KR20180023948A - 다중-펩티드 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특이적 펩티드 조합에 관계한다. 상기 펩티드 조합은 약학적으로 허용가능한 조성물 안에 존재할 수 있다. 상기 펩티드 조합은 유형 1 당뇨병 (TID)의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 치료 효과를 진단 또는 확인하는 방법에 관계하며, 이 방법은 상기 특이적 펩티드 조합을 이용한다.

Description

다중-펩티드 조성물
발명의 분야
본 발명은 유형 1 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방에 이용될 수 있는 펩티드 조합에 관계한다.
본 발명의 배경
유형 1 당뇨병 (T1D)은 특징적인 장기간의 혈관 및 신경학적 합병증을 수반하는, 포도당 대사의 조절이상이 가장 두드러진 특징을 갖는 대사 기능 장애로 특징화되는 자가면역질환이다. T1D는 가장 흔한 자가면역 질환 중 하나이며, 미국 내 250 명 중 1 명 꼴로 영향을 받으며, 미국에서 매년 약 10,000에서 15,000건의 새로운 사례가 보고 되며, 그 발생률은 증가하고 있다. T1D의 가장 높은 유병율은 북유럽에서 볼 수 있다.
T1D는 절대적 인슐린 결핍을 특징으로 하며, 이로 인하여 환자는 생존을 위해 외인성 인슐린에 의존해야 한다. 고혈당 증상이 있는 T1D의 급성 임상 개시 전에, 인슐린-생산 베타 세포가 점진적으로 파괴되는 무증상의 전임상 기간이 있다.
베타 세포 자가 항원, 대식세포, 수지상 세포, B 림프구 및 T 림프구는 자가면역 당뇨병의 발병 기전에 관여하는 것이 확인되었다. 베타 세포 자가 항원은 베타 세포에서 분비되고, 항원 제시 세포에 의해 T 헬퍼 세포 (CD4 + 세포)로 처리 및 제공된다. 순수한 CD4+ T 세포는 항원 제시 세포에서 방출된 인터루킨 (IL) -12에 의해 활성화될 수 있다. 베타 세포 항원-특이적 CD8+ T 세포는 활성화된 CD4 + T 세포에 의해 생성된 IL-2에 의해 활성화되고, 세포 그리고 세포독성 T 세포로 분화되고, 췌장 섬으로 모이게 된다. 이들 활성화된 TH1 CD4+ T 세포와 CD8+ 세포 독성 T 세포는 베타 세포의 파괴에 관여한다. 또한 IL-2는 B 림프구를 활성화시켜, 섬 세포(islet cell) 자가 항체를 분비하도록 한다.
최근에는 섬 세포 자가 항체들이 지향하는 몇 가지 자가항원이 확인되었다. 여기에는 티로신 포스파타아제-관련된 랑게르한스 항원 2 (IA-2), 인슐린, 프로-인슐린 (PI) 및 프레프로인슐린이 포함된다.
일단 개시되면, 베타 세포는 재-생성되지 않기 때문에, 평생동안 합성 인슐린 주사로 치료받아야 한다. 일단 발병되면, 당뇨병은 환자, 가족, 및 사회에 큰 부담이 된다. 인슐린에 대한 현대 투약형, 제제 및 전달 시스템으로 합당한 범위 내에서 혈당을 유지할 수 있지만, 수년에 걸쳐 질병의 합병증들은 필연적으로 발생한다. 당뇨병의 가장 흔한 중증 합병증은 신부전, 실명 및 신경 기능 상실이다. 당뇨병 환자의 수명은 평균 10 년 단축된다. 이러한 배경에 비추어, T1D를 치료하거나 또는 예방하는 새로운 수단을 고려하는 것이 중요하다. T-세포 IA-2 에피토프들이 확인되었다(Honeyman M, et al. (Honeyman M, et al. Molecular Medicine 1998; 4: 231-239), Lohmann T, et al. (Lohmann T, et al. Exp Clin Endocrinol Diabetes 1999; 107 (3): 166-71), McLaughlin KA, et al. (McLaughlin KA, et al. J Immunol 2014; 193: 4448-56) 및 Weenink SM, et al. (Weenink SM, et al., J Autoimmun 2009; 33:147-54). PI 및/또는 IA-2 펩티드는 또한 US7049292, WO2005/073248, WO00/63702 및 WO2009/004315에 개시되어 있다. 그러나, 본 발명은 PI 및 IA-2 둘 모두로부터의 주요 에피토프의 신규한 조합 및/또는 특정 투여 방식을 이용하는데, 이는 T1D의 특징인 PI/IA-2 자가면역을 제한하기 위한, 항원-특이적 면역 요법의 우수한 성능을 입증한다.
본 발명의 요약
본 발명의 첫 번째 측면에서, 다음을 포함하는 펩티드 조합이 제공된다:
서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 그리고
서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
서열 번호: 1은 IA-2의 단편으로써, 잔기 718-736을 포함한다.
서열 번호: 2는 IA-2의 단편으로써, 잔기 752-775를 포함한다.
서열 번호: 3은 IA-2의 단편으로써, 잔기 855-867을 포함한다.
서열 번호: 4는 PI의 단편으로써, 잔기 C13-C32를 포함한다.
서열 번호: 5는 PI의 단편으로써, 잔기 C19-A3을 포함한다.
서열 번호: 6은 PI의 단편으로써, 잔기 C22-A5을 포함한다.
이들 펩티드 조합은 소수의 펩티드 및 대체 펩티드 조합과 비교하여, 항-PI 및 항-IA-2 자가면역을 제한하는데 더 우수하다는 놀라운 사실을 발명자가 발견한 것이다. 놀랍게도, IA-2 펩티드의 상이한 조합이 PI 자가면역을 제한하는데 있어서 상이한 효과를 제공한다는 것이 또한 입증되었다. 현재 청구된 펩티드 조합은 다른 펩티드 조합과 비교할 때, 우수한 성능을 갖는다. 특히, 본 발명의 펩티드 조합은 치료에 이용될 때, 환자에게 상당한 이점이 될 수 있는 트랜스-항원 연계된 억제를 입증한다. 이로써, 한정된 수의 자가항원으로부터 한정된 수의 펩티드를 사용하여 T1D에서 역할을 하는 여러 가지 다양한 자가면역 반응을 표적화할 수 있다.
본원에서 기술된 바와 같이, 용어 ＂펩티드＂는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합, 즉 펩티드 동배체(isosteres)에 의해 서로 결합된 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드를 지칭한다. 펩티드는 일반적으로 자연 발생적 아미노산을 함유하지만, 해독 후 가공과 같은 자연 공정, 또는 당업계에 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변형들은 기초 도서에서 잘 설명되어 있다. 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하는 펩티드의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 동일한 유형의 변형이 주어진 펩티드의 몇몇 부위에서 동일하거나 또는 상이한 정도로 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 주어진 펩티드는 많은 유형의 변형을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 펩티드 조합은 IA-2 또는 PI의 다른 펩티드를 포함하지 않는다.
