ES2693645T3 - Uso de IL-2 a baja dosis para tratar la diabetes tipo 1 - Google Patents

Abstract

Interleucina-2 (IL-2) para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I en un sujeto humano, en donde IL-2 debe administrarse en una dosis de menos de 3,5 MUI/día, en donde dicha IL-2 es IL-2 humana o un análogo activo de ésta, cuyo análogo activo tiene al menos un 85% de identidad de aminoácidos con la IL-2 humana.

Description

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DESCRIPCION

Uso de IL-2 a baja dosis para tratar la diabetes tipo 1 Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a nuevas terapias de enfermedades humanas basadas en IL-2. Mas espedficamente, la presente invencion se refiere a terapias a baja dosis de IL-2 de la diabetes tipo 1 en sujetos humanos.

Antecedentes de la invencion

La interleucina-2 (IL-2) fue identificada hace casi 30 anos [1] y originalmente se llamo factor de crecimiento de celulas T debido a su capacidad para estimular los linfocitos T in vitro. Es una protema con un peso molecular reportado de entre aprox. 13 kda y 17 kda [2] y un punto isoelectrico de aprox. 6 a 8,7.

La IL-2 se ha utilizado en la clmica para estimular las respuestas inmunes efectivas en canceres y enfermedades infecciosas [3, 4]. Ahora esta autorizado para su uso en humanos para el tratamiento del cancer.

En una de sus indicaciones registradas, el tratamiento complementario del carcinoma de celulas renales (CCR), menos del 10% de los pacientes responden al tratamiento. Esta eficacia limitada de la IL-2 se explica ahora en parte por el reciente descubrimiento de que la IL-2 tambien desempena un papel importante en la supervivencia periferica y la funcion supresora de las celulas T reguladoras (Treg) [5, 6], que se sabe que suprimen las respuestas efectoras antitumorales.

De hecho, la senalizacion del receptor IL-2/IL-2 (IL-2R) es importante durante las respuestas inmunes de las celulas T efectoras (Teff) y Treg. Por un lado, es necesaria una extensa senalizacion de IL-2r para el desarrollo de celulas Teff de corta duracion, diferencial y terminal, que muestren una actividad funcional mejorada, y para obtener la memoria adecuada de las celulas T [7]. Por otro lado, la senalizacion de IL-2/IL-2R es esencial para el desarrollo de Treg y la homeostasis, como lo demuestra el hecho de que los ratones knock-out de IL-2 carecen de Treg. Cabe destacar que los ratones con deficiencia en IL-2 o IL-2R son capaces de desarrollar respuestas inmunitarias efectoras, como lo demuestra su desarrollo de enfermedades autoinmunes mediadas por celulas T (AID) graves.

Estas diferentes consecuencias de las anomalfas de senalizacion de IL-2 se explican ahora por el hecho de que tanto las diferencias cuantitativas como las cualitativas en la senalizacion de IL-2/IL-2R regulan a Treg y Teff. Las Treg parecen requerir un bajo umbral de senalizacion IL-2/IL-2R para apoyar su desarrollo y homeostasis periferica [6]. Se ha demostrado que la administracion de IL-2 conduce a una marcada expansion y activacion de Treg en ratones y humanos [3, 4, 8].

Hoy en dfa, la IL-2 continua siendo utilizada exclusivamente para la inmunoterapia del cancer y no se ha investigado en enfermedades autoinmunes humanas o, mas en general, en enfermedades humanas causadas por una respuesta inmune indeseable. Esto se debe a los riesgos percibidos y esperados asociados con dicho tratamiento. De hecho, la capacidad de IL-2 para estimular Teffs conlleva el riesgo de activar las celulas T muy efectoras que median la enfermedad y, por lo tanto, agravan la enfermedad.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona interleucina-2 (IL-2) para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I en un sujeto humano, en el que la IL-2 debe administrarse a una dosis de menos de 3,5 MUI/dfa.

En el presente documento se describe un metodo para reducir o prevenir una respuesta inmune indeseable en un sujeto humano, comprendiendo el metodo administrar a dicho sujeto una cantidad de interleucina-2 (IL-2) eficaz para estimular los linfocitos T reguladores (Tregs) sin inducir sustancialmente linfocitos T efectores (Teffs).

Se describe adicionalmente un metodo para reducir o prevenir una respuesta inmune no deseable en un sujeto humano, comprendiendo el metodo administrar a dicho sujeto una cantidad de interleucina-2 (IL-2) eficaz para estimular los linfocitos T reguladores (Tregs) sin inducir sustancialmente los efectos secundarios asociados a IL-2.

Tambien se describe un metodo para reducir o prevenir una respuesta inmune indeseable en un sujeto humano, comprendiendo el metodo administrar a dicho sujeto una cantidad de interleucina-2 (IL-2) eficaz para estimular los linfocitos T reguladores (Tregs) sin inducir sustancialmente los efectos secundarios asociados con los linfocitos T efectores (Teffs) e IL-2.

Se describe un metodo para reducir o prevenir una respuesta inmune indeseable en un sujeto humano, comprendiendo el metodo administrar a dicho sujeto una cantidad de interleucina-2 (IL-2) eficiente para cambiar el equilibrio (o la proporcion) entre los linfocitos T reguladores (Tregs) y los linfocitos T efectores (Teffs) (equilibrio Treg/Teff) hacia Tregs en dicho sujeto.

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Se describe aun mas un metodo para reducir o prevenir una respuesta immune indeseable en un sujeto humano, comprendiendo el metodo administrar a dicho sujeto una cantidad de interleucina-2 (IL-2) eficiente para aumentar el equilibrio (o la proporcion) entre los linfocitos T reguladores (Tregs) y los linfocitos T efectores (Teffs) en dicho sujeto.

La presente invencion propone nuevas terapias basadas en IL-2. Se describe en este documento que la IL-2 puede usarse como una nueva clase de farmacos inmunorreguladores y antiinflamatorios que actuan por expansion/activacion de Treg espedfica.

Se describe, por tanto, un metodo para tratar un trastorno autoinmune, relacionado con el sistema inmunologico o inflamatorio en un sujeto humano, comprendiendo el metodo administrar a dicho sujeto una cantidad de interleuquina-2 (IL-2) eficiente para cambiar el equilibrio entre los linfocitos T reguladores (Tregs) y los linfocitos T efectores (Teffs) (equilibrio Treg/Teff) hacia Tregs en dicho sujeto.

Se describe en este documento un metodo para tratar un trastorno autoinmune, relacionado con el sistema inmunitario o inflamatorio en un sujeto humano, comprendiendo el metodo administrar a dicho sujeto una cantidad de interleuquina-2 (IL-2) eficaz para estimular los linfocitos T reguladores (Tregs) sin inducir sustancialmente linfocitos T efectores (Teffs), y/o para disminuir la inflamacion.

Se describe el tratamiento curativo o preventivo de tales trastornos. Mas particularmente, los metodos descritos en este documento previenen la aparicion o el desarrollo de un trastorno autoinmune, relacionado con el sistema inmune o inflamatorio en un sujeto.

La IL-2 suele administrarse repetidamente.

La interleucina-2 para su uso en el tratamiento de un trastorno autoinmune, inmune o inflamatorio debe administrarse a una dosis de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2 millones de unidades internacionales (MUI)/m2/dfa, preferiblemente de aproximadamente 0,1 o 0,2 a aproximadamente 1 MUI/m2/dfa o en una dosis inferior a aproximadamente 3,5 MUIMa.

En una realizacion preferida, se administra en una dosis de aproximadamente 3 MUI/dfa o en una dosis de menos de aproximadamente 2 MUI/dfa, preferiblemente en una dosis de entre aproximadamente 0,1 MUI y aproximadamente 2 MUI/dfa, preferiblemente de aproximadamente 0,3 MUI y aproximadamente 1 MUI/dfa.

El tratamiento puede comprender preferiblemente al menos un primer tratamiento en el que la interleucina-2 se administre una vez al dfa durante al menos 3 dfas consecutivos, preferiblemente durante 3 a 7, aun preferiblemente de 4 a 5 dfas consecutivos. Preferiblemente es seguido por una dosis de mantenimiento despues de dos a cuatro semanas. La dosis de mantenimiento se puede administrar una vez a la semana, o una o dos veces al mes.

En una realizacion preferida, el tratamiento comprende al menos un primer tratamiento en el que se administra una dosis de aproximadamente 0,2 MUI/m2 de interleucina-2 una vez al dfa durante al menos 3 dfas consecutivos, preferiblemente durante 3 a 7, aun preferiblemente de 4 a 5 dfas consecutivos, seguido de una dosis de mantenimiento de aproximadamente 0,2 MUI/m2 despues de una a tres semanas, cuya dosis de mantenimiento se puede repetir cada una a tres semanas. En un aspecto preferido, el sujeto es un adulto al que se le administran aproximadamente 0,3 MUI como dosis diaria de 0,2 MUI/m2.

En otra realizacion preferida, el tratamiento comprende al menos un primer tratamiento en el que se administra una dosis de aproximadamente 0,6 MUI/m2 de interleucina-2 una vez al dfa durante al menos 3 dfas consecutivos, preferiblemente durante 3 a 7, aun preferiblemente de 4 a 5 dfas consecutivos, seguido de una dosis de

mantenimiento de aproximadamente 0,6 MUI/m2 despues de dos a 4 semanas, cuya dosis de mantenimiento se

puede repetir cada dos a cuatro semanas. En un aspecto preferido, el sujeto es un adulto al que se le administra aproximadamente 1 MUI como dosis diaria de 0,6 MUI/m2.

En otra realizacion preferida mas, el tratamiento comprende al menos un primer tratamiento en el que se administra una dosis de aproximadamente 1,8 MUI/m2 de interleucina-2 una vez al dfa durante al menos 3 dfas consecutivos, preferiblemente durante 3 a 7, aun preferiblemente de 4 a 5 dfas consecutivos, seguidos de una dosis de

mantenimiento de aproximadamente 1,8 MUI/m2 despues de aproximadamente uno o dos meses, cuya dosis de

mantenimiento se puede repetir cada uno a dos meses. En un aspecto preferido, el sujeto es un adulto que se

administra con aproximadamente 3 MUI como la dosis diaria de 1,8 MUI/m2.

En terminos generales, se prefiere que la IL-2 se administre en una dosis de D/10 a 20xD, preferiblemente D/5 a 10xD, en donde D es la dosis minima que desencadena la regulacion positiva de la expresion de CD25 en Treg, sin inducir la expansion de Treg. Preferiblemente, la regulacion al alza de la expresion de CD25 es al menos 33%, preferiblemente al menos 50%.

La invencion estimula los linfocitos T reguladores (Tregs) sin inducir sustancialmente linfocitos T efectores (Teffs) en un sujeto humano. Los metodos descritos en este documento hacen posible aumentar el equilibrio Treg/Teff o aumentar la potente poblacion supresora de celulas Treg en dicho sujeto.

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La IL-2 se administra ademas para reducir o prevenir la inflamacion en un sujeto humano.

Se describe ademas un metodo para determinar si un regimen o dosis de IL-2 debe modificarse en un paciente con un trastorno autoinmune, relacionado con el sistema inmunitario o inflamatorio, tratado con IL-2, cuyo metodo comprende monitorear la cantidad del nivel de expresion de Tregs y/o CD25 en Tregs, en donde una cantidad del nivel de expresion de Tregs y/o CD25 en Tregs inferior a un valor de control, significa que la dosis de IL-2 debe aumentarse.

