CN115697391A - 改良的疫苗制剂 - Google Patents

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Abstract

一种方法,基于通过添加氧化还原基序修饰的MHC II类表位、相应的修饰表位、药物用途、试剂盒和用于患者的基因编辑系统,用于诱发对蛋白质的给定MHC II类表位具有免疫抑制功能的CD4+T细胞,和/或用于诱发对特定目标组织含有稳态恢复特性的CD4+T细胞。

Description

改良的疫苗制剂
技术领域
本发明涉及基于修饰的表位的新疫苗组合物,用于对不良免疫反应进行特异性治疗以及增强组织修复。
背景技术
自身免疫性疾病的特点是产生抗体和激活针对自身抗原的淋巴细胞,导致靶器官功能逐渐丧失。
尽管有明确的证据表明,自身抗体和自身反应性免疫细胞在自身免疫性疾病的触发和维持中具有致病作用,并且基于非特异性免疫抑制或施用靶向细胞因子的抗体疗法的疗效较慢,因此此种疾病尚无法治愈。鉴于自身免疫疾病的发病率不断上升,这一医疗市场容量巨大,有待开发。事实上,亟需开发能够抑制自身免疫反应且不影响整体免疫系统的策略。
目前,选择性抑制自身免疫反应的疗法有限。
然而,这些方法在实践中是非常复杂的,有时只有短暂疗效,并且有时缺乏对其重要作用的证明。
专利申请WO2008/017517A1(免疫原性肽及其在免疫疾病中的用途)描述了一些肽及方法,其中含有氧化还原(硫还原酶)基序C-X-X-C(其中,C代表半胱氨酸,并且X代表任意氨基酸)的II类MHC表位用于诱发具有细胞溶解特性的表位特异性CD4+T细胞(细胞溶解CD4+T细胞)。据说通过细胞溶解清除激活的APC和旁观者T细胞可有效治疗免疫疾病,尤其是自身免疫性疾病和过敏性疾病。这些肽含有硫还原酶基序,该基序经共价酰胺键(肽键)通过/或不通过氨基酸接头连接在表位序列的任一侧。由于MHC II类分子的末端结构敞开,如果长度受限于插入II类元件的裂缝中的序列,则确实可以使用比允许的长度更长的肽。然而,该专利申请没有披露或甚至暗示对具有抑制功能(Foxp3-)的CD4+T细胞的运转在体内所起的作用,这对治疗炎症或改善组织修复是特别有利的。
T淋巴细胞是引发自身免疫反应或组织特异性炎症的关键细胞。根据激活抗原特异性T细胞的限制元件规定,将抗原特异性T细胞分为三个独立的谱系。在MHC II类复合物呈递的上下文中诱发CD4+T细胞,经MHC I类呈递后激活CD8+T细胞,并且自然杀伤T(NKT)细胞经MHC-样CD1分子呈递后激活。
当抗原呈递细胞(APC)暴露于抗原或其表位时,处理抗原后将其暴露于其表面进行特异性T细胞激活,此过程通常分为3个步骤:(1)T细胞通过其抗原特异性受体(TCR)与APC处理后并由MHC分子呈递的抗原表位接触(信号1);(2)APC表面表达的共刺激信号与T细胞表面的各自配体或受体发生相互作用(信号2);以及(3)APC产生可溶性因子,包括细胞因子和趋化因子(信号3)。
对于自身免疫性疾病或组织相关慢性炎症,旨在抑制不良反应的疫苗接种策略需考虑这些信号。简而言之,在不添加佐剂的情况下,主要获得内在耐受性,通过调节产生激活细胞因子的环境可获得外部耐受性。
然而,这些方法不适用于或效力不足以治疗复杂疾病。
另一方面,免疫系统中属于T细胞谱系的一些细胞对免疫反应有很强的抑制特性,但也带有一些额外的特性,包括抗炎性、组织修复和组织再生、促血管生成和代谢调节。
已经描述了两种类型的此类细胞:
调节性T细胞属于适应性免疫系统,携带抗原特异性受体,在胸腺和/或周边地区集中选择。众所周知,这种细胞对预防自身免疫反应至关重要。许多调节性T细胞亚群已被描述为具有不同的表型和功能特性,并且具有根据特定组织环境改变功能和表型的能力。然而,尽管进行了深入的研究,但仍然很难诱发具有稳定特性的抗原特异性调节性T细胞来进行治疗干预。
先天淋巴样细胞(ILC)被认为是组织免疫哨兵,其特性主要取决于它们所属的亚群和相关组织。这种细胞不携带抗原特异性受体,因此不能以抗原特异性方式进行刺激。
2019年6月27日提交的专利申请EP19182807.8描述了一种强大且易于实施的新方法,该方法基于将还原剂与表位一起添加,对治疗自身免疫性疾病很有帮助;这些化合物可以配制成疫苗,还可以使注射位点更加灵活。
在另一种情况下,或除此之外,本发明人现在已经鉴定出直接诱发对免疫反应(Foxp3(-))(包括炎症,甚至引发组织修复)具有强烈抑制活性的CD4+T细胞的可能性。
发明内容
在第一方面,本发明涉及一种体外或离体方法,用于诱发对蛋白质的给定MHC II类表位具有免疫抑制功能的CD4+T细胞,所述体外或离体方法包括以下步骤:
-鉴定该蛋白质中存在的MHC II类表位;
-产生修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与所述MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的CXXC基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,并且X代表任何氨基酸;以及
-使体外CD4+T细胞与所述修饰的MHC II类表位接触。
