CN1973898A - 一种含p28分子或其基因的医药制剂 - Google Patents

Abstract

本发明属医药制剂领域，涉及以p28分子或者编码p28分子的基因为有效成分、用于对抗白细胞介素27(IL－27)引起的免疫反应的医药制剂。具体是以可溶性p28分子或者可表达并分泌p28分子的基因为有效成分，对抗由IL－27介导的对机体不利的免疫反应，可广泛用于例如治疗和预防免疫反应异常亢进引起的自身免疫疾病、抑制机体对移植物的排异反应、以及对抗IL－27引起的对免疫反应的抑制作用、维持细胞免疫应答等，具有广泛的适用范围。

Description

一种含p28分子或其基因的医药制剂

技术领域

本发明属医药制剂领域，涉及以p28分子或者编码p28分子的基因为有效成分、用于对抗白细胞介素27(IL-27)引起的免疫反应的医药制剂。具体是以可溶性p28分子或者可表达并分泌p28分子的基因为有效成分，对抗由IL-27介导的对机体不利的免疫反应，可广泛用于例如治疗和预防免疫反应异常亢进引起的自身免疫疾病、抑制机体对移植物的排异反应、以及对抗由IL-27所致的免疫反应抑制，维持细胞免疫应答等，具有广泛的适用范围。

背景技术

对于治疗不良免疫反应性疾病，如以自身脏器为攻击靶的自身免疫反应性疾病以及在脏器移植中的排异反应等，通常的手段是使用免疫抑制剂。在这些免疫抑制剂中，抗T淋巴细胞抗体及甾体类激素之类药物会引起所有免疫反应抑制，环孢菌素等则抑制所有活化的T细胞的活性，因而都具有非特异性的免疫抑制作用，使用后会引起机体的防御能力减弱，增加机体对病毒和细菌的易感性，进而使机会感染的可能性大大增高。另外已经明确长期给予免疫抑制剂，能够增加癌症发生的危险。所以免疫抑制剂一方面为医疗现状中不可缺少，另一方面其使用过程中会有副作用的危险性。这类的药物制剂的开发目前还不充分，因此有必要开发直接作用于免疫反应的有关分子和有特异性的免疫抑制剂。另外关于活化免疫应答的手段，非特异性的活化药物对机体具有一定危害险性，因此使用免疫抑制物质的抗体，特异性阻遏其免疫抑制活性或阻止其和受体的结合，可以达到特异性活化免疫反应的作用，但是由于抗体在人体适用方面还有些问题，目前距离临床应用研究还有很大的距离。

由各种免疫细胞分泌的细胞因子在复杂而精细的免疫反应调控中具有重要的作用。而另一方面，这些能活化免疫细胞的细胞因子又与很多疾病有关。特别是自身免疫疾病患者，已经被证实其炎性细胞因子的分泌明显异常于正常健康人(非专利文献1)。另外，细胞因子功能失衡能促进疾病的发展。例如在癌症患者中，免疫抑制性细胞因子的分泌亢进能加剧癌的恶化(非专利文献3)。综上所述，阻断这些过度产生的细胞因子所引起的对机体有害的免疫反应，将具有一定治疗作用。因此寻找特异性地阻断上述细胞因子的受体信号传导通路的物质，是开发新的特异性免疫抑制剂或者免疫赋活剂的有效途径。

