성 장애를 갖는 인간 환자에서, 생체내에서 Teff 를 실질적으로 유도하지 않으면서 Treg 를 자극하는 능력에 있다.

Treg 의 유도 (또는 활성화 또는 증식) 는 실시예에서 개시된 바와 같이, 예를 들어, 치료된 대상으로부터의 샘플 중 Treg 의 수 (예를 들어, CD25, FoxP3... 의 발현에 기초하여) 및/또는 Treg 의 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. Teff 의 실질적 유도 (또는 활성화 또는 증식) 의 부재는 또한 실시예에서 개시된 바와 같이, 예를 들어, 치료된 대상으로부터의 샘플 중 Teff 의 수 및/또는 Teff 의 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. 바람직하게는, 실질적 유도의 부재는 표적 Teff 세포 집단이 전체 전사체 분석에 의해 평가되는 또는, CD25, CD69, 및/또는 HLA-DR 와 같은 활성화의 마커를 요구하지 않음을 나타낸다. Treg 및 Teff 세포의 상세한 탐지, 측정 및 정량화 방법이 당해 기술분야에서 그 자체로 잘 알려져 있고, 일부가 실시예에서 개시되어 있다.

Treg 의 자극은 환자에서의 Treg 총수의, 전형적으로 10% 이상의, 증가에 의해, 또는 CD25 발현의 강도와 같은 활성화 마커의 증가에 의해 측정될 수 있다. Teff 유도의 부재는 전형적으로 치료의 결과로서 상기 대상에서 Teff 세포 집단이 10% 를 초과하여 증가하지 않았음을 의미한다.

Treg 의 자극 및 Teff 의 실질적 유도의 부재는 바람직하게는 치료된 대상 내의 Treg/Teff 비 또는 균형의 측정에 의해 평가된다. 이러한 균형은 예를 들어, 대상으로부터의 샘플 중 Treg 의 수 및 Teff 의 수에 기초하여 계산된다. 실시예에서 설명되는 바와 같이, 그러한 균형은 치료된 환자에서 전형적으로 20% 이상, 더욱 바람직하게는 30%, 40% 또는 60% 이상 증가한다.

인간 대상에서의 Treg 의 기준선 백분율, 즉, Treg/CD4 +Teff 의 비는 대략 4.6±0.6% 이다 (자가면역 질환 환자에서의 기준선 % 는 훨씬 더 낮을 수 있으며, 실시예 1 에서 보여지는 바와 같이, HCV-유도된 자가면역 혈관염 환자는 기준선 백분율 수준이 오직 3.6%±0.23 이었지만, 이들 숫자는 측정의 기술적 측면에 따라 실험실마다 다를 수 있다).

본 출원에서 제시된 결과는, 1.5 MIU/일 에 의하는 치료의 첫번째 과정 후에, Treg 의 기준선 % 의 2-배 (100%) 증가가 초래되고, 이는 부가적 치료시 추가로 증폭될 수 있음을 보여준다. 프로토콜에 따라, 300% 초과의 증가가 수득되었다. 사용된 용량 (0.33; 1 및 3 MIU/일) 에 상관 없이, T1D 환자에서 첫번째 5-일 과정 후에 유사한 2-배 증가가 관찰되었다.

바람직한 구현예에서, 상기 방법은 대상에서 Treg/Teff 비의 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100% 또는 그 이상의 증가를 허용한다.

게다가, 본 발명은 CD4+ Treg 의 증가 뿐만 아니라, CD8+ 인 Treg 의 희귀한 집단의 증가를 보여준다.

특정 구현예에서, 본 발명은 순환성 CD4 ⁺ CD25 ^hi CD127 ^- Fox p3 ⁺ Treg 를 증가시킨다.

또다른 특정 구현예에서, 본 발명은 순환성 CD8 ⁺ CD25 ^hi Foxp3 ⁺ Treg 를 증가시킨다.

또다른 중요한 양상은 증폭된 Treg 세포 집단이 고도로 억제성이라는 것이다. 실제로, 제시된 결과는 본 발명에 따른 치료시 Treg 가 Teff 세포에 대해 강력한 억제 활성을 갖도록 활성화됨을 보여준다. 우리의 연구에서, 고전적 억제 검정에서 실질적 억제 활성 (>75%) 이 1/8 의 Treg/Teff 비로 탐지될 수 있었으며, 상기 검정에서 치료되지 않은 정상 개체로부터의 Treg 는 그러한 억제를 ½ ~ ¼ 의 비로 야기한다.

그러므로 본 발명은 자가면역 질환을 갖는 인간 대상에서, 효과기 T 림프구의 실질적 변경 또는 활성화 없이, Treg 의 실질적 증가를 허용한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상에서 CD25⁺Foxp3⁺ Treg 를 30% 이상 증가시키고, 상기 대상에서 표적 Teff 의 5% 미만의 증가를 야기하는 방법이다.

또한, 본 발명은 예상외로, 바람직한 투여 용량에서, 본 발명의 IL-2-기반 요법이 동맥성 고혈압 (arterial hypertension); 두통 (headaches), 구역 (nausea), 관절통 (arthralgia), 근육통 (myalgia), 또는 독감-유사 증후군 (Flu-like syndrome), 뿐만 아니라 FDA 의 IL-2 Summary of Product Charasteristics 에 기재된 많은 기타 알려진 IL-2 부작용을 본질적으로 유도하지 않음을 보여준다. 그러므로 면역-관련 장애를 갖는 인간 대상에서 IL-2 요법을 사용하여, Teff 세포를 실질적으로 활성화시키지 않으면서 그리고 IL-2-연관 부작용을 실질적으로 유도하지 않으면서, Treg 및 항-염증 효과를 매우 실질적으로 유도하는 것이 가능하다.

IL-2 투여량

본 발명에서 사용되는, IL-2 는 Teff 를 실질적으로 활성화시키지 않으면서 Treg 를 효과적으로 활성화시키는 투여량으로 투여된다. 그 결과는 대상 내의 Treg/Teff 균형의 극적 증가이다.

효과적 투여량은 본 출원에 포함된 정보에 기초하여 의사에 의해 조정될 수 있다. 특히, 자가면역 질환 환자에서, Treg 를 활성화시키지만 Teff 를 본질적으로 활성화시키지 않는 조건 하에 IL-2 가 투여될 수 있다는 본 발명의 지식에 기초하여, 당업자는 각각의 환자 및 상태에 맞춰 용량을 조정할 수 있을 것이다.

전형적으로 IL-2 는 약 0.05 ~ 약 2 MIU/㎡/일, 바람직하게는 0.2 ~ 약 1 MIU/㎡/일 의 용량으로 투여된다.

따라서 투여하는 IL-2 의 양은 바람직하게는 대상의 체표면적에 의존한다. 체표면적 (body surface area) (BSA) 은 측정된 또는 계산된 인간 신체의 표면이다.

직접적 측정 없이 BSA 에 도달하는 다양한 계산법이 공개된 바 있다:

하기 Dubois & Dubois 식 [18] 은 통상적으로 성인에서 사용된다:

통상적으로 사용되는 또다른 식은 Pharmacy and Therapeutics Committee of the Cross Cancer Institute (Edmonton, Alberta, Canada) 에 의해 사용이 채택된 하기 Mosteller 식 [19] 이다:

그것은 더욱 특히 어린이에서 사용된다.

평균 BSA 는 일반적으로 성인의 경우 1.73 ㎡ 로 간주된다.

전형적으로, 본 발명에 따른 투여량은 3.5 MIU/일/환자 미만, 더욱 바람직하게는 3.0 MIU/일/환자 미만, 더욱더 바람직하게는 2.5 MIU/일/환자 미만, 더 바람직하게는 2.0 MIU/일/환자 미만이다.

치료는 전형적으로 반복되며, 즉, 상기 저용량 IL-2 이 대상에게 여러번 투여되어, 가장 실질적인 유익을 점진적으로 달성한다. 용량 및 투여 일정은 치료의 예방 또는 치료 목적, 뿐만 아니라 치료/예방될 질환에 따라 다르다. 치료 효과가 Treg 측정에 의해 모니터링될 수 있고, 그에 따라 용량 및 투여 일정이 조정된다.