바람직하게는, 청구된 펩티드 조합은 본 발명의 정확한 서열을 포함하고, 길이가 더 긴 단편, 또는 전장 IA-2 또는 PI를 포함하지 않는다.
본 발명의 펩티드 조합은 비-펩티드 성분, 예를 들어 하기에 기술되는 바와 같은 부형제를 포함할 수 있으며, 그러나 임의의 추가의 펩티드, 특히 IA-2 또는 PI의 펩티드를 포함하지 않을 수 있음을 의미한다.
바람직하게는, 펩티드 조합을 구성하는 펩티드는 단리된 펩티드다. ＂단리된 (isolated)＂이라는 용어는 원래의 환경으로부터 펩티드를 빼내왔음을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 존재하는 펩티드는 분리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 펩티드 또는 그런 펩티드의 단편이 단리된 것이다. 이러한 펩티드는 벡터의 일부일 수 있고 및/또는 펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 그러한 벡터 또는 조성물은 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 펩티드 조합은 다음으로 구성된다:
서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 그리고
서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
이 바람직한 구체예에서, 상기 펩티드 조합은 특정 명시된 서열을 갖는 명시된 펩티드만을 포함한다.
본 발명의 두 번째 측면은 본 발명의 펩티드 조합과 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는 상기 약학 조성물은 시스테인을 포함한다. 조성물 내의 자유 시스테인의 존재는 펩티드 조합의 펩티드가 사슬간 이황화 결합을 형성하고, 이에 의해 침전되는 임의의 경향을 안정화시킨다. 상기 약학 조성물은 펩티드 조합 2 mg당 1 ~ 5 mg의 L-시스테인, 바람직하게는 펩티드 조합 2 mg당 2 ~ 4 mg의 L-시스테인, 가장 바람직하게는, 펩티드 조합 2 mg당 2.5 mg의 L-시스테인을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 사람 및 동물용 의약에서 인간 또는 동물 용으로 사용될 수 있으며, 전형적으로 하나 또는 그 이상의 적합한 부형제를 포함할 것이다. 치료용으로 허용되는 부형제는 제약 분야에서 잘 알려져 있으며, Remington＇s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)에 설명되어 있다. 약학 부형제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약학 실무와 관련하여 선택될 수 있다. 상기 약학 조성물은 부형제와 함께, 또는 부가적으로 임의의 적합한 결합제, 윤활제, 현탁제, 코팅제 또는 가용화제를 포함할 수 있다.
보존제, 안정화제 및 염료가 약학 조성물에 제공될 수 있다. 보존제의 예는 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시 벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁화제가 또한 사용될 수 있다.
상이한 전달 시스템에 따라 상이한 조성물/제형 요건이 있을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 비경구적으로 전달되도록 제형화될 수 있으며, 여기서 조성물은 예를 들어, 정맥내, 피부내, 근육내, 피하 또는 복강내 경로를 통한 투여를 위해 주사가능한 형태로 제형화된다. 비경구 투여를 위해, 조성물은 다른 물질을 함유할 수 있는 멸균 수용액, 예를 들어, 혈액과 등장인 용액을 제조하는데 충분한 염 또는 모노사카라이드의 형태로 가장 잘 사용될 수 있다. 상기 조성물은 또한 경구 또는 국소 경로에 의해 투여되도록 제형 화될 수 있으며, 비강, 경구 또는 피부외적으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 조성물은 피부내 경로에 의해 전달되도록 제형화된다.
피부속 투여 경로는 예를 들면, 미세바늘-기반 주사 및 주입 시스템 (또는 피부내 공간을 정확하게 표적화하는 다른 수단), 유체 또는 분말을 피부내 공간으로 바늘없는(needleless) 또는 무침(needle-free) 탄도주입, 만토우(Mantoux) 타입의 피부내 주사, 마이크로디바이스를 통한 향상된 이온 삼투 요법, 그리고 피부에 상기 조성물을 침착시키기 위한 패치의 사용을 포함하는, 유체, 고형물 또는 기타 투약형의 피부에 직접 침착을 이용한 임의의 피부-접근 수단을 포함한다.
전형적으로, 의사는 개별 피험자에게 가장 적합한 실제 투약형을 결정할 것이며, 이것은 특정 환자의 질병, 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다. 인간에 대한 적절한 투약형은 예를 들어, 신체 표면적 (BSA) 표준화를 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 약학 조성물은 단일 투여(single dose)에 0.1 μg~ 15 mg의 총 펩티드, 바람직하게는 단일 투여에 1 μg~ 12 mg의 총 펩티드를 포함할 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에서, 등몰비로 존재하는 상기 펩티드를 갖는 총 펩티드가 단일 투여에 240 μg (60kg 성인의 경우 표준화된 투여분량은 1 μg의 BSA)으로 투여된다. 또다른 바람직한 구체예에서, 등몰비로 존재하는 상기 펩티드를 갖는 총 펩티드가 단일 투여에 12 mg으로 투여된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 상기 펩티드 조합을 포함하는 조성물은 한 달에 최소한 한 번씩, 바람직하게는 매 1주 내지 4주에 한 번씩, 4회 투여된다.
한 구체예에서, 본 발명의 상기 펩티드 조합을 포함하는 조성물은 한 달에 최소한 한 번씩, 바람직하게는 매 2주 내지 4주에 한 번씩, 4회 투여된다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 상기 펩티드 조합을 포함하는 조성물은 한 달에 최소한 한 번씩, 바람직하게는 주당 한 번씩, 4주간 투여된다.
상기 약학 조성물은 또한 내성-촉진 어쥬번트 및/또는 내성 촉진 세포를 포함할 수 있다. 내성 촉진 어쥬번트에는 IL-10, 재조합 콜레라 독소 B-소단위 (rCTB), Toll-유사 수용체 2의 리간드, 면역 반응을 조절하는 생물 제제 및 단일클론 항체 (가령, 항-CD3 및 보조 자극 차단제)가 포함되며, 이들은 상기 펩티드 조합과 함께 투여될 수 있다. 내성 촉진 세포에는 비타민 D3 (1알파,25-디히드록시 비타민 D3) 또는 그 유사체로 처리된 미성숙 돌기 세포 및 수상 돌기 세포가 포함된다. 바람직하게는 본 발명의 상기 펩티드 조합의 하나 또는 그 이상의 펩티드는 비타민 D3 또는 그의 유사체로 처리된 수지상 세포의 표면에 접합된다. 바람직하게는 본 발명의 상기 펩티드 조합의 모든 펩티드는 비타민 D3 또는 그의 유사체로 처리된 수지상 세포의 표면에 접합된다.
본 발명의 세번째 측면은 치료에 사용하기 위한 본 발명의 약학적으로 허용되는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 네번째 측면은 유형 1 형 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 약학적으로 허용되는 조성물에 관한 것이다.
T1D가 ＂치료된다"는 것은 T1D의 하나 이상의 임상 증상이 완화된다는 의미다. T1D의 증상들이 완전히 치료되어, 환자에게서 이러한 증상이 더 이상 존재하지 않는다는 의미는 아니지만, 일부 방법에서는 이것이 가능할 수도 있다. ＂치료＂로 인하여 T1D의 증상 중 하나 이상이 치료 전보다 덜 심각하게 된다.