Leyenda de las figuras

Figura 1: Efectos de la dosis baja de IL-2 en marcadores biologicos de vasculitis autoinmune relacionada con el VHC

Se muestran los cambios en el tratamiento del tiempo en la carga viral del VHC (panel A), la crioglobulina (panel B) y los niveles sericos del complemento C4 (panel C). Los datos se expresan como media ± errores estandar (n = 10, *: P <0,05, ** P <0,01, ***: P<0,001).

Figura 2: Efectos de dosis bajas de IL-2 en subpoblaciones de linfocitos

Se muestran cambios en el tratamiento del tiempo de los porcentajes de CD4+CD25hiCD127'Foxp3+ en celulas CD4+ T y de CD8+CD25+Foxp3+ en celulas T CD8+ (panel A), relacion Treg/Teff global (panel B), numeros absolutos de celulas B totales CD19+ y celulas de la zona Marginal B (panel C) y de celulas NK y celulas CD56brightNK (panel D). Los datos se expresan como media ± errores estandar (n = 10, *: P <0,05, ** P <0,01, ***: P<0,001).

Figura 3. Caracterizacion fenotfpica de CD4+ Treg por citometna de flujo. Se muestra la puerta representativa de los linfocitos para la identificacion del subconjunto CD3+CD4+ T. Dentro de las celulas T CD3+CD4+, las Treg se identificaron como celulas CD25highCD127FoxP3+.

Figura 4. Actividad supresora de celulas Treg en pacientes con vasculitis autoinmune relacionada con el VHC bajo tratamiento con IL-2

Los Treg purificados con FACS se evaluaron para determinar su capacidad para suprimir la proliferacion de celulas T efectoras autologas en diferentes proporciones (de 1/1 a 1/8) bajo estimulacion alogenica. Los resultados se expresan en cpm. El experimento mostrado es representativo de 4.

Figura 5. Caracterizacion fenotfpica de CD8+ Treg por citometna de flujo. Se muestran puertas de linfocitos representativas para la identificacion de CD3+CD8+ Treg. Dentro de las celulas T CD3+CD8+, las Treg se identificaron como celulas CD25+FoxP3 +.

Figura 6. Caracterizacion de los subconjuntos de celulas B CD19+ por citometna de flujo

Las poblaciones de subconjuntos de celulas B se definieron como naife (IgD+CD27‘), memoria (IgD'CD27+), zona marginal (IgD+CD27+).

Figura 7: La dosis baja de IL-2 induce una disminucion global de la inflamacion revelada por los analisis de transcriptoma de PBMC

El agrupamiento jerarquico antes y despues del tratamiento con IL-2 (panel A) destaca las regulaciones de disminucion de genes que afectan principalmente a los genes relacionados con las celulas B y los genes proinflamatorios. La minena de datos identifico la via NFKB como central en la disminucion de la respuesta proinflamatoria (panel B). Los genes regulados por disminucion en pacientes tratados con IL-2 se simbolizan en cuadros rojos. Los genes presentes en la firma transcripcional (panel A) se representan esquematicamente en cuadros redondos rellenos. La activacion postranscripcional entre 2 productos geneticos (por ejemplo, por fosforilacion, clivage, etc.) se representa mediante una flecha puntiaguda, y la flecha rellena representa una activacion transcripcional directa. Las flechas punteadas representan la senalizacion indirecta.

La tabla (panel C) muestra los resultados de un ICA de estos datos. Se muestra el numero de firmas reguladas por aumento o por disminucion en el grupo tratado con IL-2 que tienen un enriquecimiento significativo para los terminos GO y las vfas de KEGG relacionadas con la inflamacion, la respuesta inmune y la enfermedad autoinmune (diabetes mellitus tipo I, lupus eritematoso sistemico, enfermedad tiroidea autoinmune), trasplante (enfermedad de injerto contra huesped y rechazo de aloinjerto) o patologfas inflamatorias relacionadas con la infeccion (enfermedad de Chagas, leishmaniasis, infeccion por Helicobacter pylori, malaria, amebiasis, shigelosis, todas caracterizadas por un alto grado de inflamacion). Como controles, se probo el mismo numero de terminos GO seleccionados aleatoriamente, junto con los terminos GO relacionados con el ciclo celular y las patologfas de control. Para cada termino GO o ruta KEGG, el valor p de prueba de Khi2 indica un posible sesgo de enriquecimiento para las firmas reguladas por aumento o por disminucion en comparacion con las firmas reguladas por aumento (2527) o por disminucion (3429) en general.

Figura 8: La dosis baja de IL-2 induce Treg en pacientes con diabetes de tipo I.

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La Figura 8 muestra la relacion Treg/TcD4 en pacientes administrados con 0,33, 1 o 3 MUI^a de IL-2 (Proleukin®) durante 5 d^as. El aumento maximo de Treg es relativamente similar a las diferentes dosis, pero la duracion del efecto depende de la dosis, y proporciona informacion para definir el programa del tratamiento de mantenimiento (es decir, cuanto menor sea la dosis, menor sera el retraso entre las inyecciones de mantenimiento).

Figura 9: La dosis baja de IL-2 no disminuyo la produccion de peptido C.

La Figura 9A muestra la relacion Treg/TcD4 en un paciente administrado con IL-2 (Proleukin®) durante 5 dfas. La Figura 9B muestra la concentracion de peptido C serico antes y despues de la administracion de IL-2, en el mismo paciente. Hay un aumento en Treg durante el tratamiento, que se correlaciona con un aumento en la produccion de peptido C a los 2 meses.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion muestra inesperadamente, por primera vez, la expansion in vivo de Treg supresoras muy potentes sin la expansion de Teff, ni la aparicion de eventos adversos, a traves de una inmunoterapia con dosis bajas de IL-2 en pacientes autoinmunes humanos.

IL-2 se utiliza exclusivamente para la inmunoterapia del cancer y no se ha investigado solo en enfermedades autoinmunes en humanos. De hecho, la capacidad de IL-2 para estimular Teffs conlleva el riesgo de activar las celulas T muy efectoras que median la autoinmunidad. En este documento, se muestra evidencia biologica de que la IL-2 se puede usar bajo condiciones que inducen Treg sin inducir Teff, concordante con la evidencia clmica que muestra que no se observaron eventos adversos relacionados con la activacion inmunitaria. De acuerdo con esta invencion, la IL-2 inclina claramente el balance de Treg/Teff a favor de las Treg, como tambien lo apoya el contexto inflamatorio reducido globalmente durante la terapia con IL-2.

En los primeros ensayos en pacientes relacionados con el VHC, los inventores demostraron que la dosis baja de IL- 2 es bien tolerada, induce un aumento espectacular y selectivo en las celulas Treg y conduce a una mejona clmica en el 80% de los pacientes.

Con un tratamiento de 5 dfas de 1,5 M de UI/dfa, se observo un aumento significativo de Treg en todos los pacientes (un aumento de 2 veces), sin efectos secundarios. Despues de tratamientos adicionales de 5 dfas de 3MUI/dfa, se observo un aumento adicional de Tregs.

Los resultados de los inventores muestran que el tratamiento fue bien tolerado, sin cambios significativos en granulocitos, globulos rojos o enzimas hepaticas. Ademas, a la dosis de 1,5 MUI/dfa, no se observaron efectos secundarios como la astenia, reacciones locales transitorias en los sitios de inyeccion, smdrome del tipo gripe, mialgia o hipertension.

Es importante destacar que, durante todo el tratamiento y el seguimiento, no hubo signos biologicos o clmicos que indicaran la activacion de celulas T patogenas.

Un tratamiento de 1,5 MUI/dfa durante 5 dfas representa hasta ahora la dosis mas baja de IL-2 con eficacia y seguridad comprobadas para fines de induccion de Treg en seres humanos.

Ademas, la presente invencion revelo, por primera vez, una marcada actividad antiinflamatoria de IL-2. Los analisis de transcriptomas no supervisados de los inventores mostraron una clara regulacion a la baja de las firmasMas asociadas con muchas enfermedades autoinmunes e inflamatorias, asf como enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario, como la enfermedad de injerto contra huesped y el rechazo de aloinjerto. Con este estudio, que muestra que es posible usar IL-2 para estimular Treg sin estimular Teff en seres humanos, los inventores proponen que los tratamientos con dosis bajas de IL-2 cambiaran profundamente los paradigmas preventivos y terapeuticos para todas estas enfermedades.

Los inventores han continuado con la prueba de dosis bajas de IL-2 en otra enfermedad autoinmune, a saber, la diabetes tipo I, lo que confirma el interes de las dosis bajas de IL-2 en el tratamiento de dicho trastorno.

Por lo tanto, la presente invencion proporciona nuevos enfoques terapeuticos para tratar la diabetes tipo I utilizando IL-2. La invencion describe que la IL-2, a dosis bajas, puede activar o expandir efectivamente la poblacion de celulas Treg supresoras en sujetos que tienen diabetes tipo I, sin activar sustancialmente las celulas T efectoras.

El sujeto es cualquier paciente humano, independientemente de su edad o genero. En una realizacion particular, el paciente puede ser un nino o un adolescente.

Interleucina-2 (IL-2)

En el contexto de esta invencion, el termino "IL-2" designa cualquier fuente de IL-2, incluidas las fuentes de mairnferos tales como, por ejemplo, ser humano, raton, rata, primate y cerdo, y puede ser nativo u obtenido mediante tecnicas recombinantes o sinteticas, incluyendo polipeptidos de IL-2 recombinantes producidos por huespedes microbianos. IL-2 puede ser o comprender la secuencia polipeptfdica nativa, o puede ser una variante

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activa del polipeptido IL-2 nativo. Preferiblemente, el polipeptido de IL-2 o variante activa se deriva de una fuente humana, e incluye IL-2 humana recombinante, particularmente IL-2 humana recombinante producida por huespedes microbianos.

Las variantes activas de IL-2 se han descrito en la bibliograffa. Las variantes de la IL-2 nativa pueden ser fragmentos, analogos y derivados de los mismos. Por "fragmento" se entiende un polipeptido que comprende solo una parte de la secuencia de polipeptidos intacta. Un "analogo" designa un polipeptido que comprende la secuencia del polipeptido nativo con una o mas sustituciones, inserciones o deleciones de aminoacidos. Las mutemas y los pseudopeptidos son ejemplos espedficos de analogos. Los "derivados" incluyen cualquier polipeptido IL-2 nativo modificado o fragmento o analogo de este, como glicosilado, fosforilado, fusionado con otro polipeptido o molecula, polimerizado, etc., o mediante modificacion o adicion qrnmica o enzimatica para mejorar las propiedades de IL-2 (por ejemplo, la estabilidad, la especificidad, etc.). Las variantes activas de un polipeptido de IL-2 de referencia generalmente tienen al menos un 75%, preferiblemente al menos un 85%, mas preferiblemente al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoacidos con la secuencia de aminoacidos del polipeptido de referencia IL-2.

Los metodos para determinar si un polipeptido variante de IL-2 esta activo estan disponibles en la tecnica y se describen espedficamente en la presente invencion. Una variante activa es, lo mas preferiblemente, una variante que activa Tregs.

Ejemplos de variantes de IL-2 se describen, por ejemplo, en los documentos EP109748, EP136489, US 4.752.585; EP200280, o EP118,617.

Preferiblemente se utiliza una IL-2 recombinante, es decir, una IL-2 que se ha preparado mediante tecnicas de ADN recombinante [9]. El organismo huesped utilizado para expresar un ADN recombinante que codifica IL-2 puede ser procariotico (una bacteria como E. coli) o eucariotico (por ejemplo, una celula de levadura, hongo, planta o marnffero). Los procesos para producir IL-2 se han descrito, por ejemplo, en los documentos US 4.656.132; US 4.748.234; US 4.530.787; o US 4.748.234.

