CN1541103A

CN1541103A - 诱导持续免疫应答的方法

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Publication number: CN1541103A
Application number: CNA028143272A
Authority: CN
Inventors: ��˹��P��Ʒ�; 尼古拉斯·P·普洛特尼科夫
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-05-16
Filing date: 2002-05-16
Publication date: 2004-10-27
Also published as: WO2002092018A3; EP1401474A2; RU2003136161A; ATE346605T1; RU2313364C2; WO2002092018A2; EP1401474A4; DE60216458D1; US20140024588A1; CN101417120A; DE60216458T2; US20030148942A1; EP1401474B1; AU2002316221A1; US8633150B2

Abstract

促进免疫低下个体持续增加T细胞产生水平的方法，其中按照间歇给药方案给予脑啡肽。特别是，该方法包括对免疫低下患者的治疗，其包括或者单独或者与其它治疗联合给予起始剂量的脑啡肽，并根据维持持续免疫系统反应的需要而定期给予加强剂量的脑啡肽。

Description

诱导持续免疫应答的方法

发明领域

本发明涉及刺激和促进持续天然免疫系统应答的方法，该方法导致对感染因子包括病毒，细菌，真菌和寄生虫，和其它免疫缺陷相关疾病增强抵抗力和抑制作用。更具体地，本发明涉及用于促进持续增加T细胞(细胞毒T细胞)产生水平的间歇给药方案。

发明背景

免疫系统保护机体抵抗感染因子，包括病毒，细菌，真菌和寄生虫。此外，免疫系统保护机体抵抗癌症，以及由免疫失衡，机会致病菌感染，和自身免疫疾病引起的疾病状态(Penney，美国专利5,980,913)。用药物刺激免疫系统是预防和治疗引起免疫抑制状态的因素的主要方法。

免疫系统对免疫原的应答可以由于某些疾病或病理状态而被抑制。例如，感染了人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的患者可以发生获得性免疫缺陷综合征(AIDS)或AIDS相关综合征(AIDS-related complex，ARC)，并因此抑制了免疫应答。这类患者对病理感染或恶性疾病更易感而在正常免疫系统将会提供足够的保护以对抗它们。其它这样的免疫低下个体包括患有癌症，接受X线，外科手术，或化疗治疗的患者。

目前防止如HIV等病毒感染的个体发生免疫缺陷的措施通常包括给予抑制病毒DNA合成因而延缓病毒相关免疫抑制发作的化合物。对HIV感染患者的治疗通常包括给予化合物例如3’叠氮-3’-脱氧胸苷(AZT)，2’，3’-双脱氧胞苷(DDC)和2’，3’-双脱氧肌苷(DDI)，齐多夫定(zidovudine)，地达诺新(didanosine)，扎西他宾(zalcitabine)，司他夫定(stavudine)，和奈韦拉平(viramune)。更新的抗HIV治疗包括给予蛋白酶抑制剂例如，沙喹那韦(saquinovir)，nefinavir，利托那韦(ritonavir)，吲哚那韦(indinavir)和其它。细胞因子治疗也用于AIDS患者的治疗，研究机构已经证实白细胞介素-2(IL2)对HIV阳性患者CD4 T细胞亚群水平升高是有效的(Kovacs，et al.，N.Engl.JMed.，1996；335：1350-1356)。也有报道详述了IL2也能提高CD8 T细胞计数(Schmitz，et al.，Science，1999；283：857-860)。不幸地是，使用IL2常常伴有明显的毒性(Davey，etal.，JAMA，2000；284：183-189)。然而，这些治疗尽管具有潜在的抗逆转录病毒的作用，但其中没有一种已被证实在AIDS的治疗或预防中完全有效。此外，这些化合物中有很多引起严重的副作用，包括血小板计数降低，腹泻，恶心，肾毒性，和骨髓细胞减少症(Kempf，et al.，U.S.Patent 6,017,928；Lai，et al.，U.S.Patent 6,093,743)。在正常志愿者，HIV阳性者，和癌症患者中用甲硫氨酸脑啡肽(met-enkephalin)进行的多项临床研究未显示明显毒性(Plotnikoff，et al，Clin.Immun.Immunopath.，1997)。但是，测定的血浆中甲硫氨酸脑啡肽半衰期大约为2分钟(Bihari，et al.，Seventh Int.Coizf.OnAIDS.1991)。因此，在此领域对需要这种治疗的患者要有刺激持续免疫系统应答的改进方法，这类患者包括例如免疫系统应答水平降低者(例如AIDS)，或者有可能出现免疫系统应答水平降低者(例如HIV感染患者)。