예시적 투여량은 0.1 ~ 3 MIU, 바람직하게는 0.1 ~ 1.5 MIU, 더 바람직하게는 0.25 ~ 1 MIU 이다. 바람직한 투여량은 다음과 같다:

- 3.0 MIU/일/환자,

- 2.5 MIU/일/환자,

- 2.0 MIU/일/환자,

- 1.5 MIU/일/환자,

- 1.0 MIU/일/환자,

- 0.5 MIU/일/환자,

- 0.3 MIU/일/환자,

- 0.1 MIU/일/환자,

- 0.05 MIU/일/환자,

- 0.02 MIU/일/환자, 또는

- 0.01 MIU/일/환자.

이들 투여량은 대상 및 질환의 평가에 따라 조합될 수 있다.

치료는 수일의 과정, 예를 들어, 1-7 일, 바람직하게는 3 ~ 5 일의 일일 투여로서 제공될 수 있다. 그러한 치료 과정은, 치료 없는 기간으로 중단되는, 상이한 시기에 재현될 수 있다. 예방적 설정에서, IL-2 는 상기 투여량으로 단일 샷 (single shot) 으로, 상이한 시간 간격으로, 예를 들어, 한 주에 한 번 장기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 환자 및 질환에 따라 상이한 프로토콜이 조정될 수 있다.

유지 투여량은 초기 사이클이 완료된 후 2 ~ 8 주에 투여될 수 있다. 바람직하게는 유지 용량은 초기 투여량과 동일하다.

투여량의 결정:

일반적으로 말하면, IL-2 는 D/10 ~ 20xD, 바람직하게는 D/5 ~ 10xD 의 용량으로 투여될 수 있으며, 여기서 D 는 Treg 의 증식을 유도하지 않으면서 Treg 중 CD25 의 발현의 유도를 유발하는 최소 용량이다.

IL-2 의 적당한 저용량을 결정하는 이러한 방법은 특히 피하 경로와 상이한 투여 경로가 고려될 때 유용하다.

특히 그러한 투여량은 경구, 비강 또는 직장 전달에서 유용할 수 있다.

CD25 수준의 확인은 유세포분석법에서 항-CD25 항체를 사용하여 달성될 수 있다.

이와 관련하여, 림프구-함유 샘플은 적합한 고정제 (예를 들어 파라포름알데히드, 이는 인산 완충 식염수 (PBS) 중 1% 로 사용될 수 있음) 로 고정되어 세포 표면 마커의 후속 정량화 또는 정성적 확인 (예를 들어 유세포분석법을 이용하여) 을 편리하게 (예를 들어 림프구-함유 샘플의 수집 및 배양 자리로부터 유세포분석 실험실로의 수송 후에) 허용할 수 있다. 상이한 형광색소 예컨대 Alexa488 (Molecular Probes, Oregon, USA) 및 FITC (Sigma) 로 표지된 상업적으로 입수가능한 항-CD25 모노클로날 항체 (mAbs) 가 입수가능하다.

용량 및 투여 일정의 예가 아래 제시되어 있다.

제 1 형 당뇨병의 치료

제 1 형 당뇨병 (Type 1 diabetes) (T1D) 은 췌장에서 인슐린-생성 세포의 자가 면역 파괴로 인한 것이다. 많은 환자에서 IL-2/IL-2 수용체 활성화 경로에서의 결함이 발견될 수 있다. 게다가, IL-2 는 T1D 의 마우스 모델 (NOD 마우스) 에서 제 1 형 당뇨병의 발생을 예방할 수 있고, 당뇨병의 발병 후 매우 조기에 제공된 IL-2 는 당뇨병을 역전시킬 수 있다.

그러나, 저용량의 IL-2 로 치료된 암 환자에서 T1D 의 새로운 발병이 기술된 바 있다. 그러므로 IL-2 에 의한 인간 T1D 환자의 치료는 간단하지 않고, 어느 누구도 아직 그러한 IL-2 단독에 의하는 치료를 시작하지 않았다. 실시예 2 는 5 일 동안 저용량 IL-2 (0.33, 1 또는 3 MIU/일) 를 투여받은 T1D 환자에서의 이중 맹검 시험의 첫번째 결과를 보여준다.

따라서 본 발명자들은 이제 저용량의 IL-2 를 사용하여 T1D, 특히 최근 발병한 T1D 를 1) 예방 및 2) 치료하는 방법을 개시한다.

인터류킨-2 는 특히 제 I 형 당뇨병을 발달시킬 위험에 처한 대상에서 권장된다. 그러한 경우에, IL-2 에 의한 치료는 상기 대상에서 당뇨병 발병을 예방한다. 예방의 설정에서, T1D 의 위험에 처한 환자 (즉 T1D 의 병력이 있는 가문에 속하는 환자 또는 높은 빈도의 T1D 와 연관되는 IL-2/IL-2 수용체 활성화 경로의 유전적 다형성을 갖는 환자, 및/또는 항원 예컨대 인슐린, GAD, 인슐린종 연관 단백질 2 (IA2), 및 티로신 포스파타제 또는 아연 트랜스포터 8 (ZnT8) 에 대한 자가-항체 (또는 T1D 와 연관되었던 항체) 가 탐지되었던 환자) 는 저용량 IL-2 로 치료되어, T1D 를 생성할 효과기 T 세포의 활성화를 예방한다.

이러한 설정에서, 치료는 3 MIU/일 이하, 또는 심지어는 바람직한 구현예에서 1 또는 0.5 MIU/일 미만인 IL-2 의 용량을 사용하고, 치료는 매 2 주 마다 한 번, 또는 바람직하게는 매 3 주 마다 한 번 또는 바람직하게는 매 달 한 번 투여된다. 치료는 Treg 비율 및 기능에 기초하여 조정될 수 있다 (용량 또는 일정).

또다른 특정 구현예에서, 바람직한 후보 치료는 IL-2 의 저생산 (underproduction), 및 인슐린의 잔류 생산 (residual production) 을 보인다.

실제로, 치료적 설정에서, 우리의 바람직한 용도는 췌장에 인슐린-생성 세포의 잔류 무리 (remaining mass) 를 여전히 갖는 것으로 알려진 T1D 로 방금 진단된 환자를 위한 것이다. 특정 구현예에서, 이러한 설정에서 위에 기재된 바와 같이 인터류킨 2 는 3 ~ 7 일 동안 3 MIU/일 의 용량으로 제공될 수 있고, 그 후 부가적 IL-2 과정이 한 달에 한 번 이상 제공될 수 있다. 치료는 Treg 비율 및 기능에 기초하여 조정될 수 있다 (용량 또는 일정).

피하 경로가 바람직하다.

다발성 경화증 재발의 치료 및 예방.

다발성 경화증 (multiple sclerosis) (MS) 환자는 IL-2 로 치료되어 재발을 예방 또는 치료할 수 있다. 다발성 경화증 환자는 재발하는 경향이 있다.

본 발명에 따른 예방의 특별한 설정에서, MS 환자는 저용량 IL-2 로 치료되어 재발을 예방한다. 이러한 설정에서, 치료는 3 MIU/일 이하, 또는 심지어는 바람직한 구현예에서 1.5 MIU/일 미만인 IL-2 의 용량을 사용하고, 치료는 매 2 주 마다 한 번, 또는 바람직하게는 매 3 주 마다 한 번 또는 바람직하게는 매달 한 번 투여된다. 치료는 Treg 비율 및 기능에 기초하여 조정될 수 있다 (용량 또는 일정).

치료적 설정에서, 재발을 겪는 MS 환자는 위에 기재된 바와 같이 IL-2 를 5 ~ 7 일 동안 3 MIU/일 의 용량으로 제공받을 수 있고, 그 후 부가적 IL-2 과정이 한 달에 한 번 제공될 수 있다. 치료는 Treg 비율 및 기능에 기초하여 조정될 수 있다 (용량 또는 일정).