En una realizacion preferida, la invencion usa una IL-2 de origen humano, o una variante activa de la misma, mas preferiblemente producida de forma recombinante. Se describen una secuencia de nucleotidos y aminoacidos de la IL-2 humana, por ejemplo, en Genbank ref 3558 o P60568, respectivamente. La invencion mas preferiblemente utiliza una IL-2 humana.

La IL-2 para uso en la presente invencion estara en forma esencialmente pura, por ejemplo, a una pureza del 95% o mas, mas preferiblemente 96, 97, 98 o 99% pura.

Para su uso en la presente invencion, la IL-2 tfpicamente no se combina o coadministra con ningun agente supresor de Teff. Sin embargo, aunque no se prefiere ni se requiere, pueden contemplarse combinaciones de farmacos.

IL-2 se puede usar en forma monomerica o multimerica.

La IL-2 esta disponible comercialmente, incluso para usos farmaceuticos, y esta autorizada para su uso en pacientes humanos. Las formas comerciales adecuadas incluyen, por ejemplo,

- Proleukin®, (aldesleukin®), una interleucina-2 humana de serina-125 des-alanil-1 desglicosilada, producida en E. coli.

- Roncoleukin®, IL-2 humana recombinante producida en levadura.

La interleucina-2 puede usarse sola o en combinacion con cualquier otro agente terapeuticamente activo. En una realizacion preferida, la IL-2 no se administra en combinacion con rapamicina cuando se usa para prevenir o tratar la diabetes tipo I.

Celulas T Reguladoras

Las celulas T reguladoras son linfocitos T que tienen actividad inmunosupresora. Las Treg naturales se caracterizan como celulas CD4+CD25+Foxp3+. Los seres humanos y los ratones que presentan un deficit genetico en Tregs desarrollan multiples enfermedades autoinmunes espedficas de organos mediadas por las celulas T. Se ha descrito un defecto cuantitativo o cualitativo de Treg en muchas enfermedades autoinmunes humanas, que incluyen lupus eritematoso sistemico (LES), diabetes tipo I, esclerosis multiple, uveitis y miositis. Por el contrario, la adicion/restauracion de Treg induce mejoras clmicas en la mayona de los modelos animales de estas enfermedades.

Las Treg tambien desempenan un papel importante en el control de las enfermedades inflamatorias, aunque su modo de accion en dicha enfermedad no se conoce bien. De hecho, en la mayona de las enfermedades inflamatorias, el agotamiento de Treg exacerba la enfermedad, mientras que la adicion de Treg la disminuye. Esto se muestra, por ejemplo, en el contexto de la aterosclerosis. Aunque esta enfermedad no es principalmente una enfermedad inflamatoria, su desarrollo implica un componente/bucle inflamatorio. En ratones deficientes en apolipoprotema E (ApoE) que desarrollan espontaneamente aterosclerosis, el agotamiento de Treg agravo

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significativamente la formacion de placa, mientras que la inyeccion de Treg policlonal mejoro significativamente la enfermedad.

La mayona de las Treg son celulas CD4+, aunque tambien existe una poblacion rara de linfocitos T CD8+ Foxp3 + T con actividad supresora.

Celulas T efectoras

En el contexto de esta solicitud, las "celulas T efectoras" (o "Teff') designan linfocitos T convencionales distintos de las Treg (a veces tambien denominadas Tconv en la bibliograffa), que expresan uno o mas receptores de celulas T (TCR) y realizan funciones efectoras (p. ej., actividad citotoxica, secrecion de citoquinas, anti-auto reconocimiento, etc.). Las principales poblaciones de Teff humanos de acuerdo con esta invencion incluyen linfocitos T auxiliares CD4+ (por ejemplo, Tho, Th1, Thl7) y linfocitos T citotoxicos CD4+ o CD8+, y pueden ser espedficos para antfgenos propios o no propios.

En la situacion particular de una enfermedad autoinmune, las celulas Teff incluyen la poblacion de celulas T responsable o involucrada en la enfermedad. Por ejemplo, dicha poblacion de celulas T incluye linfocitos T que reconocen un antfgeno propio, como un antigeno tiroideo, un antfgeno articular, un antfgeno de islote p-Langherans, etc. En una enfermedad de GVHD, las celulas de Teff incluyen linfocitos T del injerto.

Amplificacion selectiva de Tregs

En el contexto de esta invencion, una estimulacion (o induccion o activacion o amplificacion) de Treg designa cualquier aumento en la proporcion de celulas Treg en relacion con Teffs, en numero o en actividad, segun lo probado por ensayos supresores o por la expresion de moleculas que reflejen la actividad de las Treg, como CD25, la cadena alfa del receptor de IL-2, en un paciente. El aumento en la proporcion es, preferiblemente, de, al menos, un 20% en comparacion con el nivel antes del tratamiento, mas preferiblemente de, al menos, un 40%, incluso mas preferiblemente de, al menos, un 60%. En una realizacion particular y preferida, la estimulacion designa un cambio en el equilibrio Treg/Teff hacia Tregs, o un aumento en la relacion Treg/Teff.

Un aspecto esencial de la invencion reside, de hecho, en la capacidad, in vivo, en pacientes humanos que tienen un trastorno autoinmune, relacionado con el sistema inmunitario o inflamatorio, para estimular las Treg sin inducir sustancialmente a Teff.

La induccion (o activacion o expansion) de Tregs se puede medir como se describe en los ejemplos, por ejemplo, midiendo el numero de Tregs (por ejemplo, en base a la expresion de CD25, FoxP3, etc.) y/o la actividad de Tregs en muestras del sujeto tratado. La ausencia de induccion sustancial (o activacion o expansion) de Teff tambien se puede medir como se describe en los ejemplos, por ejemplo, midiendo el numero de Teff y/o la actividad de Teff en muestras del sujeto tratado. Previamente, la ausencia de una induccion sustancial indica que la poblacion de celulas Teff diana no adquiere marcadores de activacion como CD25, CD69 y/o HLA-DR, o segun lo evaluado por el analisis del transcriptoma completo. Los metodos detallados para detectar, medir y cuantificar celulas Treg y Teff son ampliamente conocidos per se en la tecnica y algunos se describen en los ejemplos.

La estimulacion en Tregs puede medirse por un aumento en los recuentos de Treg en el paciente, tfpicamente, por lo menos, en un 10%, o por un aumento en los marcadores de activacion, como la intensidad de la expresion de CD25. La ausencia de induccion de Teff tfpicamente indica que la poblacion de celulas Teff no ha aumentado en mas del 10% en dicho sujeto como resultado del tratamiento.

La estimulacion de Treg y la ausencia de una induccion sustancial de Teff se evalua preferiblemente mediante una medida de la relacion o la proporcion Treg/Teff en el sujeto tratado. Esta proporcion se calcula, por ejemplo, en funcion del numero de Tregs y el numero de Teff en una muestra del sujeto. Como se ilustra en los ejemplos, tal proporcion tfpicamente aumenta en, al menos, un 20% en los pacientes tratados, mas preferiblemente en, al menos, un 30%, 40% o 60%.

El porcentaje de referencia de Treg en sujetos humanos, es decir, la proporcion de Tregs/Teffs CD4+, es de aprox. 4,6+ 0,6% (el % de referencia en pacientes con enfermedad autoinmune puede ser mucho mas bajo, como se muestra en el Ejemplo 1, donde los pacientes con vasculitis autoinmune inducida por el VHC tuvieron un nivel de porcentaje de referencia de 3,6% + 0,23 solamente, aunque estos numeros pueden variar de un laboratorio a otro, segun los aspectos tecnicos de la medida).

Los resultados presentados en esta solicitud muestran que, despues de 1 ciclo de tratamiento con 1,5 MUI/dfa, se obtiene un aumento de 2 veces (100%) en el % de referencia de Treg, que puede amplificarse aun mas con un tratamiento adicional. Dependiendo del protocolo, se han obtenido incrementos superiores al 300%. Se ha observado un aumento similar de 2 veces despues de 1 tratamiento de 5 dfas en pacientes con T1D, independientemente de la dosis utilizada (0,33; 1 y 3 MUI/dfa).

En una realizacion preferida, el metodo permite un aumento del 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100% o mas de la relacion Treg/Teff en un sujeto.

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Ademas, la invencion muestra un aumento no solo en Treg CD4+, sino tambien en una poblacion rara de Treg que son CD8+.

En una realizacion particular, la invencion incrementa las Tregs circulantes CD4+CD25hiCD127'TFoxp3+.

En otra realizacion particular, la invencion incrementa las Tregs CD8+CD25hiFoxp3+.

Otro aspecto importante es que la poblacion de celulas Treg amplificadas es altamente supresiva. De hecho, los resultados presentados muestran que, tras el tratamiento de acuerdo con la invencion, las Treg se activan con una potente actividad supresora hacia las celulas Teff. En nuestro estudio, se pudo detectar una actividad supresora sustancial (> 75%) a una relacion Treg/Teff de 1/8 en un ensayo supresor clasico en el que las Treg de un individuo normal no tratado dan tal supresion en una relacion de 1/2 a 1/4.

Por lo tanto, la invencion permite un aumento sustancial de Treg en sujetos humanos que tienen enfermedades autoinmunes, sin una alteracion sustancial o activacion de linfocitos T efectores. En una realizacion preferida, el metodo de la invencion es un metodo que incrementa en, al menos, un 30% las Treg CD25+Foxp3+ en un sujeto y que causa menos del 5% de aumento en las Teff diana en dicho sujeto.

Ademas, la invencion muestra inesperadamente que, a dosis de administracion preferidas, las terapias basadas en IL-2 de la invencion no inducen esencialmente hipertension arterial; dolores de cabeza, nauseas, artralgias, mialgias o smdromes tipo gripe, ni muchos otros efectos secundarios conocidos de IL-2, como se describe en el Resumen de Caractensticas de Productos de IL-2 de la FDA). Por lo tanto, es posible utilizar la terapia con IL-2 en sujetos humanos que tienen trastornos relacionados con el sistema inmune, sin activar sustancialmente las celulas Teff y sin inducir sustancialmente los efectos secundarios asociados a la IL-2, mientras que inducen muy sustancialmente las Treg y el efecto antiinflamatorio.

Dosis de IL-2

Para su uso en la presente invencion, la IL-2 se administra en una dosis que activa eficazmente las Treg sin activar sustancialmente Teffs. La consecuencia es un aumento dramatico en la proporcion Treg/Teff en el sujeto.

La dosis efectiva puede ser ajustada por el medico, basandose en la informacion contenida en la presente solicitud. En particular, con el conocimiento de la presente invencion que, en pacientes con enfermedad autoinmune, la IL-2 puede administrarse en condiciones que activen Tregs y que, esencialmente, no activen Teff; la persona experta puede ser capaz de ajustar las dosis a cada paciente y condicion.

Normalmente, la IL-2 se administra a una dosis de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2 MUI/m2/dfa, preferiblemente de 0,2 a aproximadamente 1 MUI/m2/dfa.

La cantidad de IL-2 para administrar depende asp de preferencia, del area de superficie corporal del sujeto. El area de superficie corporal (BSA) es la superficie medida o calculada de un cuerpo humano.

Se han publicado varios calculos para llegar al BSA sin medicion directa:

La formula de Dubois & Dubois [18] se usa comunmente en adultos:

. . peso - altura (cn=

peso (kgV'v,'''r‘ x altura' (con)

,0.725

139.2

Otra formula comunmente utilizada es la formula de Mosteller [19] adoptada para ser utilizada por el Comite de Farmacia y Terapeutica del Cross Cancer Institute, Edmonton, Alberta, Canada:

BSA{m2) = y

peso(k:;.: x altura - peso ! - altura Vn)

,u a

3600

Se utiliza mas particularmente en ninos.