发明概述

所有引用的专利，专利申请和参考文献在此以其全部引入作为参考。

最近对甲硫氨酸脑啡肽的研究显示其激活IL2(Wybran，et al.，from SomeImmunological Effects of Methionine Enkephalin In Man：PotentialTherapeutical Use Leukocytes and Host Defense.205-212，Alan R.Liss，Inc.1986)和γ干扰素(Brown，et al.，Immunology，1986；103：19-26)及IL12(Zhong，et al.，Augmentation of TNF-alpha Production，NK cell activity andIL-12 p35 mRNA Expression by Metliaonine Enkephalin，1996；17(2)：182-5)基因的转录。AIDS患者有IL2和γ干扰素缺陷症状(Fauci，et al.，Science，1993；262：1011-1018)。最近发现HIV阳性者甲硫氨酸脑啡肽缺陷(Valentine，et al.，FASEB J.，1988；2(5)：4518；Chao，Thesis，University of Illinois College ofPharmacy 1993)。所有上述细胞因子源于辅助性T细胞中的前激素(Plotnikoff，et al.，Clin.Immun.Immunopath.，1997；82(2)：93-101)。免疫抑制，部分是细胞因子缺陷的结果(Fauci，et al.，Science，1993；262：1011-1018)。

但是，基于上述本领域的任一技术人员不会预料到本发明的活性制剂可被用于对患者产生持续免疫应答有用的治疗方法中，所述方法包括对需要这种治疗的患者按照间歇给药方案给予活性制剂。

本发明的基础是惊奇地发现，有规律的甲硫氨酸脑啡肽剂量方案在患者停药后至少1个月里对促进免疫系统应答中持续的细胞增加，包括持续的细胞水平是有效的。

本发明提供，在需要这样治疗的免疫低下患者中对诱导持续免疫系统应答有用的治疗方法，其中该方法包括给予患者有效量的脑啡肽，给药方式为单独，联合，或者进一步联合其它对增强免疫系统应答有用的化合物，包括疫苗。在此上下文中“免疫低下”指T细胞数或功能的任何降低。

本发明也提供，在感染HIV的患者中对诱导持续免疫系统应答有用的治疗方法，其中该方法包括给予HIV感染者有效量的脑啡肽，给药方式为单独，联合，或者进一步联合其它对延缓HIV增殖或HIV相关感染发展有用的化合物，包括逆转录酶抑制剂例如3’叠氮-3’-脱氧胸苷(AZT)，2’，3’-双脱氧胞苷(DDC)和2’，3’-双脱氧肌苷(DDI)，齐多夫定，地达诺新，扎西他宾，司他夫定和奈韦拉平；蛋白酶抑制剂例如，沙喹那韦，nefinavir，利托那韦，吲哚那韦；细胞因子例如G-CSF，IL-11，IL-12，IL-2；和γ干扰素以及抗生素或其它用于治疗或预防HIV感染者的感染的药物。

优选实施方案详述

定义

除非另有说明，这里使用的短语“活性制剂”指一组包括脑啡肽类的化合物。

除非另有说明，短语“脑啡肽”或“脑啡肽类”包括任何属于类鸦片(opioid)肽分子一般范畴的化合物，包括在其一个末端具有下列肽结构的化合物：

Tyr-Gly-Gly-Phe-R

其中R是甲硫氨酸或亮氨酸。脑啡肽的例子列于表I。

表I

类鸦片肽及其前体和结构

前体肽结构
前体肽结构	前-鸦片 α-内啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-黑皮质素 Pro-Leu-Val-Thr(PCMC)λ-内啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leuβ-内啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-(人) Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-lle-lle-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu

前脑啡肽A 亮氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu甲硫氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met七肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-Gly-Leu八肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-Gly-Leu肽E Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-Arg-Val-Gly-Arg-Pro-Glu(牛) -Trp-Trp-Met-Asp-Tyr-Gln-Lys-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
	前强啡肽强啡肽A(1-8) Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-lle(前脑啡肽B)强啡肽A(1-17)(猪) Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-lle-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln强啡肽B(1-13)(猪) Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Gln-Phe-Lys-Val-Val-Thrα-新-内啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro-Lysβ-新-内啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro新强啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Gln-Phe-Lys-Val-(ieumorphin) Vai-Thr-Arg-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Asn-Ala-Tyr-Tyr(猪) Glu-Glu-Leu-Phe-Asp-Val
其它 B-Casomorphin Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile皮啡肽(Dermorphin)Tyr-d-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2高托尔芬 Tyr-Arg(Kyotorphin)