在另一个方面,本申请涉及一种方法,有利的是一种体外或离体方法,用于诱发对特定靶组织中存在的给定MHC II类表位具有免疫抑制功能的CD4+T细胞,和/或用于诱发对特定靶组织含有稳态恢复特性的CD4+T细胞,该方法包括以下步骤:从该组织中鉴定与不良免疫疾病相关的(受不良免疫疾病影响的)MHC II类表位;产生修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与该MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与该MHCII类表位分开的至少一个额外的氧化还原基序,以及使(体外)CD4+T细胞与该修饰的MHCII类表位接触。
在本方法中,优选地,该CD4+T细胞与该修饰的MHC II类表位一起与药学上可接受的抗氧化剂接触。
优选地,该方法进一步包括步骤:表征和/或分选和/或分离CD4+T细胞(Foxp3(-))用于对选自由TIGIT、DLL4和CTLA2组成的组的表面标记的表达和/或用于对选自由白介素(IL)-10、IL-13、IL-4、转化生长因子(TGF)β-2、双调蛋白、精氨酸酶和镍纹蛋白组成的组的可溶性因子的分泌。
本发明的一个相关方面是通过该方法获得的CD4+T细胞,以及它们作为药物的用途,优选用于治疗不良免疫反应和/或组织修复方面。
本发明的一个相关方面是一种修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的氧化还原基序,该修饰的MHC II类表位用于在患者的组织中局部产生具有抑制功能的细胞因子,该患者对带有所述MHC II类表位或带有基本相似的MHC II类表位的肽已经产生了不良免疫反应,优选地,其中这种细胞因子(主要)在受这种不良免疫反应影响的组织(或其附近区域)中产生,更优选地,其中这些细胞因子选自由白介素(IL)-10、IL-13、IL-4、转化生长因子(TGF)β-2组成的组,并且可能还选自双调蛋白、精氨酸酶和镍纹蛋白,更优选的是,其中在施用包含额外的氧化还原基序的MHC II类表位后,这些细胞因子(至少是IL-10和/或IL-13和/或IL-4)在受影响组织中的数量至少增加一倍(乘以因子3、5、10、30、50或甚至100),和/或更优选的是,其中,在(不受这种不良免疫反应影响的)患者的其他组织的这些细胞因子的数量、也可能是在从患者身体的另一个部位(而不是受影响的组织)或靠近受影响的组织获得的血样中的这些细胞因子的数量在施用包含额外的氧化还原基序的MHC II类表位后,没有明显增加(增加不到10倍,增加不到5倍,或甚至增加不到一倍)。
这有利于在患者的特定组织中将炎症性巨噬细胞转化为非炎症性巨噬细胞,优选在脂肪组织中。
因此,本发明的另一个相关方面是一种修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的氧化还原基序,该修饰的MHC II类表位用于患者的组织修复,该患者对带有所述MHC II类表位或带有基本相似的MHC II类表位的肽患有不良免疫疾病(或患有不良免疫反应引起的炎症疾病)。
本发明的另一个相关方面是一种试剂盒,该试剂盒包含(i)修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的氧化还原基序,该修饰的MHC II类表位用于治疗对带有所述MHC II类表位或带有基本相似的MHC II类表位的肽产生不良免疫反应;以及(ii)用于监测(Foxp3(-))CD4+T细胞激活的部件,优选地,其中所述MHC II类表位在受到所述不良免疫反应影响的患者组织和/或器官中表达,并且优选地,其中用于监测(Foxp3(-))CD4+T细胞激活的部件包含用于监测所述受影响组织内的(Foxp3(-))CD4+T细胞激活的(体外)部件。
在该试剂盒内,用于监测(Foxp3(-))CD4+T细胞激活的部件优选为用于通过(Foxp3(-))CD4+T细胞测量表面标记的表达的部件、和/或用于通过所述(Foxp3(-))CD4+T细胞监测可溶性因子的分泌的部件,其中表面标记选自由TIGIT、DLL4和CTLA2组成的组,并且可溶性因子选由自白介素(IL)-10、IL-13、IL-4、转化生长因子(TGF)β-2、双调蛋白、精氨酸酶和镍纹蛋白组成的组。
优选地,该试剂盒进一步包含一种抗氧化剂化合物,与该修饰的MHC II类表位一起施用于患者。
可能的是,在本发明中(上述所有方面),不良免疫反应是炎症。
本发明的另一个相关方面是一种修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的氧化还原基序,该修饰的MHC II类表位用于诱发(Foxp3(-)CD4+T细胞表达选自由TIGIT、DLL4和CTLA2组成的组的表面标记,和/或分泌选自由白介素(IL)-10、IL-13、IL-4、转化生长因子(TGF)β-2、双调蛋白、精氨酸酶和镍纹蛋白组成的组的(大量的)可溶性因子,所述CD4+T细胞对所述MHC II类表位具有特异性,所述MHC II类表位在受不良免疫反应影响的患者的组织和/或器官中表达。