La BSA promedio generalmente se toma en 1,73 m2 para un adulto.

Valores BSA promedio

Neonato (recien nacido) 0,25 m2

Nino 2 anos 0,5 m2

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Nino de 9 anos

1,07 m

Nino 10 anos

1,14 m

Nino 12-13 anos

1,33 m

Para hombres

1,9 m2

Para mujeres

1,6 m2

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Tfpicamente, la dosis segun la invencion es inferior a 3,5 millones de UI^a/paciente, mas preferiblemente inferior a 3,0 millones de UI/dfa/paciente, incluso mas preferiblemente inferior a 2,5 millones de UI/dfa/paciente, aun mas preferiblemente inferior a 2,0 millones de Ul/dfa/paciente.

El tratamiento se repite tipicamente, es decir, las dosis bajas de IL-2 anteriores se administran varias veces a un sujeto, para lograr progresivamente el beneficio mas sustancial. La dosis y el programa de administracion vanan segun el objetivo preventivo o terapeutico del tratamiento, asf como tambien segun la enfermedad que se va a tratar/prevenir. El efecto del tratamiento se puede controlar mediante medidas Treg y la dosis y el calendario de administracion se ajustan en consecuencia.

Las dosis ejemplares estan entre 0,1 y 3 MUI, preferiblemente de 0,1 a 1,5 MUI, aun preferiblemente de 0,25 a 1 MUI. Las dosis preferidas son:

- 3,0 M UI/dfa/paciente,

- 2,5 M UI/dfa/paciente,

- 2,0 M UI/dfa/paciente,

-1,5 M UI/dfa/paciente,

-1,0 M UI/dfa/paciente,

- 0,5 M UI/dfa/paciente,

- 0,3 MUI/dfa/paciente -0,1 M UI/dfa paciente,

- 0,05 M UI/dfa paciente,

- 0,02 M UI/dfa paciente, o

- 0,01 M UI/dfa paciente.

Estas dosis se pueden combinar, dependiendo del sujeto y la evolucion de la enfermedad.

El tratamiento se puede proporcionar como tratamientos de varios dfas, por ejemplo, 1-7 dfas de administracion diaria, preferiblemente entre 3 y 5 dfas. Dichos tratamientos de tratamiento pueden reproducirse en diferentes penodos de tiempo, interrumpidos por penodos sin tratamiento. En un contexto preventivo, la IL-2 puede administrarse en la dosis anterior en inyecciones individuales, a diferentes intervalos de tiempo, por ejemplo, una vez a la semana durante largos penodos de tiempo. Se pueden ajustar diferentes protocolos segun el paciente y la enfermedad.

La dosis de mantenimiento se puede administrar de dos a ocho semanas despues de que se completara el ciclo de inicio. Preferiblemente, la dosis de mantenimiento es la misma que la dosis inicial.

Determinacion de la dosificacion:

En terminos generales, la IL-2 se puede administrar a una dosis de D/10 a 20xD, preferiblemente de D/5 a 10xD, en donde D es la dosis minima que activa la induccion de la expresion de CD25 en Treg, sin inducir la expansion de Treg.

Este metodo para determinar la dosis baja apropiada de IL-2 es particularmente util cuando se contempla una via de administracion diferente de la subcutanea.

Especialmente tal dosis puede ser util en la administracion oral, nasal o rectal.

La determinacion de los niveles de CD25 se puede lograr utilizando anticuerpos anti-CD25 en la citometna de flujo.

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A este respecto, las muestras que contienen linfocitos pueden fijarse con un agente de fijacion adecuado (por ejemplo, paraformaldetndo, que se puede usar al 1% en solucion salina tamponada con fosfato (PBS)) para permitir la posterior cuantificacion o determinacion cualitativa del marcador de superficie celular (por ejemplo, mediante el uso de citometna de flujo) segun sea conveniente (por ejemplo, despues del transporte desde el sitio de recoleccion y cultivo de la muestra que contiene linfocitos hasta un laboratorio de citometna de flujo). Los anticuerpos monoclonales anti-CD25 (mAbs) disponibles en el mercado y etiquetados a diferentes fluorocromos como Alexa488 (Molecular Probes, Oregon, EE. UU.) y FITC (Sigma) estan disponibles.

A continuacion, se proporcionan ejemplos de dosis y programas de administracion.

Tratamiento de la diabetes tipo 1

La diabetes tipo 1 (T1D) se debe a la destruccion autoinmune de las celulas productoras de insulina en el pancreas. En muchos pacientes se puede encontrar un defecto en la via de activacion del receptor de IL-2/IL-2. Ademas, la IL- 2 puede prevenir la aparicion de diabetes tipo 1 en modelos de ratones con T1D (ratones NOD) y la IL-2 administrada muy pronto, despues de la aparicion de la diabetes, puede revertir la diabetes.

Sin embargo, la aparicion de un nuevo inicio de T1D se ha descrito en pacientes con cancer tratados con dosis bajas de IL-2. Por lo tanto, el tratamiento de pacientes humanos con T1D con IL-2 no es sencillo y no ha iniciado anteriormente ningun tratamiento de este tipo solo con IL-2. El ejemplo 2 muestra los primeros resultados en un ensayo doble ciego en pacientes con T1D administrados con dosis bajas de IL-2 (0,33, 1 o 3 MUI/dfa) durante 5 dfas.

Por lo tanto, los inventores ahora describen un metodo para 1) prevenir y 2) tratar el T1D usando una dosis baja de IL-2, especialmente el T1D de inicio reciente.

La interleucina-2 se recomienda especialmente en los sujetos con riesgo de desarrollar diabetes tipo I. En ese caso, el tratamiento con IL-2 es preventivo en la aparicion de la diabetes en dicho sujeto. En el contexto de la prevencion, los pacientes con riesgo de T1D (es decir, pacientes provenientes de familias con antecedentes de T1D o pacientes con polimorfismo genetico de la via de activacion del receptor de IL-2/IL-2 asociados con una mayor frecuencia de T1D, y/o pacientes en los que se han detectado autoanticuerpos contra antfgenos, como insulina, GAD, protema asociada a insulinoma 2 (IA2) y tirosina fosfatasa o transportador de zinc 8 (ZnT8) (o anticuerpos que se han asociado con T1D) se tratan con dosis bajas de IL 2, impidiendo asf la activacion de las celulas T efectoras que generaran T1D.

En este contexto, el tratamiento utiliza dosis de IL-2 iguales o inferiores a 3 M UI/dfa o, incluso en una realizacion preferida, por debajo de 1 o 0,5 M UI por dfa, y el tratamiento se administra una vez cada dos semanas, o preferiblemente una vez cada 3 semanas o preferentemente una vez al mes. El tratamiento se puede ajustar (dosis o programa) en funcion de la proporcion y funcion de Treg.

En otra realizacion particular, un tratamiento candidato preferido muestra una subproduccion de IL-2 y una produccion residual de insulina.

De hecho, en el entorno terapeutico, el uso preferido de los inventores es para pacientes recien diagnosticados con T1D que se sabe que todavfa tienen una masa restante de celulas productoras de insulina en el pancreas. En una realizacion particular, la interleucina 2 en este contexto puede administrarse a una dosis de 3 millones de unidades por dfa durante 3 a 7 dfas y, luego, se pueden administrar otros tratamientos de IL-2 al menos una vez al mes como se describe anteriormente. El tratamiento se puede ajustar (dosis o programa) en funcion de la proporcion y funcion de Treg.

En una realizacion preferida, el tratamiento comprende al menos un primer tratamiento en el que se administra una dosis de aproximadamente 0,2 MUI/m2 de interleucina-2 una vez al dfa durante al menos 3 dfas consecutivos,

preferiblemente durante 3 a 7, aun preferiblemente de 4 a 5 dfas consecutivos, seguido de una dosis de

mantenimiento de aproximadamente 0,2 MUI/m2 despues de una a tres semanas, cuya dosis de mantenimiento se puede repetir cada una a tres semanas. En un aspecto preferido, el sujeto es un adulto al que se le administran aproximadamente 0,3 MUI como dosis diaria de 0,2 MUI/m2.

En otra realizacion preferida, el tratamiento comprende al menos un primer tratamiento en el que se administra una dosis de aproximadamente 0,6 MUI/m2 de interleucina-2 una vez al dfa durante al menos 3 dfas consecutivos, preferiblemente durante 3 a 7, aun preferiblemente de 4 a 5 dfas consecutivos, seguido de una dosis de

mantenimiento de aproximadamente 0,6 MUI/m2 despues de dos a 4 semanas, cuya dosis de mantenimiento se

puede repetir cada dos a cuatro semanas. En un aspecto preferido, el sujeto es un adulto que se administra con aproximadamente 1 MUI como dosis diaria de 0,6 MUI/m2.

En otra realizacion preferida, el tratamiento comprende al menos un primer tratamiento en el que se administra una dosis de aproximadamente 1,8 MUI/m2 de interleucina-2 una vez al dfa durante al menos 3 dfas consecutivos, preferiblemente durante 3 a 7, aun preferiblemente de 4 a 5 dfas consecutivos, seguidos de una dosis de mantenimiento de aproximadamente 1,8 MUI/m2 despues de aproximadamente uno o dos meses, cuya dosis de

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mantenimiento se puede repetir cada uno a dos meses. En un aspecto preferido, el sujeto es un adulto que se administra con aproximadamente 3 MUI como la dosis diaria de 1,8 MUI/m2.

Se prefiere la via subcutanea.

Ejemplos adicionales del regimen para controlar los brotes:

- Infusion continua de 24 h durante 5 a 7 dfas de 0,1 a 3,5 6 3 M UI/dfa

- Dosis repetidas una vez al dfa durante 5 a 30 dfas en dosis diarias de 0,1 a 3,5 6 3 M UI/dfa

- Dosis repetidas una vez cada dos dfas durante 15 a 30 dfas a una dosis diaria de 0,1 a 3,5 6 3 M UI/dfa

- Dosis repetidas una vez al dfa durante 3 dfas consecutivos en una semana durante 2 a 4 semanas consecutivas a dosis diarias de 0,1 a 3,5 M o 3 UI/dfa

Ejemplos de regimen de mantenimiento y/o prevencion:

- Dosis repetidas diariamente de uno a siete dfas en una semana cada dos a seis semanas con dosis diarias de 0,1 a 3,5 6 3 M IUMa

- Dosis repetidas una vez al dfa durante 5 a 30 dfas cada 3 a 6 meses a dosis diarias de 0,1 a 3,5 6 3 M UI/dfa

- Dosis repetidas una vez al dfa durante 5 a 30 dfas una vez al ano con dosis diarias de 0,1 a 3,5 6 3 M UI/dfa

- Dosis repetidas una vez al dfa durante 1 a 3 dfas, cada 1 a 3 meses, en dosis diarias de 0,1 a 3,5 o 3 M IU/dfa

- Dosificaci6n de mantenimiento de 0,01 a 1 M UI/dfa, 1 dfa cada semana

La necesidad de administrar multiples ciclos de un regimen de dosificaci6n de IL-2 constante o multiples ciclos de un regimen de dosificaci6n de IL-2 de multiples niveles es a discreci6n del medico responsable y puede evaluarse mediante el seguimiento de las celulas Treg en sujetos en tratamiento con el metodo de la invenci6n.