脑啡肽类似物也属于本发明范畴，并且在引入以做参考的下列文献中有描述：1994年8月28日授权Rodbard等人的美国专利4,468,383；1983年2月1日授权Pert等人的美国专利4,371,463；1981年4月14日授权Smolarsky等人的美国专利4,261,883；1981年3月3日授权Wilkinson等人的美国专利4,254,106；1980年7月22日授权Kastin等人的美国专利4,213,968；1980年4月15日授权Hudson等人的美国专利4,198,398；1978年11月28日授权Coy等人的美国专利4,127,534；1978年3月30日授权Jones，Jr.等人的美国专利4,092,304；1977年6月7日授权Jones，Jr.等人的美国专利4,028,319；J.Chang et al.，″Opiate Receptor Affnities and Behavioral Effects of Enkephalin：Structure Activity Relationship of Ten Synthetic Peptide Analogues，″18 Life Sci.1473-1482(1976)；G.A.Gacel et al.，″Synthesis，Biochemical andPharmacological Properties of BUBUC，a Highly Selective and SystematicallyActive Agonist for In Vivo Studies of Delta-Opioid Receptors″，11 Peptides983-988(1990)；和B.P.Roques，″Peptidomimetics as Receptor Agonists orPeptidase Inhibitors：A Structural Approach in the Field of Enkephalins，ANP andCCK″，32 Biopolymers 407-410(1992)。

如这里使用的，短语“持续免疫系统应答”意思是，使患者体内与免疫系统相关的细胞或分子的血清水平维持在高于基线的水平，细胞包括T细胞例如CD3，CD4，CD8，CD56，CD25，CD38，分子例如白细胞介素和干扰素。

如这里使用的，短语“基线”或“基础应答水平”意思是指给予活性制剂前患者体内与免疫系统相关的细胞或分子的血清水平，细胞包括T细胞例如CD3，CD4，CD8，CD56，CD25，CD38，分子例如白细胞介素和干扰素。

这里使用的短语脑啡肽的“间歇剂量方案”指脑啡肽重复给药的起始规律，在一定时间段内从每日给药到每周给药不等(或者可以在一定时间段内给药能促进体内产生脑啡肽的化合物)(统称“起始剂量方案”)，当这种给药不连续时要随后间歇一段时间。此后在一定间断的基础上给予额外的脑啡肽(或促进体内产生脑啡肽的化合物)。

间歇剂量方案实例包括，但不局限于，在12周内每周给予脑啡肽1至5次，然后间歇4至24周。此后，在某些规定的标准基础上，给予加强剂量，最高至每周5次，持续1-4周。属于本发明范畴的间歇剂量方案的其它例子包括4周内每周给予脑啡肽1至5次，然后间歇4至16周。此后根据测定的持续应答水平给予加强剂量，最高至每周5次，持续1至4周。也可以使用其它间歇方案。

这里使用的短语“HIV”包括HIV-1，HIV-2的所有变异体和型别，以及其它同义的逆转录病毒，例如人类III型T淋巴病毒(HTLV-III)和淋巴结病相关病毒(LAV-1和LAV-2)。

这里使用的短语“AIDS”指获得性免疫缺陷综合征，AIDS-相关综合征(ARC)，和HIV感染个体淋巴细胞数降低。

这里使用的短语“治疗或预防AIDS”包括预防或降低AIDS引起的免疫抑制，例如，通过降低患者外周血淋巴细胞中HIV水平，或者通过增加淋巴细胞数来实现；骨髓再造；增加HIV感染患者的存活；以及预防或降低相关的症状，异常和与HIV感染相关的感染，包括但不局限于对致病生物和机会致病生物和感染的易感性，贫血，血小板减少症，和淋巴细胞减少症。

这里使用的短语“机会致病菌感染”指在有正常免疫系统功能的患者体内一般是不致病的微生物的感染。

在本发明中描述的许多肽类可以商业上获得，但是也可以用任何传统方法合成，包括但不局限于下列文献发表的：J.M.Stewart and J.D.Young，SolidPhase Peptide Synthesis，2nd ed.，Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.(1984)和J.Meienhofer，HormonalProteins and Peptides，Vol.2，Academic Press，NewYork，(1973)for solid phase synthesis and E.Schroder and K.Lubke，ThePeptides，Vol.1，Academic Press，New York，(1965)for solution synthesis。前述的发表物在此引入作为参考。