在另一个方面,本发明涉及一种包含MHC II类表位的非人核酸酶的肽片段,所述肽片段进一步包含与所述核酸酶的所述片段相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述特定核酸酶的所述片段分开的CXXC基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,并且X代表任何氨基酸,该肽片段用于与包含所述核酸酶的基因编辑系统结合使用,优选用于治疗遗传性疾病。
本发明的另一个相关方面是一种试剂盒,该试剂盒包含带有特定核酸酶或编码所述特定核酸酶的核酸分子的基因编辑系统;以及为MHC II类表位的所述特定核酸酶的肽片段,所述肽片段进一步包含与所述特定核酸酶的所述片段相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述特定核酸酶的所述片段分开的氧化还原基序;或编码所述修饰的肽片段的核酸分子。
在原位(体内)产生病毒靶向的(患者的)细胞突变(产生耐药性的突变、基因表达的修饰)时,该试剂盒有利地用于治疗遗传性疾病和/或预防和/或治疗病毒性疾病,和/或用于治疗癌症(纠正癌细胞的有害突变,诸如纠正p53的突变),同时不会引发患者对施用的基因编辑系统的免疫反应。
在本试剂盒中,优选地,(用于基因编辑的)核酸酶选自由TALEN、Cas、Cpf和CSM组成的组。
在以上所有方面,在上述方法、MHC II类表位、CD4+T细胞、药物组合物或试剂盒中,该氧化还原基序包含或主要由肽序列CXXC,优选选自由CPXC、CXPC、HCXXC、CXXCH、HCPXC、CPCXH、HCXPC和CXPCH组成的组的氧化还原基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,X代表任何氨基酸,P代表脯氨酸,并且H代表组氨酸。
具体实施方式
本发明人已经创立了几种微调免疫反应的方法,特别是通过特异性靶向T细胞谱系CD4、CD8和/或NKT。
本发明人已经意外地发现,在II类表位的侧翼区域中添加一个氧化还原基序(CXXC)能够用于诱发具有直接抑制活性的CD4+T细胞,这是由于独特的细胞因子谱包括IL-10、IL-4和IL-13,但也包括ROR-(NR1F1)。
这代表了一种针对不良免疫反应的具体方法,这在炎症的情况下或用于改善组织修复特别有利。事实上,发明人已经发现,这些CD4+细胞是在受影响的组织附近调动起来的,这意味着效果更强,并且副作用更小。
特别是,施用(优选与佐剂一起施用)时,添加一个与MHC II类表位共价偶联的具有氧化还原特性的基序可靠地诱发稳定的抗原特异性Foxp3(-)CD4+T细胞,其特性的不同关联包括:
通过产生作用于单核细胞的IL-13来减少IL-6、IL-1a和LIF的产生,从而减少炎症;
通过表达抑制IL-1b、TNF、IL-6和MCP-1的转录的ROR-(NR1F1),从而减少炎症。
通过产生精氨酸1,吸引和调节具有调节特性的髓系免疫细胞;
通过产生IL-10、前列腺素E2和TGF-β,从而产生调节性T细胞;
通过提供前列腺素E2(PGE2)作为调节性T细胞底物,从而抑制常规T细胞激活功能;
通过产生双调蛋白(Areg),参与组织修复;
产生具有抗炎、促血管生成、组织修复特性以及增加血栓溶解(MMP9)的金属蛋白酶,诸如MMP9和ADAM,诸如ADAM33;
产生几丁质酶样蛋白,诸如几丁质酶3-样-3,或人类等效基因产物,对巨噬细胞具有抗炎特性(M2转化),并激活修复机制和组织再生;
通过TGF-β-依赖性增加肾上腺素能神经支配,增加脂肪组织的生热作用;
产生骨形态发生蛋白7(BMP7)与增加神经元存活和神经形成;
产生GDF11,对轴突髓鞘再生有积极作用;
通过产生内皮细胞特异性分子1(ESM1),增加血管生成,并对防止移植排斥反应有潜在影响。
此外,这类细胞表达不同数量的参与抑制功能的表面分子,包括TIGIT、DLL4和CTLA2,以及一种对组织驻留很重要的分子,如Hobit。还有就是产生镍纹蛋白,增加神经形成和轴突延伸的前体细胞分化、肌肉细胞修复中的肌细胞分化、和软骨重建中的软骨细胞分化。
优选地,在本发明(该方法、表位、CD4+T细胞、药物组合物或试剂盒)中,MHC II类表位被鉴定和/或从已发表的文献和/或生物信息学研究中选择。由于有数百个,甚至数千个MHC II类表位与不良免疫反应相关,因此不可能也没有必要将它们全部列出。技术人员可以很容易地例如,按照以下步骤鉴定它们并将它们与疾病联系起来:鉴定与不良免疫反应有关的疾病;选择或鉴定与该疾病有关的一个或几个(多个)肽(来自组织和/或器官);在硅胶中和/或体外鉴定其中与不良免疫反应有关的一个或几个假定的MHC II类表位,因此优选地存在于受该不良免疫反应影响的组织和/或器官的蛋白质的MHC II类表位。通过预测该多肽中存在的切割位点,然后预测MHC II类呈现的多肽,并且优选预测T细胞受体(TCR)对呈现的多肽的识别,可以在硅胶中鉴定肽中的MHC II类表位。
优选地,因此,这种MHC II类表位是在受不良免疫反应影响的组织中发现(推断)的。
然后,这种MHC II类表位将通过添加所谓的"氧化还原"基序而被修饰。这种氧化还原基序已经至少在WO 2008/017517中公开。
优选地,在本发明(方法、MHC II类表位、CD4+T细胞、药物组合物或试剂盒)中,该氧化还原基序包含或主要由肽序列CXXC优选选自由CPXC、CXPC、HCXXC、CXXCH、HCPXC、CPCXH、HCXPC和CXPCH组成的组的氧化还原基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,X代表任何氨基酸,P代表脯氨酸,并且H代表组氨酸。