新发现的p28基因于2002年被确定，已经明确该基因编码的p28分子和Epstein-Barr virus-induced gene 3(EBI3)分子一起构成新发现的细胞因子IL-27(非专利文献4)。作为一种异二聚体蛋白，IL-27由树状细胞分泌，具有和IL-12、IL-23相似的结构，属于IL-12细胞因子家族。在体外实验中，发现IL-7能使静息的T细胞的增殖亢进，IL-12依赖的IFN-γ的产生增强。最近还阐明了与B细胞的抗体基因类别转换(Ig class switch)也有关系(非专利文献5)。IL-27的受体是由II型细胞因子受体家族分子WSX-1分子和IL-6受体的亚单位的gp130分子所组成的二聚体，该受体在静息T细胞和自然杀伤细胞(NKcell)上表达(非专利文献6，7)。从IL-12受体主要在辅助T细胞1型(Th1)上表达，而IL-23受体主要在记忆T细胞上表达，看来这些IL-12家族分子在T细胞的成熟分化过程中起着相互协调的作用。特别是根据IL-27的诱导IL-12受体亚单位的IL-12Rβ2，可以认为IL-27的作用先于IL-12(非专利文献8)。即IL-27对于初期的静息T细胞的增殖、活化过程、IL-12对于T细胞的分化过程、IL-23对于记忆T细胞的维持分别发挥不同的作用，从而与细胞免疫应答密切相关。IL-27受体来的信号传导和其它IL-12家族分子一样，利用Jak激酶/STAT分子通路，STAT1被强烈激活，STAT3、STAT5分子也同时被激活(非专利文献8-10)。特别是STAT1通路在增强调控IFN-γ基因表达的转录因子T-bet的表达中具有重要作用(非专利文献8-10)。

研究发现，将IL-27基因导入肿瘤细胞，并将这种表达IL-27的肿瘤细胞接种于同系的小鼠，杀伤性T细胞或NK细胞被活化，接种的肿瘤被排斥(非专利文献11)。而IL-27受体(WSX-1)缺失小鼠，Th1功能不全，如果感染了利什曼虫等细胞内寄生的病原体，则不能将其排除(非专利文献12-13)。这些实验结果提示，IL-27在细胞免疫应答活化中具有举足轻重的作用。最近的研究证实，同样为WSX-1缺失的小鼠，在感染寄生虫以后的免疫应答后期非但炎症反应没有减弱，反而诱导了II型辅助T细胞型(Th2)的过度反应(非专利文献13-14)。因此IL-27的机体的作用有两面性，在免疫反应的初期能增强包括Th1细胞的增殖、分化、活化在内的细胞免疫应答，而在后期则能抑制炎症或Th2反应，减弱免疫应答。

类风湿关节炎、1型糖尿病、克罗恩病(crohn病，又名结肠克隆病)等脏器特异性自身免疫性疾患，大多是由于Th1和Th2的作用失衡，自身反应性Th1细胞被激活所致。根据IL12具有增强Th1反应的生理活性，提示其在自身免疫性疾患的发生中起了非常重要的作用。研究报告表明，在自身免疫性疾患小鼠模型上，给予能特异性阻断IL-12与其受体结合的抗p40单克隆抗体，能减轻自身免疫疾病症状，抑制疾病产生的病理变化(非专利文献15)。另外，用髓磷脂碱基蛋白质或髓磷脂少突神经胶质细胞来源的糖蛋白的多肽片断来免疫特定品系的小鼠，则可诱发实验性自身免疫性脑脊髓炎，该实验模型证实了IL-12和IL-23共同参与了该疾患的发生(非专利文献16)。因此可以预想，对Th1细胞具有激活作用的IL-27也一样参与了自身免疫性疾病的发生。实际上有研究报告表明，向实验性自身免疫性脑脊髓炎以及佐剂诱导的关节炎模型鼠投予具有中和IL-27作用的抗p28抗体，能够抑制疾病患的发生或减轻其病变(非专利文献17-18)。

【非专利文献1】Shimozato，O et al.，Cytokine，8，99-105，1996

【非专利文献2】Skurkovich，SV et al.，Med.Hypotheses，59，770-780，2002

【非专利文献3】Wittke，F et al.，Br.J.Cancer，79，1182-1184，1999

【非专利文献4】Pflanz，S et al.，Immunity，16，779-790，2002

【非专利文献5】Yoshimoto，T et al.，J.Immunol.，173，2479-2485，2004

【非专利文献6】Pflanz，S et al.，J.Immunol.，172，2225-2231，2004

【非专利文献7】Chen，Q et al.，Nature，407，916-920，2000

【非专利文献8】Takeda，A et al.，J.Immunol.，170，4886-4890，2003

【非专利文献9】Lucas S et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，100，15047-15052，2003