一般地，这些方法包括在延长的肽链上顺序加入受保护的氨基酸(美国专利5,693,616，在此以其全部引入作为参考)。通常，将第一个氨基酸的氨基或者羧基和任何反应性侧链基团加以保护。然后将受保护的氨基酸附着于惰性固体支持物上，或者应用于溶液中，将同样被适当保护的按顺序排列在下一个的氨基酸在利于形成酰胺键的条件下加入。在所有的目的氨基酸按照正确的顺序连接后，去除保护基团和任何固相支持物，得到粗制多肽。将多肽脱盐并纯化，优选层析纯化，以生产最终产物。

可以按照标准的固相方法学合成肽类，例如可以在Applied BiosystemsModel 430A peptide synthesizer(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)上按照生产商的说明进行。通过固相方法学或者在液相中合成肽或肽类似物的其它方法，是本领域技术人员熟知的。

或者，可以用传统的生物学方法生产肽。

发明详述

定义

在本发明的一个实施方案中，在12周期间内按每周一次给予患者有效量的活性制剂，然后停药。起始剂量停药后从4周到16周测定患者的免疫应答(T细胞计数)，并且既与基础应答水平对比也与该剂量方案结束时测定的应答水平对比。此后，根据需要给予加强剂量，最高至每周5次，持续1至4周。

在本发明的其它实施方案中，在4周期间内按每周1至5次给予患者有效量的活性制剂，然后停药。起始剂量停药后从4周到16周测定患者的免疫应答(T细胞计数)。此后，根据测定的持续应答水平考虑给予加强剂量，最高至每周5次，持续1至4周。也可以使用其它间歇方案。

本发明方法的一方面用于在HIV感染患者中治疗或预防AIDS，包括给予HIV感染患者有效治疗或预防AIDS剂量的至少一种化合物，其选自多种活性制剂，并且是单独给予，不同活性药物联合给予，或与其它对治疗或预防HIV感染个体的AIDS有益的化合物联合给予，这些化合物包括但不局限于逆转录酶抑制剂，蛋白酶抑制剂，细胞因子，以及抗生素或其它用于治疗或预防HIV感染患者感染的药物或者疫苗，其中逆转录酶抑制剂包括但不局限于，3’叠氮-3’-脱氧胸苷(AZT)，2’，3’-双脱氧胞苷(DDC)和2’，3’-双脱氧肌苷(DDI)，齐多夫定，地达诺新，扎西他宾，司他夫定，和奈韦拉平；蛋白酶抑制剂例如沙喹那韦，nefinavir，利托那韦，吲哚那韦；细胞因子例如G-CSF，IL-11，IL-12，IL-2和红细胞生成素。

用于治疗或预防HIV感染个体的AIDS发作时，可将活性制剂按照任何合适的途径给药，但是优选口服，非胃肠道给药，通过雾化吸入，经皮，静脉，直肠，动脉，鼻内，滴眼，面颊贴(buccal patch)，或者局部给药，为含有传统可药用的载体，助剂，和赋形剂的剂量单位配制剂。这里使用的短语非胃肠道，包括皮下，粘膜内，静脉，动脉，或腱内。

也可以将活性制剂置于适合药用的赋形剂中直接向患者给药，所述赋形剂例如，5％DMSO或10％乙醇的盐水溶液。在优选实施方案中，在包括有效治疗在内的时间段内多次给予活性制剂。

已知本领域中有大量适合持续释放目的的可选方案并且视为包括在本发明范围内。合适的传送赋形剂包括但不局限于下列：微囊或微球；脂质体和其它以脂类为基础的释放系统；类晶体和粘性滴剂；可吸收的和/或可生物降解的机械载体；和聚合的释放物质，例如聚环氧乙烷/聚环氧丙烷嵌段共聚物(例如poloxamers)，聚原酸酯，交联聚乙烯醇，聚酐，聚甲基丙烯酸酯和聚甲基丙烯酰胺水凝胶，阴离子碳水聚合物，聚乙二醇，等等。有用的传送系统是本领域熟知的并且在例如美国专利4,937,254中有描述，在此将其全部内容引入作为参考。

也可以将活性制剂制成液体形式(例如溶液，悬液，或乳剂)，以及可以进行传统的制药操作例如灭菌和/或可以含有传统的可药用的助剂，例如稳定剂，湿润剂，乳化剂，保存剂，共溶剂，悬浮剂，粘度增强剂，离子强度和重量克分子渗透浓度调节剂以及其它除了缓冲试剂外的赋形剂。可被用于药物传送赋形剂中的合适的水溶性保存剂包括亚硫酸氢钠，硫代硫酸钠，抗坏血酸盐，苯扎氯铵，氯丁醇，硫柳汞，硼酸苯汞，parabens，苄醇，苯基乙醇或抗氧化剂例如维生素E和生育酚，螯合剂例如EDTA和EGTA。一般地，这些制剂可以按重量大约0.001％至大约5％的量存在，并且优选地，以重量大约0.01％至大约2％的量存在。

