ES2778630T3 - Composición multipeptídica - Google Patents

Composición multipeptídica Download PDF

Info

Publication number
ES2778630T3
ES2778630T3 ES16729347T ES16729347T ES2778630T3 ES 2778630 T3 ES2778630 T3 ES 2778630T3 ES 16729347 T ES16729347 T ES 16729347T ES 16729347 T ES16729347 T ES 16729347T ES 2778630 T3 ES2778630 T3 ES 2778630T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
peptide
seq
amino acid
proinsulin
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16729347T
Other languages
English (en)
Inventor
Mark Peakman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kings College London
Original Assignee
Kings College London
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kings College London filed Critical Kings College London
Application granted granted Critical
Publication of ES2778630T3 publication Critical patent/ES2778630T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

Combinación de péptidos que comprende: un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición multipeptídica
Sector de la invención
La presente invención se refiere a una combinación de péptidos que se puede utilizar en la terapia o prevención de la diabetes tipo 1 (T1D, de Type 1 Diabetes).
Estado de la técnica anterior
La diabetes tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune caracterizada por una disfunción metabólica, en particular una desregulación del metabolismo de la glucosa, acompañada de complicaciones vasculares y neurológicas a largo plazo características. La T1D es una de las enfermedades autoinmunes más comunes, que afecta a uno de cada 250 individuos en los EE. UU., en los que se reportan aproximadamente de 10.000 a 15.000 casos nuevos cada año, y la incidencia está aumentando. La prevalencia más elevada de la T1D se encuentra en el norte de Europa. La T1D se caracteriza por una deficiencia absoluta de insulina, lo que hace que los pacientes dependan de insulina exógena para sobrevivir. Antes del inicio clínico agudo de la T1D con síntomas de hiperglucemia, hay un largo período preclínico asintomático, durante el cual las células beta productoras de insulina progresivamente se destruyen.
Se ha demostrado que los autoantígenos de células beta, los macrófagos, las células dendríticas, los linfocitos B y los linfocitos T están implicados en la patogenia de la diabetes autoinmune. Se cree que los autoantígenos de las células beta se liberan de las células beta y se procesan y presentan a las células T auxiliares (células CD4+) por las células presentadoras de antígeno. Las células T CD4+ indiferenciadas se pueden activar mediante la interleucina (IL)-12 liberada por las células presentadoras de antígeno. Las células T CD8+ específicas de antígeno de células beta se activan mediante la IL-2 producida por las células T CD4+ activadas, se diferencian en células T citotóxicas y se reclutan en los islotes pancreáticos. Estas células T TH1 CD4+ activadas y las células T CD8+ citotóxicas están involucradas en la destrucción de las células beta. La IL-2 también activa los linfocitos B para secretar autoanticuerpos de células de islote.
En los últimos años, se han identificado diversos autoantígenos contra los cuales se dirigen los autoanticuerpos de células de los islotes. Entre estos se incluyen el antígeno de islote relacionado con la tirosina fosfatasa 2 (IA-2), y la insulina, la proinsulina (PI) y la preproinsulina.
Una vez iniciado, el tratamiento con inyecciones de insulina sintética es necesario de por vida, dado que las células beta no se regeneran. Una vez establecida, la diabetes es una carga importante para el paciente, para la familia del paciente y para la sociedad. Aunque las dosis, preparaciones y sistemas de administración de insulina modernos pueden mantener la glucosa en la sangre dentro de límites razonables, a lo largo de diversos años inevitablemente ocurren complicaciones de la enfermedad. Las complicaciones graves más comunes de la diabetes son la insuficiencia renal, la ceguera y la pérdida de la función nerviosa. La esperanza de vida de un paciente con diabetes se reduce en un promedio de 10 años. A la luz de estos antecedentes, es importante considerar nuevos medios para tratar o prevenir la T1D. Se han identificado epítopos IA-2 de células T en Honeyman M, et al. (Honeyman M, et al. Molecular Medicine 1998; 4: 231-239), Lohmann T, et al. (Lohmann T, et al. Exp Clin Endocrinol Diabetes 1999; 107 (3): 166-71), McLaughlin KA, et al. (McLaughlin Ka , et al. J Immunol 2014; 193: 4448-56) y Weenink SM, et al. (Weenink SM, et al., J Autoimmun 2009; 33: 147-54. Los péptidos PI y/o IA-2 también se dan a conocer en las Patentes US7049292, WO2005/073248, WO00/63702 y WO2009/004315. Sin embargo, la presente invención utiliza una nueva combinación de epítopos clave de tanto PI como IA-2, y/o un régimen de administración específica, que demuestran un rendimiento superior de inmunoterapia específica de antígeno con el efecto de limitar la autoinmunidad PI/IA-2 que es característica de la T1D.
Características de la invención
La presente invención está definida por las reivindicaciones: en un primer aspecto de la presente invención, se da a conocer una combinación de péptidos que comprende:
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
La SEQ ID NO: 1 es un fragmento de IA-2, que comprende los residuos 718-736.
La SEQ ID NO: 2 es un fragmento de IA-2, que comprende los residuos 752-775.
La SEQ ID NO: 3 es un fragmento de IA-2, que comprende los residuos 855-867.
La SEQ ID NO: 4 es un fragmento de PI, que comprende los residuos C13-C32.
La SEQ ID NO: 5 es
Figure imgf000003_0001
un fragmento de PI, que comprende los residuos C19-A3.
La SEQ ID NO: 6 es un fragmento de PI, que comprende los residuos C22-A5.
El inventor de la presente invención ha descubierto que, sorprendentemente, esta combinación de péptidos es superior para limitar la autoinmunidad anti-PI y anti-IA-2, en comparación con un número menor de péptidos y combinaciones alternativas de péptidos. Sorprendentemente, también se ha demostrado que las diferentes combinaciones de péptidos IA-2 ofrecen diferentes efectos para limitar la autoinmunidad a PI. La combinación de péptidos reivindicada actualmente tiene un rendimiento superior en comparación con otras combinaciones de péptidos. En particular, la combinación de péptidos de la presente invención demuestra la supresión unida a antigenicidad cruzada que puede ser de considerable beneficio para los pacientes cuando se explota terapéuticamente. Permite que se utilice un número limitado de péptidos, de un número limitado de autoantígenos, para atacar las múltiples respuestas autoinmunes diferentes que desempeñan una función en la T1D.