因此,本发明将提到(i)MHC II类表位,指的是被抗原呈递细胞(APC)加载和呈递的蛋白质的一部分(从受不良免疫反应影响的患者组织中推断出来的),以便随后被CD4+(Foxp3(-))T淋巴细胞识别;和(ii)相应的修饰的MHC II类表位,这是(基本上)相同的表位序列,进一步包含至少一个氧化还原基序,要么紧靠边界(在MHC II类表位的N端和/或C端),要么在其附近(例如,有一个多达7个氨基酸的接头)。
在第一方面,本发明涉及一种体外或离体方法,用于诱发对蛋白质的给定MHC II类表位具有免疫抑制功能的CD4+T细胞,所述体外或离体方法包括以下步骤:
-鉴定该蛋白质中存在的MHC II类表位;
-产生修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与所述MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的CXXC基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,并且X代表任何氨基酸;以及
-使体外CD4+T细胞与所述修饰的MHC II类表位接触。
本发明的另一个方面是一种(体外或离体)方法,用于诱发对给定MHC II类表位具有免疫抑制功能(对于特定靶组织)的CD4+T细胞,和/或用于诱发含有组织稳态恢复特性的CD4+T细胞,该方法包括以下步骤:鉴定与哺乳动物不良免疫疾病相关的MHC II类表位,优选地,该MHC II类表位从受不良免疫疾病影响的患者组织(和/或器官)中鉴定;产生修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与所述MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的氧化还原基序;以及使体外CD4+T细胞(从患者身上获得)与所述修饰的MHC II类表位接触。
在这种体外或离体方法中,优选地,CD4+T细胞是Foxp3(-)。
有利地,在这种体外或离体方法中,这些CD4+T细胞与抗氧化剂(遵循2019年6月27日提交的专利申请EP19182807.8的教导)(体外)接触,并与修饰的MHC II类表位接触;这样可以获得更强的效果。在抗氧化剂中,有与细胞生物学相容的分子,优选地也与药物用途相容,并有足够的强度来切割二硫桥。一种方便的抗氧化剂包含-SH活性部分,如半胱氨酸部分,例如(还原)谷胱甘肽。WO2016/162495公开了一种连接了谷胱甘肽-冠状纳米颗粒,该颗粒含有自身抗原肽,治疗自身免疫性疾病。如本专利文件所述,在此类颗粒中整合谷胱甘肽后,谷胱甘肽的游离-SH基团与颗粒反应,经由形成共价键连接,谷胱甘肽不再作为抗氧化剂。
优选地,该体外或离体方法进一步包括表征和/或分选和/或分离CD4+T细胞(Foxp3(-))的步骤,用于对选自由TIGIT、DLL4和CTLA2组成的组的表面标记的表达和/或用于对选自由白介素(IL)-10、IL-13、IL-4、转化生长因子(TGF)β-2、双调蛋白、精氨酸酶和镍纹蛋白组成的组的可溶性因子的分泌;这可以确保生产和分选正确的CD4+T淋巴细胞,鉴于CD4+T淋巴细胞的可塑性,这一点特别重要。这种表征和/或分选和/或分离步骤可以在与修饰的MHC II类表位接触后和/或在此步骤之前进行,如CD4+淋巴细胞的初步分选、对分泌的细胞因子谱的测量(这可以直接从培养基样品中进行)、与MHC II类表位接触、然后对所分泌的细胞因子谱的测量(以确保正确/改进的表达谱)。在这一表征步骤中,通过将细胞与荧光标记的特异性抗体进行孵育,并用FACS(荧光激活细胞分选仪)进行检测,可以有利地确定这种CD4+T细胞的表面标记。有利地,转录因子的表达通过RNASeq或qPCR检测。产生的蛋白质阵列优选地通过质谱法进行评估。表观遗传变异由ATAC-Seq(转座酶可及染色质的测定)来测量。分泌的细胞因子优选通过多重评估,而细胞内的细胞因子优选通过与渗透细胞上的特定标记抗体孵育来检测。
本发明的一个相关方面是通过该体外或离体方法可获得的CD4+T细胞,以及它们作为药物,有利地用于治疗不良免疫反应和/或组织修复方面的用途。事实上,这种工程化的CD4+T细胞现在能够具体和局部地作用于受不良免疫反应影响的组织,使(i)患者的目标组织减少不良免疫反应,如炎症,从而使正常的新陈代谢重新开始;并且(ii)原位产生可溶性因子,从而促进目标组织的再生:因此本发明对于局部反应和组织修复特别有效。