对于给药，一般将活性制剂与一种或多种适合所需给药方式的可药用助剂联合。可以将化合物与下列物质混合：乳糖，蔗糖，淀粉，链烷酸的纤维素酯，硬脂酸，滑石粉，硬脂酸镁，氧化镁，磷酸和硫磺酸的钠盐和钙盐，阿拉伯树胶，明胶，藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，和/或聚乙烯醇，并制成适于传统给药的片剂或胶囊。或者，可以将本发明的化合物溶解于盐水，水，聚乙二醇，丙二醇，羧甲基纤维素胶体溶液，乙醇，玉米油，花生油，棉籽油，芝麻油，黄芪胶树脂，和/或包括磷酸缓冲盐水等各种缓冲液。其它佐剂和给药方式是制药领域熟知的。载体或稀释液可以包括延时物质，例如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯，单独或与蜡或本领域熟知的其它物质一起使用。

用于诱导HIV感染患者持续免疫系统应答的活性制剂的剂量方案以许多因素为基础，包括年龄，体重，性别，个体的医疗状况，严重程度，给药方式，和使用的具体活性制剂。因此，剂量方案可以有很大不同，但是可以由内科医生使用标准方法来常规判断。

活性制剂在10^-14μg/Kg至30,000μg/Kg体重之间的剂量水平可以用于这里公开的所有方法。在间歇剂量方案中优选的剂量水平从1μg/Kg至250μg/Kg。在优选实施方案中，在起始剂量方案期间剂量为20μg/Kg受试者体重，在该起始剂量方案之后间歇剂量变为从20-100μg/Kg体重。

用测定下述指标的方法判断剂量方案的有效性，所述指标例如患者外周血淋巴细胞中HIV水平的降低，(病毒载量)，贫血，血小板减少症，和淋巴细胞减少症；CD4+，CD8+，CD3+，和CD56+细胞计数，淋巴细胞数，抗体滴度，对致病性感染和机会致病性感染的抵抗力的增加，和HIV感染患者的存活。

本发明的活性制剂也可以用更稳定的形式给药，例如，与聚乙二醇联合或为融合蛋白，或其它本领域已知的形式。

已经发现AIDS，外科手术患者和癌症患者具有升高的皮质醇(cortisol)水平，其导致对细胞因子，例如IL2和γ干扰素的产生进行抑制。对细胞因子的产生的这种抑制促成免疫系统的抑制。特别是，认为皮质醇对IL2的基因转录有抑制作用，并下调细胞毒细胞和NK细胞。参见，例如K.Ogawa etal.，″Suppression of Cellular Immunity by Surgical Stress，″Surgery，127(3)：329-36(March，2000)；″Suppressant Effects of Cortisol，″Goodman and Gilmans，The Pharmacological Basis of Therapeutics，Pergamon Press，New York(8th Ed.1990)。皮质醇也使AIDS患者疲劳和衰弱。在实施例中报道的研究证明，甲硫氨酸脑啡肽的间歇剂量方案逆转了HIV诱导的免疫抑制，导致增加了IL2水平和T细胞，并且预期能逆转由普通途径-皮质醇-诱导的这类免疫抑制，如在AIDS，外科手术，癌症和其它患者上见到的一样。

参考附带的实施例可以更好理解本发明，实施例仅意在说明的目的不应被理解为对本发明范围的限制。

实施例1：甲硫氨酸-脑啡肽作为“治疗性疫苗”的体内给药

设计最初12周的双盲研究，来测定甲硫氨酸-脑啡肽规律剂量方案对HIV感染患者细胞毒T细胞水平的影响。每个患者的剂量按照组别有不同：(1)60μg/Kg；(2)125μg/Kg和(3)安慰剂。每周一次静脉注射给予患者活性制剂(甲硫氨酸-脑啡肽)或者安慰剂(常规盐水；对照组)持续12周。在8和12周时，采集每位患者的标本以测定T细胞水平。在12周时停止注射。在停止注射后4周时(时间点为16周)再记录下T细胞数的测定值。结果显示在最后一次甲硫氨酸脑啡肽给药的一个月后细胞毒T细胞的持续应答水平。

表II：末次N-盐水注射的一个月后的免疫学值

	基线	一个月	差异
	基线	一个月	差异	CD3(6/8)CD4(6/8)CD8(5/8)CD56(7/8)CD25(5/8)(IL2受体)CD38(7/8)	1260±136(1)383±37914±15322±645±8220±8	976±103^304±37^668±104^80±18^90±17^*505±84	-284-79-246+58+45+285

