JP6969790B2 - マルチペプチド組成物 - Google Patents
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Description
配列番号:1のアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号:2のアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号:3のアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号:4のアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号:5のアミノ酸配列を有するペプチド、及び
配列番号:6のアミノ酸配列を有するペプチド
を含むペプチドの組み合わせが提供される。
配列番号:1は、残基718〜736を含むIA−2のフラグメントである。
配列番号:2は、残基752〜775を含むIA−2のフラグメントである。
配列番号:3は、残基855〜867を含むIA−2のフラグメントである。
配列番号:4は、残基C13〜C32を含むPIのフラグメントである。
配列番号:5は、残基C19〜A3を含むPIのフラグメントである。
配列番号:6は、残基C22〜A5を含むPIのフラグメントである。
配列番号:1のアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号:2のアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号:3のアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号:4のアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号:5のアミノ酸配列を有するペプチド、及び
配列番号:6のアミノ酸配列を有するペプチドから成る。
配列番号:4のアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号:5のアミノ酸配列を有するペプチド、及び
配列番号:6のアミノ酸配列を有するペプチド
を含む、1型糖尿病(T1D)の処置または予防への使用のためのペプチドの組み合わせであって、本組み合わせは、4回の投与に対して少なくとも1か月に1回、好ましくは1から4週毎に1回の投与のためである、ペプチドの組み合わせに関する。
配列番号:4のアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号:5のアミノ酸配列を有するペプチド、及び
配列番号:6のアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチドの組み合わせは、T1Dの患者またはT1Dのリスクが高いと特定された非糖尿病の個人に4回の投与に対して少なくとも1か月に1回、好ましくは1から4週毎に1回投与される、方法に関する。
B6.129S2−H2−Ab1tm1GruTg(HLA−DRA/H2−Ea,HLA−DRB1*0401/H2−Eb)1Kitoマウス(HLA−DR4−Tg)(1)をTaconic、米国から輸入し、すべての実験に使用した。内務省規則に従って、すべての動物は病原体がいないことを特定し、King’s College London Biological Services Unitにおいて標準的な条件に維持した。
流入領域リンパ節(DLN)をBD Cell Strainer(70μm)を使用してホモジナイズした。細胞を、RPMI中で洗浄し、0.5%の自家マウス血清を含むRPMI中に2.5×106細胞/mlで再懸濁した。2.5×105細胞をU底プレートの各ウェルに添加した。細胞を、培地単独、陽性対照刺激としてα−CD3/α−CD28 dynabeads(Invitrogen)によりまたはプロインスリンタンパク質もしくはIA−2により再刺激した。48時間の時点で、サイトカイン分析のために上清を取り出し、0.5mCi/ウェルのトリチウムチミジン[3H]を添加した。その細胞を18時間後にMicroBeta Trilux機器(Perkin Elmer)を使用して回収した。48時間の時点で採取した培養上清中のIFN−γ及びIL−10レベルを、製造業者のガイドラインに従ってready−SET−Goキット(ebiosciences)を使用して測定した。
前に記載したとおりにマウスのプロインスリンに対する寛容を破綻させた。マウスに、その後、プロインスリンに対する進行中の自己免疫応答をプロインスリン/IFAの皮下注射によりブーストする前に、1μgの対照PIまたはプロインスリンマルチPI(等モル量のC13〜22、C19〜A3及びC22〜A5を含む)の皮内処置を週に1回、4回受けさせた。リンパ節を取り出し、CD4+T細胞をCD4 T細胞単離キット(Miltenyi Biotec、ドイツ)を使用した負の選択によって単離した。細胞を、その後、抗CD25−FITC(eBioscience)で染色し、CD4+CD25highサプレッサーT細胞を、BD FACSAriaを使用した蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって単離した。プロインスリン/CFA免疫マウスのレスポンダー細胞を、前に記載したとおりCFSEで標識し、培地単独、α−CD3α−CD28 dynabeadsまたはプロインスリンタンパク質とともにCD4+CD25highT細胞と96時間共培養した。レスポンダー細胞の増殖(CFSE低下に対応する)をフローサイトメトリーによって測定した。%抑制を以下によりにより算出した。
(TrespのCFSE希釈−Tresp:TregのCFSE希釈)/(TrespのCFSE希釈)×100
酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイを使用してペプチド刺激に反応したCD4+T細胞によるインターフェロン(IFN)−γの検出を行った。このアッセイは、以前に示されたとおり、盲検の技量試験において1型糖尿病に対して著しい識別能力を有する(Arif, S. et al. J Clin Invest 2004;113: 451−463 and Herold, K. C. et al. Diabetes 2009;58: 2588−2595)。データは3つ組のスポットの平均数として表し、希釈液単独の存在下における平均スポット数(刺激指数;SI)と比較した。応答は、以前に示されたとおりの受信者操作特性プロットを使用して求めたカットオフを使用してSIが≧3の場合に陽性と見なされる(Arif, S. et al. J Clin Invest 2004;113: 451−463)。
いくつかのプロインスリン(PI)及びIA−2ペプチドの組み合わせを、免疫調節を誘導する際に最適であると評価するために選択した。以下の表1を参照のこと。
配列番号:8は、残基855〜869を含むIA−2のフラグメントである。
配列番号:9は、残基709〜732を含むIA−2のフラグメントである。
配列番号:10は、残基856〜870を含むIA−2のフラグメントである。
配列番号:11は、残基709〜736を含むIA−2のフラグメントである。
配列番号:12は、残基853〜872を含むIA−2のフラグメントである。
HLA−DR4形質転換(ヒト化)マウスを、強力なアジュバント及びPI/IA−2による免疫化により「自己免疫性」にして、上記のとおりPI及びIA−2に対する炎症反応を誘導する。炎症反応は、ヒトにおける自己免疫性(1型)糖尿病の主要な特徴であるT細胞の増殖及び炎症性サイトカイン産生を含む。マウスを、表1に示したとおりのペプチドカクテルまたは対照による5つの処置群に割り当てた。
PIに対する自己免疫応答を、上記実施例1に記載したとおりB6.129S2−H2−Ab1tm1Gru Tg(HLA−DRA/H2−Ea,HLA−DRB1*0401/H2−Eb)1Kitoマウス(HLA−DR4−Tg)において誘導した。
マウスを、1μgまたは10μgのいずれかのマルチPIにより、2回または4回のいずれかで処置した(図5A)。マルチPIの回数及び/または用量の低減の影響を確かめるために、プロインスリンタンパク質及びプロインスリンペプチドに対するDLN細胞懸濁液の増殖及びサイトカイン産生を測定することによってリコール応答をin vitroにおいて分析した(図5B〜D)。マルチPI処置の回数を4回から2回に減らすと、治療的効果が大幅に低下した。対照的に、マルチPIの4回の処置は、プロインスリンに対する応答を抑制的に調節することに対して効果的であり、1μgの低減された用量は、10μgのマルチPIと同様に効果的なようであった(図5B〜D)。2回目の免疫化後7日目におけるフローサイトメトリーによるDLN組成物の分析は、対照PIを与えられたマウスと比較して、マルチPIを与えられたマウスにおける制御性T細胞の増殖のレベルの増加を明らかにし、各処置群の間で有意差は確認されなかった(図5E)。プロインスリン特異的な血清IgGレベルは、マルチPIによって抑制的に調節され、10μgのマルチPIの4回の処置を与えたマウスにおいて有意に低下した(図5F)。
有効な処置を与えたものと比較した、対照PIで処置したマウスのTreg部分におけるプロインスリン特異的サプレッサー活性を測定することによってマルチPIのTregの機能に対する影響を評価した。CD4+CD25high制御性T細胞を、対照PIまたはプロインスリンマルチPIにより処置したマウスから単離し、プロインスリン/CFAで免疫したマウスのCFSE標識レスポンダーT細胞とともに異なる濃度で共培養した(図6A)。細胞を、抗CD3/抗CD28免疫磁気ビーズの存在下において共培養して、ポリクローナル応答を抑制する対照PIT及びマルチPIT Tregの能力を評価した。両処置条件下で形成されたTregは、同等の抑制能力を示した(図6B)。しかしながら、プロインスリンタンパク質で刺激した共培養物では、異なる処置に関連した抑制能力があった(図6C)。マルチPI処置マウスのTregは、対照PI処置マウスのTregよりも有意に大きな程度にまでプロインスリン特異的な応答を抑制した(図6D)。
Claims (10)
- 配列番号:1のアミノ酸配列からなるペプチド、
配列番号:2のアミノ酸配列からなるペプチド、
配列番号:3のアミノ酸配列からなるペプチド、
配列番号:4のアミノ酸配列からなるペプチド、
配列番号:5のアミノ酸配列からなるペプチド、及び
配列番号:6のアミノ酸配列からなるペプチド
を含む、ペプチド組成物。 - 配列番号:1のアミノ酸配列からなるペプチド、
配列番号:2のアミノ酸配列からなるペプチド、
配列番号:3のアミノ酸配列からなるペプチド、
配列番号:4のアミノ酸配列からなるペプチド、
配列番号:5のアミノ酸配列からなるペプチド、及び
配列番号:6のアミノ酸配列からなるペプチド
から成る、請求項1に記載のペプチド組成物。 - 請求項1または請求項2に記載のペプチド組成物及び1つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的に許容される組成物。
- システインをさらに含む、請求項3に記載の薬学的に許容される組成物。
- 治療で使用するための請求項3または4に記載の薬学的に許容される組成物。
- 1型糖尿病(T1D)の処置または予防における使用のための、請求項5に記載の薬学的に許容される組成物。
- 1型糖尿病(T1D)の処置または予防のための薬剤の製造への使用のための、請求項5に記載の薬学的に許容される組成物。
- 前記組成物は、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、経鼻、経口もしくは皮膚上経路を含む非経口、経口または局所経路によって送達されるよう製剤化される、請求項3から7のいずれか1項に記載の薬学的に許容される組成物。
- 前記組成物は、皮内経路によって送達されるよう製剤化される、請求項8に記載の薬学的に許容される組成物。
- 請求項1または請求項2に記載のペプチド組成物を含む1型糖尿病(T1D)を処置または予防するためのキット。
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