【非专利文献10】Kamiya，S et al.，J.Immunol.，173，3871-3877，2004

【非专利文献11】Hisada，M et al.，Cancer Res.，64，1152-1156，2004

【非专利文献12】Yoshida，H et al.，Immunity，15，569-578，2001

【非专利文献13】Hamano，S et al.，Immunity，19，657-667，2003

【非专利文献14】Villarino，A et al.，Immunity，19，645-655，2003

【非专利文献15】Leonard，JP et al.，J.Exp.Med.，181，381-386，1995

【专利文献16】Cua，DJ et al.，Nature，421，744-748，2003

【非专利文献17】Goldberg，R et al.，J.Immunol.，173，1171-1178，2004

【非专利文献18】Goldberg，R et al.，J.Immunol.，173，6465-6471，2004

发明的内容

IL-27参与上述细胞性免疫应答的活化，与自身免疫疾患中的过度免疫应答密切相关。由此推断，特异地阻断IL-27所致的对机体有害的免疫应答，将是免疫疾病有效治方法之一。并且，从免疫应答的后期IL-27参与了对已经活化的免疫应答的抑制考虑，阻断IL-27的作用有助于细胞免疫应答效果的维持。因此，IL-27功能的阻止剂，能够对免疫应答进行人为的调控，可能在治疗过度免疫应答所致疾病中具有巨大的应用价值。

本发明用可溶性IL-27的亚单位分子来阻遏IL-27在免疫初期激活细胞性免疫应答、后期减弱免疫反应的功能，即通过可溶性亚单位分子和IL-27受体的结合来特异性阻止该受体和IL-27的结合。其结果是阻止了IL-27向细胞内的信号传导。这种可溶性亚单位分子是根据机体内本来存在的分子结构，用分子生物学的方法合成制作的，能够特异性地抑制IL-27所致的免疫应答。在这一点上和现有的非特异性免疫抑制剂及抗体制品不同，也和抗个体基因型抗体产生等抗体医药制剂的作用机理不同，临床上有应用价值。而且它还具有现有医药制品所不及之处和独特的特点，还具有作为免疫应答维持剂的应用价值。

IL-12的亚单位p40分子，能单独与IL-12受体IL-12Rβ₁分子相结合，所以可溶性p40分子能竞争性阻断IL-12与其受体的结合，从而阻遏IL-12分子的活性。有报告表明，二聚体p40分子比单体p40分子能更加有效地阻遏IL-12的功能活性(Gillessen，S et al.，Eur.J.Immunol.，25，200-206，1995)。因此，可以推测可溶性IL-27亚单位分子也能阻遏IL-27与其受体的结合。我们的工作表明，合成的IL-27亚单位EBI3和p28分子中，只有p28分子是可溶性的。p28分子能够抑制IL-27引起的免疫应答、抑制IL-27介导的IFN-γ的产生、又阻遏IL-27基因导入肿瘤后引起的抗肿瘤免疫反应，从而从多方面证实了p28分子能够阻遏IL-27所引起的免疫应答。

所以发现了p28分子或其基因，能够作为阻遏IL-27所致的免疫应答的医药制剂的有效成分。使得本发明得以完成。

因此，本发明是以IL-27的亚单位p28分子或者其基因为有效成分，目的是阻止由IL-27所致的免疫应答的医药制剂。

本发明用p28分子或其基因为有效成分，抑制IL-27介导的自身免疫性疾病、脏器移植等中的免疫应答，可以预防和治疗自身免疫性、过敏性疾病、使移植脏器的存活期延长。另外能够阻止IL-27所致的免疫应答抑制，使细胞免疫应答得以维持。对于细胞内寄生的感染性疾病等能够发挥有效的治疗作用。

p28分子是树状细胞分泌的细胞因子IL-27的亚单位。本发明所采用的p28分子，具体来说、例如是具有序列表1所示的从第29至243氨基酸序列的p28分子，或者在序列表1所示的从第29至243的氨基酸序列的基础上，缺失、置换和/或者添加1个或数个氨基酸残基形成的，与p28分子有同样功能的蛋白质。这里说的有同样功能是指的p28分子所具有的阻断IL-27所致的免疫应答功能。作为在序列表1所示从第29至243的氨基酸序列基础上缺失、置换和/或者添加1个或数个氨基酸残基形成的氨基酸序列，与序列表1所示的从第29至243氨基酸序列相比，希望能具有70％以上相同的氨基酸序列。另外，序列表1所示的第1到第28的氨基酸序列是信号肽。