죽상동맥경화증의 예방 및 치료

용도의 (비제한적) 예는 다음과 같다: 1) 상태의 악화를 예방하기 위해 저용량의 IL-2 의 매월 주사를 수령할 수 있는 중등도 죽상동맥경화증, 즉 무증상 동맥 협착증 환자를 위해; 2) 동맥류 크기의 점진적 증가 및 상태의 악화를 예방하기 위해 저용량의 IL-2 의 매월 주사를 수령할 수 있는 대동맥류 환자를 위해; 3) 염증 및 재협착 위험을 감소시키기 위해 스텐트삽입술을 이용하여/이용하지 않고 혈관성형술에 의해 치료되는 관상 또는 말초 동맥 협착증 환자를 위해, IL-2 를 5 ~ 7 일 동안 3 MIU/일 의 용량으로 및 그 후 부가적 IL-2 과정을 한 달에 한 번; 4) 염증 및 재협착 위험을 감소시키기 위한 동맥 우회 수술 후에, IL-2 를 5 ~ 7 일 동안 3 MIU/일 의 용량으로 및 그 후 부가적 IL-2 과정을 한 달에 한 번.

반복적 자연 유산의 예방

일부 커플은 면역이 원인으로 여겨지는 반복적 자연 유산으로 생식에 어려움을 겪는다.

반복적 유산의 마우스 모델에서, 우리는 짝짓기 전 IL-2 의 투여가 정상적 임신 결과를 허용함을 밝혔다.

자연 유산이 반복되는 여성 환자에서, 계획된 임신 또는 시험관내 수정에 의해 얻어지는 배아의 착상 전에 IL-2 가 제공되어 태아 착상을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 예정된 짝짓기 또는 착상 전 1 달 ~ 1 주 전에 5 일 동안 3 MIU/일 의 IL-2 과정이 제공될 수 있다.

세포 또는 기관 거부의 예방

잠재적으로 면역원성인 동종이계 세포 또는 조직 또는 이식유전자로 유전자 조작된 세포의 이식 후, 본 발명에 따른 IL-2 의 투여를 사용하여 거부율을 감소시킬 수 있다.

발적 (flare) 통제를 위한 섭생법의 부가적 예:

- 0.1 ~ 3.5 또는 3 MIU/일 로 5 ~ 7 일 동안 연속적 24 h 주입

- 0.1 ~ 3.5 또는 3 MIU/일 의 일일 투여량으로 5 ~ 30 일 동안 하루에 한 번 반복되는 투여

- 0.1 ~ 3.5 또는 3 MIU/일 의 일일 투여량으로 15 ~ 30 일 동안 이틀에 한 번 반복되는 투여

- 0.1 ~ 3.5 또는 3 MIU/일 의 일일 투여량으로 2 ~ 4 연속주 동안 한 주에 3 연속일 동안 하루에 한 번 반복되는 투여

유지 및/또는 예방을 위한 섭생법의 예:

- 0.1 ~ 3.5 또는 3 MIU/일 의 일일 투여량으로 2 ~ 6 주 마다 한 주에 1 ~ 7 일 동안 매일 반복되는 투여

- 0.1 ~ 3.5 또는 3 MIU/일 의 일일 투여량으로 3 ~ 6 달 마다 5 ~ 30 일 동안 하루에 한 번 반복되는 투여

- 0.1 ~ 3.5 또는 3 MIU/일 의 일일 투여량으로 일년에 한 번 5 ~ 30 일 동안 하루에 한 번 반복되는 투여

- 0.1 ~ 3.5 또는 3 MIU/일 의 일일 투여량으로 1 ~ 3 달 마다 1 ~ 3 일 동안 하루에 한 번 반복되는 투여

- 0.01 ~ 1 MIU/일 로, 매 주 1 일 유지 투약

여러 사이클의 일정한 IL-2 투약 섭생법 또는 여러 사이클의 다단계 IL-2 투약 섭생법의 투여에 대한 필요는 담당 의사의 재량에 달렸으며, 본 발명의 방법으로 치료 중인 대상에서 Treg 세포를 모니터링함으로써 평가될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 자가면역 질환 환자에서, Treg 백분 수준 (percent level) 을 총 T 세포의 5-10% 로 유지 및/또는 도달시키는 것이 최선이다.

예방적 설정에서, Treg 백분 수준을 총 T 세포의 4.5-7% 로 유지 및/또는 도달시키는 것이 바람직하다.

IL-2 용량은 환자의 반응, 즉 Treg 백분율 및 그의 활성화 상태 (CD25) 에 대한 효과에 따라 조정될 수 있다.

따라서 IL-2 로 치료되는, 자가면역, 면역-관련 또는 염증성 장애가 있는 환자에서, IL-2 섭생법 또는 용량이 수정되어야 하는지 여부를 결정하는 방법으로서, Treg 의 양 및/또는 Treg 중 CD25 발현 수준을 모니터링하는 것을 포함하는 방법이 기재되어 있다.

대조군 값보다 열등한 Treg 의 양 및/또는 Treg 중 CD25 발현 수준은 IL-2 의 용량이 증가되어야 함을 의미한다. 대조군 값은 일반적으로 임의의 치료 전에 환자에서의 Treg 의 기준선 양 및/또는 CD25 발현 수준이다.

특정 구현예에서, 그러한 정량화는 치료가 개시될 때 수행될 수 있다 (예를 들어 첫번째 투여 후 3 ~ 5 일에). Treg 백분율 또는 CD25 발현 수준이 기준선에 비해 20% 증가 미만인 경우, IL-2 의 용량은 증가될 수 있고 (예를 들어 x2), 적절한 Treg 반응을 유도하는 용량 (3,5 MIU/일 미만) 이 발견될 때까지 과정이 반복된다.

바람직하게는 이러한 방법은 또한 유지 기간 동안 수행되며, 이는 매 2 ~ 6 달 마다, 바람직하게는 IL-2 의 투여 후 1 ~ 5 일에 Treg 의 수 및/또는 Treg 중 CD25 의 발현 수준을 정량화하는 것을 수반한다. Treg 백분율 또는 CD25 발현 수준 기준선에 비해 20% 증가 미만인 경우, IL-2 의 용량은 증가될 수 있을 것이다 (예를 들어 x2).

투여 형태 및 경로

IL-2 는 당해 기술분야에서 그 자체로 알려진 임의의 허용가능한 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, IL-2, 또는 IL-2 를 포함하는 약학적 조성물은 정맥내 (intravenous) (IV), 근육내 (intramuscular) (IM), 또는 경피 (transdermal) 또는 피하 (subcutaneous) (SC) 주사 (injection) 를 포함하는 임의의 형태의 주사에 의해, 또는 경구 (oral) 또는 비강 경로 (nasal route) 에 의해, 뿐만 아니라 국소 투여 (topical administration) [크림 (cream), 액적 (droplets) 등] 에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, IL-2 는 지속 방출성 제형, 또는 지속 방출 장치를 사용하여 투여되는 제형으로서 사용된다. 그러한 장치는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, 경피 패치 (patch), 및 다양한 용량으로 시간의 흐름에 따라 연속적, 정상상태 (steady-state) 방식으로 약물의 전달을 제공하여 지속 방출 효과를 달성할 수 있는 소형 이식성 펌프를 포함한다.

설하 또는 점안액 제형이 또한 고려될 수 있다.

IL-2 는 전형적으로 약학적으로 허용가능한 비히클, 담체 또는 부형제와 연합하여 (예를 들어, 용액, 현탁액, 또는 혼합물로) 투여된다. 적합한 부형제는 임의의 등장액, 식염수, 완충액, 서방성 제형 등을 포함한다. IL-2 또는 그의 변이체를 포함하는 액체, 동결견조된, 또는 분무건조된 조성물이 당해 기술분야에서 알려져 있고, 수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다.

바람직하게는 제조 및 저장 동안 단백질 안정성 및 생물학적 활성의 상실과 연관되는 문제를 최소화하도록, 약학적 조성물은 적당한 안정화제, 완충제, 증량제 (bulking agent), 또는 그들의 조합을 포함한다.

완충제를 사용하여 IL-2 의 안정성을 위한 허용가능한 범위 내에서 액체 조성물의 pH 를 유지할 수 있다. 완충제는 산 예컨대 예를 들어, 숙신산, 시트르산, 인산, 및 글루탐산일 수 있다.

적합한 증량제의 예는 예를 들어, 글라이신, 만니톨, 또는 발린, 또는 그들의 임의의 조합을 포함한다.

안정화제로서 사용될 수 있는 불활성 담체의 예는 당 (예를 들어, 수크로스, 글루코스, 덱스트로스) 및 당 알코올, 뿐만 아니라 아미노산을 포함한다.

약학적 조성물은 기타 안정화제, 예컨대 메티오닌, 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리소르베이트 80 등을 부가적으로 포함할 수 있다.