Tal como se describe en la presente memoria descriptiva, el término "péptido" se refiere a cualquier péptido que comprende aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos. El péptido generalmente contendrá aminoácidos de origen natural, pero puede incluir secuencias de aminoácidos modificadas por procesos naturales, tales como el procesamiento postraduccional, o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Dichas modificaciones están bien descritas en textos básicos. Las modificaciones pueden tener lugar en cualquier parte de un péptido, incluida la cadena principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos terminales amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en diversos grados en diversos sitios en un péptido dado. Además, un péptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. En una realización preferente, la combinación de péptidos no comprende otros péptidos de IA-2 o PI.
Preferentemente, la combinación de péptidos reivindicada comprende las secuencias exactas de la presente invención y no fragmentos más largos de IA-2 o PI, o la longitud completa de los mismos.
Resultará evidente para un experto en la técnica que la combinación de péptidos de la presente invención puede comprender componentes no peptídicos, tales como excipientes, tal como se discute más adelante, pero que puede no comprender ningún péptido adicional, en particular péptidos de IA-2 o PI.
Preferentemente, los péptidos que forman la combinación de péptidos son péptidos aislados. El término "aislado" significa que el péptido se elimina de su entorno original. Por ejemplo, un péptido presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo péptido, o un fragmento de dicho péptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dichos péptidos podrían formar parte de un vector y/o los péptidos podrían formar parte de una composición, y aún estar aislados, dado que dicho vector o composición no es parte de su entorno natural.
En una realización preferente, la combinación de péptidos consiste en:
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos ID NO: 1;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos ID NO: 2;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos ID NO: 3;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos ID NO: 4;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos
Figure imgf000003_0002
ID NO: 5; y
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos ID NO: 6.
En esta realización preferente, la combinación de péptidos solo comprende los péptidos recitados que tienen las secuencias específicas recitadas.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéuticamente aceptable que comprende la combinación de péptidos de la presente invención y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Preferentemente, la composición farmacéutica comprende cisteína. La presencia de cisteína libre dentro de la composición estabiliza cualquier tendencia de los péptidos de la combinación de péptidos a formar enlaces disulfuro entre cadenas y de este modo precipitar. La composición farmacéutica puede comprender de 1 a 5 mg de L-cisteína por 2 mg de combinación de péptidos, preferentemente, de 2 a 4 mg de L-cisteína por 2 mg de combinación de péptidos y, de la manera más preferente, 2,5 mg de L-cisteína por 2 mg de combinación de péptidos.
La composición farmacéutica puede ser para su utilización humana o animal en medicina humana y veterinaria y comprenderá, normalmente, uno o más excipientes adecuados. Los excipientes aceptables para su utilización terapéutica son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (edit. A. R. Gennaro 1985). La elección del excipiente farmacéutico se puede seleccionar con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como el excipiente, o además del mismo, cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento o agente solubilizante adecuado.
Se pueden proporcionar conservantes, estabilizantes y colorantes en la composición farmacéutica. Entre los ejemplos de conservantes se incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También se pueden utilizar antioxidantes y agentes de suspensión.
Puede haber diferentes requisitos de composición/formulación dependiendo de los diferentes sistemas de administración. A modo de ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención se puede formular para administrarse por vía parenteral, en la que la composición se formula en forma de inyectable, para administración, por ejemplo, por vía intravenosa, intradérmica, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal. Para la administración parenteral, las composiciones se pueden utilizar mejor en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, sales o monosacáridos suficientes para hacer que la solución sea isotónica con la sangre. La composición también se puede formular para administrarse por vía oral o tópica, incluyendo la vía nasal, oral o epicutánea. Preferentemente, la composición está formulada para administrarse por vía intradérmica.
Entre las vías de administración intradérmica se incluyen cualquier medio de acceso dérmico, por ejemplo, utilizar sistemas de inyección e infusión basados en microagujas (u otros medios para direccionar con precisión al espacio intradérmico), inyección balística sin aguja de fluidos o polvos en el espacio intradérmico, inyección intradérmica tipo Mantoux, iontoforesis mejorada a través de microdispositivos y depósito directo de fluidos, sólidos u otras formas de dosificación en la piel, incluida la utilización de parches para depositar la composición sobre la piel.
Normalmente, un médico determinará la dosis real que será más adecuada para un sujeto individual y ésta variará con la enfermedad, edad, peso y respuesta del paciente particular. Un experto en la materia puede determinar la dosis apropiada para seres humanos, por ejemplo, utilizando la normalización del área de superficie corporal (BSA). Por ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender, aproximadamente, de 0,1 |xg a 15 mg de péptido total por dosis única, preferentemente, de 1 |xg a 12 mg de péptido total por dosis única. En una realización preferente, se administran 240 |xg (dosis de 1 |xg de BSA normalizada para un humano adulto de 60 kg) de péptido total por dosis única, con los péptidos presentes en una proporción equimolar. En otra realización preferente, se administran 12 mg de péptido total por dosis única, con los péptidos presentes en una proporción equimolar.
En una realización preferente, la composición que comprende la combinación de péptidos de la presente invención se administra, como mínimo, una vez al mes, preferentemente, una vez cada 1 a 4 semanas durante cuatro administraciones.
En una realización, la composición que comprende la combinación de péptidos de la presente invención se administra, como mínimo, una vez al mes, preferentemente, una vez cada 2 a 4 semanas durante cuatro administraciones.
En otra realización, la composición que comprende la combinación de péptidos de la presente invención se administra, como mínimo, una vez al mes, preferentemente, una vez a la semana durante cuatro semanas.
La composición farmacéutica también puede comprender adyuvantes promotores de tolerancia y/o células promotoras de tolerancia. Entre los adyuvantes promotores de la tolerancia se incluyen IL-10, subunidad B recombinante de la toxina del cólera (rCTB), ligandos para el receptor 2 de tipo Toll, así como anticuerpos biológicos y monoclonales que modulan las respuestas inmunes, tales como anti-CD3 y bloqueadores de la coestimulación, que se pueden administrar conjuntamente con la combinación de péptidos. Entre las células promotoras de la tolerancia se incluyen células dendríticas inmaduras y células dendríticas tratadas con vitamina D3, (lapha, 25-dihidroxi vitamina D3) o sus análogos. Preferentemente, uno o más de los péptidos de la combinación de péptidos de la presente invención se conjugan con la superficie de una célula dendrítica tratada con vitamina D3 o sus análogos. Preferentemente, todos los péptidos de la combinación de péptidos de la presente invención se conjugan con la superficie de una célula dendrítica tratada con vitamina D3 o sus análogos.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a la composición farmacéuticamente aceptable de la presente invención para su utilización en terapia.
Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a la composición farmacéuticamente aceptable de la presente invención para su utilización en el tratamiento o la prevención de la diabetes tipo 1 (T1D).
Cuando la T1D se "trata", esto significa que una o más manifestaciones clínicas de la T1D mejoran. No significa que los síntomas de la diabetes tipo 1 estén completamente sanados, de manera que ya no estén presentes en el paciente, aunque en algunos procedimientos, este pueda ser el caso. El "tratamiento" hace que uno o más de los síntomas de la T1D sean menos graves que antes del tratamiento.
Preferentemente, la composición farmacéuticamente aceptable de la presente invención se administra a un paciente que tiene una masa de células beta restante.
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un kit para el tratamiento o la prevención de la diabetes tipo 1 (T1D) que comprende la combinación de péptidos de la presente invención.
Dichas APC pueden ser linfocitos B, monocitos, macrófagos o células dendríticas, o células mononucleares de sangre periférica completa (PBMC, de peripheral blood mononuclear cells). Las APC también pueden ser líneas celulares inmortalizadas derivadas de linfocitos B, monocitos, macrófagos o células dendríticas. Cuando los sujetos son seres humanos, las APC también pueden ser células T, dado que las células T humanas son capaces de expresar moléculas MHC de clase II. El procedimiento comprende además administrar la combinación de péptidos de la presente invención al individuo si los linfocitos CD4 reconocen el péptido unido a MHC de clase II.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una combinación de péptidos que comprende:
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6
para su utilización en el tratamiento o la prevención de la diabetes tipo 1 (T1D) en la que la combinación se administra, como mínimo, una vez al mes, preferentemente, una vez cada 1 a 4 semanas durante cuatro administraciones.
En una realización, la composición que comprende la combinación de péptidos de la presente invención se administra, como mínimo, una vez al mes, preferentemente, una vez cada 2 a 4 semanas durante cuatro administraciones.
En otra realización, la composición que comprende la combinación de péptidos de la presente invención se administra, como mínimo, una vez al mes, preferentemente, una vez a la semana durante cuatro semanas.
"En la que la composición es para su administración" significa que la combinación se administra. Preferentemente, la combinación de péptidos es para su administración a una dosis de 240 |xg o 12 mg de péptido total, con los péptidos presentes en una relación equimolar.
Preferentemente, la combinación de péptidos se formula como una composición farmacéuticamente aceptable que incluye uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Preferentemente, la composición está formulada para administrarse por vía parenteral, oral o tópica, incluidas las vías intravenosa, intradérmica, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, nasal, oral o epicutánea y, más preferentemente, la composición está formulada para administrarse por vía intradérmica.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de tratamiento o prevención de la diabetes tipo 1 (T1D) en el que una combinación de péptidos que comprende:
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6
se administra a un paciente con T1D o un individuo no diabético identificado con alto riesgo de T1D, como mínimo, una vez al mes, preferentemente, una vez cada 1 a 4 semanas durante cuatro administraciones.
En una realización, la composición que comprende la combinación de péptidos de la presente invención se administra, como mínimo, una vez al mes, preferentemente, una vez cada 2 a 4 semanas durante cuatro administraciones.
En otra realización, la composición que comprende la combinación de péptidos de la presente invención se administra, como mínimo, una vez al mes, preferentemente, una vez a la semana durante cuatro semanas. Preferentemente, la combinación se administra a una dosis de 240 |xg o 12 mg de péptido total, con los péptidos presentes en una relación equimolar.
Preferentemente, la combinación de péptidos se formula como una composición farmacéuticamente aceptable que incluye uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Preferentemente, la composición está formulada para administrarse por vía parenteral, oral o tópica, incluidas las vías intravenosa, intradérmica, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, nasal, oral o epicutánea y, más preferentemente, la composición está formulada para administrarse por vía intradérmica.
En particular, los aspectos de la combinación de péptidos, por ejemplo, pueden haberse descrito con mayor detalle que en otros aspectos de la presente invención, por ejemplo, la utilización de la combinación de péptidos. Sin embargo, el experto apreciará que cuando se ha proporcionado información más detallada para un aspecto particular de la presente invención, generalmente, esta información es aplicable de igual manera a otros aspectos de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describirá ahora en detalle a modo de ejemplo solo con referencia a las figuras, en las que:
La figura 1 muestra los resultados de 3 secuencias parentales mostradas con sombreado cruzado, y comparadas con una secuencia peptídica anidada más corta, para mostrar el porcentaje de pacientes con diabetes tipo 1 que responden, utilizando la producción de interferón-y como la lectura, detectada por inmunoensayo enzimático de puntos.
La figura 2 muestra los resultados de la proliferación de células T como una lectura de autoinmunidad específica a PI e IA-2 después de la inmunización con composiciones multipeptídicas para derivar un modelo preclínico de autoinmunidad relacionada con la diabetes.
La figura 3 muestra los resultados de la proliferación de células T como una lectura de autoinmunidad a PI y IA-2 después del tratamiento de ratones Tg autoinmunes HLA-DR4 con composiciones multipeptídicas.
La figura 4 muestra que el tratamiento de ratones con una combinación de 3 péptidos PI es más eficaz que el tratamiento con un solo péptido PI. En resumen, la tolerancia a la proinsulina se rompió en ratones mediante inmunización subcutánea con 100 |xg de proteína de proinsulina emulsionada en CFA y tratamiento intraperitoneal con toxina pertussis inmediatamente después de la inmunización y 1 día después de la misma. Posteriormente, los ratones recibieron 4 tratamientos intradérmicos semanales de 10 |xg de PI de control o mono/multi-PI proinsulina (C13-32 (SEQ ID NO: 4); C19-A3 (SEQ ID NO: 5); C22-A5 (SEQ ID NO: 6)), antes de la inmunización subcutánea con 100 |xg de proteína proinsulina emulsionada en IF A para aumentar la respuesta autoinmune en curso (A). Los ganglios linfáticos (LN, de lymphatic nodes) se extrajeron 7 días después y las suspensiones de células LN se cultivaron con o sin proteína o péptido de proinsulina (C13-32; C19-A3; C22-A5) durante 48 horas in vitro. Se analizó la proliferación de células T CD4+ y la producción de IFN-y mediante dilución CFSE a las 96 horas (B) y ELISA a las 48 horas (C) en respuesta a la estimulación in vitro con 50 |xg/ml de proteína de proinsulina y 10 |xg/ml de péptidos (C13-32; C19-A3; C22-A5). Se midieron los niveles séricos de IgG1 específica de proinsulina en el día 42 (D). Se midieron los porcentajes de la proliferación de células T reguladoras CD3+CD4+CD25highFoxP3+ mediante citometría de flujo en cultivos de LN en el día 42 (E). Los datos son representativos de tres experimentos independientes. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001; la significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional o la prueba de la t de Student. 15 ratones por grupo en B y C; 5 ratones por grupo D-F.