본 발명의 다섯째 측면은 유형 1 형 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 약학적으로 허용되는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 여섯 번째 측면은 유형 1 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방 방법에 관계하는데, 이때 본 발명의 약학적으로 허용되는 조성물은 T1D 환자, 또는 T1D이될 위험이 높은 것으로 확인된 비-당뇨병 환자에게 투여된다.
바람직하게는, 본 발명의 약학적으로 허용가능한 조성물은 베타 세포 덩어리를 가진 환자에게 투여된다.
본 발명의 일곱 번째 측면은 유형 1 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방을 위하여, 본 발명의 상기 펩티드 조합을 포함하는 키트에 관계한다.
본 발명의 여덟 번째 측면은 진단 또는 치료 효과를 결정하는, 다음을 포함하는 방법에 관계한다: (a) T1D에 걸린 또는 의심되는 개체의 CD4 림프구를 제공하고; (b) 항원 제시 세포(APCs)의 표면 상에 상기 개체에 의해 발현된 것과 동일한 대립 형의 클래스 II MHC 분자를 지니는 세포 개체군을 제공하는 단계, APCs의 집단은 본 발명의 상기 펩티드 조합과 접촉되며, 클라스 II MHC 분자는 본 발명의 상기 펩티드 조합의 하나 또는 그 이상의 펩티드에 결합되며; 또는 (c) 상기 개체에서 발현되는 것과 동일한 대립형의 클라스 II MHC 분자를 포함하는 가용성 펩티드-HLA 다량체 시약을 제공하고, 상기 MHC 분자는 본 발명의 상기 펩티드 조합의 하나 또는 그 이상의 펩티드에 결합하며; (d) (b)의 APCs 집단 또는 (c)의 펩티드-HLA 다량체에 (a)의 CD4 림프구를 접촉시키고; 그리고 (e) 상기 CD4 림프구가 클라스 II MHC-결합된 펩티드를 인지하는 지를 확인하고, 이것은 상기 개체가 T1D을 가지는지 또는 가질 경향이 있는지를 나타낸다.
그러한 APC는 B-림프구, 단핵세포, 대식세포, 또는 수지상 세포 또는 전체 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 일 수 있다. APC는 또한 B-림프구, 단핵세포, 대식세포 또는 수지상 세포로부터 유래된 불사화된 세포주일 수 있다. 피험자가 사람인 경우, 인간 T 세포는 클래스 II MHC 분자를 발현할 수 있기 때문에 APC는 또한 T 세포일 수 있다. 상기 방법은 CD4 림프구가 클래스 II MHC-결합 펩티드를 인식하는 경우, 본 발명의 펩티드 조합을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 아홉 번째 측면은 다음과 관계한다:
서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 그리고
서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 펩티드 조합을 유형 1 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방에 이용하는 것에 관계하고, 이때 상기 조합은 한 달에 최소한 한 번씩, 바람직하게는 매 1~4주에 한 번씩, 4회 투여된다.
한 구체예에서, 본 발명의 상기 펩티드 조합을 포함하는 조성물은 한 달에 최소한 한 번씩, 바람직하게는 매 2주 내지 4주에 한 번씩, 4회 투여된다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 상기 펩티드 조합을 포함하는 조성물은 한 달에 최소한 한 번씩, 바람직하게는 주당 한 번씩, 4주간 투여된다.
＂조성물은 투여를 위한 것이다＂는 것은 이 조합이 투여되는 것을 의미한다. 바람직하게는 상기 펩티드 조합은 등몰비로 존재하는 펩티드를 갖는 총 펩티드를 240 μg 또는 12 mg로 투여하기 위한 것이다.
바람직하게는 상기 펩티드 조합은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학적으로 허용가능한 조성물로서 제형화된다. 바람직하게는 상기 조성물은 정맥내, 피부내, 근육내, 피하, 복강내, 비강, 구강 또는 피부외적 경로를 포함하는, 비경구, 경구 또는 국소 경로에 의해 전달되도록 제형화되며, 더욱 바람직하게는, 상기 조성물은 피부내 경로에 의해 전달되도록 제형화된다.
본 발명의 열번째 측면은 유형 1 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방 방법에 관계하며, 이때
서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 그리고
서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 펩티드 조합을 T1D 환자, 또는 T1D이 될 위험이 높은 것으로 확인된 비-당뇨병 환자에게 한 달에 최소한 한 번씩, 바람직하게는 매 1~4주에 한 번씩, 4회 투여한다.
한 구체예에서, 본 발명의 상기 펩티드 조합을 포함하는 조성물은 한 달에 최소한 한 번씩, 바람직하게는 매 2주 내지 4주에 한 번씩, 4회 투여된다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 상기 펩티드 조합을 포함하는 조성물은 한 달에 최소한 한 번씩, 바람직하게는 주당 한 번씩, 4주간 투여된다.
바람직하게는 상기 펩티드 조합은 등몰비로 존재하는 펩티드를 갖는 총 펩티드를 240 μg 또는 12 mg로 투여된다.
바람직하게는 상기 펩티드 조합은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학적으로 허용가능한 조성물로서 제형화된다. 바람직하게는 상기 조성물은 정맥내, 피부내, 근육내, 피하, 복강내, 비강, 구강 또는 피부외적 경로를 포함하는, 비경구, 경구 또는 국소 경로에 의해 전달되도록 제형화되며, 더욱 바람직하게는, 상기 조성물은 피부내 경로에 의해 전달되도록 제형화된다.
당업자라면, 예를 들어, 펩티드 조성물, 그의 용도, 약학적으로 허용 가능한 조성물 또는 치료 방법과 관련이 있는지 여부와 같은 본 발명의 모든 양태는 본 발명의 모든 다른 측면에 동일하게 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 예를 들어, 펩티드 조합은 본 발명의 다른 양태, 예를 들어, 펩티드 조합의 사용보다 더 상세하게 기술될 수 있다. 그러나, 당업자는 본 발명의 특정 양태에 대해 보다 상세한 정보가 주어졌을 때 이를 인지할 수 있을 것이며, 이 정보는 일반적으로 본 발명의 다른 측면에 동등하게 적용 가능하다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 이제 도면을 참조하여, 단지 실시예로서 상세히 기술될 것이다:
도 1에서는 직교(cross-hatching)로 표시된 3개의 모계(parental) 서열과 더 짧은 내포(nested) 서열의 펩티드를 비교한 결과를 보여주는데, 이는 효소-연계된 면역스팟을 통하여 탐지된 판독으로써, 인터페론-γ의 생산을 이용하여 반응한 T1D 환자의 백분율을 나타내기 위함이다.
도 2는 당뇨병-관련된 자가 면역의 전임상 모델을 유도하기 위하여, 다중-펩티드 조성물로 면역화시킨 후, PI- 및 IA-2-특이적 자가면역의 판독으로써 T 세포 증식 결과를 나타낸다.