本发明所采用的p28分子的编码基因，具体说来，例如编码如序列表1所示的具有从第29至243的氨基酸序列的蛋白质的基因，或编码在序列表1所示从第29至243的氨基酸序列基础上缺失、置换和/或者添加1个或数个氨基酸残基的、并有和p28分子同样功能的蛋白质的基因。更具体地说来，是具有序列表1所示的从第85至第732的碱基序列的基因，或是与序列表1所示和从第85至第732的碱基序列基因有互补的碱基序列基因在严格条件下杂交获得的，编码和p28分子有同样功能的蛋白质的基因。这里所说的有同样的功能和上述内容的意义是一样的。所谓严格的杂交条件，例如将含有6×SSPE、2×Denharts溶液、0.5％SDS、0.1mg/ml大马哈鱼精囊DNA的溶液，在65℃、12个小时反应条件下进行原位杂交等，另外序列表1所示的从第1至第84碱基序列相当于编码信号肽的基因。

正如后面要说明的，本发明在将p28分子编码基因作为有效成分使用时，通常采用能表达、分泌该基因的病毒载体和非病毒载体。所以，还附加了p28分子的编码基因的上游的信号肽的基因。决定信号肽的基因不限于序列表所示和从第1至第84的碱基序列的基因。通常也可以将决定信号肽的编码基因作为使用基因运用。

上述基因可以用PCR法这一大家熟悉的方法得到序列表1所示的p28分子基因碱基序列。这些方法，例如可以根据Molecular Cloning 2nd Edt.，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)等的教科书所载，专业人士不难进行。还有，例如根据部位特异性突然变异，用PCR式通常的原位杂交法不难得到。具体方法可以参考上述著作。上述的p28分子也可以通过上述基因由专业人士用DNA重组法不难得到。或者用通常的蛋白合成法制取。

本发明所用的p28分子，通常用静脉、皮下、肌肉、局部、经直肠、经皮经鼻等非口服的方法给予。因为是非口服用药剂型，可以是注射剂型、油剂、软膏剂、雪花膏剂、酊剂、喷雾剂、栓剂、贴附剂等。还有调制成缓释性的小型小丸型剂埋入体内，使用渗透泵使药物在体内持续缓慢地吸收和发挥作用。另外、口服也是可能的，通常使用的微胶囊或用脂质两层包装的剂型，其在消化道内不能分解。

该制剂用众所周知的传统方法调治，在制剂方面通常使用无毒而且无活性的物质作为赋形剂。而且还可以根据需要，使用普通的结合剂、稳定剂、缓冲剂、溶解辅助剂等。

p28分子的使用量以及使用次数，是根据使用对象的症状、病史、年龄、体重、使用状况等而异。例如成人(体重60kg)静脉内等非口服使用的场合，一般一天100～5000mg、希望在400～2000mg，最好在800～1200mg的范围内适当调节，一次或分数次使用。

在本发明在使用决定p28分子的编码基因的时候，一般如上所述使用形式，为能表达、分泌p28分子的基因的病毒载体和非病毒载体，病毒载体通常以腺病毒逆转录病毒为代表，具体地说，例如无毒化的逆转录病毒，腺病毒、腺体随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、舟状花叶病毒、仙台病毒、SV40、爱滋病病毒等DNA病毒或RNA病毒。在上述病毒当中，腺病毒的感染力远高于其它病毒，所以希望使用腺病毒载体系列。

作为病毒载体，只要是在哺乳类动物体内表达希望表达的基因的载体都可以，例如pcDNA3.1、pZeoSV、pBK-CMV(Invitrogene公司、Strategene公司)和pCAGGS(Niwa，H et al.，Gene，108，193-199，1991)等表达载体。