La figura 5 muestra que una mayor frecuencia de dosis bajas de multi-PI es más eficaz que una dosis más elevada o menos tratamientos para revertir la ruptura de la tolerancia a la proinsulina completa. La tolerancia a la proinsulina se rompió en ratones mediante inmunización subcutánea con 100 |xg de proteína de proinsulina emulsionada en CFA y tratamiento intraperitoneal con toxina pertussis inmediatamente después de la inmunización y 1 día después de la misma. Posteriormente, los ratones recibieron 4 o 2 tratamientos intradérmicos semanales de 10 |xg o 1 |xg que consistían en 3 péptidos de proinsulina (C13-32; C19-A3; C22-A5) o péptido HA de control, antes de la inmunización subcutánea con 100 |xg de proteína proinsulina emulsionada en IFA para aumentar la respuesta autoinmune en curso (A). Los LN se extrajeron en el día 42 y las células LN se cultivaron con o sin proteína o péptido de proinsulina (C13-32; C19-A3; C22-A5) durante 48 horas in vitro. Se analizaron la proliferación y la producción de citocinas mediante la incorporación de timidina y ELISA y se muestra la proliferación promedio ± EEP en respuesta a 50 |xg/ml de proinsulina (B) y la producción de IFN-y en respuesta a 50 |xg/ml de proinsulina (C) o 10 |xg/ml de péptidos de proinsulina, en cultivos DLN. Se midió el porcentaje de proliferación de células T reguladoras CD3+CD4+CD25highFoxP3+ mediante citometría de flujo en cultivos de LN el día 42 (E). Se midieron los niveles séricos de IgG1 específica de proinsulina en el día 42 (F). Los datos son representativos de, como mínimo, dos experimentos independientes. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001; la significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional o la prueba de la t de Student. 6 ratones por grupo.
La figura 6 muestra que el tratamiento con 3 péptidos PI aumenta la regulación específica de antígeno. Las células T reguladoras de ratones tratados con multi-PI proinsulina tienen una actividad supresora específica de proinsulina mejorada en comparación con los ratones tratados con PI de control. La tolerancia a la proinsulina se rompió en ratones mediante inmunización subcutánea con 100 |xg de proteína de proinsulina emulsionada en CFA y tratamiento intraperitoneal con toxina pertussis inmediatamente después de la inmunización y 1 día después de la misma. Posteriormente, los ratones recibieron 4 tratamientos intradérmicos semanales de 1 |xg de PI que consistía en 3 péptidos de proinsulina (C13-32; C19-A3; C22-A5) o péptido HA de control, antes de la inmunización subcutánea con 100 |xg de proteína proinsulina emulsionada en IFA para aumentar la respuesta autoinmune en curso (A). Se extrajeron LN en el día 42 y se aislaron y se cultivaron conjuntamente células T reguladoras CD4+CD2Shigh, a concentraciones variables, con células T de respuesta marcadas con CFSE, a partir de ratones inmunizados con la proinsulina/CFA. Las células se cultivaron conjuntamente en presencia de partículas inmunomagnéticas aCD3aCD28 (B) o proteína proinsulina (C) y se calculó la proliferación de células T CD4+ de respuesta midiendo la dilución CFSE mediante citometría de flujo a las 96 horas. Promedio ± EEP de proliferación de células de respuesta marcadas con CFSE en respuesta a 50 |xg/ml de proinsulina en presencia de concentraciones decrecientes de células T reguladoras CD4+CD25high de ratones tratados con HA o proinsulina-PIT (D). La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional o la prueba de la t de Student. *p <0,05, **p <0,01, 15 ratones por grupo (ganglios linfáticos agrupados).
Ejemplo 1
Generación de un modelo en ratón de autoinmunidad relevante para diabetes a través de la inducción de autorreactividad específica para proinsulina/específica para IA-2
Se importaron de Taconic, EE. UU., ratones 1 Kito Tg B6.129S2-H2-Abíím,Gru (HLA-DRA/H2-Ea, HLA-DRB1*0401/H2-Eb) (HLA-DR4-Tg) (1), y se utilizaron en todos los experimentos. Se determinó que todos los animales estuvieran libres de patógenos y se mantuvieron en condiciones estándar en la Unidad de Servicios Biológicos del King's College de Londres, de conformidad con el Reglamento de la Oficina Central.
Los ratones se expusieron por vía subcutánea en la base de la cola a 100 |xg de proteína proinsulina humana recombinante entera (Biomm , Brasil) y/o antígeno 2 asociado a insulinoma humano recombinante (IA-2; Proteogenix) emulsionados en adyuvante completo de Freund (CFA, de Complete Freund’s Adjuvant, Sigma-Aldrich). Los ratones se trataron con 200 ng de toxina pertussis (PTX, de Pertussis Toxin, Sigma-Aldrich) administrados a través de la cavidad intraperitoneal en el momento de la inmunización y 1 día después de la misma. Al ensayar la inmunoterapia con péptidos, las respuestas autoinmunes se incrementaron adicionalmente con 100 |xg de autoantígeno (proinsulina y/o IA-2) emulsionados en adyuvante incompleto de Freund (IFA, de Incomplete Freund’s Adjuvant, Sigma-Aldrich) por vía subcutánea en la base de la cola 7 días después de la última terapia de tratamiento con péptidos. Se obtuvo evidencia de la inducción de autoinmunidad específica de proinsulina e IA-2 ensayando las respuestas de recuerdo a proinsulina o IA-2 para demostrar la proliferación de células T y la producción de citocinas inflamatorias de células T.