CD3 ^*P＝0.01

CD4 ^*P＝0.001

CD8 ^*P＝0.02

CD56 ^*P＝0.01

CD25 ^*P＝0.02

CD38 ^*P＝0.01

(1)每立方毫米的平均细胞数±标准误

(N/8)细胞数高于(或低于)基线的患者的数量

表III：末次N-甲硫氨酸脑啡肽注射的一个月后的免疫学值

	基线	一个月	差异
	基线	一个月	差异	CD3(9/12)CD4(7/12)CD8(9/12)CD56(11/12)CD25(10/12)(IL2受体)CD38(9/12)	1003±81(1)314±39659±6422±658±12320±79	1183±116^351±37^787±79^137±6^145±62^636±103^	+180+37+128+115+87+316

(1)每立方毫米的平均细胞数±标准误

CD3 ^*P＝0.04

CD4 ^*P＝0.01

CD8 ^*P＝0.001

CD56 ^*P＝0.001

CD25 ^*P＝0.09

CD38 ^*P＝0.05

(N/12)细胞数高于基线的患者的数量

结果概述：

发现与基线值相比，末次N-甲硫氨酸脑啡肽给药(8-12周注射)的一个月后，细胞毒T细胞(包括CD3，CD4，CD8细胞)水平升高。与此明显对比，安慰剂处理的对照组在16周研究期间同类细胞的水平进行性降低。这些结果显示，用甲硫氨酸脑啡肽处理增加了细胞毒T细胞(这可减少病毒载量)，并且可以认为是间歇剂量方案治疗HIV的“治疗性疫苗”方法。这些持续性结果尤其惊奇的是，经过测定，血浆中甲硫氨酸脑啡肽的半衰期大约为2分钟。

CD3，CD4，和CD8细胞

发现一个月前用甲硫氨酸脑啡肽治疗的患者具有相对于基线而言持续的T细胞增加(平均值CD3+180，CD4+37，CD8+128)。明显对比的是，一个月前用n-盐水注射的患者T细胞数相对于基线值直线下降(CD3-284，CD4-79，CD8-246)。

CD56细胞

与基线对比，甲硫氨酸脑啡肽组和n-盐水注射组的自然杀伤细胞数均比基线增高。但是，甲硫氨酸脑啡肽组明显高于n-盐水组(80+18对137+21p＝0.03)。

CD25细胞(IL2受体)

白细胞介素II受体表达在两个组中都比基线水平增加，但甲硫氨酸脑啡肽组比n-盐水组增加得更多(45对87个细胞)。

CD38细胞

发现两个组的CD38细胞数均高于基线(盐水组的285对脑啡肽组的316)。

本研究支持Walker及其同事提出的假说，即在AIDS患者体内维持免疫系统时最重要的细胞是细胞毒T细胞(CD3，CD8)(Walker，et al.，Nature，1987；328：345-348)。这些细胞毒T细胞与被疫苗激活的细胞是同一种细胞(Belyakov，et al.，J.Clin.Invest.，1998；102(112)：2072-2081)。CD4亚群也具有抗HIV的细胞毒作用(Hahn，et al.，Int.Rev.Immunol.，1999；18(5-6)：449-464)。NK细胞也具有对抗HIV的细胞毒作用(Melder，et al.，FASEB J.，1989；3：4)。

在本研究中，CD56细胞在脑啡肽和盐水治疗组均升高(注射8-12周)。在脑啡肽组的显著更明显增加可归因于脑啡肽的激活作用，并且脑啡肽组的最终增加可归因于NK细胞。盐水注射8-12周也可以由于该操作的压力而在一定程度上激活相同系统，导致细胞因子和CD25的一定程度的增加。

实施例2：进展期AIDS患者的甲硫氨酸脑啡肽体内给药

6例CD4计数低于每微升200个细胞的进展期AIDS患者，用甲硫氨酸脑啡肽进行间歇治疗。在起始剂量方案期间，甲硫氨酸脑啡肽的剂量按20μg/Kg受试者体重给药，每周3次持续4周。此后，根据需要给予受试者20-100μg/Kg体重。患者4和6在起始剂量方案后进行了间歇治疗。

方案开始时，规律起始剂量方案的一个月后，以及对患者4和6而言，额外3个月间歇治疗后的结果列于表IV和V。

表IV-AIDS患者Rx方案和临床评价

患者描 Rx前状态 Met脑啡肽治疗相关治疗临床评价

述 Rx方案期间

1.42 ·Kaposi肉瘤 20μg/Kg， 4个月 ·Kaposi肉瘤稳定

岁，男 (皮肤) 3x/wk ·无机会感染

同性恋 ·卡氏肺囊虫 (5/15/87)