도 3은 자가면역 HLA-DR4 Tg 마우스를 다중-펩티드 조성물로 처리 후 PI 및 IA-2-특이적 자가면역의 판독으로써 T 세포 증식 결과를 나타낸다.
도 4에서는 3개의 PI 펩티드 조합으로 마우스를 처리하는 것이 단일 PI 펩티드로 처리하는 것보다 효과적임을 보여준다. 간단히 말해, CFA에 유화된 프로인슐린 단백질 100 μg으로 피하 면역접종하고, 즉시 그리고 그 면역접종 후 1일차 복강내 백일해 독소로 처리한 마우스에서 프로인슐린에 대한 내성은 파기되었다. 마우스는 10 μg의 대조-PI 또는 프로인슐린 모노/다중-PI (C13-32 (서열 번호: 4); C19-A3 (서열 번호: 5); C22-A5 (서열 번호:6))으로 4주간 피부내로 제공받았고, 진행중인 자가면역 반응(A)을 부양하기 위하여 IFA에서 유화된 100 μg의 프로인슐린 단백질로 피하 면역접종받았다. 림프절 (LNs)은 그 후 7일차에 수거하였고, LN 세포 현탁액은 프로인슐린 단백질 또는 펩티드 (C13-32; C19-A3; C22-A5)와 함께, 또는 없이 48 시간 동안 시험관에서 배양되었다. CD4+ T 세포의 증식 및 IFN-γ 생산은 50 μg/mL의 프로인슐린 단백질과 10 μg/mL의 펩티드 (C13-32; C19-A3; C22-A5)의 시험관 자극에 반응하여 48시간(C)에 ELISA 그리고 96시간(B)에 CFSE 희석에 의해 분석되었다. 프로인슐린 특이적 IgG1의 혈청 수준은 42일 차 (D)에 측정되었다. CD3+CD4+CD25높음FoxP3+ Tregs의 증식 백분율은 42 일차(E)에 LN 배양물에서 유동 세포측정에서 측정되었다. 데이터는 세 가지 독립 실험을 대표한다. *p　< 0.05, **p　< 0.01, ***p　< 0.001; 통계적 유의성은 일원(one-way) ANOVA 또는 스튜던트 t 테스트(Student ＇s t test)에 의해 결정되었다. B와 C에서 한 집단에 15마리 마우스; D-F에서 한 집단에 5 마리 마우스.
도 5에서는 전체 프로인슐린에 대한 내성의 붕괴를 역전시키는데 있어서 더 높은 투여량, 또는 보다 적은 치료보다 저용량 다중 PI의 빈도 증가가 더욱 효과적이라는 것을 보여준다. CFA에 유화된 프로인슐린 단백질 100 μg으로 피하 면역접종하고, 즉시 그리고 그 면역접종 후 1일차 복강내 백일해 독소로 처리한 마우스에서 프로인슐린에 대한 내성은 파기되었다. 마우스는 3개의 프로인슐린 펩티드 (C13-32; C19-A3; C22-A5) 또는 대조 HA 펩티드로 구성된 10 μg 또는 1μg의 피부내 치료를 4 또는 2주 제공받았고, 진행중인 자가면역 반응(A)을 부양하기 위하여 IFA에서 유화된 100 μg의 프로인슐린 단백질로 피하 면역접종받았다. LNs은 그 후 42일차에 수거하였고, LN 세포는 프로인슐린 단백질 또는 펩티드 (C13-32; C19-A3; C22-A5)와 함께, 또는 없이, 48 시간 동안 시험관에서 배양되었다. 증식 및 사이토킨 생산은 티미딘 혼입과 ELISA에 의해 분석되었으며, DLN 배양물에서 50 μg/mL의 프로인슐린 (B)에 반응한 평균 ± SEM 증식과 50μg/mL의 프로인슐린 (C) 또는 10μg/mL의 프로인슐린 펩티드에 반응하여 IFN-γ 생산을 나타낸다. CD3+CD4+CD25높음FoxP3+ Tregs의 증식 백분율은 42 일차(E)에 LN 배양물에서 유동 세포측정에서 측정되었다. 프로인슐린 특이적 IgG1의 혈청 수준은 42일 차 (F)에 측정되었다. 데이터는 최소한 2 가지 독립 실험을 대표한다. *p　< 0.05, **p　< 0.01, ***p　< 0.001; 통계적 유의성은 일원(one-way) ANOVA 또는 스튜던트 t 테스트에 의해 결정되었다. 한 집단에 6 마리 마우스.
도 6에서는 3개 PI 펩티드로 처리는 항원 특이적 조절을 강화시킨다는 것을 보여준다. 프로인슐린 다중-PI로 처리된 마우스의 Tregs는 대조군-PI 처리된 마우스와 비교하여, 프로인슐린 특이적 억제 활성을 증가시켰다. CFA에 유화된 프로인슐린 단백질 100 μg으로 피하 면역접종하고, 즉시 그리고 그 면역접종 후 1일차 복강내 백일해 독소로 처리한 마우스에서 프로인슐린에 대한 내성은 파기되었다. 마우스는 3개의 프로인슐린 펩티드 (C13-32; C19-A3; C22-A5) 또는 대조 HA 펩티드로 구성된 1 μg의 PI의 피부내 치료를 4주 제공받았고, 진행중인 자가면역 반응(A)을 부양하기 위하여 IFA에서 유화된 100 μg의 프로인슐린 단백질로 피하 면역접종받았다. 42 일째에 LN을 수확하고, CD4+CD25높음 Tregs를 단리하였고, 프로인슐린/CFA로 면역화된 마우스로부터의 CFSE 라벨된된 응답자 T 세포를, 다양한 농도에서 공동-배양하였다. 세포를 αCD3αCD28 다이나-비드 (B) 또는 프로인슐린 단백질 (C)의 존재 하에 공동 배양하고, 반응 세포 CD4+ T 세포의 증식을 유동 세포 계측법에 의한 96 시간 CFSE 희석을 측정하여 산출하였다. HA- 또는 프로인슐린-PIT 처리 마우스 (D)에서 CD4+CD25높음의 농도의 감소가 있을 때, 50μg/mL의 프로인슐린에 대한 반응으로 CFSE 표지된 응답자 세포의 평균 ± SEM 증식. 통계적 유의성은 일원 NOVA 또는 스튜던트 t 테스트에 의해 결정되었다. *p　< 0.05, **p　< 0.01, ***p　< 0.001; 통계적 유의성은 일원 ANOVA 또는 스튜던트 t 테스트에 의해 결정되었다.*p　< 0.05, **p　< 0.01, 한 집단에 15마리 마우스(모집된 림프절).
실시예 1
프로-인슐린-특이적/ IA-2-특이적 자가반응의 유도를 통하여 당뇨병-관련된 자가면역의 마우스 모델 생성
B6.129S2-H2 - Ab1 tm1Gru 　Tg (HLA-DRA/H2-Ea,HLA-DRB1*0401/H2-Eb) 1Kito 마우스 (HLA-DR4-Tg) (1)는 Taconic, USA로부터 들여왔고, 모든 실험에 이용되었다. 모든 동물은 병원균이 없도록 명시되었으며, 본사 규칙에 따라 King ＇s College London Biological Services Unit에서 표준 조건하에 유지되었다.