Los gráficos de la figura 2 muestran la producción de citocinas proinflamatorias contra los autoantígenos proinsulina (PI) e IA-2 (paneles A y B, respectivamente) y proliferación de células T (paneles C y D, respectivamente) después de la inmunización de ratones humanizados (Tg HLA-DR4: ratones transgénicos para el péptido humano que presentan la molécula HLA-DR4) con estos autoantígenos en CFA con adyuvante de toxina pertussis (PTX). Está bien establecido que la proliferación y la producción de citocinas proinflamatorias por las células T en respuesta a estos autoantígenos es una característica de la diabetes tipo 1 humana. Por lo tanto, estos datos indican que el ratón Tg HLA-DR4, manipulado tal como se ha mostrado, puede sintetizar las características autoinmunes de la enfermedad humana.
Ejemplo 2
Medición de la proliferación de células T específicas de proinsulina e IA-2, producción de citocinas inflamatorias e inducción de células T reguladoras proliferativas (célula T reguladora) en ratones
Se homogeneizaron los ganglios linfáticos de drenaje (DLN, de Draining lymph nodes) utilizando un filtro de células BD (70 p.m). Las células se lavaron en RPMI y se resuspendieron a 2,5x106 células/ml en RPMI que contenía el 0,5 % de suero de ratón autólogo. Se añadieron 2,5x105 células a cada pocillo de una placa de fondo en U. Las células se reestimularon solo con medio, partículas magnéticas a-CD3/a-CD28 (Invitrogen) como un estímulo de control positivo o con proteína proinsulínica o IA-2. A las 48 horas, se eliminaron los sobrenadantes para el análisis de citocinas y se añadieron 0,5 mCi/pocillo de timidina tritiada [3H]. Las células se recolectaron 18 horas después utilizando una máquina MicroBeta Trilux (Perkin Elmer). Se midieron los niveles de IFN-y e IL-10 en sobrenadantes de cultivo tomados a las 48 horas utilizando un kit ready-SET-Go (ebiosciences) según las directrices del fabricante.
Se realizó la citometría de flujo según el protocolo estándar. Se añadieron anticuerpos (Abs, de Antibodies) (anti-CD4-PerCP, anti-FoxP3-APC, anti-CD3-PE, anti-CD25-FITC, anti-ki67-Pacific Blue (todos eBioscience, Reino Unido), anti-CDllc-PE Cy7, anti-PDL1-PE, anti-CD86-FITC, anti-HLA-APC (todos BD bioscience), a cada muestra a una dilución de 1:100. Se realizó la tinción intracelular utilizando un kit estándar y según las directrices del fabricante (Biolegend). Se analizaron las muestras utilizando un citómetro de flujo FACSCanto III equipado con un láser violeta de 405 nm, un láser de argón de 488 nm y un láser de diodo rojo de 635 nm (BD Bioscience) y el software FlowJo. En primer lugar, se identificaron los linfocitos según el tamaño y granularidad utilizando parámetros de dispersión frontal y lateral. Se identificaron, a continuación, las células T CD4+ sobre la base de la expresión de CD3 y CD4. Las células T reguladoras se caracterizaron sobre la base de la alta expresión de CD25 y la expresión de FoxP3. Finalmente, se identificaron las células T reguladoras CD3+CD4+FoxP3+CD25high que proliferaron sobre la base de la regulación positiva de la proteína nuclear, Ki67.
Ejemplo 3
Regulación específica de proinsulina
Se rompió la tolerancia a la proinsulina en ratones tal como se ha descrito anteriormente. Posteriormente, los ratones recibieron 4 tratamientos intradérmicos semanales de 1 |xg de PI de control o multi-PI proinsulina (que comprende cantidades equimolares de C13-22, C19-A3 y C22-A5) antes de que la respuesta autoinmune en curso a la proinsulina se hubiera potenciado mediante la inyección subcutánea de proinsulina/IFA. Se extirparon los ganglios linfáticos y se aislaron las células T CD4+ mediante selección negativa utilizando un kit de aislamiento de células T CD4 (Miltenyi Biotec, Alemania). A continuación, las células se tiñeron con anti-CD25-FITC (ebioscience) y se aislaron las células T supresoras CD4+ CD25high mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un BD FACSAria. Las células informadoras a partir de ratones inmunizados con proinsulina/CFA se marcaron con CFSE, tal como se ha descrito anteriormente y se cultivaron conjuntamente con células T CD4+ CD25high durante 96 horas con medio solo, con partículas magnéticas a-CD3a-CD28 o con proteína proinsulina. La proliferación de las células informadoras (correspondiente a la pérdida de CFSE) se midió por citometría de flujo. El % de supresión se calculó mediante:
Dilución de CFSE de T informadoras - Dilución de CFSE de T informadoras: T reguladoras x100
Dilución de CFSE de T informadoras
Ejemplo 4
Identificación de secuencias óptimas de IA-2 en pacientes con T1D humana
Se llevó a cabo la detección de interferón (IFN)-y por células T CD4+ en respuesta a la estimulación peptídica utilizando un ensayo inmunoensayo enzimático de puntos (ELISPOT) que tiene una capacidad discriminativa significativa para la diabetes tipo 1 en los ensayos de competencia ciega, tal como se ha descrito anteriormente (Arif, S. et al. J Clin Invest 2004; 113: 451-463 y Herold, KC et al. Diabetes 2009; 58: 2588-2595). Los datos se expresan como el número promedio de puntos por triplicado y se comparan con el número promedio de puntos en presencia solo de diluyente (índice de estimulación; SI, de Stimulation Index). Una respuesta se considera positiva cuando el SI es > 3 utilizando puntos de corte determinados utilizando gráficas características del receptor-operador, tal como se ha descrito anteriormente (Arif , S. et al. J Clin Invest 2004; 113: 451-463).
La figura 1 muestra la proporción (como %) de pacientes con diabetes tipo 1 que responden a epítopos anidados dentro de una serie de péptidos específicos que se identificaron mediante elución (ver Peakman M, et al. J Clin Invest 1999; 104: 1449-57). Los resultados se muestran para 3 secuencias parentales (sombreadas) y se comparan con péptidos de secuencia anidada más cortos. Las respuestas representan la producción de IfN-y por células mononucleares de sangre periférica cultivadas con cada péptido, tal como se detecta utilizando un inmunoensayo enzimático de puntos.