En una realizaci6n preferida, en un paciente con enfermedad autoinmune, es mejor alcanzar y/o mantener el nivel de porcentaje de Tregs entre 5-10% de celulas T totales.

En un contexto preventivo, es deseable alcanzar y/o mantener el nivel de porcentaje de Tregs entre un 4,5-7% de celulas T totales.

Las dosis de IL-2 pueden adaptarse segun la respuesta de los pacientes, es decir, los efectos sobre el porcentaje de Treg y su estado de activaci6n (CD25).

Por lo tanto, se describe un metodo para determinar si un regimen o dosis de IL-2 debe modificarse en un paciente con un trastorno autoinmune, inmunol6gico o inflamatorio, tratado con IL-2, cuyo metodo comprende monitorear la cantidad de Tregs y/o el nivel de expresi6n de CD25 en Tregs.

Una cantidad de Tregs, y/o un nivel de expresi6n de CD25 en Tregs inferior al valor de control, significa que la dosis de IL-2 debe aumentarse. El valor de control es generalmente la cantidad de referencia del nivel de expresi6n de Tregs y/o CD25 en el paciente, antes de cualquier tratamiento.

En una realizaci6n particular, dicha cuantificaci6n se puede llevar a cabo cuando se inicia el tratamiento (por ejemplo, entre 3 y 5 dfas despues de la primera administraci6n). Si los porcentajes de Tregs o los niveles de expresi6n de CD25 estan por debajo de un aumento del 20% en comparaci6n con el valor inicial, la dosis de IL-2 se puede aumentar (p. ej., x2) y se encuentra que el proceso se puede repetir hasta que una dosis (inferior a 3,5 MUI/dfa) induzca una respuesta Treg adecuada.

Preferiblemente, este metodo tambien se realiza durante el penodo de mantenimiento, lo que implica cuantificar el numero de Treg y/o el nivel de expresi6n de CD25 en Treg cada 2 a 6 meses, preferiblemente entre 1 y 5 dfas despues de la administraci6n de iL-2. Si los porcentajes de Tregs o los niveles de expresi6n de CD25 estan por debajo de un aumento del 20% en comparaci6n con el valor inicial, la dosis de IL-2 podna aumentar (por ejemplo, x2).

Formas y vfas de administraci6n

Se puede administrar IL-2 usando cualquier metodo aceptable conocido per se en la tecnica. Asf, por ejemplo, la IL- 2, o la composici6n farmaceutica que comprende IL-2, puede administrarse mediante cualquier forma de inyecci6n, incluida la inyecci6n intravenosa (IV), intramuscular (IM), transdermica o subcutanea (SC), o por via oral o via nasal, asf como por administraci6n t6pica (crema, gotitas, etc.). En una realizaci6n particular de la invenci6n, la IL-2 se usa como una formulaci6n de liberaci6n sostenida, o una formulaci6n que se administra usando un dispositivo de liberaci6n sostenida. Dichos dispositivos son ampliamente conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, parches

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transdermicos y bombas implantables en miniatura que pueden proporcionar el suministro de medicamentos a lo largo del tiempo en una forma continua y estable en una variedad de dosis para lograr un efecto de liberacion sostenido. Tambien se pueden contemplar formulaciones sublinguales o gotas para los ojos.

La IL-2 se administra tipicamente en asociacion (por ejemplo, en solucion, suspension o mezcla) con un veldculo, portador o excipiente farmaceuticamente aceptable. Los excipientes adecuados incluyen cualquier solucion isotonica, solucion salina, solucion tamponada, formulacion de liberacion lenta, etc. Las composiciones lfquidas, liofilizadas o secadas por pulverizacion que comprenden IL-2 o variantes de estas son conocidas en la tecnica y pueden prepararse como soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas.

Preferiblemente, las composiciones farmaceuticas comprenden agentes estabilizantes, agentes tamponantes, agentes de carga, o combinaciones de estas apropiadas para minimizar los problemas asociados con la perdida de la estabilidad de la protema y la actividad biologica durante la preparacion y el almacenamiento.

Puede usarse un agente de tamponamiento para mantener el pH de la composicion lfquida dentro de un intervalo aceptable para la estabilidad de IL-2. El agente de tamponamiento puede ser un acido tal como, por ejemplo, acido sucdnico, acido dtrico, acido fosforico y acido glutamico.

Los ejemplos de agentes de carga adecuados incluyen, por ejemplo, glicina, manitol o valina, o cualquier combinacion de estos.

Los ejemplos de veldculos inertes que pueden usarse como agentes estabilizantes incluyen azucares (por ejemplo, sacarosa, glucosa, dextrosa) y alcoholes de azucar, asf como aminoacidos.

La composicion farmaceutica puede incorporar adicionalmente otros agentes estabilizantes, como la metionina, un surfactante no ionico, como el polisorbato 80, etc.

Se describen ejemplos espedficos de formulaciones de IL-2 [10] y en el documento US 4.604.377.

Cuando la IL-2 esta en forma monomerica, se prefiere agregar a las composiciones una base de aminoacidos suficiente para disminuir la agregacion de IL-2 durante el almacenamiento. La base de aminoacidos puede ser un aminoacido o una combinacion de aminoacidos, donde cualquier aminoacido dado esta presente en su forma de base libre o en su forma de sal. Los ejemplos de dichos aminoacidos incluyen arginina, lisina y acido aspartico.

En una realizacion particular, la composicion comprende una IL-2 multimerica, por ejemplo, liofilizada.

Un ejemplo espedfico de tal composicion es la IL-2 Proleukin®. Esta formulacion liofilizada comprende IL-2 recombinante oxidada selectivamente mezclada con un veldculo soluble en agua, como el manitol, que proporciona volumen y SDS para asegurar la solubilidad de IL-2 en agua. Esta composicion es adecuada para la reconstitucion en soluciones acuosas para inyeccion parenteral.

Envasado

El envasado actual de IL-2 son viales que contienen 18 M UI de IL-2. Dada la baja dosis que se utilizara, se preparan preferiblemente envases para dosis de 0,01M UI, 0,02M UI, 0,5M UI, 0,1M UI, 0,2M IU, 0,5M IU, 1M IU y 3, o 3,5M UI.

Por lo tanto, un objeto espedfico de esta invencion tambien se basa en una composicion farmaceutica que comprende una dosis unitaria de 3 M UI de IL-2, o menos. La composicion puede estar en un vial, capsula, jeringa, etc.

Tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias

Los metodos descritos en este documento se pueden usar para el tratamiento de cualquier afeccion asociada o causada por una respuesta inmune indeseable y/o en la que se ha descrito un defecto cuantitativo o cualitativo de Treg.

El tratamiento puede ser curativo o preventivo. En una realizacion particular, el tratamiento es curativo, es decir, se refiere a un sujeto en el que se declara la enfermedad, incluso en etapas muy tempranas. En tales pacientes, el tratamiento tiene como objetivo reducir o detener la progresion de la enfermedad y/o suprimir los smtomas o las causas de la enfermedad. El tratamiento puede llevar a la desaparicion completa de la enfermedad en el paciente, como se ilustra en los ejemplos.

El tratamiento puede ser preventivo, es decir, en pacientes que no tienen declarada una enfermedad o en pacientes en remision de una enfermedad para prevenir recafdas, como en el caso de la esclerosis multiple. En tales pacientes, el tratamiento apunta a mantener un nivel elevado de Tregs y/o reducir la inflamacion para evitar el desarrollo de una enfermedad causada por una reaccion inmune indeseable.

El tratamiento designa cualquier mejora en la condicion del paciente, como menor dolor, menor lesion tisular, etc.

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La infeccion cronica por el VHC esta asociada de manera unica con una serie de complicaciones extrahepaticas, cuyos mecanismos patogenos parecen ser en gran medida impulsados por el sistema inmunologico. Entre ellas, la crioglobulinemia y sus secuelas clmicas tienen la asociacion mas fuerte. Las crioglobulinas son facilmente detectables en el 40-60% de los pacientes infectados por el VHC [11, 20, 21, 22], mientras que en el 5-10% de los casos se desarrolla una vasculitis manifiesta por crioglobulinemia (crioglobulinemia mixta: MC) [11]. Los organos diana mas frecuentes son la piel, las articulaciones, los nervios y el rinon. La expresion de la enfermedad es variable, desde smtomas clmicos leves (purpura, artralgia) hasta complicaciones fulminantes que amenazan la vida (glomerulonefritis, vasculitis generalizada). La observacion de las celulas T en infiltrados vasculares, la presencia de autoanticuerpos y la observacion de que algunos grupos HLA confieren susceptibilidad frente a MC en pacientes infectados por hCv respaldan la naturaleza autoinmune de esta patologfa ligada a virus [12, 13]. La fisiopatologfa de la MC parece ser el resultado de la interaccion entre el VHC y los linfocitos, que modula directamente la funcion de las celulas B y T y da como resultado la activacion policlonal y la expansion de celulas B que producen IgM con actividad del factor reumatoide (RF) [23]. Anteriormente se informo que las Treg se redudan significativamente en los pacientes con HCV-MC [12, 14, 15]. Ademas, en pacientes con MC, que podnan tratarse con exito para el VHC, la eliminacion del virus se asocio con la cura de la vasculitis y la recuperacion de Treg.

La seccion experimental muestra los resultados de un estudio de fase I/IIa disenado para evaluar la seguridad, los efectos inmunologicos y la eficacia clmica de la administracion repetida de la terapia con baja dosis de IL-2 en pacientes infectados por el VHC con autoinmunidad asociada. Se muestra que la dosis baja de lL-2 es bien tolerada, induce un aumento drastico y selectivo en las celulas Treg y conduce a una mejona clmica en todos los pacientes tratados. Esta es la primera demostracion de la induccion y recuperacion de Treg in vivo despues de la inmunoterapia con IL-2 en una enfermedad autoinmune humana.

Como se mostro en los ejemplos, el tratamiento fue bien tolerado y no indujo la activacion de celulas T efectoras, brote de vasculitis o aumento de la viremia por VHC. Las dosis bajas de IL-2 aumentaron drasticamente las proporciones de Tregs CD4+CD25hiCD127-Foxp3+ con una potente actividad supresiva en todos los pacientes, y disminuyeron las proporciones de las celulas B de la zona marginal de forma concomitante. Los estudios de transcriptoma de las celulas mononucleares de sangre periferica mostraron que la IL-2 induda una atenuacion global de los mediadores del estres inflamatorio/oxidativo. Se observo una reduccion de la crioglobulinemia y/o una mejona clfnica de la vasculitis en el 90% (9/10) y el 80% (8/10) de los pacientes, respectivamente.

Esta es la primera demostracion de recuperacion de celulas Treg y de mejona clmica despues de una inmunoterapia con IL-2 en dosis baja y bien tolerada en una enfermedad autoinmune humana. Allana el camino para un uso mas amplio de IL-2 para tratar enfermedades inflamatorias y autoinmunes.

Los siguientes ejemplos se ofrecen con fines ilustrativos y no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo de referencia 1: IL-2 de dosis baja en la vasculitis relacionada con el VHC

En este documento se proporciona la primera evidencia biologica en sujetos humanos de que la IL-2 puede usarse en condiciones que inducen Tregs sin inducir Teffs en pacientes con autoinmunidad. Los inventores presentan en este documento la primera demostracion de la expansion in vivo de una Treg supresora muy potente a traves de la inmunoterapia con IL-2 en una enfermedad autoinmune humana, que conduce a una mejona clmica. El punto final primario del estudio de los inventores, el aumento de Treg al final de la terapia con IL-2, y todos los puntos finales secundarios, incluida la respuesta clmica, se cumplieron. Los inventores muestran que la baja dosis de IL-2 es bien tolerada, induce un aumento drastico y selectivo en las celulas Treg y conduce a una mejona clmica en el 80% de los pacientes. Esta es la primera demostracion de la induccion y recuperacion de Treg in vivo despues de la inmunoterapia con IL-2 en una enfermedad autoinmune humana. Ademas, se muestra por primera vez un marcado efecto antiinflamatorio de las dosis bajas de IL-2 en seres humanos.