IL-2 제형의 구체적 예가 [10] 및 US4,604,377 에 기재되어 있다.

IL-2 가 단량체 형태인 경우, 저장 동안 IL-2 의 응집을 감소시키기에 충분한 아미노산 염기를 조성물에 첨가하는 것이 바람직하다. 아미노산 염기는 아미노산 또는 아미노산의 조합일 수 있으며, 임의의 제공되는 아미노산은 그것의 자유 염기 형태 또는 염 형태로 존재한다. 그러한 아미노산의 예는 아르기닌, 라이신, 및 아스파르트산을 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 조성물은, 예를 들어 동결건조된, 다량체성 IL-2 를 포함한다.

그러한 조성물이 구체적 예는 Proleukin^R IL-2 이다. 이러한 동결건조된 제형은 물에서 IL-2 의 용해를 보장하는 SDS, 및 벌크 (bulk) 를 제공하는 만니톨과 같은 수용성 담체와 혼합된 선별적으로 산화된, 재조합 IL-2 를 포함한다. 이러한 조성물은 비경구 주사용 수용액 중에 재구성하기에 적합하다.

포장 (packaging)

IL-2 의 현재의 포장은 18 MIU 의 IL-2 를 함유하는 바이알 (vial) 이다. 저용량이 사용되는 경우에, 0.01 MIU, 0.02 MIU, 0.05 MIU, 0.1 MIU, 0.2 MIU, 0.5 MIU, 1 MIU 및 3, 또는 3.5 MIU 의 용량을 위한 포장이 바람직하게는 제조된다.

그러므로 본 발명의 특정 목적은 또한 3 MIU IL-2 이하의 단위 용량을 포함하는 약학적 조성물이다. 상기 조성물은 바이알, 캡슐, 주사기 등 중에 존재할 수 있다.

자가면역 및 염증성 질환의 치료

본 발명은 원치 않는 면역 반응과 연관되는 또는 그에 의해 야기되는 및/또는 Treg 정량적 또는 정성적 결함이 기술된 바 있는 임의의 상태의 치료에 사용될 수 있다. 그러한 질환의 예는 자가면역 질환, 염증성 질환 (염증 과정이 중요한 역할을 하는 임의의 인간 질환을 포함함), 뿐만 아니라 면역-관련 질환을 포함한다.

치료는 치유적 (curative) 또는 예방적 (preventive) 일 수 있다. 특정 구현예에서, 치료는 치유적이며, 즉, 심지어는 매우 초기 단계에서라도, 질환이 선언된 대상과 관련된다. 그러한 환자에서, 치료는 질환 진행의 감소 또는 중단 및/또는 질환 증상 또는 원인의 억제를 목표로 한다. 실시예에서 설명되는 바와 같이, 치료는 환자에서 질환의 완전한 소멸을 초래할 수 있다.

치료는 예방적일 수 있으며, 즉, 질환이 선언되지 않은 환자와 관련되거나, 또는 다발성 경화증의 경우와 같이 질환에 차도가 있는 환자에서 재발을 예방할 수 있다. 그러한 환자에서, 원치 않는 면역 반응에 의해 야기되는 질환의 발달을 회피하기 위해 치료는 Treg 의 상승된 수준을 유지시키고/거나 염증을 감소시키는 것을 목표로 한다.

치료는 환자 상태의 임의의 개선, 예컨대 통증의 감소, 조직 손상의 감소 등을 의미한다.

Treg 결함이 다양한 자가면역 인간 질환에서 보고된 바 있고, 본 발명은, HCV-관련 혈관염, 포도막염, 근염, 제 I 형 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스, 전신성 혈관염, 건선, 알레르기, 천식, 크론병, 다발성 경화증, 류머티스성 관절염, 죽상동맥경화증, 자가면역 갑상선 질환, 자가-염증성 질환, 신경-변성 질환, 알츠하이머병, 이식편 대 숙주 질환, 자연 유산 및 동종이식편 거부를 제한 없이 포함하는, 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하는데 특히 적합하다. 본 발명은, 모두 높은 정도의 염증 또는 수술후 국소 염증 (post-surgical local inflammation) 과 같이 요법에 영향을 미치는 염증 성분을 수반하는 상태를 특징으로 하는, 염증성 감염-관련 병증 (inflammatory infection-related pathologies) 예컨대 샤가스 질환 (Chagas disease), 레슈마니아증 (Leishmaniasis), 헬리코박터 파이로리 감염 (Helicobacter pylori infection), 만성 바이러스성 간염 (chronic viral hepatitis) (B, C, D), HIV, HTLV, 말라리아 (Malaria), 아메바증 (Amoebiasis), 또는 시겔라증 (Shigellosis) 에 대한 보조 치료 (adjunct treatment) 로서 사용될 수 있다.

만성 HCV 감염은 다수의 간외 합병증 (extrahepatic complications) 과 고유하게 연관되며, 발병 메카니즘은 대체로 면역적으로 추진되는 것으로 보인다. 이들 중에서, 크리오글로불린혈증 (cryoglobulinaemia) 및 그것의 임상 후유증이 가장 강한 연관성을 보유한다. 크리오글로불린 (Cryoglobulin) 은 HCV-감염된 환자의 40-60% 에서 쉽게 탐지될 수 있지만 [11, 20, 21, 22], 현성 크리오글로불린혈증 혈관염 (overt cryoglobulinaemia vasculitis) [혼합 크리오글로불린혈증 (mixed cryoglobulinaemia): MC)] 은 사례 중 오직 5-10 % 에서만 발달한다 [11]. 가장 빈번한 표적 기관은 피부, 관절, 신경 및 신장이다. 질환 발현은 경도의 임상 증상 [자반병 (purpura), 관절통 (arthralgia)] 에서부터 전격 생명 위협적 합병증 [사구체신염 (glomerulonephritis), 광범위한 혈관염 (widespread vasculitis)] 에 이르기까지 다양하다. 혈관 침윤물 중 T 세포의 관찰, 자가항체의 존재 및 HCV-감염된 환자에서 일부 HLA 기가 MC 에 대한 감수성을 부여한다는 관찰은 이러한 바이러스-연관 병리의 자가면역 본질을 뒷받침한다 [12, 13]. MC 병태생리는, B- 및 T-세포 기능을 직접 조정하고 폴리클로날 활성화 및 류머티즘 인자 (rheumatoid factor) (RF) 활성을 갖는 IgM 을 생성하는 B 세포의 증식을 초래하는, HCV 와 림프구 사이의 상호작용으로부터 초래되는 것으로 보인다 [23]. 우리는 이전에 HCV-MC 환자에서 Treg 가 유의하게 감소된다고 보고했다 [12, 14, 15]. 더욱이, HCV 에 대해 성공적으로 치료될 수 있었던 MC 환자에서, 바이러스 청소가 혈관염 치유 및 Treg 회복과 연관되었다.

실험 섹션은 연관된 자가면역을 갖는 HCV-감염된 환자에서 저용량 IL-2 요법의 반복된 투여의 안전성, 면역학적 효과 및 임상적 효능을 평가하도록 디자인된 제 I/IIa 상 연구의 결과를 보고한다. 우리는 저용량 IL-2 이 잘 관용되고, Treg 세포의 극적인 선별적 증가를 유도하고, 치료된 모든 환자에서 임상적 개선을 초래함을 보인다. 이는 인간 자가면역 질환에서 IL-2 면역요법 후 생체내 Treg 유도 및 회복의 첫번째 입증이다.

실시예에서 보고된 바와 같이, 치료는 잘 관용되었고, 효과기 T 세포 활성화, 혈관염 발적 (vasculitis flare) 또는 증가된 HCV 바이러스혈증 (HCV viremia) 을 유도하지 않았다. 저용량 IL-2 는 모든 환자에서 강력한 억제 활성을 갖는 CD4+CD25hiCD127-Foxp3+ Treg 의 비율을 극적으로 증가시켰고, 동시에 변연부 (marginal zone) B 세포 비율을 감소시켰다. 말초 혈액 단핵구의 전사체 연구 (Transcriptome studies) 는 IL-2 가 염증성/산화적 스트레스 매개인자 (inflammatory/oxidative stress mediators) 의 전체적 감쇠를 유도했음을 보여줬다. 감소된 크리오글로불린혈증 및/또는 혈관염의 임상적 개선이 각각 환자의 90% (9/10) 및 80% (8/10) 에서 관찰되었다.