·AIDS-(IV，C，D)

AZT(5/87)

2.42 ·卡氏肺囊虫 20μg/Kg， 10个 ·两性霉素 ·除念珠菌食管炎以外无

岁，男食管念珠菌病； 3x/wk(12/85) 月 ·磺胺嘧啶机会感染

非洲人脑的弓形体病；至100μg/Kg， ·长春新碱 ·志贺菌肠炎治愈

全身性隐球菌感染 3x/wk(10/87) ·咪康唑 ·Kaposi肉瘤稳定

(肺，G.I，骨髓，脑膜炎， ·克雷伯氏菌败血症治愈

心包炎)

·Kaposi肉瘤稳定

·AIDS-(IV，C，D)

3.34 ·Kaposi肉瘤(皮肤淋巴 20μg/Kg， 24个 ·局部液态 ·Kaposi肉瘤稳定(一些消

岁，男结) 3x wk(10/85) 月 N2 退，一些新损伤)

同性恋 ·AIDS-(IV，C，D) 至100μg/Kg， ·无机会感染

3x(10/87) ·22个月时沙门菌败血症

4.37 ·脑的弓形体病； 20μg/Kg， 8个月 ·磺胺嘧啶 ·7个月Rx截瘫和括约肌

岁，女 ·念珠菌食管炎；(皮肤) 3x/wk(1/87) ·乙胺嘧啶问题(HIV脊神经根炎？)

非洲人 ·Kaposi肉瘤至100μg/Kg， ·不明原因死亡(细菌感

·AIDS-(IV，C) (2/87) 染？肺栓塞？)

·无机会感染的复发

5.34 ·脑 20μg/Kg， 4个月 ·磺胺嘧啶 ·RX 2个月后有脑萎缩症

岁，男 ·弓形体病； 3x/wk(1/07)； (退出) ·乙胺嘧啶状(HIV痴呆)

同性恋 ·AIDS-(IV，C) 至50μg/Kg， ·无机会感染的复发

3x/1wk(3/87)

6.31 ·非何杰金氏 20μg/Kg， 11个 ·皮肤损伤消失(活检)的第

岁，男 ·淋巴瘤 3x/wk(4/86)；月一例，但复发(7个月)且11

同性恋 ·脑至100μg/Kg， (退出) 个月时可能累及肺

·弓形体病； (5/87) ·无机会感染复发

·分支杆菌

·Kansani

·Kaposi肉瘤(皮肤)

·AIDS-(IV，C，D)

表V-AIDS患者免疫学

患者编号#

淋巴细胞数/mm³

开始时 1个月 4个月其它值(月数) 其它值(月数)

1 578 - 1130^*

2 700 1066^* 1172^* 540(8M) 360(10M)

3 1716 2080^* 1776^* 1173(24M)

4 1380 1440^* 1620^* 969(7M)

5 896 928^* 360 -

6 247 324^* 252 112(11M)

CD3/mm³

1 387 - 881^* -

2 616 820 1337 410(8M) 256(10M)

3 1287 1560^* 1598^* 961(24M)

4 730 940^* 790^* 532(7M)

5 689 677 - -

6 205 250^* 164 78(11M)

CD4/mm³

1 29 68^* - -

2 28 43^* 49^* 32(8M) 7(10M)

3 205 437^* 391^* 106(24M)

4 40 40 60^* 58^*(7M)

5 63 65^* 50 -

6 25 32^* 13 10(11M)

CD8/mm³

开始时 1个月 4个月

1 61 66^*

2 546 767^* 1271^* 340(8M) 23(10M)

3 1047 1144^* 1154^* 821(24M)

4 650 860^* 770^* 610(7M)

5 609 594 198 -

6 205 250^* 164 78(11M)

CD4/CD8比率

1 0.5 - 1.0^* -

2 0.05 0.06^* 0.40 0.09^*(8M) 0.02(10M)

3 0.02 0.38^* 0.34^* 0.13(24M)

4 0.06 0.05 0.08^* 0.09^*(7M)

5 0.10 0.11^* 0.26^* -

6 0.10 0.13^* 0.08 0.13^*(11M)

PHA(cpmx10³)

1 213 - -

2 42 8 28 15(8M) 11(10M)

3 144 72 128 227^*(24M)

4 92 151^* 187^* 16(7M)

5 48 82^* 60^* -

6 96 86 37 8(11M)