为了使这些基因在载体上表达，采用插入能决定信号肽的编码基因的上游附加p28分子编码基因的方法，调制出本发明的医药制剂。这些非病毒载体及病毒载体的调制方法、使用方法已经为专门从事者所熟知，可以参考的资料如：别册实验医学、基因治疗的基础技术，羊土公司1996。别册实验医学、基因导入和表达分析实验法，羊土公司1997。日本基因治疗学主编基因治疗开发研究手册、NTS1999。

插入能够决定表达、分泌p28分子编码基因的病毒载体或非病毒载体，用其本来的状态，或用医药方面允许的一般的赋形剂，制成溶液、混悬液、凝胶等形式的制剂后使用。给药方式，可以争取局部注射等方式。另外，一般的都可以经静脉、动脉等方法达到全身性用药。

还有也可以将上述插入的能将决定表达、分泌p28分子编码基因的病毒载体或非病毒载体预先导入细胞，然后用该细胞投药。这种作为承担体的细胞有纤维细胞、肌母细胞、末梢血细胞、各种干细胞和用放射线处理过的肿瘤细胞等等。在血细胞内导入病毒载体或非病毒载体的过程中，将p28分子编码基因插入LXSN(Miller，AD，Rosman，GJ，BioTechniques，7，980-990，1989)、MGF、α-SCG、PLJ、pEm(特表平6-503968号公報)等逆转录病毒载体的克隆部位，使其表达、分泌。然后将该DNA导入至包装细胞，使用导入了决定p28分子细胞编码基因的培养上清液里所含的逆转录病毒，让细胞感染，这样就将决定p28分子细胞的编码基因导入了细胞内。导入以后的细胞，一般用半通透性的多聚体等包埋，用精氨酸多L赖氨酸藻酸盐胶囊或者琼脂糖微型珠等的形式给药。

决定p28分子细胞编码基因的使用量，根据给药对象的症状、年龄、性别、给药途径、剂型等而异。一般成人一日给药决定p28分子细胞的编码基因的重量为10μg至500mg。

本发明的医药制剂对由IL-27免疫应答的异常亢进所致的免疫性疾患，如胶原病、多发性硬化症、慢性类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、I型糖尿病、慢性甲状腺炎等有特效。另外、由IL-27所致的免疫应答而引起的脏器移植排斥反应等也有效。还有在能阻遏免疫应答的减弱，维持免疫应答，对感染性疾病、癌等也有效。本发明的医药制剂在能够特异性地阻遏IL-27所致的免疫应答这一点上有和其它医药制剂不同的优点。

下面详细地说明本发明的具体实施的例子，但本发明并非仅仅局限于下列实施例子。

实施例1

重组IL-27及p28分子的制作

从BALB/c小鼠的大腿骨采取骨髓细胞，用脂多糖(10μg/ml)刺激6小时，再用RT-PCR法从该骨髓细胞的RNA分离p28及EBI3的全长度cDNA。将它们分别插入动物细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His(Invitrogen公司)的克隆部位。另外，关于IL-27的表达，在pcDNA3.1的载体内，将p28及EBI3通过internal ribosomal entry site(IRES)(Duke，GM et al.，J.Virol.，66，1602-1609，1992)插入。紧接着IL-27的表达载体出现在巨细胞病毒启动子的下游，基因按p28/IRES/EBI3的顺序序列，p28和EBI3 cDNA由同一启动子进行复制。这些DNA通过使用Lipofectin(Invitrogen公司)导入中华田鼠的卵巢癌细胞的CHO細胞或猴的上皮细胞的COS-7细胞，48-96小时后回收培养上清液，以下的实验中，是将这些培养液作为IL-27及可溶性亚单位分子使用的。

在这里使用的小鼠决定p28及EBI3分子的编码基因，是序列表1及3所表示的碱基序列而来的。序列表所示的碱基序列是信号肽编码碱基序列5′末端侧(第1到84)里的序列。