Metodos

Pacientes

Los criterios de inclusion para el estudio fueron los siguientes: 1) infeccion cronica por VHC activa definida por un ARN de VHC positivo; 2) antecedentes de vasculitis MC definida por la (i) presencia de crioglobulina serica > 0,05 g/l en al menos dos determinaciones y (ii) la presencia de la tnada purpura-artralgia-astenia o (iii) vasculitis comprobada por biopsia (rinon, nervios o piel) en ausencia de purpura [16, 17]; 3) presencia en la inclusion de una vasculitis clmicamente activa con resistencia o intolerancia a terapias convencionales, es decir, terapia antiviral (Peg- Interferon-a y ribavirina) y/o Rituximab; 5) un mmimo de 6 o 2 meses despues de suspender el tratamiento con rituximab o antiviral, respectivamente.

Los criterios de exclusion incluyeron la coinfeccion con el virus de la hepatitis B o VIH, cirrosis hepatica, cancer o linfoma, cualquier uso de inmunosupresores en los ultimos 6 meses, adiccion a las drogas, abuso del alcohol o embarazo.

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Diseno del estudio

Se realizo un ensayo monocentrico en fase I/II prospectivo abierto. Se administraron cuatro ciclos de terapia subcutanea de IL-2 durante 5 dfas. La primera cura se realizo a una dosis de 1,5 millones de UI^a durante una hospitalizacion de una semana para evaluar la tolerancia. Sobre la base de una tolerancia satisfactoria, las 3 curaciones posteriores se realizaron de forma ambulatoria a la dosis de 3 millones de UI/dfa. La segunda cura se inicio despues de un lavado de 10 dfas, mientras que las siguientes 2 curaciones despues de un penodo de 17 dfas sin agua. El estudio fue aprobado por el comite de etica institucional y se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes.

Los pacientes fueron evaluados el dfa 1 y el dfa 5 de cada cura, antes de la primera y ultima administracion de IL-2 de esa cura. Tambien se evaluaron de 48 a 90 dfas despues de la ultima administracion de IL-2.

La respuesta al tratamiento se analizo comparando los parametros clmicos, inmunologicos y virologicos en la evaluacion inicial, al final de cada tratamiento de IL-2 (en las semanas 1, 3, 6 y 9) y al final del seguimiento. La respuesta clmica se definio analizando la progresion de los siguientes signos clmicos principales: afectacion de la piel (ausencia de purpura y/o ulcera de la pierna), neuropatfa periferica (mejona clmica y electrofisiologica en dos examenes sucesivos), afectacion renal (normalizacion del nivel de creatinina serica y desaparicion de proteinuria y/o hematuria), y ausencia de artralgia.

El punto final primario fue un aumento absoluto del 4% de la proporcion de celulas T reguladoras (Treg) CD4+CD25+Foxp3+ al final de la terapia con IL-2 (es decir, en W9). Los puntos finales secundarios incluyeron la seguridad, la evaluacion de la inmunidad celular y humoral en W9, el aumento persistente de los niveles de Treg a distancia del tratamiento (W19) y la evaluacion de la respuesta clmica de la vasculitis.

Analisis de citometna de flujo.

El control inmunologico se realizo de acuerdo con los metodos de rutina previamente publicados y utilizados en el departamento de Bioterapia de Pitie-Salpetriere.

Brevemente, se establecieron recuentos (celulas/pl) de subconjuntos de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) (linfocitos T CD3+, CD4+, CD8+, linfocitos B CD19+ y celulas NK CD3'CD56+) a partir de muestras de sangre recien extrafda utilizando los kits CYTO-STAT tetraCHROME con gotas fluorescentes Flowcount como estandar interno y el software tetra CXP con un citometro FC500 segun las instrucciones del fabricante (Beckman Coulter, Villepinte, Francia). Los subconjuntos de estas celulas se analizaron mediante citometna de flujo multicolor y mAbs directamente conjugados a varios marcadores fluorescentes. La adquisicion y el analisis de las celulas mediante citometna de flujo se realizaron con un citometro FC500 (Beckman Coulter). Los parametros de ajuste del instrumento (ganancias, compensaciones y umbral) se establecieron con el software de la maquina (software CXP; Beckman Coulter) junto con las perlas de calibracion (perlas de fraguado de flujo, kit Cytocomp y celulas de control CYTO-TROL). La reproducibilidad de la maquina se verifico con cuentas estandarizadas (Flow-check). Los datos se analizaron con el software de analisis CXP (Beckman Coulter).

Los subconjuntos de estas celulas se analizaron utilizando citometna de flujo multicolor y mAbs directamente conjugados con isotiocianato de fluorescema (FITC), ficoeritrina (PE), ficoeritrina-Rojo de Texas (ECD), Aloficocianina (APC) o ficoeritrina-Cianina 7 (PE-Cya7) fueron utilizados para: CD3-ECD o -PC7, CD4-ECD o -Pc7, CD8-PC7, CD8-APC, CD14-PE, CD16-FITC, CD19-ECD, CD28-FITC, CD45RA-APC, CD45RO-FITC, CD56-PE CD69-PE, CD152-PE y HLA-DR-PC7, todos de Beckman Coulter (Villepinte, Francia). CD25-PE, CD25APC, CD27- PE, CD62L-FITC e IgD-FITC, fueron de BD Biosciences (Le Pont De Claix, Francia). CD127 era de e-Biosciences (San Diego, CA, EE. UU.) y protema relacionada con el factor de necrosis tumoral inducida por glucocorticoides (GITR)-PE de Miltenyi Biothech (Pans, Francia). Los anticuerpos peptido asociado a la latencia (LAP)-PE y CCR7- PE fueron de R&D Systems (Abingdon, Reino Unido). El marcaje intracelular de CD152 se realizo utilizando el reactivo Fix y Perm de Invitrogen (Cergy Pontoise, Francia) despues de la tincion de las membranas CD3, CD4, CD127 y CD25. Se utilizaron anticuerpos de control de isotipo de raton emparejado. El marcaje intranuclear con FOXP3 se realizo despues de la tincion de las membranas CD3, CD4, CD 127 y cD25 utilizando el kit de Foxp3 anti- humano APC (clon PCH101, eBiosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizo IGg2a APC de rata como control isotfpico (eBiosciences).

La adquisicion y el analisis de las celulas mediante citometna de flujo se realizaron con un citometro FC500 (Beckman Coulter). Los parametros de ajuste del instrumento (ganancias, compensaciones y umbral) se establecieron con el software de la maquina (software CXP; Beckman Coulter) junto con las perlas de calibracion (perlas de fraguado de flujo, kit Cytocomp y celulas de control CYTO-TROL). La reproducibilidad de la maquina se verifico con cuentas estandarizadas (Flow-check). Los datos se analizaron con el software de analisis CXP y el software Kaluza (Beckman Coulter).

Para la deteccion de la produccion de citocinas intracelulares, las PBMC se estimularon con PMA 50 ng/ml e ionomicina 1 mM en presencia de Golgi-Stop (BD Biosciences) durante 4 horas y luego se tineron con anti-IFN-g- FITC (eBioscience), o anti-IL-17-Alexa Fluor 647 (e-Bioscience) despues de la fijacion y permeabilizacion, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

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Ensayos de supresion de celulas T

El ensayo de supresion de celulas se realizo como se describio anteriormente. Brevemente, las PBMC se tineron con combinaciones apropiadas de mAbs para purificar mediante citometro de flujo (FACS Aria, BD Biosciences) celulas CD3+CD4+cD25+CD127low/-; a saber, Treg clasificado por FACS. Para probar su actividad supresora, las Treg se analizaron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo redondo mezcladas en varias relaciones celulares (1/1; 1/2; 1/4; 1/8; 1/16) con 5 x 104 celulas CD4+CD25- clasificadas por Facs autologas como celulas respondedoras en presencia de 104 PBMC alogenicas irradiadas (15 grises) como celulas estimuladoras en 200 pl de medio de cultivo completo. Se realizaron triplicados para cada condicion de cultivo. Despues de 4 dfas, se determino la proliferacion celular mediante la incorporacion de 1 pCi (0,037 MBq) de 3H-timidina (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) durante 16 h adicionales y se midio usando un contador p (contra-WALLAC). Los resultados se expresaron en recuentos por minuto (cpm) y el porcentaje de supresion de la proliferacion se determino mediante la proliferacion de celulas efectoras sin treg/proliferacion de celulas efectoras con la relacion treg.

Estudios de transcriptoma

Se generaron ARN utilizando el Mini Kit RNeasy (QIAGEN, requis, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La integridad del ARN se evaluo mediante un analizador de Agilent que mostraba una calidad del numero de integridad del ARN de 7-9,5 (Agilent Technologies). El rendimiento de ARN se evaluo utilizando un espectrofotometro NanoDrop 1000 (NanoDrop Products, Thermo Fisher Scientific).

El ARN total se amplifico y se convirtio en ARNc biotinilado de acuerdo con el protocolo del fabricante (Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit; Ambion).

Los ARNc marcados se hibridaron durante la noche en matrices Illumina Human HT-12 V3 BeadChip (Illumina), que conteman mas de 48.000 sondas. Luego, las matrices se lavaron, bloquearon, tineron y escanearon en una Illumina BeadStation siguiendo los protocolos del fabricante. El software Illumina BeadStudio (Illumina) se uso para generar valores de intensidad de senal a partir de las exploraciones.

Los datos se normalizaron de acuerdo con el metodo de los cuantiles y la agrupacion jerarquica supervisada se realizo en 435 transcripciones seleccionadas que se modularon significativamente despues del tratamiento en al menos 3 de cada 6 pacientes. Las relaciones del umbral de modulacion se establecieron en 0,6 y 1,5 para las transcripciones reguladas por aumento o por disminucion respectivamente. Un paciente que presentaba perfiles de modulacion demasiado divergentes de los otros se excluyo del analisis de agrupamiento. Las firmas de genes se analizaron para generar redes funcionales utilizando el software PredictSearch™ (Prediguard), una solucion bioinformatica de analisis de datos dedicada a identificar correlaciones relevantes entre genes y conceptos, se utilizo para generar redes funcionales. Esta herramienta se actualiza diariamente con toda la base de datos de NCBI Pubmed y busca correlaciones relevantes entre gen-gen o concepto-gen dentro de las cocitaciones de los resumenes.

Las correlaciones tambien se recuperan de la comparacion cruzada con el conjunto completo (> 18000) de firmas transcripcionales depositadas en la base de datos GEO del NCBI y se extraen con el algoritmo DBF-MCL usando la herramienta TranscriptomeBrowser. Ademas, PredictSearchTM permite la anotacion de genes modulados segun las vfas de KEGG y Biocarta, asf como a la ontologfa GO.