因此,一个相关方面是一种修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与来自特定目标组织的MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与来自特定目标组织的所述MHC II类表位分开的至少一个额外的氧化还原基序,该修饰的MHC II类表位用于在患者中局部产生具有(不良免疫反应的)抑制功能的细胞因子,该患者对带有该MHC II类表位或带有基本相似的MHC II类表位的(来自特定目标组织的)肽已经产生了不良免疫反应。事实上,当患者已经被诊断出有不良免疫反应时,其原因很容易被确定,那就是(来自受影响的组织和/或器官的)肽导致了这种不良免疫反应。然后,根据患者的HLA分型,可以确定(一个或几个)MHC II类表位(在硅胶中,或因为这种表位已经在其他患者身上发现),然后用这种氧化还原基序产生并嫁接。在一个实施例中,修饰的MHC II类表位包含在长度为10至100个氨基酸的肽内,例如长度为10至40个氨基酸,诸如长度为10至25个氨基酸,例如长度为10至20个氨基酸。与向患者注射细胞因子相比,本发明的优势在于对受影响的组织和/或器官的效果的定位和其更长时长:由这种MHC II类氧化还原肽诱发的CD4+T淋巴细胞将被吸引/保持在相应的不良免疫反应的位点,在该位点,它们将产生所需的细胞因子(主要是,如果在那里不是唯一的),直到免疫反应已经被停止。
有利地,本修饰的MHC II类表位允许在患者的特定组织中将炎症性巨噬细胞转化为非炎症性巨噬细胞,优选脂肪组织中。
因此,本发明的另一个方面是一种修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的氧化还原基序,该修饰的MHC II类表位用于患者的组织修复,该患者对带有所述MHC II类表位或带有基本相似的MHC II类表位的肽患有不良免疫疾病(或患有不良免疫反应引起的炎症疾病)。
本发明的另一个相关方面是一种试剂盒,该试剂盒包含修饰的MHC II类表位以及用于监测Foxp3(-)CD4+T细胞的激活的部件,该修饰的MHC II类表位包含与所述MHC II类表位相邻或通过多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的氧化还原基序,该修饰的MHC II类表位用于治疗对包含所述MHC II类表位的(自然发生的)肽(并引起这种不良免疫反应)的不良免疫反应。这将使我们能够在患者的层面上更好地监测免疫系统的反应。
优选地,在该试剂盒内,用于监测(Foxp3(-))CD4+T细胞激活的部件是用于通过这些(Foxp3(-))CD4+T细胞测量表面标记的表达的部件,和/或用于通过这些(Foxp3(-))CD4+T细胞监测可溶性因子的分泌的部件,其中表面标记选自由TIGIT、DLL4和CTLA2组成的组,并且可溶性因子选自由白介素(IL)-10、IL-13、IL-4、转化生长因子(TGF)β-2、双调蛋白、精氨酸酶和镍纹蛋白组成的组。
优选地,该试剂盒进一步包含抗氧化剂化合物(例如谷胱甘肽或类似的药学上可接受的化合物,具有减少二硫桥的能力,遵循2019年6月27日提交的专利申请EP19182807.8的教导),与修饰的MHC II类表位一起施用于患者。
本发明的另一个相关方面是一种修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与这种MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与这种MHC II类表位分开的至少一个额外的氧化还原基序,该修饰的MHC II类表位用于诱发(特异于本MHC II类表位的)Foxp3(-)CD4+T细胞表达选自由TIGIT、DLL4和CTLA2组成的组的表面标记,和/或分泌选自由白介素(IL)-10、IL-13、IL-4、转化生长因子(TGF)β-2、双调蛋白、精氨酸酶和镍纹蛋白组成的组的可溶性因子。
另一个相关方面是一种试剂盒,该试剂盒包含:
具有特定核酸酶的基因编辑系统(诸如CRISPR/Cas(Cas9、Cpf1、Csm等),但也包含TALEN或任何其他基于施用外源核酸酶特异性分割DNA的基因编辑系统以随后在目标基因组位点引入所需修饰)或编码所述特定核酸酶的核酸分子,以及
所述特定核酸酶的片段是MHC II类表位,该MHC II类表位进一步包含与该特定核酸酶的这种片段相邻或通过多达7个氨基酸的接头与该特定核酸酶的这种片段分开的氧化还原基序。
该试剂盒有利地用于治疗一种遗传性疾病。事实上,由于对该核酸酶的免疫反应,给患者施用外源性特定核酸酶(通常是原核生物来源和/或人工构建体)会有问题。本发明允许对所引起的不良免疫反应进行特定的下调,为这种新方法铺平了道路。
因此,在本发明的体外或离体方法的一个实施例中,蛋白质是一种非人核酸酶。
而且,在另一个方面,本发明涉及一种包含MHC II类表位的非人核酸酶的肽片段,所述肽片段进一步包含与所述核酸酶的所述片段相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述特定核酸酶的所述片段分开的CXXC基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,并且X代表任何氨基酸,
该肽片段用于与包含所述核酸酶的基因编辑系统结合使用,优选用于治疗遗传性疾病。
示例
示例1
视神经脊髓炎(NMO)
NMO是一种严重的中枢神经系统(CNS)炎症性疾病,伴有水通道蛋白4(AQP4)的抗体。病变定位在脊髓和前部视觉通路,其中星形胶质细胞AQP4的浓度最高。
病变依赖于外周的抗AQP4抗体的产生,然而这种抗体必须穿过血脑屏障(BBB),而这取决于特异性CD4+T细胞所提供的炎症。在原位,抗体激活了星形胶质细胞表面的补体通路,导致裂解复合物的形成和细胞毒性。