La figura 1 ilustra las secuencias preferenciales dentro de las series 709 (718-36) y 853 (855-67). Ninguno de los péptidos anidados para la serie 752 es evidentemente superior.
Ejemplo 5
Combinaciones de péptidos
Se seleccionaron diversas combinaciones de péptidos de proinsulina (PI) e IA-2 para su evaluación como óptimas para inducir la regulación inmune. Véase la tabla 1 de a continuación.
Tabla 1-Cócteles de péptidos utilizados en el tratamiento de inmunoterapia con péptidos
Figure imgf000008_0001
La SEQ ID NO: 7 es un fragmento de IA-2, que comprende los residuos 718-730.
La SEQID NO: 8 es un fragmento de IA-2, que comprende los residuos 855-869.
La SEQ ID NO: 9 es un fragmento de IA-2, que comprende los residuos 709-732.
La SEQ ID NO: 10 es un fragmento de IA-2, que comprende los residuos 856-870.
La SEQ ID NO: 11 es un fragmento de IA-2, que comprende los residuos 709-736.
La SEQ ID NO: 12 es un fragmento de IA-2, que comprende los residuos 853-872.
Ejemplo 6
Una combinación específica de seis péptidos es más eficaz para limitar la autoinmunidad a proinsulina e IA-2 que diversas otras combinaciones probadas
Los ratones transgénicos (humanizados) HLA-DR4 se vuelven "autoinmunes", mediante inmunización con adyuvantes fuertes y PI/IA-2, para inducir una respuesta inflamatoria a PI e IA-2, tal como se ha descrito anteriormente. La respuesta inflamatoria incluye la proliferación de células T y la producción de citocinas inflamatorias, principales características de la diabetes autoinmune (Tipo 1) en el hombre. Los ratones se asignaron a 5 grupos de tratamiento con los cócteles de péptidos o control, tal como se muestra en la tabla 1.
Se indujeron respuestas autoinmunes contra PI y IA-2 en ratones 1 Kito Tg B6.129S2-H2-Ab1tm1Gru (HLA-DRA/H2-Ea, HLA-DRB1 * 0401/H2-Eb) (HLA-DR4-Tg), tal como se ha descrito en el ejemplo 1 anterior. Para examinar los efectos de diferentes combinaciones de péptidos administrados como inmunoterapia peptídica sobre la respuesta autoinmune inducida, se administraron las combinaciones de péptidos que se muestran en la tabla 1 o un control (agua para inyección) en 100 p.l de PBS estéril mediante inyección intradérmica (10 |xg de contenido de péptido total por inyección, con los péptidos en una proporción equimolar) sobre el abdomen, una vez por semana durante 4 semanas. Se ensayaron las respuestas autoinmunes a PI e IA-2 7 días después, examinando la proliferación y la producción de citocinas de células de ganglios linfáticos contra PI e IA-2, tal como se ha descrito en el ejemplo 2. Los ratones tratados con el control tendrán una proliferación robusta de células T y respuestas inflamatorias de citocinas. Cuando la terapia sea eficaz, estas respuestas se reducirán significativamente.
Los resultados se expresan como promedio ± error estándar del promedio (EEP). La distribución gaussiana se confirmó mediante la prueba de normalidad ómnibus D'Agostino y Pearson antes de determinar la significación mediante ANOVA de una vía o la prueba de la t de Student. Un valor de p <0,05 se consideró significativo.
La figura 3 representa respuestas de proliferación de recuerdo a PI (panel A) e IA-2 (panel B) in vitro de células de ganglios linfáticos obtenidas de ratones Tg HLA-DR4 que se habían vuelto autoinmunes contra PI e IA-2 por inmunización. Posteriormente, los ratones se trataron con control o una de las combinaciones de péptidos especificadas en la tabla 1. Los datos en la figura 3 se muestran como promedios (EEP) de n = 8 por grupo.
La figura 3A ilustra que la combinación del grupo 1 es el único cóctel que proporciona una reducción estadísticamente significativa en la autoinmunidad a PI en comparación con el control. La combinación del grupo 1 es significativamente mejor que su versión alternativa más cercana para reducir la autoinmunidad. Los grupos 3 y 4 no reducen significativamente la autoinmunidad.
La figura 3B ilustra que la combinación del grupo 1 es el único cóctel que proporciona una reducción estadísticamente significativa en la autoinmunidad a iA-2 en comparación con el control. La combinación del grupo 1 es significativamente mejor que su versión alternativa más cercana para reducir la autoinmunidad. Los grupos 3 y 4 no reducen significativamente la autoinmunidad.
Los péptidos del grupo 1 consiguen una reducción significativa en la proliferación (es decir, el control de la autoinmunidad a PI e IA-2), por lo que muestran el mejor rendimiento como tolerógenos. Hay que destacar que los péptidos del grupo 1-4 solo difieren en la composición de IA-2. Los péptidos PI son los mismos en todos los grupos, sin embargo, la combinación de péptidos del grupo 1 también es superior para limitar la autoinmunidad específica de PI. Esto sugiere un fenómeno de supresión ligado a antigenicidad cruzada.
Los resultados descritos anteriormente demuestran que la nueva combinación de péptidos, actualmente reivindicada, es superior para limitar la autoinmunidad anti-PI y anti-IA-2 en comparación con combinaciones de péptidos alternativas. De manera sorprendentemente, se ha demostrado que las diferentes combinaciones de péptidos IA-2 ofrecen diferentes efectos para limitar la autoinmunidad a Pl. Esta es una demostración de la supresión ligada al antígeno trans que puede ser de considerable beneficio terapéutico para los pacientes. Se podría utilizar un número limitado de péptidos, de un número limitado de autoantígenos para apuntar a los múltiples autoantígenos diferentes que desempeñan un papel en la T1D.
Ejemplo 7
Una combinación PI tripeptídica específica es más eficaz para limitar la autoinmunidad a la proinsulina que cada péptido PI solo.
Se indujeron respuestas autoinmunes contra PI y IA-2 en ratones 1 Kito Tg B6.129S2-H2-Ab1tm1Gru (HLA-DRA/H2-Ea, HLA-DRB1 *0401/H2-Eb) (HLA-DR4-Tg), tal como se ha descrito en el ejemplo 1 anterior.