Para los analisis no supervisados, las firmas moleculares potenciales se extrajeron utilizando un Analisis de componentes independientes no supervisados (ICA). Esas firmas se agregaron a la base de datos de analisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA, por sus siglas en ingles) y se verificaron por su importancia en los datos de micromatrices que utilizan el software GSEA. Los bordes iniciales de GSEA de firmas moleculares estadfsticamente significativas (valor de q FDR <0,05) se anotaron para los terminos GO y el enriquecimiento de las vfas KEGG. Se seleccionaron firmas con enriquecimiento para terminos GO relacionados con la inflamacion, respuesta inmune y patologfas autoinmunes. Se uso una prueba de Khi2 para determinar si estas firmas seleccionadas estaban reguladas por aumento o por disminucion de manera preferencial en muestras tratadas con IL-2 en comparacion con la distribucion general de las firmas reguladas por aumento o por disminucion.

Analisis estadfstico

Un tamano de muestra de 10 pacientes alcanza el 94% de potencia para detectar una media de diferencias apareadas de 4% con una desviacion estandar estimada de 3% y un nivel de significacion (alfa) de 0,05 mediante una prueba de suma clasificada de Wilcoxon de dos lados, asumiendo que la distribucion real del porcentaje de celulas T reguladoras CD4+ CD25+Foxp3 + es normal.

Las comparaciones de la lmea de referencia con las medidas W9 o Post-IL-2 se realizaron con la prueba de suma clasificada de Wilcoxon. La aproximacion F de la prueba de Friedman se utilizo para comparar todas las mediciones repetidas [24]. Las aproximaciones de la region cntica de la estadfstica de Friedman y las comparaciones multiples se realizaron cuando fue apropiado [25].

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Los valores de tiempo hasta el pico (Tmax) se determinaron directamente a partir de los datos experimentales como el tiempo del porcentaje maximo de Treg (Emax).

Resultados

Pacientes

Se incluyeron diez pacientes (Tabla-1). En el momento de la inclusion, la mediana de la edad (Q1-Q3) fue de 58,5 (49,5- 66,2) anos con una proporcion de hombres/mujeres de 50/50%. Las manifestaciones clmicas de vasculitis MC incluyeron neuropatia periferica (n = 8), purpura (n = 8), astenia (n = 6), artralgia (n = 3) y compromiso renal (n = 1) [proteinuria diaria 1,5 g, hematuria microscopica y creatininemia 74|jmol/L]. El nivel medio de crioglobulina (Q1-Q3) fue de 0,53 (0,26-2,77) g/L, de IgM Kappa de tipo II en todos los casos. La mediana (Q1-Q3) del factor del complemento C4 fue de 0,065 (0,02-0,16) mg/L, la actividad del factor reumatoide estuvo presente en el 90% de los casos y los anticuerpos antinucleares fueron positivos en un paciente (a un tttulo de 1/640). La carga viral media del VHC fue de 6,25 (5,5-6,8) Log copias/ml; ningun paciente tuvo cirrosis hepatica.

Seguridad de baja dosis de IL-2.

El cumplimiento del tratamiento fue bueno y todos los pacientes completaron los 4 tratamientos de IL-2. La IL-2 fue, clmicamente y biologicamente, bien tolerada (Tabla-1). No se observaron cambios significativos en los granulocitos, globulos rojos o enzimas hepaticas a lo largo del estudio. Solo se observaron efectos secundarios menores de grado clmico 1 y se resolvieron espontaneamente, como astenia (n = 4), reacciones locales transitorias en los sitios de inyeccion (n = 4), smdrome del tipo gripe (n = 4), mialgia (n = 1) e hipertension (n = 1). Notablemente, ninguno de estos ocurrio con la dosis mas baja de 1,5 millones de UI/dfa de IL-2 (Tabla-1). Durante todo el tratamiento y el seguimiento, no hubo signos biologicos o clmicos que indicaran una activacion de las celulas T patogenas: no se observo brote de vasculitis; el examen de organos linfaticos no mostro anomalfas sugestivas de induccion de trastorno linfoproliferativo; no se observo ningun aumento en la carga viral del VHC (Tabla 1 y Fig. 1 A).

Eficacia biologica y clmica de dosis bajas de IL-2 en HCV-MC

La carga viral del VHC disminuyo continuamente durante el penodo de tratamiento con IL-2 y fue significativamente mas baja en W9 (p = 0,02), en ausencia de cualquier tratamiento antiviral. Los niveles sericos de crioglobulina, que tambien disminuyeron continuamente (P = 0,014, en W9), ya estaban disminuidos (P = 0,003), mientras que C4 aumento inversamente (P = 0,027) despues del primer tratamiento de IL-2 de 1,5m IU (Fig-1). Ningun paciente desarrollo anticuerpos antinucleares sobre la terapia con IL-2 y los anticuerpos antinucleares desaparecieron en el paciente N°. 1.

De acuerdo con los parametros biologicos mejorados de la vasculitis por HCV-MC (Fig. 1), 8 de cada 10 pacientes mostraron una mejona clmica notable despues del tratamiento con IL-2, con desaparicion de purpura y artralgia (8/8 y 3/3 pacientes, respectivamente). Parametros renales normalizados (proteinuria diaria <0,3 g y ausencia de hematuria) en el paciente N°. 10. Los unicos pacientes que no tuvieron una respuesta clmica marcada fueron aquellos que presentaron solo una neuropatfa en el momento de la inclusion (n = 2).

La dosis baja de IL-2 induce un aumento drastico de las celulas T reguladoras de CD4+ y CD8+.

La IL-2 indujo un aumento drastico en las Treg CD4+CD25hiCD127'Foxp3+ circulantes (Fig.-2A y Fig-3). El porcentaje de referencia de Treg en este grupo de pacientes fue de 3,6% + 0,23 (media +/- sem), significativamente mas bajo que los valores normales (4,6 + 0,6) de acuerdo con los estudios informados anteriormente por los inventores. En W9, las proporciones de Treg fueron de 11,8% + 1,96 (P = 0,004), alcanzando el criterio de valoracion principal de eficacia de los inventores. Cabe destacar que las proporciones de Treg ya aumentaron aproximadamente 2 veces despues del primer tratamiento de 5 dfas de 1,5 millones de UI de IL-2 (Fig. 2A). Las proporciones de Treg continuaron aumentando durante el penodo de lavado entre los tratamientos, y fueron impulsadas por los tratamientos subsiguientes (Fig-2A). En comparacion con los valores de referencia, estas proporciones aumentadas de Treg fueron estadfsticamente significativas durante todo el tratamiento (P = 0,016 en W1 y P <0,001 en W3, 6 y 9). La mediana del valor pico de la proporcion de Tregs (Emax = 14%) se alcanzo al final del tercer tratamiento de IL- 2 (Temax mediana = 2,9), lo que corresponde a un aumento del 10,3% en comparacion con la lmea de referencia (Emax menos la lmea de referencia) o corresponde a un aumento del 350% de Tregs (Emax/lmea de referencia). A una distancia (de 129 a 150 dfas) del tratamiento, la proporcion de Treg se mantuvo significativamente elevada, al doble del valor de referencia (6,1% + 0,51, P = 0,008), en el rango de valores para donantes de sangre normales. Finalmente, se evaluaron la funcionalidad de las Treg expandidas IL-2 y se encontro que eran altamente supresivas (Fig-4).

Se puede detectar una poblacion de celulas T CD8+CD25hiFoxp3 raras con funcion supresora en individuos normales [26] (Fig. 5). Se supervisaron estas celulas durante el tratamiento con IL-2 y se observo su marcado aumento, concomitante con el aumento de Treg CD4+. Despues del primer tratamiento, su proporcion aumento en aproximadamente un 500% y se mantuvo elevada durante todo el tratamiento (Fig. 2A, Tabla 2). En conjunto, el aumento de Tregs CD4+ y cD8+ conduce a un aumento notable en la relacion Treg/Teff global, sin modificacion de la relacion CD4/CD8 (Fig-2B, Tabla-2).

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El numero total de celulas B disminuyo durante el tratamiento con IL-2, inmediatamente despues del primer tratamiento, y luego se recupero a distancia de la terapia. Esta disminucion afecto particularmente a las celulas de la zona marginal IgD+CD27+ que estan implicadas en la fisiopatologfa de la vasculitis [27] (Fig-2C, Fig-6). En contraste, hubo un aumento significativo en el numero de celulas NK, que ya se detecto despues del primer tratamiento de IL- 2, y mostro una clara tendencia a un aumento continuo a lo largo del tiempo; esto ceso rapidamente despues de la interrupcion de IL-2. En particular, hubo un aumento espedfico de las celulas NK CD56bright que producen altos niveles de citoquinas inmunorreguladoras y son poco citotoxicas (Fig. 2D, Tabla-2).

La dosis baja de IL-2 induce una disminucion global de la inflamacion revelada por los analisis de transcriptoma de PBMC

Se analizo el transcriptoma de PBMC antes y despues del tratamiento de IL-2 (Fig-3. Primero se realizo un analisis supervisado, comparando directamente los dos conjuntos de datos y buscando genes que estaban regulados por aumento o por disminucion entre las dos condiciones. Este estudio primero confirmo las observaciones fenotfpicas, mostrando una mayor expresion de genes relacionados con la funcion de las celulas Treg y NK, junto con una menor expresion de genes relacionados con la funcion de las celulas B (no se muestra). Los enfoques de agrupamiento jerarquico y de minena de datos revelaron una disminucion notable en la expresion de genes asociados con mediadores del estres inflamatorio/oxidativo (Fig. 7A). La via NFKB aparece crucialmente involucrada en esta regulacion (Fig. 7B). Se confirmaron estos resultados mediante un analisis no supervisado (es decir, no basado en hipotesis). En este enfoque, todos los datos de transcriptoma pre y post-IL-2 se mezclan, y las firmas que maximizan la segregacion de los datos en grupos independientes se buscan en base al Analisis de Componentes Independientes (ICA) [28]. Los terminos y vfas de la ontologfa de genes (GO) (GOTP) se buscan entre las firmas que diferenciaron los grupos pre y post-tratados. La proporcion de GOTP regulada por aumento o por disminucion fue de 0/251 para la inflamacion (p = 1,3E-40), 16/684 para las respuestas inmunes (p = 3,4E-94) y 77/555 para la activacion de linfocitos (p = 7,0E-49) (Fig-3C). A la inversa, se obtuvieron 1701 firmas reguladas por aumento y 208 por disminucion con el GOTP relacionado con el ciclo celular (p = 1,5E-138). Analisis similares con terminos de control elegidos al azar no mostraron enriquecimiento.

Luego se realizo un analisis similar en los terminos de las rutas de Kyoto Encyclopedia de genes y genomas (KEGG) relacionadas con patologfas autoinmunes, inflamatorias y relacionadas con trasplantes y enfermedades infecciosas. Estas firmas fueron preferentemente reguladas por disminucion despues del tratamiento con IL-2 (p = 7,6E-09 y p = 7,6E-36, respectivamente), mientras que las patologfas de control no lo fueron.