没有重建整个人类疾病的动物模型,但小鼠在没有抗AQP4抗体的情况下,积累AQP4特异性的TH17亚型CD4+T细胞,导致BBB开放和局部炎症,从而形成类似的病理。
C57BL/6(H-2b)品系是可选的动物模型,因为其CD4+T细胞的天然谱系含有可通过AQP4表位免疫激活的细胞,其序列与激活人CD4+T细胞的序列完全重合。此外,人类和小鼠AQP4之间的同源性为93%。然而,由于对AQP4的天然耐受性,仍然难以产生具有致病潜力的T细胞。因此,使用缺乏AQP4(AQP4 KO)表达的C57BL/6小鼠。
包含AQP4的氨基酸残基21-38的多肽(SEQ ID NO:1)
SIMVAFKGVWTQAFWKAV(核心表位下划线)。
在100μg的弗氏完全佐剂中乳化,对AQP4 KO C57BL/6小鼠的脚底板进行免疫,然后每隔10天注射3次100μg的弗氏不完全佐剂。最后一次注射后四周,处死小鼠并制备脾细胞。从大量脾细胞中分离出CD4+T细胞后,通过磁珠孵育分离出对SEQ ID NO:1肽特异的淋巴细胞,该磁珠涂有负载SEQ ID NO:1肽的II类(H2b)分子。
然后对AQP4特异性CD4+T细胞进行表型,并且发现其属于Th17亚型。
然后通过IV注射给野生型C57BL/6小鼠施用这种细胞(每只小鼠106个细胞)。10天后,处死小鼠,并且分离脊髓。在靠近星形胶质细胞附近观察到炎症细胞(包括AQP4特异性CD4+T细胞)的浸润。
在AQP4 KO C57BL/6小鼠中进行类似的实验,用相同的肽免疫,但在其侧翼残基(SEQ ID NO:2)中含有氧化还原基序(黑体),并用明矾代替CFA/IFA
HCPYCSIMVAFKGVWTQAFWKAV
从脾脏获得的CD4+T细胞表征为如TIGIT和CTLA2的标记,并产生PGE2(前列腺素E2)和IL-10。
在一个对照实验中,通过IV注射将106个细胞施用给野生型C57BL/6小鼠。脊髓没有显示炎症病变或T淋巴细胞,表明通过SEQ ID NO:2的肽免疫获得的CD4+T细胞群不会诱发渗透BBB和允许T细胞在CNS种排出所需的炎症反应。
接下来,为了确定通过SEQ ID NO:2的肽免疫获得的CD4+T细胞是否能抑制通过SEQ ID NO:1的肽免疫获得的致病性CD4+T细胞,用负载SEQ ID NO:1的肽的抗原呈递细胞进行混合培养。对于这种体外实验,两种CD4+T细胞群是从表达Thy1.1或Thy1.2表面表型标记的C57BL/6小鼠中获得的,由特异性抗体标识。
由外周血单核细胞转化的树突状细胞被用作抗原呈递细胞。因此,将50x106个细胞与10μg的SEQ ID NO:1的肽在室温下孵育16小时,清洗,然后与1/1混合物进行孵化,该1/1混合物为用SEQ ID NO:1的肽免疫获得的Thy1.1 CD4+T细胞和用SEQ ID NO:2的肽免疫获得的Thy1.2 CD4+T细胞的1/1混合物。然后培养7天后对每个CD4+T细胞群的表型进行评估。
结果表明Thy1.1 CD4+T细胞已经失去了Th17细胞的表型特征,并且没有显示出增殖。
因此得出结论,(侧翼残基中含有氧化还原基序的同源表位刺激的)CD4+T淋巴细胞抑制(没有氧化还原基序的同源表位刺激的)细胞群,但没有显示细胞毒性的证据。
示例2
胰岛素依赖型糖尿病
胰岛素依赖型或1型糖尿病表征为:由于原位炎症和对一些抗原(包括谷氨酸脱羧酶(GAD65))的自身免疫反应的结合,胰岛β细胞逐渐丧失。一些证据表明,GAD65特异性CD4+和CD8+T细胞在胰岛内的积累与糖尿病有关。将导致产生(对GAD65特异性的)抑制性CD4+T细胞的疗法将导致炎症的消散和来自胰岛的免疫细胞(CD4+和CD8+T细胞)的清除,这与它们的精确抗原特异性无关。
非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠是最常用的糖尿病动物模型,因为在炎症和自身免疫起决定性作用的情况下,小鼠会无意识地形成胰岛炎、高血糖症和糖尿病。局部病变,即胰岛炎,在几周后开始积累,因此,治疗干预应被视为抑制性而非预防性的。
用GAD65的II类限制性T细胞表位(319-333:ILEVKQKGFVPFLVS,SEQ ID NO:3)制成的肽或在其侧翼残基中含有氧化还原基序(黑体字)的同一肽免疫6周龄的雌性NOD小鼠
HCYPCILEVKQKGFVPF(SEQ ID NO:4)
使用100μg的SEQ ID NO:4的肽在氢氧化铝中进行免疫,每隔一周进行一次,共进行四次免疫。对照组小鼠根据相同的注射计划接受SEQ ID NO:3的肽。
然后在第15周将小鼠处死,分离胰腺并通过组织学评估以鉴定胰岛炎。
结果表明用含有氧化还原基序的SEQ ID NO:4的肽免疫的小鼠保留了大部分(≥70%)的胰岛,没有炎症或细胞浸润的迹象,而用SEQ ID No:3的肽免疫的小鼠则相反。
这表明通过SEQ ID NO:4的肽免疫产生的CD4+T细胞足以清除积聚在胰岛内的免疫细胞,与它们的抗原特异性无关。
在体外培养中,结果表明与从用SEQ ID NO:4的肽免疫的小鼠脾脏中获得的CD4+T细胞共同培养后,从用SEQ ID NO:3的肽免疫的小鼠脾脏中获得的(并用CFSE标记)的CD4+的数量略有减少(约5%)。然而,从这种共培养中回收的CFSE标记的细胞在呈递其同源表位(SEQ ID NO:3)时已经失去了增殖的能力。这表明,从用含氧化还原表位免疫的小鼠获得的细胞发挥了抑制活性,但对用未修饰表位扩增的细胞几乎没有或没有细胞毒性。