이는 인간 자가면역 질환에서 잘 관용되는 저용량 IL-2 면역요법 후 Treg 세포 회복 및 임상적 개선의 첫번째 입증이다. 그것은 염증성 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 IL-2 의 더 광범위한 사용을 촉진한다.

다른 질환은 하기를 포함한다:

- 전신성 염증 반응 증후군 (systemic inflammatory response syndrome) (SIRS) (choc) (보조);

- 간 이식 (liver graft) - 염증성 간 섬유증 (inflammatory hepatic fibrosis) 의 예방을 위한 신보조 및 보조 요법 - 개선된 이식 통제를 위한 공여자 및/또는 수령자의 치료

- 간경변 (liver cirrhosis) - 염증성 간 섬유증 및 관련 합병증의 예방을 위함

- 자가-염증성 전신성 질환 (auto-inflammatory systemic diseases) - 임상적/생물학적 발적 (clinical/biological flares) 이 있는 염증 반응의 감소 또는 예방

- 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome) (ARDS) (보조)

- 급성 췌장염 (acute pancreatitis) - 염증 반응 및 및 이차 괴사 (secondary necrosis) 의 감소

- 혈관 수술 (vascular surgery) - 스텐트 (stent) - 스텐트 삽입에 대한 염증 반응을 방지함으로써 스텐트 폐색의 예방

- 심근 경색 (cardiac infarction) 후 심장 개조 (cardiac remodelling) 의 개선

- 정형외과 수술 (orthopaedic surgery) - OS 후 염증 반응의 감소

- 치과 (odontology) - 치주염 (parodonditis) 의 치료

- 스틸 병 (Still disease)

- 정신과 (psychiatry): 우울증 (depression)

하기 실시예는 설명을 목적으로 제공되고 제한을 위한 것이 아니다.

실시예

실시예 1: HCV-관련 혈관염에서 저용량 IL-2

여기에서, 우리는 자가-면역을 갖는 환자에서 Teff 를 유도하지 않으면서 Treg 를 유도하는 조건 하에 IL-2 가 사용될 수 있다는 인간 대상에서의 첫번째 생물학적 증거를 제공한다. 우리는 여기에서 임상적 개선을 초래하는, 인간 자가면역 질환에서 IL-2 면역요법을 통한 매우 강력한 억제성 Treg 의 생체내 증식의 첫번째 입증을 보고한다. 우리의 연구의 일차 종점인, IL-2 요법의 마지막에 증가된 Treg, 및 임상적 반응을 포함하는 모든 이차 종점이 모두 충족되었다. 우리는 저용량 IL-2 가 잘 관용되고, Treg 세포의 극적인 선별적 증가를 유도하고, 환자의 80% 에서 임상적 개선을 초래함을 밝힌다. 이는 인간 자가면역 질환에서 IL-2 면역요법 후 생체내 Treg 유도 및 회복의 첫번째 입증이다. 게다가, 우리는 인간에서 저용량 IL-2 의 현저한 항-염증성 효과를 최초로 밝힌다.

방법

환자

연구에 대한 포함 기준은 다음과 같았다: 1) 양성 HCV RNA 에 의해 정의되는 만성 활성 HCV 감염; 2) (i) 2 회 이상의 측정에서 혈청 크리오글로불린 ≥ 0.05g/ℓ 의 존재 및 (ii) 삼조 (triad) 자반병-관절통-무력증의 존재 또는 (iii) 자반병의 부재시 생검 입증된 혈관염 (신장, 신경 또는 피부) 에 의해 정의되는 MC 혈관염의 병력 [16, 17]; 3) 포함시에 종래의 요법, 즉 항바이러스 요법 (Peg-인터페론-α 및 리바비린) 및/또는 리툭시맙에 대한 저항성 또는 불내성이 있는 임상적 활성 혈관염의 존재; 5) 리툭시맙 또는 항바이러스 요법을 중단한지 각각 최소 6 또는 2 달 후.

배제 기준은 간염 B 바이러스 또는 HIV 에 의한 동시-감염, 간경변, 암 또는 림프종, 최근 6 달 내에 임의의 면역억제제 사용, 약물 중독, 알코올 남용 또는 임신을 포함했다.

연구 디자인

우리는 단일센터 개방형 전향적 제 I/II 상 시험을 수행했다. 5-일 피하 IL-2 요법의 4 사이클을 투여했다. 첫번째 치유를 1 주 입원 동안 1.5 MIU/일 의 용량으로 수행하여 관용 (tolerance) 을 평가했다. 만족스러운 관용에 기초하여, 3 회의 후속 치유를 3 MIU/일 의 용량으로 변경하여 실시했다. 10-일 세척제거 (washout) 후 두번째 치유를 시작했고, 17-일 세척제거 기간 후 2 회의 치유가 뒤따랐다. 연구는 병원 윤리위원회에 의해 승인되었고, 고지에 입각한 동의를 모든 환자로부터 받았다.

각각의 치유의 제 1 일 및 제 5 일에, 치유의 첫번째 및 마지막 IL-2 투여 전에 환자를 평가했다. 또한 마지막 IL-2 투여 후 48 ~ 90 일에 환자를 평가했다.

초기 평가시에, IL-2 의 각각의 과정의 마지막에 (제 1, 3, 6 및 9 주에), 및 추적의 마지막에 임상적, 면역학적, 및 바이러스학적 파라미터를 비교함으로써 치료에 대한 반응을 분석했다. 하기 주된 임상적 징후의 진행을 분석함으로써 임상적 반응을 정의했다: 피부 이환 (자반병 및/또는 다리 궤양의 부재), 말초 신경병증 (2 회의 연속적 검사에서의 임상적 및 전기생리학적 개선), 신장 이환 (단백뇨 및/또는 혈뇨의 소멸 및 혈청 크레아티닌 수준의 정규화), 및 관절통의 부재.

일차 종점은 IL-2 요법의 마지막에 (즉 W9 에서) CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺조절성 T 세포 (Treg) 비율의 4% 절대 증가였다. 이차 종점은 안전성, W9 에서 세포성 및 체액성 면역의 평가, 치료로부터 오랜 후에 (W19) Treg 수준의 지속적 증가, 및 혈관염의 임상적 반응의 평가를 포함했다.

유세포분석법

면역모니터링을 Pitie-Salpetriere Biotherapy department 에서 사용된 이전에 공개된 일상적 방법에 따라 수행했다.

간략히, CYTO-STAT tetraCHROME 키트 (내부표준으로서 플로우카운트 (Flowcount) 형광 비드 및 tetra CXP 소프트웨어를 포함) 와 FC500 세포측정기를 제조사 (Beckman Coulter, Villepinte, France) 의 지침에 따라 사용하여 신선한 혈액 샘플로부터 말초 혈액 단핵구 (PBMC) 부분집합 (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺ T 림프구, CD19⁺ B 림프구 및 CD3^-CD56⁺ NK 세포) 총수 (세포/㎕) 를 밝혔다. 이들 세포의 부분집합을 다색 유세포분석법 및 다양한 형광 마커에 직접 접합된 mAb 를 사용하여 분석했다. 세포 획득 및 유세포분석법에 의한 분석을 FC500 세포측정기 (Beckman Coulter) 를 사용하여 실시했다. 기계 소프트웨어 (CXP 소프트웨어; Beckman Coulter) 와 함께 보정 비드 (calibration bead) (플로우-세트 비드 (Flow-set bead), Cytocomp 키트, 및 CYTO-TROL 대조군 세포) 로 장비 설정 파라미터 [게인 (gain), 보상 (compensation), 및 역치 (threshold)] 를 설정했다. 표준화된 비드 (Flow-check) 로 기계 재현성을 확인했다. CXP 분석 소프트웨어 (Beckman Coulter) 로 데이타를 분석했다.