实施例2

p28分子的分泌

将空载体(pcDNA3.1/myc-His)或在同样载体内插入p28、EBI3 cDNA后导入CHO細胞，96小时后将细胞培养液、细胞溶解液和抗体一起进行了免疫印迹法解析(图1)。其结果在EBI3基因导入细胞当中，仅从细胞溶解液中检出该基因的产物，而从细胞培养液中什么也没检测出来。在p28导入的细胞中仅从细胞溶解液中检出少量该基因的产物，而在细胞培养液中则检出了许多同该分子量一致的相同产物，即p28分子是被单独分泌出来的，而EBI3分子则基本上为非分泌型的。

实施例3

p40抑制IL-27诱导脾细胞产生IFN-γ的作用

将pcDNA3.1插入IL-12(p35/IRES/p40)(Tasaki，K et al.，Cancer GeneTher.，7，247-254，2000)、IL-27及p28基因载体的DNA导入COS-7的细胞，使用培养上清液或没有导入该基因的相同细胞的培养上清液，培养从C57BL/6小鼠的脾脏制取CD4⁺细胞。在培养开始48小时后，同样收集其上清液，用免疫酶ELISA法(e-Bioscience公司)测定IFN-γ的含量(图2)。只在未导入基因的COS-7细胞的培养上清液培养的CD4⁺细胞的上清液中没有检出IFN-γ，而在添加了含有IL-12分子培养上清液中产生了IFN-γ，同时添加含有IL-12分子培养上清液和含有IL-27分子的培养上清液时，IFN-γ的产生进一步增加。如果将由IL-27所致的IFN-γ的产生增加的部分和含有p28分子的培养上清液同时添加，IFN-γ则完全消失。而将含有IL-12分子培养上清液和含有p28分子的培养上清液同时添加时，IFN-γ的产量没有有意义的改变。所以p28分子能阻遏依赖性的IFN-γ产生，而不能影响IL-12分子依赖性的IFN-γ的产生量。

实施例4

IL-27及p28分子基因导入细胞的建立

将用p28分子及EBI3 cDNA或IRES制成的p28/IRES/EBI3基因插入逆转录病毒载体LXSN(Miller，AD，Rosman，GJ，BioTechniques 7，980-990，1989)。将该DNA用Lipofectin导入包装细胞Psi-2(ATCC)，选用G418(400μg/ml、Invitrogen公司)添加培养基，然后使用培养上清液和多聚季胺(polybrene，8μg/ml、Aldrich公司)将基因导入PA317细胞(ATCC)，用G418(400μg/ml)添加培养基选择得到了PA317培养上清液中的逆转录病毒。用该逆转录病毒感染小鼠大肠癌细胞(Colon26)，树立了p28、EBI3及IL-27基因导入细胞

(Colon26/p28、Colon26/EBI3、Colon26/IL-27)。这些基因导入细胞的各个基因的表达经RNA印迹法予以了确认(图3)。另外，在肿瘤抗原的提示中发现重要的主要组织相适应的抗原H-2K/H-2D/H-2L、母细胞株和各个基因导入细胞之间没有大的差别，进一步证明了各个基因导入细胞的体外培养的增殖细胞和母细胞株上的一样。

实施例5

可溶性p28分子阻遏了由于导入IL-27基因而引起的抗肿瘤效果

将Colon26/IL-27的细胞(1×10⁶)接种于同系小鼠BALB/c的皮下，肿瘤短时间生长存活了，但随着时间的经过，全部缩小，最后完全被机体排斥，但是如果接种Colon26/p28或Colon26/EBI3细胞(1×10⁶)，肿瘤则生长，其增长的程度和母细胞株肿瘤差不多，试将这些细胞投予到小鼠肿瘤，观察其存活状况，Colon26/IL-27细胞投予的小鼠全部生存。Colon26/p28或Colon26/EBI3细胞投予的小鼠全部死亡。而其生存状况和母细胞株投予的情况无差异。因IL-27基因在肿瘤中的表达接种于同系的小鼠，则产生了抗肿瘤效果，而p28或EBI3基因导入细胞则完全没有看到这种效果。