마우스를 100μg의 재조합 인간 프로인슐린 전체 단백질 (Biomm, Brazil) 및/또는 완전 프로운트 어쥬번트(Complete Freund ＇s Adjuvant)(CFA, Sigma-Aldrich)에 유화된 재조합 인간 인슐린종-관련 항원-2 (IA-2, Proteogenix)를 꼬리 저부를 통하여 피하 투여하였다. 마우스는 면역주사 때, 그리고 하루 뒤, 복강 내강을 통해 전달된 200 ng의 백일해 독소 (PTX, Sigma-Aldrich)로 치료하였다. 펩티드 면역요법을 시험할 때, 펩티드 면역요법 최종 치료 7 일 후에 미완성 프로운트 어쥬번트(IFA, Sigma-Aldrich)에서 유화된 자가 항원(프로-인슐린 및/또는 IA-2) 100 μg를 꼬리 기부를 통하여 동시에 피하로 추가로 부양시켰다. T-세포 증식과 T-세포 염증성 사이토킨 생산을 실증하기 위하여, 프로-인슐린 또는 IA-2에 대한 리콜 반응(recall responses)을 시험함으로써, 프로-인슐린 및 IA-2 특이적 자가면역의 유도에 대한 증거를 얻었다.
도 2의 그래프는 하기 자가 항원으로 인간화된 마우스(HLA-DR4 Tg: 인간 펩티드 제시 분자 HLA-DR4에 대하여 유전자 전이된 마우스)에게 백일해 독소(PTX) 어쥬번트와 함께, 면역주사 후, 이들 자가항원 프로인슐린 (PI) 및 IA-2 (차례로, 패널 A 및 B)와 T 세포 증식(차례로 패널 C 및 D)에 대한 프로-염증성 사이토킨 생산을 나타낸다. 이들 자가 항원에 대한 T 세포의 증식 및 프로-염증성 사이토킨 생성은 인간 1 형 당뇨병의 특징이라고 잘 알려져 있다. 따라서, 이 데이터는 나타낸 바와 같이 조작된 HLA-DR4 Tg 마우스가 인간 질환의 자가면역 특징을 반복할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2
마우스에서 프로-인슐린 및 IA-2 특이적 T 세포 증식, 염증성 사이토킨 생산 그리고 조절 T 세포 ( Treg )의 증식 유도를 측정
배액 림프절 (DLN)은 BD Cell Strainer (70 μm)를 사용하여 균질화시켰다. 세포를 RPMI에서 세척하고, 0.5 %의 자가 마우스 혈청을 함유하는 RPMI에서 2.5x106 세포/ml로 재현탁시켰다. 2.5x105 세포를 U 자형 바탁 플레이트의 웰에 추가하였다. 세포는 배지 단독, 양성 대조 자극으로써 α-CD3/α-CD28 다이나비드(dynabeads) (Invitrogen)로, 또는 프로-인슐린 단백질 또는 IA-2로 재-자극되었다. 48 시간 후, 사이토킨 분석을 위하여 상청액을 제거하고, 0.5 mCi/웰의 삼중수소화된 티미딘 [3H]을 첨가하였다. 18 시간 후에, MicroBeta Trilux 기계(Perkin Elmer)를 사용하여 세포를 수확했다. 제조사의 지침에 따라, ready-SET-Go 키트 (ebiosciences)를 사용하여 48 시간 시점에 취한 배양 상청액에서 IFN-γ 및 IL-10 수준을 측정하였다.
표준 프로토콜에 따라, 유동 세포 측정이 수행되었다. 항체(Abs) (항-CD4-PerCP, 항-FoxP3-APC, 항-CD3-PE, 항-CD25-FITC, 항-ki67-Pacific Blue (모두 eBioscience, UK), 항-CD11c-PE Cy7, 항-PDL1-PE, 항-CD86-FITC, 항-HLA-APC (모두 BD bioscience)들이 각 시료에 1:100의 희석비로 추가되었다. 세포 내 착색은 표준 키트를 사용하고, 제조자 지침 (Biolegend)에 따라 수행하였다. 405-nm 바이올렛 레이저, 488-nm 아르곤 레이저 및 635-nm 레드 다이오드 레이저 (BD Bioscience) 및 FlowJo 소프트웨어가 장착된 FACSCanto III 유동 세포측정기를 사용하여 시료를 분석했다. 림프구는 전방 및 측면 산란 매개변수를 사용하여, 크기 및 과립도에 따라 먼저 확인되었다. CD4+ T 세포는 다음으로 CD3 및 CD4 발현에 기초하여 동정되었다. 조절 T 세포는 높은 CD25 발현 및 FoxP3 발현을 기초로 특징 지어졌다. 마지막으로, 증식하는 조절 CD3+CD4+FoxP3+CD25높음 T 세포는 핵 단백질 Ki67의 상향 조절에 기초하여 확인되었다.
실시예 3
프로-인슐린 특이적 조절
이전에 기술된 바와 같이, 프로인슐린에 대한 내성이 마우스에서 파괴되었다. 그 다음 프로인슐린에 대한 진행중인 자가면역 반응이 프로인슐린/IFA의 피하 주사에 의해 부양되기 전에, 마우스에게 1 μg의 대조-PI 또는 프로인슐린 다중-PI(C13-22, C19-A3 및 C22-A5의 등 몰량 포함)를 4주간 매주 피하 처리하였다. 림프절을 제거하고, CD4 T 세포 단리 키트 (Miltenyi Biotec, Germany)를 사용하여 CD4+ T 세포를 네가티브 선별에 의해 단리하였다. 그 다음 세포는 항-CD25-FITC (ebioscience)로 착색시키고, CD4+ CD25높음 억제 T 세포는 BD FACSAria를 이용하여 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 단리되었다. 프로인슐린/CFA 면역화된 마우스로부터 반응 세포들은 이미 설명된 바와 같이 CFSE로 라벨시키고, 그리고 배지 단독, α-CD3α-CD28 다이나비드 또는 프로인슐린 단백질과 함께 96시간 동안 CD4+ CD25높음 T 세포와 함께 공동-배양하였다. 반응 세포의 증식(CFSE 손실에 상응)는 유동 세포계측에 의해 측정된다. 억제 %는 다음에 의해 산출된다:
Figure pct00001
실시예 4
인간 T1D 환자에서 최적 IA-2 서열의 확인
CD4+ T 세포가 펩티드 자극에 반응하여 인터페론 (IFN)-γ의 탐지는 효소-연계된 면역스팟 (ELISPOT) 분석을 이용하여 실행하는데, 이것은 이미 설명된 바와 같이(Arif, S. et al. J Clin Invest 2004; 113: 451-463 및 Herold, K. C. et al. Diabetes 2009; 58: 2588-2595), 블라인드 테스트에서 유형 1 당뇨병을 유의적으로 식별하는 능력을 갖는다. 데이터는 희석제만 존재할 때 (자극 지수; SI), 평균 스팟 수와 삼중 반복당 평균 스팟 수로 나타내었다. 기존 설명한 것처럼(Arif, S. et al. J Clin Invest 2004; 113: 451-463), 수신자-운전자 특성 플롯(receiver-operator characteristic plots)을 사용하여 결정된 컷오프를 사용하여 SI가 ≥3 일 때, 응답이 긍정적인 것으로 간주된다.