이들 세포의 부분집합을 다색 유세포분석법을 사용하여 분석했고, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 피코에리트린 (PE), 피코에리트린-텍사스 레드 (ECD), 알로피코시아닌 (APC) 또는 피코에리트린-시아닌 7 (PE-Cya7) 에 직접 접합된 mAb 를 하기에 사용했다: CD3-ECD 또는 -PC7, CD4-ECD 또는 -PC7, CD8-PC7, CD8-APC, CD14-PE, CD16-FITC, CD19-ECD, CD28-FITC, CD45RA-APC, CD45RO-FITC, CD56-PE CD69-PE, CD152-PE 및 HLA-DR-PC7 (모두 Beckman Coulter (Villepinte, France) 사제). CD25-PE, CD25APC, CD27-PE, CD62L-FITC 및 IgD-FITC 는 BD Biosciences (Le Pont De Claix, France) 사제였다. CD127 은 e-Biosciences (San Diego, CA, USA) 사제, 글루코코르티코이드-유도성 종양 괴사 인자-관련 단백질 (GITR)-PE 은 Miltenyi Biothech (Paris, France) 사제였다. 잠재기-연관 펩티드 (LAP)-PE 및 CCR7-PE 항체는 R&D Systems (Abingdon, UK) 사제였다. CD3, CD4, CD127 및 CD25 막 염색 후 Invitrogen (Cergy Pontoise, France) 사제 Fix 및 Perm 시약을 사용하여 세포내 CD152 표지화 (labelling) 를 수행했다. 조화되는 (Matched) 마우스 아이소타입 대조군 항체를 사용했다. APC 항-인간 Foxp3 키트 (PCH101 클론, eBiosciences) 를 제조사의 지침에 따라 사용하여 CD3, CD4, CD127 및 CD25 막 염색 후 핵내 FOXP3 표지화를 실시했다. 랫트 IGg2a APC 를 아이소타입 대조군으로서 사용했다 (eBiosciences,).

세포 획득 및 유세포분석법에 의한 분석을 FC500 세포측정기 (Beckman Coulter) 를 사용하여 실시했다. 기계 소프트웨어 (CXP 소프트웨어; Beckman Coulter) 와 함께 보정 비드 (플로우-세트 비드, Cytocomp 키트, 및 CYTO-TROL 대조군 세포) 로 장비 설정 파라미터 (게인, 보상, 및 역치) 를 설정했다. 표준화된 비드 (Flow-check) 로 기계 재현성을 확인했다. CXP 분석 소프트웨어 및 Kaluza 소프트웨어 (Beckman Coulter) 로 데이타를 분석했다.

세포내 사이토카인 생성의 탐지를 위해, PBMC 를 4 hr 동안 Golgi-Stop (BD Biosciences) 의 존재 하에 50 ng/㎖ PMA 및 1 mM 이오노마이신으로 자극한 후, 제조사의 지침에 따라, 고정 및 투과화 후 항-IFN-g-FITC (eBioscience), 또는 항-IL-17-Alexa Fluor 647 (e-Bioscience) 로 염색했다.

억제 T 세포 검정

세포 억제 검정을 이전에 기재된 바와 같이 수행했다. 간략히, 유세포분석기 (FACS Aria, BD Biosciences) 에 의해 CD3+CD4+CD25+CD127low/- 세포 즉 FACS-분류된 Treg 를 정제하기 위해 PBMC 를 적당한 조합의 mAb 로 염색했다. 그들의 억제 활성을 시험하기 위해, Treg 를 둥근 바닥 96-웰 조직 배양 플레이트에서 200 ㎕ 의 완전 배양 배지 중 자극자 세포로서 10⁴ 방사선조사된 (15 grays) 동종이계 PBMC 의 존재 하에 반응자 세포로서 5×10⁴ 자가 Facs-분류된 CD4+CD25- 세포와 다양한 세포 비 (1/1; 1/2; 1/4; 1/8; 1/16) 로 혼합하여 검정했다. 각각의 배양 조건에 대해 3 회 실시했다. 4 일 후, 세포 증식을 부가적 16 h 동안 1 μCi (0.037 MBq) 의 ³H-티미딘 (Amersham, Buckinghamshire, UK) 의 편입에 의해 확인했고, β-계수기 (counter-WALLAC) 를 사용하여 측정했다. 결과를 분당계산수 (counts per minute) (cpm) 로 표현했고, 증식의 억제의 백분율을 treg 부재시 효과기 세포의 증식 / treg 존재시 효과기 세포의 증식 비에 의해 결정했다.

전사체 연구 (Transcriptome studies)

RNeasy Mini 키트 (QIAGEN, requis, CA) 를 제조사의 지침에 따라 사용하여 RNA 를 생성했다. 7-9.5 의 RNA 완전성 수의 품질을 보여주는 Agilent Bioanalyser (Agilent Technologies) 를 사용하여 RNA 완전성을 평가했다. NanoDrop 1000 분광광도계 (NanoDrop Products, Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 RNA 수율을 평가했다.

제조사의 프로토콜 (Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit; Ambion) 에 따라 총 RNA 를 증폭시키고 비오티닐화된 cRNA 로 전환시켰다.

표지된 cRNA 를 48,000 개 초과의 탐침을 함유했던 Illumina 인간 HT-12 V3 BeadChip 어레이 (Illumina) 에 밤새 혼성화시켰다. 그 후 어레이를 세정하고, 차단하고, 염색하고, 제조사의 프로토콜에 따라 Illumina BeadStation 에서 스캔했다. Illumina BeadStudio 소프트웨어 (Illumina) 를 사용하여 스캔으로부터 신호 강도 값을 생성했다.

변위치 방법 (quantiles method) 에 따라 데이타를 정규화하고, 6 명 중 3 명 이상의 환자에서 치료 후 유의하게 조정되었던 435 개의 선별된 전사물 (transcript) 에 대해 감시되는 계층적 군집화 (supervised hierarchical clustering) 를 수행했다. 조정 역치 비 (Modulation threshold ratios) 를 하향 및 상향-조절된 전사물에 대해 각각 0.6 및 1.5 로 설정했다. 다른 환자들과 너무 다른 조정 프로파일을 나타내는 한 명의 환자를 군집화 분석에서 배제했다. 유전자와 개념 사이의 적절한 상관관계를 식별하기 위한 데이타마이닝 생물정보 솔루션인 PredictSearch^TM 소프트웨어 (Prediguard) 를 사용하여 유전자 서명 (gene signatures) 을 분석하여 기능적 네트워크 (functional networks) 를 생성했다. 이러한 툴은 전체 NCBI Pubmed 데이타베이스로 매일 업데이트되고, 개요 동시인용 (abstracts cocitations) 내에서 유전자-유전자 또는 유전자-개념 사이의 적절한 상관관계를 탐색한다.

상관관계를 또한 NCBI GEO 데이타베이스에 예치된 전사 서명의 전체 집합 (>18000) 와 교차비교하여 검색하고, TranscriptomeBrowser 툴을 사용하여 DBF-MCL 알고리즘으로 추출한다. 게다가 PredictSearch™ 은 KEGG 및 Biocarta 경로 뿐만 아니라 GO 온톨로지 (ontology) 에 따라 조정된 유전자의 주석달기 (annotation) 를 허용한다.

무감독 분석을 위해, 무감독 독립 성분 분석 (Independent Component Analysis) (ICA) 을 사용하여 잠재적 분자 서명을 추출했다. 그러한 서명들을 유전자 집합 강화 분석 (Gene Set Enrichment Analysis) (GSEA) 서명 데이타베이스에 추가하고, GSEA 소프트웨어를 사용하여 우리의 마이크로어레이 데이타에 대한 그들의 유의성에 대해 시험했다. 통계적으로 유의한 분자 서명 (FDR q.값<0.05) 의 GSEA 첨단을 그들의 GO 텀 및 KEGG 경로 강화에 대해 주석달기를 실시했다. 염증, 면역 반응 및 자가면역 병증과 관련된 GO 텀에 대해 강화된 서명을 선별했다. Khi2 검정을 사용하여 이들 선별된 서명이 상향- 또는 하향-조절된 서명의 전체적 분포와 비교시 IL-2-처리된 샘플에서 우선적으로 상향- 또는 하향-조절되었는지 여부를 확인했다.

통계적 분석

CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ 조절성 T 세포의 백분율의 실제 분포가 정상적이라고 추정하면, 10 명의 환자의 샘플 크기는 양면 윌콕슨 부호 순위 검정 (two-sided Wilcoxon signed rank test) 을 사용하여 0.05 의 유의성 수준 (알파) 및 3% 의 차이의 추정된 표준 편차로 4% 의 대응 차이 (paired differences) 의 평균을 탐지하는 94% 파워를 달성한다.