示例3
多发性硬化症
多发性硬化症是一种慢性自身免疫性疾病,显示免疫和炎症细胞积聚到CNS的白区。该病的一个主要因素是脱髓鞘和暴露于轴突破坏,导致进行性敏感和运动退化。因此,清除对髓磷脂的自身免疫反应是未实现的,但却是预期实现的。
髓磷脂是由几种成分组成的,包括主要碱性蛋白质(MBP)。对MBP的自身免疫反应性进行了良好的描述,并且有预测模型可以评估各种形式的免疫疗法的影响。
对C57BL/6雌性小鼠使用100μl的注射液进行处理,该注射液含有200μg的包含MBP的氨基酸残基35-47的肽,即:
TGILDSIGRFFSG(SEQ ID NO:5)
和100μl的弗氏完全佐剂。此外,在第0天和第2天腹腔给药200μg的百日咳毒素,以渗透血-脑屏障。
6天后,观察到与诱发脑脊髓炎有关的体征,包括轻度瘫痪和尾松垂,这些体征在几周内形成。在疾病诱发之日起一个月后,检查脊髓的炎症浸润情况。组织在甲醛中固定,用苏木精-伊红染色,进行细胞计数。使用抗CD3抗体鉴定T细胞。通过用Luxol Fast Blue(LFB)染色来检测脱髓鞘现象。据观察,所有小鼠都出现了包括T淋巴细胞在内的明显浸润和脱髓鞘迹象。
为了证实本发明的细胞对致病性T细胞产生抑制作用,对两组C57BL/6雌性小鼠每周4次皮下注射100μg的肽进行治疗
HCYPCTGILDSIGRFFSG(SEQ ID NO:6)
对应于SEQ ID NO:5的肽,但含有一个氧化还原基序(黑体)。这些注射液是用含有氢氧化铝的制剂作为佐剂制成的。要注意的是,在这种小鼠身上没有观察到疾病的迹象。
在第一组中,小鼠在免疫程序开始后的第35天被处死,准备脾细胞用于分离CD4+T淋巴细胞。然后将后者在负载了SEQ ID NO:5的肽的抗原呈递细胞存在下进行培养。培养7天后,对CD4+T细胞的表型和细胞因子的产生进行了评估。结果表明这种细胞表达转录因子ROR-α(NR1F1)和BMP7(骨形态发生蛋白7)并产生GDF11,使其具有抗炎和组织修复的特性,但没有表达穿孔蛋白。
然后,用SEQ ID NO:6的肽免疫的第二组小鼠与阳性对照组一样治疗,即SEQ IDNO:5的肽与弗氏完全佐剂和百日咳毒素进行治疗。这组小鼠确实只表现出轻微和短暂的疾病迹象,在不到一周的时间内完全康复。同样,在脊髓中也没有观察到T淋巴细胞浸润或轻微的T淋巴细胞浸润,LFB染色后也没有观察到明显的脱髓鞘迹象。
因此得出结论,用含有氧化还原基序的SEQ ID NO:6的肽免疫后获得的CD4+T细胞显示出对用SEQ ID NO:5的肽免疫诱发的致病性T细胞的抑制功能。
示例4
核酸酶
核酸酶对基因编辑至关重要。然而,核酸酶来源于细菌,如每个人都会接触到的链球菌或葡萄球菌物种。因此,几乎每个人都携带特定的抗体和T细胞,这禁止使用这种核酸酶。因此,在不影响对细菌的整体防御的情况下,清除这种反应性是非常可取的。
在开放条件下饲养的Balb/c小鼠(不是无病原体)对金黄色葡萄球菌核酸酶表现出特异性抗体和CD4+T细胞。从这种小鼠身上获得脾细胞以制备CD4+T细胞。这种细胞在抗原呈递细胞存在的情况下下培养和扩增,该抗原呈递细胞负载有序列为NTHEQHLRKS(SEQID NO:7)的肽或序列为HCYPCHNTHEQHLRKS的肽(SEQ ID NO:8),该肽包含氧化还原基序(粗体)。
经过2个周期的刺激,对细胞的表型和细胞因子的产生进行检查。用SEQ ID NO:7的肽刺激得到的细胞呈现Th1细胞的特点,并产生γ干扰素(IFN-γ)。相比之下,在SEQ IDNO:8的肽存在的情况下,从培养物中获得的细胞产生IL-4、IL-10、IL-13和双调蛋白(AREG),并显示TIGIT和BLIMP-1的表面表达。具有免疫抑制功能的CD4+T细胞的其他标记包括DLL4(Rubey等人,Diabetes[糖尿病]2020 69(5):915-926,CTLA2(Sugita等人,JImmunol[免疫学方法杂志]2009 183(8):5013-22),TGF-β2(Mir等人,Immunology[免疫学]2015 146(4):547-56,精氨酸酶(Khoshnejad等人,Mol Ther Methods Clin Dev[分子治疗方法与临床发展]2020 18:652-663和meterin(Baht等人,Nat Metab[镍纹蛋白]2020 2(3):278-289)
用SEQ ID NO:7的肽刺激获得的细胞用CFSE标记,并与用SEQ ID NO:8的肽获得的细胞以1比1的比例在负载SEQ ID NO:7的肽的抗原呈递细胞上一起培养。
在共培养7天后,用CFSE稀释法测量细胞的增殖。结果表明在暴露于SEQ ID NO:8的肽而获得的细胞存在的情况下,通过暴露于SEQ ID NO:7的肽而获得的细胞不会增殖。进一步评估用SEQ ID NO:8的肽获得的细胞显示出不变的表型,这表明通过暴露于含有氧化还原基序的表位获得的特性是不可逆的。
因此,我们得出结论,当氧化还原基序附着在MHC II类表位上时,会诱发CD4+T细胞群,它们具有抑制而非细胞毒性的特性,并且在暴露于相同的II类表位的自然条件下保持这种特性。
序列表
<110> 伊科沃里有限公司(Equaly S.A.)