도 1에서는 용출로 확인된 일련의 특정 펩티드 안에 있는 에피토프에 대하여 반응하는 유형 1 당뇨병 환자의 비율(%)을 나타낸다(Peakman M, et al. J Clin Invest 1999; 104:1449-57 참고). 결과는 3 개의 모계 서열 (직교)에 대해 나타내며, 이들은 보다 짧은 내재된 서열 펩티드와 비교된다. 응답은 효소-연계 면역스팟 분석을 사용하여 검출된, 각 펩티드로 배양된 말초 혈액 단핵구 세포에 의한 IFN-γ 생성을 나타낸다.
도 1은 709 시리즈 (718-36) 및 853 시리즈 (855-67) 안에 선호되는 서열을 설명한다. 752 시리즈의 내재 펩티드들에서 두드러지게 더 우수한 것은 없다.
실시예 5
펩티드 조합
면역 조절을 유도하는데 있어서 최적인 것을 평가하기 위하여 몇 가지 프로인슐린 (PI) 및 IA-2 펩티드 조합이 선택되었다. 하기 표 1 참고.
Figure pct00002
서열 번호: 7은 IA-2의 단편으로써, 잔기 718-730을 포함한다.
서열 번호: 8은 IA-2의 단편으로써, 잔기 855-869를 포함한다.
서열 번호: 9는 IA-2의 단편으로써, 잔기 709-732를 포함한다.
서열 번호: 10은 IA-2의 단편으로써, 잔기 856-870을 포함한다.
서열 번호: 11은 IA-2의 단편으로써, 잔기 709-736을 포함한다.
서열 번호: 12는 IA-2의 단편으로써, 잔기 853-872를 포함한다.
실시예 6
특이적 6개 펩티드 조합은 몇 가지 다른 시도된 조합보다 프로-인슐린 및 IA-2 자가면역을 제한함에 있어서 더 효과적이다.
상기 설명된 바와 같이, PI 및 IA-2에 대한 염증 반응을 유도하기 위해, HLA-DR4 유전자전이된(인간화) 마우스에게 강한 어쥬번트 및 PI/IA-2로 면역접종하여, ＂자가면역＂이 되도록 한다. 염증 반응에는 T 세포 증식과 염증성 사이토킨 생산이 포함되며, 이는 사람에서 자가면역 (유형 1) 당뇨병의 주요 특징이 된다. 표 1에 제시된 바와 같이, 마우스를 펩티드 칵테일 또는 대조를 갖는 5 개의 치료 그룹에 할당하였다.
PI 및 IA-2에 대한 자가면역 반응이 상기 실시예 1에서 설명된 바와 같이, B6.129S2-H2-Ab1 tm1Gru 　Tg (HLA-DRA/H2-Ea,HLA-DRB1*0401/H2-Eb) 1Kito 마우스 (HLA-DR4-Tg)에서 유도되었다. 유도된 자가면역 반응에 있어서, 펩티드 면역 요법으로 투여된 펩티드의 상이한 조합의 효과를 조사하기 위해, 표 1에 나타낸 상기 펩티드 조합들(등몰비의 상기 펩티드들이 있는, 주사당 10 μg의 총 펩티드) 또는 대조(주사용 물)는 100 μl의 멸균 PBS로, 4주간 매주 일회, 복부를 통하여 피하 주사에 의해 전달되었다. PI 및 IA-2에 대한 자가면역 반응은 7일 후 실시예 2에서 설명된 바와 같이, PI 및 IA-2에 대한 림프절의 증식 및 사이토킨 생산을 검사하여 테스트되었다.
대조로 치료받은 마우스는 강력한 T 세포 증식 및 염증성 사이토킨 반응을 나타낼 것이다. 치료가 효과적인 경우, 이러한 반응이 현저하게 줄어들 것이다.
결과는 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 나타낸다. 가우시안(Gaussian) 분포는 D＇Agostino & Pearson 옴니버스 정규성 검정에 의해 확인된 후, 일원 ANOVA 또는 스튜던트 t 테스트에 의해 결정되었다. p <0.05의 값이 유의적인 것으로 간주되었다.
도 3은 면역화에 의해 PI 및 IA-2에 대항하여 부여된 자가면역화된 HLA-DR4 Tg 마우스로부터 얻은 림프절 세포의 시험관 내 PI (패널 A) 및 IA-2 (패널 B)에 대한 증식 반응을 나타낸다. 그 후, 마우스를 대조 또는 표 1에 명시된 펩티드 조합 중 하나로 처리하였다. 도 3의 데이터는 그룹당 n=8의 평균으로 나타낸다.
도 3a는 그룹 1 조합이 대조와 비교하여, PI 자가면역을 통계적으로 유의하게 감소시키는 유일한 칵테일임을 보여준다. 그룹 1의 조합은 자가 면역을 감소시키는 가장 가까운 대체 형태보다 훨씬 우수하다. 그룹 3과 그룹 4는 자가면역을 유의적으로 감소시키지 못했다.
도 3b는 그룹 1 조합이 대조와 비교하여, IA-2 자가면역을 통계적으로 유의하게 감소시키는 유일한 칵테일임을 보여준다. 그룹 1의 조합은 자가 면역을 감소시키는 가장 가까운 대체 형태보다 훨씬 우수하다. 그룹 3과 그룹 4는 자가면역을 유의적으로 감소시키지 못했다.
그룹 1의 펩티드에 의한 증식의 현저한 감소 (즉, PI 및 IA-2에 대한 자가면역의 조절)는 관용원(tolerogens)으로서 가장 우수한 성능을 나타낸다. 그룹 1-4 펩티드는 IA-2 조성물에 의해서만 상이하다는 것이 주목할 만하다. PI 펩티드는 모든 그룹에서 동일하지만, 그룹 1 펩티드 조합은 또한 PI- 특이성 자가면역을 제한하는데 또한 우수하다. 이것은 트랜스-항원에 의해 억제된 현상을 암시한다.
상기 결과는 현재 청구된 신규한 펩티드 조합이 대안적인 펩티드 조합과 비교하여, 항-PI 및 항-IA-2 자가면역을 제한하는데 우수하다는 것을 입증한다. 놀랍게도, IA-2 펩티드의 상이한 조합이 PI 자가면역을 제한하는데 있어서 상이한 효과를 제공한다는 것이 입증되었다. 이것은 환자에게 상당한 치료 효과를 줄 수 있는 트랜스-항원 결합 억제의 실증이다. 이로써, 한정된 수의 자가항원으로부터 한정된 수의 펩티드를 사용하여 T1D에서 역할을 하는 다중의 상이한 자가-항원을 표적화할 수 있다.