기준선과 W9 또는 IL-2 후 측정값의 비교를 윌콕슨 부호 순위 검정으로 실시했다. 프리드만 검정 (Friedman test) 의 F 근사화 (approximation) 를 사용하여 모든 반복된 측정들 사이를 비교했다 [24]. 다중 비교 및 프리드만 통계량의 기각역 (critical region) 의 근사화를 적절한 경우 수행하였다 [25].

피크값 도달 시간 (Time-to-peak values) (Tmax) 을 실험 데이타로부터 직접 최대 Treg 백분율 (Emax) 의 시간으로서 결정했다.

결과

환자

10 명의 환자를 포함시켰다 (표-1). 포함시, 중간 (Q1-Q3) 연령은 58.5 (49.5-66.2) 세였고, 남성 대 여성 비가 50/50% 였다. MC 혈관염의 임상 징후는 말초 신경병증 (n=8), 자반병 (n=8), 무력증 (n=6), 관절통 (n=3) 및 신장 이환 (n=1) [일일 단백뇨 1.5g, 미세 혈뇨 및 고크레아티닌혈증 74 μmol/L] 을 포함했다. 중간 (Q1-Q3) 크리오글로불린 수준은 모든 사례에서 타입 II IgM 카파의 0.53 (0.26-2.77) g/L 였다. 중간 (Q1-Q3) C4 보체 인자 수준은 0.065 (0.02-0.16) ㎎/L 였고, 류머티즘 인자 활성은 사례의 90% 에서 존재했고, 항핵 항체는 한 명의 환자에서 양성이었다 (1/640 역가에서). 중간 HCV 바이럴 로드는 6.25 (5.5-6.8) Log copies/㎖ 였다; 어떤 환자도 간경변을 갖지 않았다.

저용량 IL-2 의 안전성

치료에 대한 순응도 (compliance) 는 양호했고, 모든 환자가 IL-2 의 모든 4 과정을 완료했다. IL-2 는 임상적으로 그리고 생물학적으로 잘 관용되었다 (표-1). 연구 동안 내내 과립구, 적혈구, 또는 간 효소에서 유의한 변화가 탐지되지 않았다. 무력증 (n=4), 주사 자리에서의 일시적 국소 반응 (n=4), 독감-유사 증후군 (n=4), 근육통 (n=1) 및 고혈압 (n=1) 을 포함하는, 오직 가벼운 임상 등급 (clinical grade) 1 부작용이 관찰되었고, 자발적으로 해소되었다. 특히, 최저 IL-2 투여량, 1.5 MIU/일 에서는 이들 중 어느 것도 발생하지 않았다 (표-1). 전체 치료 및 추적 동안, 병원성 T 세포의 활성화를 나타내는 생물학적 또는 임상적 징후가 없었고: 혈관염 발적이 탐지되지 않았고; 림프양 (lymphoid) 기관 검사는 림프증식성 장애 유도를 시사하는 이상을 보이지 않았다; HCV 바이럴 로드의 증가가 관찰되지 않았다 (표-1 & 도-1A).

HCV-MC 에 대한 저용량 IL-2 의 생물학적 및 임상적 효능

임의의 항바이러스 치료의 부재시, HCV 바이럴 로드는 IL-2 치료 기간 동안 지속적으로 감소했고, W9 (p=0.02) 에서 유의하게 더 낮았다. 역시 지속적으로 감소되었던 (W9 에서, P=0.014), 크리오글로불린 혈청 수준이 먼저 감소되었고 (P=0.003), 한편 C4 는 첫번째 1.5 MIU IL-2 과정 후 반비례하여 증가했다 (P=0.027) (도-1). IL-2 요법 동안 어떠한 환자도 항핵 항체를 발달시키지 않았고, 항핵 항체가 환자 #1 에서 소멸했다.

HCV-MC 혈관염의 개선된 생물학적 파라미터와 일치하게 (도-1), 10 명 중 8 명의 환자는 IL-2 요법 후 현저한 임상적 개선과, 자반병 및 관절통의 소멸 (각각, 8/8 및 3/3 환자) 을 보였다. 환자 #10 에서 신장 파라미터가 정규화되었다 (일일 단백뇨 <0.3g 및 혈뇨의 부재). 현저한 임상적 반응을 보이지 않았던 유일한 환자는 포함시에 오직 신경병증만을 나타냈던 환자였다 (n=2).

저용량 IL-2 는 CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ 조절성 T 세포의 극적 증가를 유도함

IL-2 는 순환성 CD4⁺CD25^hiCD127^-Foxp3⁺Treg 의 극적 증가를 유도했다 (도-2A 및 도-3). 이러한 환자의 군 중 Treg 의 기준선 백분율은, 우리의 이전에 보고된 연구와 일치하게 정상 값 (4.6±0.6) 보다 유의하게 더 낮은, 3.6%±0.23 (평균 +/- sem) 였다. W9 에서, Treg 비율은 11.8%±1.96 (P=0.004) 로, 우리의 일차 효능 기준 종점에 도달했다. 특히, Treg 비율은 IL-2 의 1.5 MIU 의 첫번째 5-일 과정 후 이미 대략 2-배 증가되었다 (도-2A). Treg 비율은 과정 사이의 세척제거 기간 동안 계속 증가되었고, 후속 과정에 의해 추가로 부스팅되었다 (도-2A). 기준선 값과 비교되는, 이들 증가된 Treg 비율은 치료 전체에서 통계적으로 유의했다 (W1 에서 P=0.016 및 W3, 6 및 9 에서 P<0.001). 세번째 IL-2 과정의 마지막에 Treg 비율의 중간 피크 값 (Emax= 14%) 에 도달했고 (중간 Temax= 2.9), 이는 기준선과 비교시 10.3 % 의 증가에 해당하거나 (Emax - 기준선) Treg 의 350% 증가에 해당했다 (Emax/기준선). 치료로부터 오랜 후에 (129 ~ 150 일), Treg 비율은 정상적 혈액 공여자에 대한 값의 범위 내인 기준선 값의 2 배 (6.1% ±0.51, P=0.008) 로 유의하게 상승된 상태로 유지되었다. 마지막으로, 우리는 IL-2 증식된 Treg 의 기능을 평가했고, 그들이 고도로 억제성임을 발견했다 (도-4).

억제자 기능을 갖는 희귀한 CD8⁺CD25^hiFoxp3⁺T 세포의 집단은 정상적 개체에서 탐지될 수 있다 [26] (도-5). 우리는 이들 세포를 IL-2 치료 동안 모니터링했고, CD4⁺ Treg 증가에 수반되는, 그들의 현저한 증가를 관찰했다. 첫번째 과정 후에, 그들의 비율은 대략 500% 증가했고, 그것은 치료 동안 상승된 상태로 유지되었다 (도-2A, 표-2). 전체적으로, CD4⁺ 및 CD8⁺ Treg 의 증가는 CD4/CD8 비의 변화 없이 전체적 Treg/Teff 비의 현저한 증가를 초래한다 (도-2B, 표-2).

총 B 세포 수는 IL-2 치료 동안 첫번째 과정 직후 감소했고, 그 후 요법으로부터 오랜 후에 회복되었다. 이러한 감소는 특히 혈관염 병리생리에 연루되는 IgD⁺CD27⁺ 변연부 B 세포에 영향을 미쳤다 [27] (도-2C, 도-6). 그와 대조적으로, NK 세포의 수의 유의한 증가가 있었으며, 이는 첫번째 IL-2 과정 후에 이미 관찰되었고, 시간의 흐름에 따라 분명한 연속적 증가 경향을 보였다; 이는 IL-2 중단 후 신속히 중단되었다. 특히 높은 수준의 면역조절성 사이토카인을 생성하고 불량하게 세포독성인 CD56^bright NK 세포의 특이적 증가가 있었다 (도-2D, 표-2).