Tabla 1: Caracteiisticas y resultados de pacientes con ulceras vasculares autoinmunes relacionadas con HCV con terapia 1L-2

Caractensticas

Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4 Paciente 5 Paciente 6 Paciente 7 Paciente 8 Paciente 9 Paciente 10

Edad en el momento del diagnostico (anos)

48 74 63 50 59 67 51 66 58 43

Sexo

mujer mujer hombre hombre hombre hombre mujer hombre mujer mujer

Smtomas

Lmea de referencia

P, A, F P, N, F P, N, F N, F P, N, F P, N P, N N A, P A, P, N, K, F

Terapia post IL-2

- - N N - - - N - N

Terapia previa

Peg IFN/RBV Peg IFN/RBV Peg IFN/RBV Peg IFN/RBV Peg IFN/RBV Peg IFN/RBV Peg IFN/RBV Peg IFN/RBV Peg IFN/RBV Peg IFN/RB

Rituxan Rituxan

Nivel serico de crioglobulina (g/l)

Lmea de referencia

0,56 1,61 0,17 0,16 0,30 0,3 6,99 2,77 2,78 0,51

Terapia post IL-2

0 1,00 0,91 0 0,34 0 3,87 1,99 2,94 0,19

Nivel de complemento C4 (g/L)

Lmea de referencia

0,20 0,06 0,08 0,20 0,06 0,15 0,07 0,02 0,03 0,02

Terapia post IL-2

0,21 0,05 0,12 0,27 0,09 0,19 0,10 0,06 0,04 0,03

Carga viral HCV (Log UI/mL)

Lmea de referencia

5,3 6,2 7,2 6,3 5,6 6,9 5,8 6,3 6,8 5,4

Tratamiento posterior a IL-2

5,2 5,8 5,6 6,2 5,6 5,8 6,0 5,1 4,6 5,5

Alanina aminotransferasa (UI/L)

Lmea de referencia

26 38 29 25 77 40 58 60 104 40

Terapia post IL-2

19 17 45 24 81 23 22 62 80 35

Terapia IL-2

Efectos secundarios

Tratamiento 1 (1,5 MUI/dfa por 5 dfas)

- - - - - - - - - -

Tratamiento 2 (3 MUI/dfa durante 5 dfas)

- F, M F F F Flu, LR Flu, LR Flu, LR AH Flu, LR

Tratamiento 3 (3 MUI/dfa durante 5 dfas) -

- F F F F LR Flu Flu, LR AH -

Tratamiento 4 (3 MUI/dfa durante 5 dfas)

- - - - - LR - LR - -

A: artralgia, F: fatiga, P: purpura, N: neuropatfa, K: compromiso renal, M: mialgia, Flu: Smdrome tipo gripe, LR: reaccion local, AH: hipertensos arteriales

Tabla 2: Caractensticas inmunologicas bajo la terapia con IL-2

Lmea de referencia Fin del tratamiento 1 Fin del tratamiento 2 Fin del tratamiento 3 Fin del tratamiento 4 Post IL-2

Linfocitos (celulas/jl)

685 838 746 781 855 871

(242-2008)

(267-1817) (238-1529) (398-2320) (558-1859) (426-2302)

Celulas T (celulas/jl)

633 655 456* 506 647 690

(242-1214)

(401-1214) (284-1334) (250-1237) (292-1660) (299-936)

Celulas T CD4 totales (celulas/jl)

298 456 335 403 340 531

(149-1193)

(118-1009) (91-658) (94-1192) (173-1041) (151-984)

Celulas T CD8 totales (celulas/jl)

234 191 130* 147* 223 292

(73-681)

(36-531) (64-414) (77-680) (104-448) (84-518)

Relacion CD4/CD8

1,9 1,8 1,6 1,7 1,96 1,8

(1,4-4,3)

(1-5,3) (1,1-5,2) (0,9-5,1) (0,8-4,9) (1,3-4,9)

Celulas NK (celulas/jl)

63 97* 155** 164** 209*** 77

(49-184)

(44-245) (13-290) (50-269) (79-389) (41-229)

Celulas NKbright CD56 (celulas/jl)

8 18** 27*** 2Q** 27** 7***

(5-17)

(8-30) (2-100) (6-58) (8-93) (2-12)

Celulas B (celulas/jl)

118 90 84* 86* 98 111

(18-570)

(20-334) (27-236) (24-342) (29-175) (30-522)

Celulas MZ B (celulas/jl)

12 4* 3* 0** 4** 3

(1-77)

(1-35) (1-14) (1-15) (1-14) (1-42)

Treg

CD4+CD25hiCD127-Foxp3 + (celulas/jl)

15 25 2Q*** 31** 36** 31**

(5-29)

(8-71) (9-92) (14-221) (20-271) (12-62)

% CD25hiCD127- FoxP3+/CD4+

3,8 6,8* 10 4*** -| Q*** -| -| *** 0**

(1,8-4,4)

(3,7-15) (5-24) (3,2-29) (6-26) (3-8)

CD8+Foxp3+ (celulas/jl)

0,08 0,46* 0,46* 0,62** 0,47** 0,19

(0,03-1,36)

(0,03-3,71) (0,11 - 3,31) (0,12-6,8) (0,17-2,68) (0,07-0,64)

% CD25+FoxP3+/CD8+

0,04 0,35*** 0 24*** q 2 *** 0 28*** 0,08

(0,01 -0,2)

(0,02-0,7) (0,08-0,99) (0,11-1) (0,08-0,6) (0,03-0,24)

% Treg/Teff (CD4+CD8)

4 9,5** -| 0*** 14,5*** -| ^*** 0**

(2-6)

(4-17) (9-53) (6-42) (7-32) (4-13)

Celulas T CD4+

44 29 -| g*** 23*** 20** 46

% CD25+ (sin Treg)

(20-59) (10-63) ___(5-32) (10-40) ___(7-48) (17-66)

Los resultados mostrados son la mediana con el rango entre parentesis para cada poblacion celular analizada para los 10 pacientes incluidos en el protocolo.

5 El analisis estad^stico se realizo mediante la prueba de suma clasificada de Wilcoxon; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 versus la lmea de referencia

Ejemplo 2: IL-2 de dosis baja en la diabetes tipo 1

Los inventores iniciaron un ensayo clmico de deteccion de dosis de IL-2 en T1D, cuyo objetivo era definir la dosis activa mas baja que podfa inducir de forma segura Treg en pacientes adultos con T1D.

10 El ensayo DF-IL2 es doble ciego, comparando placebo, dosis de Proleukin® de 0,3, 1 y 3 MUI/dfa (dosis acumulada de 1,5, 5 y 15 MUI, respectivamente).

El objetivo del ensayo sera preservar la secrecion de insulina endogena restante en pacientes con T1D recientemente diagnosticada.

Principales caractensticas del paciente: adultos, ambos sexos, diagnostico T1D como WHO-ADA, duracion de la 15 enfermedad desde el diagnostico de menos de 12 semanas en la primera dosis de IL-2 y peptido C detectable en la entrada.

La recomendacion actual para un efecto clmicamente significativo es abordar con el tratamiento activo al menos una preservacion de la masa de celulas p pancreaticas, es decir, el mantenimiento del peptido C AUCO-120 en comparacion con la lmea de referencia.

20 Todos los 24 pacientes han sido incluidos. Aunque los investigadores aun desconocen la dosis de IL-2 administrada, los resultados obtenidos hasta ahora muestran que la IL-2 es segura (no hay SAE en ninguno de los pacientes). Se

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han observado eventos adversos menores (fiebre leve, dolor moderado en el lugar de la inyeccion, etc.) en algunos pacientes y, segun los datos de seguridad del ensayo clmico de los inventores previo 40, probablemente esten relacionados con la dosis de 3 MUI/dfa. Un analisis provisional de la dinamica de Treg para los primeros 16 pacientes que completaron su tratamiento se ha realizado y sin ciego del estudio a los investigadores (luego de la autorizacion de las autoridades reguladoras). Este analisis provisional muestra que (i) la IL-2 puede inducir Treg en pacientes con T1D y (ii) la dosis de 1 MUI por dfa induce una buena respuesta de Treg que dura mas de 2 semanas (ver Figura 8).

Es importante destacar que no se detecto en pacientes una disminucion significativa de la produccion de peptido C. La medicion del peptido C despues de un MMTT (prueba de tolerancia a las comidas mixtas) muestra al menos una produccion de peptido C conservada o, a veces, 2 meses despues del tratamiento de 5 dfas con IL-2 en pacientes, como se muestra para el paciente 1 en la Figura 9B (tengase en cuenta que no se conoce la dosis recibida por este paciente, pero el aumento en Treg observado durante el tratamiento indica que recibio IL-2, no el placebo).

Despues de este primer estudio con pacientes adultos con T1D, los inventores concibieron un segundo ensayo de busqueda de dosis, para T1D infantil, con inclusion de pacientes de 7 anos o mas (DF-IL2-nino). Se refino el estudio de busqueda de dosis de los inventores en base a los resultados de estos en el ensayo descrito anteriormente. Se esta investigando un intervalo de dosis de 0,125 a 1 MUI/m2/d (definido en este documento como dosis ultra baja) durante un penodo de tratamiento de un ano (16 inyecciones), con el objetivo de confirmar la tolerancia y la eficacia para la induccion de Treg. Esto corresponde a una dosis acumulada de 2 a 16 MUI/m2, mas de 100 veces menos que en el estudio descrito anteriormente.

En conjunto, los resultados clmicos de los inventores alivian la preocupacion de que la IL-2 podna no ser tan efectiva en la induccion de Treg en pacientes con T1D que tienen alteraciones de la via de activacion de IL-2/IL-2R. Tambien confirman la excelente tolerancia de IL-2 a las dosis utilizadas y confirman que 0,5 MUI/m2/dfa es una dosis adecuada para evaluar la eficacia de IL-2 en pacientes con T1D, ninos y adultos, recientemente diagnosticados.

Referencias

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5

10

15

20

25

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Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Interleucina-2 (IL-2) para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I en un sujeto humano, en donde IL-2 debe administrarse en una dosis de menos de 3,5 MUI/dfa, en donde dicha IL-2 es IL-2 humana o un analogo activo de esta, cuyo analogo activo tiene al menos un 85% de identidad de aminoacidos con la IL-2 humana.
2. 2. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicha IL-2 es un analogo activo de la IL-2 humana que tiene al menos un 90% de identidad de aminoacidos con la IL-2 humana.
3. 3. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que dicha IL-2 es aldesleucina.
4. 4. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que debe administrarse a una dosis de aproximadamente 3 MUI/dfa.
5. 5. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la interleucina-2 (IL-2) debe administrarse en una dosis de menos de 2 MUI/dfa.
6. 6. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la IL-2 debe administrarse repetidamente.
7. 7. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el tratamiento comprende al menos un primer tratamiento en el que la interleucina-2 debe administrarse una vez al dfa durante al menos 3 dfas consecutivos.
8. 8. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que el tratamiento comprende al menos un primer tratamiento en el que la interleucina-2 debe administrarse una vez al dfa durante 3 a 7 dfas.
9. 9. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I segun la reivindicacion 7 u 8, en la que dicho primer ciclo de tratamiento es seguido por una dosis de mantenimiento despues de 1 a 4 semanas.
10. 10. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el tratamiento es terapeutico.
11. 11. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el tratamiento es preventivo.
12. 12. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el tratamiento previene la aparicion o el desarrollo de la diabetes tipo I.
13. 13. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento o la prevencion de la diabetes tipo I de acuerdo con la reivindicacion

    12, en donde el sujeto tiene riesgo de desarrollar diabetes tipo I y el tratamiento con IL-2 es preventivo de la aparicion de la diabetes en dicho sujeto.
14. 14. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento o la prevencion de la diabetes tipo I de acuerdo con la reivindicacion

    13, en donde el sujeto a tratar muestra una subproduccion de IL-2 y una produccion residual de insulina.
15. 
    15. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I de acuerdo con cualquiera de las

    reivindicaciones 1 a 14, en donde la interleucina-2 se administra por inyeccion o por administracion oral, nasal o topica.
16. 
    16. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I de acuerdo con cualquiera de las

    reivindicaciones 1 a 14, en donde la interleucina-2 (IL-2) se administra por via subcutanea.
17. 
    17. Interleucina-2 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo I de acuerdo con cualquiera de las

    reivindicaciones 1 a 16, en donde la interleucina-2 debe administrarse en un vehfculo o excipiente

    farmaceuticamente aceptable.