Este modelo de autoinmunidad a PI se utilizó para evaluar la capacidad de los monopéptidos y multipéptidos proinsulina para modular una respuesta autoinmune establecida a la proinsulina. El potencial tolerógeno de cada péptido de proinsulina restringido a HLA-DR4 se investigó tratando ratones HLA-DR4-Tg con 4 inyecciones intradérmicas semanales de mono-PI o multi-PI (un cóctel equimolar de los 3 péptidos de proinsulina). Se analizaron in vitro las respuestas de recuerdo, después de una exposición secundaria con proinsulina-IFA completa para aumentar la respuesta autoinmune en curso (figura 4A). El Multi-PI moduló significativamente a la baja la capacidad proliferativa específica de antígeno de cultivos de ganglios linfáticos de drenaje (DLN) en respuesta a la proinsulina y péptidos de proinsulina, pero no a la ovoalbúmina (OVA) (figura 4B). Además, el multi-PI disminuyó significativamente la síntesis de los mediadores inflamatorios IFN-y, (figura 4C), IL-17 e IL-13 (datos no mostrados). Curiosamente, no se observó una inducción específica de antígeno de IL-10 (figura 4D). El multi-PI también fue eficaz en la modulación a la baja de la respuesta a la proteína proinsulina in vivo, como lo indican los niveles séricos reducidos de IgG específica de proinsulina (figura 4E). En contraste, el mono-PI con péptidos individuales C13-32, C19-A3 o C22-A5 mostró niveles más bajos de potencia terapéutica (figuras 4E-F).
En relación con el mecanismo de estos efectos, el análisis de DLN por citometría de flujo demostró que la proporción de células T reguladoras proliferantes en los ganglios linfáticos después del multi-PI aumentó significativamente en comparación con los ratones tratados con PI de control (figura 2F). Una vez más, la combinación de 3 péptidos de proinsulina fue más eficaz que el mono-PI para inducir la proliferación de células T reguladoras, lo que sugiere que múltiples péptidos PI son más eficaces que los péptidos PI individuales para modular una respuesta autoinmune establecida.
Ejemplo 8
Optimización de la dosificación y administración de péptidos
Se trataron los ratones con 1 o 10 |xg de multi-PI, en 2 o 4 ocasiones, (figura 5A). Para establecer el efecto de una frecuencia y/o dosis reducida de multi-PI, se analizaron las respuestas de recuerdo in vitro, midiendo la proliferación y la producción de citocinas de suspensiones de células DLN a proteínas de proinsulina y péptidos de proinsulina (figuras 5B-D). La reducción del número de tratamientos multi-PI de 4 a 2 dio como resultado una pérdida sustancial de potencia terapéutica. En contraste, 4 tratamientos de multi-PI fueron eficaces en la modulación a la baja de la respuesta a la proinsulina y una dosis reducida de 1 |xg parecía ser tan eficaz como 10 |xg de multi-PI (figuras 5B-D). El análisis de la composición de DLN por citometría de flujo, a los 7 días de la inmunización secundaria posterior, reveló un mayor nivel de proliferación reguladora de células T en ratones que habían recibido multi-PI en comparación con los ratones que habían recibido PI de control, sin que se observara una diferencia significativa entre grupos de tratamiento (figura 5E). Los niveles de IgG en suero específicos de proinsulina se modularon a la baja mediante multi-PI y se redujeron significativamente en ratones que habían recibido 4 tratamientos de 10 |xg de multi-PI (figura 5F).
Ejemplo 9
El tratamiento con tres péptidos PI mejora la regulación específica de antígeno
Se evaluó el impacto de multi-PI en la función de las células T reguladoras midiendo la actividad supresora específica de proinsulina en el compartimento de células T reguladoras de ratones tratados con PI de control en comparación con aquellos que recibieron tratamiento activo. Se aislaron células T reguladoras CD4+CD25high de ratones tratados con PI de control o multi-PI proinsulina y se cultivaron conjuntamente, en concentraciones variables, con células T informadoras marcadas con CFSE de ratones inmunizados con proinsulina/CFA (figura 6A). Las células se cultivaron conjuntamente en presencia de partículas inmunomagnéticas anti-CD3/anti-CD28 para medir la capacidad de las células T reguladoras de PIT de control y multi-PIT para suprimir una respuesta policlonal. Las células T reguladoras generadas en ambas condiciones de tratamiento demostraron una capacidad supresora equivalente (figura 6B). Sin embargo, en cultivos conjuntos estimulados con proteína de proinsulina hubo una capacidad supresora distinta relacionada con el tratamiento (figura 6C). Las células T reguladoras de ratones tratados con multi-PI suprimieron las respuestas específicas de proinsulina en un grado significativamente mayor que las células T reguladoras de ratones tratados con PI de control (figura 6D).

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Combinación de péptidos que comprende:
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
2. Combinación de péptidos, según la reivindicación 1, que consiste en:
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y
un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
3. Composición farmacéuticamente aceptable que comprende la combinación de péptidos, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
4. Composición farmacéuticamente aceptable, según la reivindicación 3, que comprende además cisteína.
5. Composición farmacéuticamente aceptable, según la reivindicación 3 o 4, para su utilización en terapia.
6. Composición farmacéuticamente aceptable, según la reivindicación 5, para su utilización en el tratamiento o la prevención de la diabetes tipo 1 (T1D).
7. Composición farmacéuticamente aceptable, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4 o la composición para su utilización, según las reivindicaciones 5 y 6, en la que la composición está formulada para administrarse por vía parenteral, oral o tópica, incluyendo las vías intravenosa, intradérmica, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, nasal, oral o epicutánea.
8. Composición farmacéuticamente aceptable para su utilización, según la reivindicación 7, en la que la composición está formulada para administrarse por vía intradérmica.