실시예 7
특이적 PI 삼중-펩티드 조합은 각 PI 펩티드 단독보다 프로-인슐린 자가면역을 제한함에 있어서 더 효과적이다.
PI에 대한 자가면역 반응이 상기 실시예 1에서 설명된 바와 같이, B6.129S2-H2 -Ab1 tm1Gru 　Tg (HLA-DRA/H2-Ea,HLA-DRB1*0401/H2-Eb) 1Kito 마우스 (HLA-DR4-Tg)에서 유도되었다.
이 PI 자가면역 모델을 이용하여 프로인슐린에 대한 확립된 자가면역 반응을 조절함에 있어서, 모노- 및 다중-프로인슐린 펩티드의 능력을 평가하였다. HLA-DR4-Tg 마우스를 모노-PI 또는 다중-PI (3 개의 모든 프로-인슐린 펩티드의 등몰량 칵테일)로 4 회 매주 피하 주사하여, 각각 HLA-DR4 제한된 프로인슐린 펩티드의 내성 유발 가능성을 조사하였다. 진행중인 자가면역 반응을 부양시키기 위하여, 온전한 프로인슐린-IFA 전체로 2 차 공격 후, 시험관에서 리콜 반응을 분석했다 (그림 4a). 다중-PI는 프로인슐린, 및 프로인슐린 펩티드에 반응하여 림프절을 배출하는(DLN) 항원 특이적 증식성 능력을 유의적으로 하향-조절하였지만, 오브알부민(OVA)에 대해서는 그러지 못하였다 (도 4b). 또한, 다중-PI 는 염증성 중개물질 IFN-γ, (도 4c), IL-17 및 IL-13의 합성을 유의적으로 감소시켰다 (데이터 제시하지 않음). 흥미롭게도, IL-10의 항원 특이적 유도는 관찰되지 않았다 (도 4d). 다중-PI는 프로인슐린 특이적 IgG의 혈청 수준이 감소됨에 따라 생체내 프로인슐린 단백질에 대한 반응을 하향 조절 하는데도 효과적이었다 (도 4e). 대조적으로, 개별 C13-32, C19-A3 또는 C22-A5 펩티드의 모노-PI는 더 낮은 수준의 치료 효능을 보였다(도 4e-f).
이러한 효과의 기전과 관련하여, 유동 세포 계측법에 의한 DLN의 분석에서 다중 PI 처리후 림프절에서 증식하는 Treg의 비율이 대조-PI 처리 마우스와 비교하여, 유의적으로 증가한다는 것을 입증했다 (도 2f). 다시 한번, 3개의 프로인슐린 펩티드의 조합은 Treg 증식 유도에 있어서 모노-PI보다 더 효과적이며, 이것은 다중 PI 펩티드는 확립된 자가면역 반응 조절에 있어서, 단일 PI 펩티드보다 더 효과적임을 암시한다.
실시예 8
펩티드 투여량 및 투여의 최적화
마우스는 1 또는 10 μg의 다중-PI로 2 회 또는 4 회 처리하였다(도 5a). 다중-PI의 감소된 빈도 및/또는 투여분량의 효과를 얻기 위하여, 프로인슐린 단백질 및 프로인슐린 펩티드에 대한 DLN 세포 현탁액의 증식 및 사이토킨 생성을 측정함으로써, 시험관에서 리콜 반응을 분석하였다(도 5b-d). 다중 PI 처리 수를 4회에서 2회로 줄이면, 치료 효능이 크게 감소하였다. 대조적으로, 다중-PI의 4회 처리는 프로인슐린에 대한 반응의 하향 조절에 효과적이었으며, 1 μg의 감소된 투여분량은 10 μg의 다중-PI와 마찬가지로 효과적인 것으로 나타났다 (도 5b-d). 2차 면역접종 후 7일차에 유동 세포분석에 의한 DLN 조성물 분석에서 대조-PI를 제공받았던 마우스와 비교하였을 때, 다중-PI를 제공받았던 마우스에서 조절 T 세포 증식 수준이 증가되었으며, 처리 그룹단에 유의적인 차이가 관찰되지는 않았다(도 5e). 프로인슐린 특이적 혈청 IgG 수준은 다중-PI에 의해 하향 조절되었고, 10 μg의 다중-PI로 4회 처리를 받은 마우스에서 유의적으로 감소되었다 (도 5f).
실시예 9
3가지 PI 펩티드로 처리하면 항원 특이적 조절이 강화된다.
활성 치료를 받은 마우스와 비교하여 대조-PI로 처리된 마우스의 Treg 격실에서 프로인슐린 특이적 억제제 활성을 측정함으로써, Treg 기능에 있어서 다중-PI의 효과가 평가되었다. CD4+CD25높음 조절 T 세포는 대조-PI 또는 프로인슐린 다중-PI으로 처리된 마우스로부터 단리되었고, 다양한 농도에서 공동-배양되었고, 프로인슐린/CFA로 면역주사를 맞은 CFSE 라벨된 응답자 T 세포와 함께, 다양한 농도에서 공동-배양되었다 (도 6a). 세포는 다클론 반응을 억제하는 대조-PIT 및 다중-PIT Tregs의 능력을 측정하기 위하여 항-CD3/항-CD28 면역자성 비드의 존재하에 공동-배양되었다. 이 두 처리 조건하에 생성된 Tregs는 등가의 억제 활성을 나타내었다(도 6b). 그러나, 프로인슐린 단백질로 자극된 공동-배양물에서 처리-관련된 억제 능력이 분명하게 있었다 (도 6c). 다중-PI 처리된 마우스의 Tregs는 대조-PI 처리된 마우스의 Tregs보다 상당히 더 큰 수준으로 프로인슐린-특이적 반응을 억제하였다 (도 6d).
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전체가 본원에 참고자료로 편입되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> King's College London <120> Multi-peptide Composition <130> P530969GB <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Tyr Gln Ala Glu Pro Asn Thr Cys Ala Thr Ala Gln Gly Glu Gly 1 5 10 15 Asn Ile Lys <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Leu Lys Val Glu Ser Ser Pro Ser Arg Ser Asp Tyr Ile Asn Ala 1 5 10 15 Ser Pro Ile Ile Glu His Asp Pro 20 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Tyr Leu Lys Asn Val Gln Thr Gln Glu Thr Arg Thr Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly 1 5 10 15 Ser Leu Gln Lys 20 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly 1 5 10 15 Ile Val <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu 1 5 10 15 Gln <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Tyr Gln Ala Glu Pro Asn Thr Cys Ala Thr Ala Gln 1 5 10 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Tyr Leu Lys Asn Val Gln Thr Gln Glu Thr Arg Thr Leu Thr Gln 1 5 10 15 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Leu Ala Lys Glu Trp Gln Ala Leu Cys Ala Tyr Gln Ala Glu Pro Asn 1 5 10 15 Thr Cys Ala Thr Ala Gln Gly Glu 20 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Lys Asn Val Gln Thr Gln Glu Thr Arg Thr Leu Thr Gln Phe 1 5 10 15 <210> 11 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu Ala Lys Glu Trp Gln Ala Leu Cys Ala Tyr Gln Ala Glu Pro Asn 1 5 10 15 Thr Cys Ala Thr Ala Gln Gly Glu Gly Asn Ile Lys 20 25 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Phe Tyr Leu Lys Asn Val Gln Thr Gln Glu Thr Arg Thr Leu Thr 1 5 10 15 Gln Phe His Phe 20

Claims (32)

  1. 다음을 포함하는, 펩티드 조합:
    서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
    서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
    서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
    서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
    서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 그리고
    서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 다음으로 구성된 펩티드 조합:
    서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
    서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
    서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
    서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
    서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 그리고
    서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
  3. 청구항 1 또는 2에 따른 펩티드 조합과 그 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 시스테인을 더 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물.