<120> CD4redox
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Ile Met Val Ala Pro Leu Gly Val Thr Thr Gly Ala Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ala Val
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His Cys Pro Thr Cys Ser Ile Met Val Ala Pro Leu Gly Val Thr Thr
1 5 10 15
Gly Ala Pro Thr Leu Ala Val
20
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ile Leu Gly Val Leu Gly Leu Gly Pro Val Pro Pro Leu Val Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
His Cys Thr Pro Cys Ile Leu Gly Val Leu Gly Leu Gly Pro Val Pro
1 5 10 15
Pro
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Thr Gly Ile Leu Ala Ser Ile Gly Ala Pro Pro Ser Gly
1 5 10
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
His Cys Thr Pro Cys Thr Gly Ile Leu Ala Ser Ile Gly Ala Pro Pro
1 5 10 15
Ser Gly
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Thr His Gly Gly His Leu Ala Leu Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
His Cys Thr Pro Cys His Ala Thr His Gly Gly His Leu Ala Leu Ser
1 5 10 15

Claims (18)

1.一种体外或离体方法,用于诱发对蛋白质的给定MHC II类表位具有免疫抑制功能的CD4+T细胞,所述体外或离体方法包括以下步骤:
鉴定该蛋白质中存在的MHC II类表位;
产生修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与所述MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的CXXC基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,并且X代表任何氨基酸;以及
使体外CD4+T细胞与所述修饰的MHC II类表位接触。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述蛋白质存在于特定靶组织中,并且其中,所述靶组织受到免疫疾病的影响。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述蛋白质是一种非人核酸酶。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述CD4+T细胞与所述修饰的MHC II类表位一起与药学上可接受的抗氧化剂接触。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,该方法进一步包括如下表征和/或分选和/或分离CD4+T细胞(Foxp3(-))的步骤,用于对选自由TIGIT、DLL4和CTLA2组成的组的表面标记的表达和/或用于对选自由白介素(IL)-10、IL-13、IL-4、转化生长因子(TGF)b-2、双调蛋白、精氨酸酶和镍纹蛋白组成的组的可溶性因子的分泌。
6.通过根据前述权利要求中任一项所述的方法可获得的CD4+T细胞,优选作为药剂使用或用于治疗不良免疫反应和/或用于组织修复。
7.一种修饰的MHC II类表位,包含与MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的CXXC基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,并且X代表任何氨基酸,
所述修饰的MHC II类表位用于在患者的组织中局部产生具有抑制功能的细胞因子,该患者对带有所述MHC II类表位或带有基本相似的MHC II类表位的肽已经产生了不良免疫反应。
8.根据权利要求7所述的修饰的MHC II类表位,用于在患者的组织中将炎症性巨噬细胞转化为非炎症性巨噬细胞,优选在脂肪组织中。
9.一种修饰的MHC II类表位,包含与MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的CXXC基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,并且X代表任何氨基酸,
所述修饰的MHC II类表位用于患者的组织修复,该患者对带有所述MHC II类表位或带有基本相似的MHC II类表位的肽患有免疫疾病。
10.一种包含MHC II类表位的非人核酸酶的肽片段,所述肽片段进一步包含与所述核酸酶的所述片段相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述特定核酸酶的所述片段分开的CXXC基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,并且X代表任何氨基酸,
所述肽片段用于与包含所述核酸酶的基因编辑系统结合使用,优选用于治疗遗传性疾病。
11.一种试剂盒,该试剂盒包含:
修饰的MHC II类表位,该修饰的MHC II类表位包含与MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的CXXC基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,并且X代表任何氨基酸;以及
监测(Foxp3(-))CD4+T细胞激活的部件,
其中,所述试剂盒用于治疗对带有所述MHC II类表位的肽的不良免疫反应。
12.根据权利要求11所述的试剂盒,其中监测(Foxp3(-))CD4+T细胞激活的部件是用于通过所述(Foxp3(-))CD4+T细胞测量表面标记的表达的部件、和/或通过所述(Foxp3(-))CD4+T细胞分泌监测可溶性因子的分泌的部件,其中表面标记选自由TIGIT、DLL4和CTLA2组成的组,并且可溶性因子选自由白介素(IL)-10、IL-13、IL-4、转化生长因子(TGF)b-2、双调蛋白、精氨酸酶和镍纹蛋白组成的组。
13.根据权利要求11或12所述的试剂盒,其进一步包含与所述修饰的MHC II类表位一起施用于患者的一种抗氧化剂化合物。
14.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的MHC II类表位,其中,不良免疫反应是炎症。
15.一种修饰的MHC II类表位,包含与MHC II类表位相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述MHC II类表位分开的至少一个额外的CXXC基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,并且X代表任何氨基酸,
该修饰的MHC II类表位用于诱发(Foxp3(-)CD4+T细胞表达选自TIGIT、DLL4和CTLA2组成的组的表面标记,和/或分泌选自白介素(IL)-10、IL-13、IL-4、转化生长因子(TGF)-2、双调蛋白、精氨酸酶和镍纹蛋白组成的组的可溶性因子;
所述CD4+T细胞对所述MHC II类表位具有特异性,所述MHC II类表位是存在于受不良免疫反应影响的患者的组织和/或器官中的蛋白质的一部分。
16.一种试剂盒,包含:
带有特定核酸酶或编码所述特定核酸酶的核酸分子的基因编辑系统,以及
为MHC II类表位的所述特定核酸酶的肽片段,所述肽片段进一步包含与所述特定核酸酶的所述片段相邻或通过具有多达7个氨基酸的接头与所述特定核酸酶的所述片段分开的CXXC基序,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,并且X代表任何氨基酸。
17.根据权利要求16所述的试剂盒,作为药剂使用,优选用于治疗遗传性疾病和/或治疗和/或预防病毒性疾病和/或治疗癌症。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法、MHC II类表位、CD4+T细胞、药物组合物或试剂盒,其中该CXXC基序选自由CPXC、CXPC、HCXXC、CXXCH、HCPXC、CPCXH、HCXPC和CXPCH组成的组,其中C代表半胱氨酸或硒半胱氨酸,X代表任何氨基酸,P代表脯氨酸,并且H代表组氨酸。
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