9. Kit para su utilización en el tratamiento o la prevención de la diabetes tipo 1 (T1D) que comprende la combinación de péptidos, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
ES16729347T 2015-06-10 2016-06-10 Composición multipeptídica Active ES2778630T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1510056.3A GB201510056D0 (en) 2015-06-10 2015-06-10 Multi-peptide composition
PCT/GB2016/051726 WO2016198887A1 (en) 2015-06-10 2016-06-10 Multi-peptide composition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2778630T3 true ES2778630T3 (es) 2020-08-11

Family

ID=53785229

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16729347T Active ES2778630T3 (es) 2015-06-10 2016-06-10 Composición multipeptídica

Country Status (27)

Country Link
US (1) US11400131B2 (es)
EP (1) EP3307298B1 (es)
JP (1) JP6969790B2 (es)
KR (1) KR20180023948A (es)
CN (1) CN107896494B (es)
AR (1) AR104947A1 (es)
AU (1) AU2016275295B2 (es)
BR (1) BR112017026537A2 (es)
CA (1) CA2984957A1 (es)
CL (1) CL2017003143A1 (es)
CO (1) CO2017012986A2 (es)
EA (1) EA201890007A1 (es)
EC (1) ECSP18001655A (es)
ES (1) ES2778630T3 (es)
GB (1) GB201510056D0 (es)
HK (1) HK1253094A1 (es)
IL (1) IL256199A (es)
MA (1) MA41668A1 (es)
MX (1) MX2017015658A (es)
PE (1) PE20180450A1 (es)
PH (1) PH12017501918A1 (es)
PL (1) PL3307298T3 (es)
TN (1) TN2017000517A1 (es)
TW (1) TW201712027A (es)
UY (1) UY36722A (es)
WO (1) WO2016198887A1 (es)
ZA (1) ZA201707873B (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201913408D0 (en) * 2019-09-17 2019-10-30 King S College London Proinsulin peptides for type 1 diabetes

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1986011B1 (en) * 1999-04-21 2015-02-11 Eisai Inc. Peptide epitopes recognized by disease promoting CD4+ T lymphocytes
AU2002249895A1 (en) * 2001-01-05 2002-07-16 Joslin Diabetes Center, Inc. Autoantigen composition
GB0402129D0 (en) * 2004-01-30 2004-03-03 King S College London Therapeutic and diagnostic peptides
PL1709070T3 (pl) * 2004-01-30 2014-01-31 King S College London Peptydy do leczenia chorób autoimmunologicznych
WO2005076965A2 (en) * 2004-02-04 2005-08-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-cd3 and antigen-specific immunotherapy to treat autoimmunity
ES2533566T3 (es) * 2006-12-29 2015-04-13 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Diana diagnóstica y terapéutica para enfermedades autoinmunitarias y sus usos
CA2827894A1 (en) * 2011-02-22 2012-08-30 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. Circulating biomarkers
EP2819689A1 (en) * 2012-03-01 2015-01-07 Yeda Research and Development Co. Ltd. Regeneration of islet beta cells by hsp60 derived peptides

Also Published As

Publication number Publication date
US11400131B2 (en) 2022-08-02
BR112017026537A2 (pt) 2019-11-12
GB201510056D0 (en) 2015-07-22
WO2016198887A1 (en) 2016-12-15
CO2017012986A2 (es) 2018-03-09
EP3307298A1 (en) 2018-04-18
AU2016275295B2 (en) 2021-12-09
HK1253094A1 (zh) 2019-06-06
TN2017000517A1 (en) 2019-04-12
MA41668A1 (fr) 2018-03-30
CN107896494A (zh) 2018-04-10
US20180221434A1 (en) 2018-08-09
ECSP18001655A (es) 2018-10-31
JP2018524301A (ja) 2018-08-30
PE20180450A1 (es) 2018-03-05
AR104947A1 (es) 2017-08-23
CA2984957A1 (en) 2016-12-15
PH12017501918A1 (en) 2018-03-19
EP3307298B1 (en) 2020-01-15
MX2017015658A (es) 2018-08-15
TW201712027A (zh) 2017-04-01
UY36722A (es) 2017-01-31
CN107896494B (zh) 2021-09-03
CL2017003143A1 (es) 2018-05-18
EA201890007A1 (ru) 2018-05-31
IL256199A (en) 2018-02-28
AU2016275295A1 (en) 2017-12-07
PL3307298T3 (pl) 2020-06-29
JP6969790B2 (ja) 2021-11-24
ZA201707873B (en) 2019-05-29
KR20180023948A (ko) 2018-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2693645T3 (es) Uso de IL-2 a baja dosis para tratar la diabetes tipo 1
ES2811624T3 (es) Régimen de dosificación de IL-2 para tratar lupus eritematoso sistémico
US9018006B2 (en) Stable Tregs and related materials and methods
EP3185885B1 (en) Polypeptides and uses thereof as a drug for treatment of autoimmune disorders
CN103561760A (zh) 包含apob100的免疫原性片段的免疫调节组合物、方法和系统
KR0159046B1 (ko) 포유류의 자기면역 포도막망막염의 치료 또는 예방방법
Koga et al. IL10-and IL35-secreting MutuDC lines act in cooperation to inhibit memory T cell activation through LAG-3 expression
JP2012513448A (ja) 自己免疫疾患および炎症性疾患の処置ための化合物および方法
EP2989121A1 (en) Methods of preparation and composition of peptide constructs useful for treatment of rheumatoid arthritis
ES2778630T3 (es) Composición multipeptídica
Puentes et al. Immune modulation and prevention of autoimmune disease by repeated sequences from parasites linked to self antigens
Donaldson et al. Mucosal administration of the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin promotes the development of Foxp3-expressing regulatory T cells
WO2007143174A2 (en) Combination therapy method and formulation
WO2020123825A1 (en) Compositions and methods for immunosuppression
KR20190008343A (ko) 약제학적 조성물 및 자가면역 질환의 치료에 있어 이의 용도
US20190309044A1 (en) Polypeptides and uses thereof as a drug for treatment of autoimmune disorders
EP3958887B1 (en) Medical uses for inducing or restoring immune tolerance
CN114641304A (zh) 改良的疫苗制剂
US20160158330A1 (en) Methods of preparation and composition of peptide constructs useful for treatment of rheumatoid arthritis
Offner et al. Treatments targeting the T cell receptor (TCR): effects of TCR peptide-specific T cells on activation, migration, and encephalitogenicity of myelin basic protein-specific T cells
Moorman A Single-Chain Gmcsf-Mog Tolerogenic Vaccine Expands Mog-Specific CD25+ FOXP3+ Regulatory T Cells through Low-Efficiency Antigen Recognition Events to Inhibit Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Rynda Low dose tolerance vaccine platform, reovirus protein sigma 1 and treatment of autoimmunity
Itani Infection with neuroantigen-encoding Listeria: induction of CD8 T cell responses and suppression of demyelinating disease
Dong The function of CD27 costimulation in the activation and fate decisions of CD8+ T cells
Strainic Jr The Absence of C3ar and C5ar Signal Transduction Promotes T Regulatory Cell Differentiation and Regulates Immunologic Tolerance