  5. 청구항 3 또는 4에 있어서, 치료법에 사용을 위한 약학적으로 허용가능한 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 유형 1 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방에 사용을 위한, 약학적으로 허용가능한 조성물.
  7. 청구항 5에 있어서, 유형 1 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방용 약물의 제조에 사용을 위한, 약학적으로 허용가능한 조성물.
  8. 청구항 3-7중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 조성물은 정맥내, 피부내, 근육내, 피하, 복강내, 비강, 구강 또는 피부외적 경로를 포함하는, 비경구, 경구 또는 국소 경로에 의해 전달되도록 제형화되는, 약학적으로 허용가능한 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 이때 상기 조성물은 피부내 경로에 의해 전달되도록 제형화되는, 약학적으로 허용가능한 조성물.
  10. 유형 1 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방 방법에 있어서, 청구항 3 또는 4에 따른 조성물은 T1D 환자, 또는 T1D이 될 위험이 높은 것으로 확인된 비-당뇨병 환자에게 투여되는, 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 본 발명의 약학적으로 허용가능한 조성물은 베타 세포 덩어리를 가진 환자에게 투여되는, 방법.
  12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 이때 상기 조성물은 정맥내, 피부내, 근육내, 피하, 복강내, 비강, 구강 또는 피부외적 경로를 포함하는, 비경구, 경구 또는 국소 경로에 의해 전달되도록 제형화되는, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 이때 상기 약학적으로 허용가능한 조성물은 경피 경로에 의해 투여되는, 방법.
  14. 청구항 1 또는 2에 따른 펩티드 조합을 포함하는, 유형 1 당뇨병 (T1D) 치료 또는 예방용 키트.
  15. 치료 효과를 진단 또는 확인하는, 다음을 포함하는 방법:
    (a) T1D를 가진 또는 가질 경향이 있는 것으로 의심되는 개체의 CD4 림프구를 제공하고;
    (b) 항원 제시 세포(APCs)의 표면 상에 상기 개체에 의해 표현 된 것과 동일한 대립 형의 클래스 II MHC 분자를 지니는 세포 개체군을 제공하는 단계, APCs의 집단은 청구항 1에 따른 펩티드 조합과 접촉되며, 클라스 II MHC 분자는 청구항 1에 따른 펩티드 조합의 하나 또는 그 이상의 펩티드에 결합되며; 또는
    (c) 상기 개체에 의해 발현되는 것과 동일한 대립형의 클라스 II MHC 분자를 포함하는 가용성 펩티드-HLA 다량체를 제공하고, 이때 MHC 분자는 본 발명의 상기 펩티드 조합의 하나 또는 그 이상의 펩티드에 결합되며;
    (d) (b)의 APCs 집단 또는 (c)의 펩티드-HLA 다량체에 (a)의 CD4 림프구를 접촉시키고; 그리고
    (e) 상기 CD4 림프구가 클라스 II MHC-결합된 펩티드를 인지하는 지를 확인하고, 이는 상기 개체가 T1D를 가지거나, 이에 걸릴 경향이 있음을 나타낸다.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 CD4 림프구가 클라스 II MHC-결합된 펩티드를 인지하는 경우, 상기 개체에게 청구항 1 또는 2에 따른 펩티드 조합을 투여하는 것을 더 포함하는, 방법.
  17. 유형 1 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방에 이용되는 펩티드 조합:
    이때 상기 펩티드 조합은
    서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
    서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 그리고
    서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하고,
    이때 상기 조합은 한 달에 최소한 한 번씩, 바람직하게는 매 1~4주에 한 번씩, 4회 투여된다.
  18. 청구항 17에 있어서, 이때 상기 조합은 한 달에 최소한 한 번씩, 바람직하게는 매 2~4주에 한 번씩, 4회 투여되는, 펩티드 조합.
  19. 청구항 17에 있어서, 이때 상기 조합은 최소 한 달에 한 번씩, 바람직하게는 4주 동안 주당 한 번씩 투여되는, 펩티드 조합.
  20. 청구항 17-19중 임의의 한 항에 있어서, 상기 조합은 240 μg의 총 펩티드 투여분량으로 투여되는, 펩티드 조합.
  21. 청구항 17-19중 임의의 한 항에 있어서, 상기 조합은 12mg의 총 펩티드 투여분량으로 투여되는, 펩티드 조합.
  22. 청구항 17-21중 임의의 한 항에 있어서, 상기 펩티드 조합은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학적으로 허용가능한 조성물로서 제형화되는, 펩티드 조합.
  23. 청구항 22에 있어서, 이때 상기 조성물은 정맥내, 피부내, 근육내, 피하, 복강내, 비강, 구강 또는 피부외적 경로를 포함하는, 비경구, 경구 또는 국소 경로에 의해 전달되도록 제형화되는, 펩디트 조합.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 조성물은 피부내 경로에 의해 전달되도록 제형화되는, 펩티드 조합.
  25. 유형 1 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방을 위한 방법에서, 이 방법은
    서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 펩티드;
    서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 그리고
    서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 펩티드 조합을 T1D 환자, 또는 T1D이 될 고위험에 처한 것으로 확인된 비-당뇨병 환자에게 한 달에 최소한 한 번씩, 바람직하게는 매 1~4주에 한 번씩, 4회 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 이때 상기 펩티드 조합은 한 달에 최소 한 번씩, 바람직하게는 매 2-4주에 한 번씩, 4회 투여되는 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 상기 펩티드 조합은 한 달에 최소 한 번씩, 바람직하게는 4주 동안 주당 한 번씩 투여되는, 방법.
  28. 청구항 25-27중 임의의 한 항에 있어서, 상기 조합은 240 μg의 총 펩티드 투여분량으로 투여되는, 방법.
  29. 청구항 25-27중 임의의 한 항에 있어서, 상기 조합은 12 mg의 총 펩티드 투여분량으로 투여되는, 방법.
  30. 청구항 25-29중 임의의 한 항에 있어서, 상기 펩티드 조합은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학적으로 허용가능한 조성물로서 제형화되는, 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 이때 상기 조성물은 정맥내, 피부내, 근육내, 피하, 복강내, 비강, 구강 또는 피부외적 경로를 포함하는, 비경구, 경구 또는 국소 경로에 의해 전달되도록 제형화되는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 조성물은 피부내 경로에 의해 전달되도록 제형화되는, 방법.
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