저용량 IL-2 는 PBMC 의 전사체 분석에 의해 밝혀진 염증의 전체적 감소를 유도함

우리는 IL-2 과정 전 및 후에 PBMC 의 전사체를 분석했다 (도-3). 우리는 먼저 유감독 분석을 수행하여, 2 세트의 데이타를 직접 비교하고 2 개의 조건 사이에서 상향- 또는 하향-조절되는 유전자를 탐색했다. 이러한 연구는 먼저 표현형 관찰을 확인하여, Treg 및 NK 세포 기능과 관련되는 유전자의 증가된 발현과 함께, B 세포 기능과 관련되는 유전자의 감소된 발현을 밝혔다 (제시되지 않음). 계층적 군집화 및 데이타 마이닝 접근법은 염증성/산화적 스트레스 매개인자와 연관되는 유전자의 발현의 현저한 증가를 밝혔다 (도-7A). NFKB 경로는 이러한 조절에서 중요하게 연루되는 것으로 보인다 (도-7B). 우리는 이러한 결과를 무감독 (즉 비 가설 추진) 분석에 의해 확인했다. 이러한 접근법에서, 모든 IL-2 전 및 후 전사체 데이타를 함께 혼합하고, 독립적 군에서 데이타의 분리를 최대화하는 서명을 독립 성분 분석 (ICA) 에 기초하여 탐색했다 [28]. 그 후 치료 전 및 후 군을 구별지었던 서명 중에서 유전자 온톨로지 (GO) 텀 및 경로 (GOTP) 를 탐색했다. 상향- 대 하향-조절된 GOTP 의 비는 염증의 경우 0/251 (p=1,3E-40), 면역 반응의 경우 16/684 (p=3,4E-94) 및 림프구 활성화의 경우 77/555 (p=7,0E-49) 였다 (도-3C). 반대로, 우리는 세포 사이클과 관련된 GOTP 가 강화된 1701 상향- 및 208 하향-조절된 서명을 수득했다 (p=1,5E-138). 무작위로 선택된 대조군 텀 (term) 을 이용한 유사한 분석은 강화를 보이지 않았다.

자가면역, 염증성, 및 이식-관련 병증 및 감염성 질환과 관련되는 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 경로 텀에 대해 유사한 분석을 수행했다. 이들 서명은 IL-2 치료 후 우선적으로 하향-조절되었지만 (각각, p=7.6E-09 및 p=7.6E-36), 대조군 병증은 그렇지 않았다.

실시예 2: 제 1 형 당뇨병에서 저용량 IL-2

본 발명자들은, 성체 T1D 환자에서 Treg 을 안전하게 유도할 수 있었던 최저 활성 용량을 정의하는 것을 목적으로, T1D 에서 IL-2 용량-탐색 임상 시험을 개시했다.

DF-IL2 시험은, 위약, 0.3, 1 및 3 MIU/일 Proleukin® 용량 (각각, 1.5, 5 및 15 MIU 의 누적 용량) 을 비교하는, 이중 맹검이었다.

시험의 목적은 T1D 로 최근에 진단된 환자에서 잔류 내생적 인슐린 분비를 보존하는 것일 것이다.

주요 환자 특징: 성인, 양쪽 성, WHO-ADA 로서 T1D 진단, 첫번째 IL-2 투약시 진단으로부터의 질환 지속기간 12 주 미만, 및 진입시 C-펩티드 탐지가능.

임상적으로 의미 있는 효과를 위한 현재의 추천은 활성 치료로 적어도 췌장 β-세포 무리의 보전, 즉 기준선과 비교시 C-펩티드 AUC0-120 의 유지를 목표로 하는 것이다.

모든 24 명의 환자를 포함시켰다. 조사자들은 투여되는 IL-2 용량에 대해 여전히 몰랐지만 (blind), 지금까지 수득된 결과는 IL-2 가 안전함을 보여준다 (어떠한 환자에서도 SAE 가 없었음). 소수의 유해 사건 (경도의 열, 주사 자리에서의 중등도 통증...) 이 일부 환자에서 관찰되었고, 우리의 이전 임상 시험으로부터의 안전성 데이타에 기초하여 40 이 3mIU/일 의 용량과 가장 관련되는 것 같다. 치료를 완료한 처음 16 명의 환자에 대해 Treg 동태의 과도 (interim) 분석을 독립적 통계학자에 의해 그리고 연구를 조사자들에게 맹검 해제 (un-blinding) 하지 않고 수행했다 (규제 기관으로부터의 허가 후). 이러한 과도 연구는 (i) IL-2 가 T1D 환자에서 Treg 를 유도할 수 있고 (ii) 1 MIU/일 의 용량이 2 주 이상 지속되는 양호한 Treg 반응을 유도함을 보여준다 (도 8 참조).

중요하게, 환자에서 C-펩티드 생성의 유의한 감소가 탐지되었다. MMTT [혼합식 관용 시험 (mixed-meal tolerance test)] 후 C-펩티드 측정은 환자에서 5-일 IL-2 치료 후 2 달에 적어도 보존된 또는 때때로 증가된 C-펩티드 생성을 보여주며, 이는 도 9B 의 환자 1 에서 나타난다 (우리는 이러한 환자가 수령한 용량을 모르지만, 치료 동안 관찰된 Treg 의 증가는 그가 위약이 아니라 IL-2 를 수령했음을 시사한다는 점에 유의한다).

성체 T1D 환자에 대한 이러한 첫번째 연구 후, 본 발명자들은 7 세 이상의 환자 (DF-IL2-어린이) 를 포함하는 어린이 T1D 에 대한 두번째 용량 발견 시험을 구상했다. 우리는 상기 시험에서의 우리의 결과에 기초하여 용량 발견 연구를 개량했다. Treg 유도에 대한 효능 및 관용을 확인하는 것을 목적으로, 0.125 ~ 1 MIU/㎡/일 (본원에서 초저용량으로서 정의됨) 의 용량 범위가 1-년 치료 기간 (16 회 주사) 동안 조사된다. 이는 상기 연구에서 100 배 미만 더 높은 2 ~ 16 MIU/㎡ 의 누적 용량에 해당한다.

전체로서, 우리의 임상 결과는 IL-2/IL-2R 활성화 경로가 변경된 T1D 환자에서 IL-2 가 Treg 유도에 효과적이지 않을 수 있다는 염려를 없앤다. 그들은 또한 사용된 용량에서 IL-2 의 우수한 관용을 확인하고, 0.5 MIU/㎡/일 이 최근 진단된 T1D 환자, 어린이 및 성인에서 IL-2 효능을 평가하기에 적당한 용량임을 지지한다.

참고문헌

Claims

3.5 MIU/일 미만의 인터류킨-2 (Interleukin-2) 용량으로 조성물을 투여함으로써 인간 대상에서 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (Interleukin-2) 를 함유하는 조성물로서, 상기 자가면역 장애는 제 I 형 당뇨병, HCV-관련 혈관염 또는 전신성 혈관염인 조성물.
제 1 항에 있어서, 인터류킨-2 (IL-2) 가 2 MIU/일 이하의 용량으로 투여되는, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 인터류킨-2 (IL-2) 가 0.05 MIU ~ 2 MIU/일의 용량으로 투여되는, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 인터류킨-2 (IL-2) 가 1 MIU ~ 2 MIU/일의 용량으로 투여되는, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 1 항에 있어서, IL-2 가 반복적으로 투여되는, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 치료가 적어도 인터류킨-2 가 하루에 한 번 3 연속일 이상 동안 투여되는 첫번째 과정을 포함하며, 그 후 1 ~ 4 주 후에 유지 용량 (maintenance dose) 이 뒤따르는, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 치료가 치료적 (therapeutic) 인, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 치료가 예방적 (preventive) 인, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 장애가 제 I 형 당뇨병인, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 9 항에 있어서, 대상이 제 I 형 당뇨병을 발달시킬 위험에 처해 있고, IL-2 를 이용한 치료가 상기 대상에서 당뇨병의 발병에 예방적인, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 9 항에 있어서, 치료할 대상이 IL-2 의 저생산 (underproduction), 및 인슐린의 잔류 생산 (residual production) 을 보이는, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 인터류킨-2 가 주사 (injection) 에 의해 또는 경구 (oral), 비강 (nasal), 또는 국소 투여 (topical administration) 에 의해 투여되는, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 인터류킨-2 (IL-2) 가 피하 경로 (subcutaneous route) 에 의해 투여되는, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 인터류킨-2 가 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 중에 투여되는, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 인터류킨-2 가 알데스류킨 (Aldesleukin) 인, 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 인터류킨-2 (IL-2) 를 함유하는 조성물.
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