PHA(cpmx10³) 开始时 1个月 4个月

1 32 - - -

2 14 6 7 12(8) 9(10M)

3 14 19^* 12 57^*(24M)

4 21 25^* 47^* -(7M)

5 13 18^* 12 --

6 17 19^* - -

NK(％)

1 3 - 17^*

2 27 27 6 -

3 26 43^* 33^* 13(8M)

4 5 5 4 30^*(24M)

5 2 7^* - 16^*(7M)

6 18 19^* - -(11M)

IL2(单位)

1 0.04 - 0.1^* -

2 0 - - 0.1^*(8M) 0(10M)

3 0.34 0.43^* 0 -

4 0 0 0 0.03^* (7M)

5 0 0 0.03^* -

6 0.1 0 - -(11M)

^*比基线升高

结果概述：

实施例2中描述的研究证明，与使用相当于(comparable)起始剂量方案的连续方案的患者相比，在某些患者中间歇剂量方案提供可比的或更好的结果。特别是，患者4和6在延续的时间内出现阳性结果，无机会感染的复发。患者6在延续的时间内皮肤损伤消失。变化包括肉眼可见的某些肿瘤体积的缩小，以及肿瘤颜色退成白色。

患者4被证实增加了淋巴细胞，CD3，CD4，和CD8的计数；患者6与基线相比增加了淋巴细胞数。主要的免疫学效应是T细胞亚群(CD3，CD4，和CD8)增加以及与基因转录的激活相伴的母细胞化。

因此，此临床数据证明，甲硫氨酸脑啡肽的间歇剂量治疗可以增加进展期AIDS患者T细胞的基因转录并缩小或稳定Kaposis肉瘤。

本领域的技术人员可以看出活性制剂和本发明的方法可以在不背离本发明的精神和范围的情况下进一步修改，并且不被前述的实施例或优选实施方案所限制。此公开的内容意欲包括在其所属领域总体遵循本发明原则的所有本发明的变体，应用，或改变。

Claims

1.一种促进免疫低下个体持续增加T细胞产生水平的方法，其中按照间歇给药方案给予脑啡肽。

2.一种治疗免疫低下患者的方法，其包括在起始剂量方案中单独给予或者与其它治疗联合给予脑啡肽，并根据维持持续免疫系统应答的需要而定期给予脑啡肽加强剂量。

3.权利要求1或2的治疗方法，其中其它治疗包括疫苗，细胞因子，抗病毒，抗生素，抗真菌，抗寄生虫和抗肿瘤治疗。

4.权利要求2的方法，其中起始剂量方案是在4-12周期间每周给药1-5次。

5.权利要求2的方法，其中起始剂量方案期间脑啡肽的剂量是按患者体重10^-14-30,000μg/Kg。

6.权利要求2的方法，其中起始剂量方案期间脑啡肽的剂量是按患者体重1至250μg/Kg。

7.权利要求2的方法，其中起始剂量方案期间脑啡肽的剂量是按患者体重20μg/Kg。

8.权利要求2的方法，其中是否需要定期加强剂量，是通过起始剂量方案停药的4周到16周后测定患者的免疫应答(T细胞计数)，并且将免疫应答既与基线应答水平对比也与该剂量方案结束时测定的应答水平对比来判断。

9.权利要求2的方法，其中按照需要给予定期加强剂量，最高至每周5次持续1-4周。

10.权利要求2的方法，其中起始剂量方案后脑啡肽的加强剂量为20-100μg/Kg体重。

11.按照间歇剂量方案给予脑啡肽而治疗癌症的方法。

12.治疗癌症的方法，其包括在起始剂量方案中单独或者与其它治疗联合给予脑啡肽，并根据维持持续免疫系统应答的需要给予定期加强剂量的脑啡肽。

13.治疗受试者皮质醇诱导的免疫抑制的方法，其通过周脑啡肽起始剂量方案然后再给予脑啡肽定期加强剂量来治疗该受试者。

14.抑制受试者经皮质醇诱导的对细胞因子的产生进行抑制的方法，其通过用脑啡肽起始剂量方案，然后再给予脑啡肽定期加强剂量来治疗该受试者。

15.抑制受试者经皮质醇诱导的IL2基因转录降低的方法，其通过用脑啡肽起始剂量方案，然后再给予脑啡肽定期加强剂量来治疗该受试者。

16.抑制受试者经皮质醇诱导的细胞毒细胞或NK淋巴细胞下调的方法，其通过用脑啡肽起始剂量方案，然后再给予脑啡肽定期加强剂量来治疗该受试者。