因此观察了p28分子是否能在体内阻遏IL一27的功能。将Colon26/IL-27和母细胞株以1∶1的比例混合，使总细胞数达到1×10⁶接种于同系小鼠的皮下，肿瘤随着时间的经过，全部退缩，最终被全部排斥(图4)。但将Colon26/IL-27细胞和Colon26/p28细胞按1∶1的比例混合(细胞总数1×10⁶)。并接种于同系小鼠的皮下，其增殖程度和仅用母细胞株(细胞总数1×10⁶)的情况及仅用Colon26/p28细胞(细胞总数1×10⁶)接种的情况相比，完全一样。肿瘤产生排斥的反应没有发生，即明确了IL-27的抗肿瘤效果被可溶性p28分子阻遏。

小鼠p28分子的氨基酸序列(序列表2的第29到第234的氨基酸序列)和人类的p28分子的氨基酸序列(序列表1的第29到第234的氨基酸序列)有74.9％的相同性。另外小鼠和人的IL-27功能是相同的，与此相关的内容已由Schoehaut DS，et al.，Cloning and expression of murine IL-12.J.Immunol.，1992，148，63433-3440等报告。明确了小鼠和人的p40分子分别阻遏IL-12.的内容已由Ling P，et al.，Human IL-12p40homodimer binds to the IL-12receptor butnot mediate biologic activity.J.Immunol.，1997，154，116-127；Gillessen S，et al.，Mouse interleukin-12(IL-12)p40homodimer：a potent IL-12antagonist.Eur.J.Immunol，1995，25，200-206；Matter F，et al.，The interleukin-12subunit p40specifically inhibits effects of the interleukin-12heterodimer.Eur.J.Immunol.，1993，23，2202-2208等报告。还有关于小鼠和人的IL-27功能是相同的已由Pflanz S，et al.WSX-1 and glycoprotein  130constitute a signal-transducingreceptor for IL-27.J.Immunol.，1997，154，116-127；Pflanz S，et al.，IL-27，aheterodimeric cytokine composed of EBI3and p28protein，induces proliferation ofnaive CD4(+)T cells.Immunity，2002，16，755-758等报告。因此，根据这些事实采用序列表2的第29到第234的氨基酸序列组成的小鼠p28分子和采用序列表1的第29到第234的氨基酸序列组成的人类的p28分子，得到了上述同样的实验结果，这在专业人士中已经得到明确认同。

技术效果

正如以上的详细说明，证明了导入决定p28分子的编码基因的COS-7的培养上清夜抑制了由IL-27所致的CD4+脾细胞的IFN-γ的产生。另外通过导入了决定p28分子的编码基因的Colon26细胞阻遏了导入决定IL-27的编码基因的IL-27细胞接种所显示抗肿瘤的效果。这些事实证明p28分子能够阻遏IL-27所致的免疫应答。而且通过决定p28分子编码基因插入有可能表达、分泌载体，产生p28分子能同样阻遏IL-27所致的免疫应答，所以使用p28分子或决定p28分子的编码基因能够抑制自身免疫性疾病、脏器移植等与IL-27有关的免疫应答，使自身免疫和过敏性疾病的预防和治疗成为可能。还可以对抗IL-27引起的免疫应答抑制、使细胞免疫应答得以维持、对细胞内寄生感染性疾病发挥作用。

附图说明

【图1】图显示了细胞的分泌仅仅是IL-27亚单位分子的p28分子，而没有分泌其它亚单位分子的EBI3分子。

【图2】图显示了导入p28基因的COS-7的培养上清夜抑制了由IL-27所致的CD4+脾细胞的IFN-γ的产生，也标明了标准误差。

【图3】图显示了在Colon26细胞(Parent)表达了导入p28、EBI3、IL-27(p28/IRES/EBI3)基因或LXSN载体(Vector)细胞(IL-27基因导入细胞为#2、#4和#12的3个克隆)的各个基因，表示了Elongationfactor(EF)-1α的RNA被正确地显示出来。

【图4】图显示了通过p28基因导入的Colon26细胞阻遏了IL-27基因导入的Colon26肿瘤接种的抗肿瘤效果，也标明了标准误差。

【序列表】

                        Sequence Listing

<110>Chiba Prefecture

<120>Pharmaceutical Preparation Containing p28 Molecule or Gene Encoding

the Same

<130>DA-03777

<210>1

<211>732

<212>DNA

<213>Homo sapience

atg ggc cag acg gca ggc gac ctt ggc tgg cgt ctc agc ctg ttg ctg  48

Met Gly Gln Thr Ala Gly Asp Leu Gly Trp Arg Leu Ser Leu Leu Leu

        5                   10                  15

ctt ccc ttg ctc ctg gtt caa gct ggt gtc tgg gga ttc cca agg ccc  96

Leu Pro Leu Leu Leu Val Gln Ala Gly Val Trp Gly Phe Pro Arg Pro

            20                  25                  30

cca ggg agg ccc cag ctg agc ctg cag gag ctg cgg agg gag ttc aca  144

Pro Gly Arg Pro Gln Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Phe Thr

        35                  40                  45

gtc agc ctg cat ctc gcc agg aag ctg ctc tcc gag gtt cgg ggc cag  192

Val Ser Leu His Leu Ala Arg Lys Leu Leu Ser Glu Val Arg Gly Gln

    50                  55                  60

gcc cac cgc ttt gcg gaa tct cac ctg cca gga gtg aac ctg tac ctc  240

Ala His Arg Phe Ala Glu Ser His Leu Pro Gly Val Asn Leu Tyr Leu

65                  70                  75                  80

ctg ccc ctg gga gag cag ctc cct gat gtt tcc ctg acc ttc cag gcc  288

Leu Pro Leu Gly Glu Gln Leu Pro Asp Val Ser Leu Thr Phe Gln Ala

                85                  90                  95

tgg cgc cgc ctc tct gac ccg gag cgt ctc tgc ttc atc tcc acc acg  336

Trp Arg Arg Leu Ser Asp Pro Glu Arg Leu Cys Phe Ile Ser Thr Thr

            100                 105                 110

ctt cag ccc ttc cat gcc ctg ctg gga ggg ctg ggg acc cag ggc cgc  384

Leu Gln Pro Phe His Ala Leu Leu Gly Gly Leu Gly Thr Gln Gly Arg

        115                 120                 125

tgg acc aac atg gag agg atg cag ctg tgg gc catg agg ctg gac ctc  432

Trp Thr Asn Met Glu Arg Met Gln Leu Trp Ala Met Arg Leu Asp Leu

    130                 135                 140

cgc gat ctg cag cgg cac ctc cgc ttc cag gtg ctg gct gca gga ttc  480

Arg Asp Leu Gln Arg His Leu Arg Phe Gln Val Leu Ala Ala Gly Phe

145                 150                 155                 160

aac ctc ccg gag gag gag gag gag gaa gag gag gag gag gag gag gag  528

Asn Leu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

                165                 170                 175

agg aag ggg ctg ctc cca ggg gca ctg ggc agc gcc tta cag ggc ccg  576

Arg Lys Gly Leu Leu Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala Leu Gln Gly Pro

            180                 185                 190

gcc cag gtg tcc tgg ccc cag ctc ctc tcc acc tac cgc ctg ctg cac  624

Ala Gln Val Ser Trp Pro Gln Leu Leu Ser Thr Tyr Arg Leu Leu His

        195                 200                 205

tcc ttg gag ctc gtc tta tct cgg gcc gtg cgg gag ttg ctg ctg ctg  672

Ser Leu Glu Leu Val Leu Ser Arg Ala Val Arg Glu Leu Leu Leu Leu

    210                 215                 220

tcc aag gct ggg cac tca gtc tgg ccc ttg ggg ttc cca aca ttg agc  720

Ser Lys Ala Gly His Ser Val Trp Pro Leu Gly Phe Pro Thr Leu Ser

225                 230                 235                 240

ccc cag ccc tga                                                  732

Pro Gln Pro^***

<210>2

<211>705

<212>DNA

<213>Mouse

atg ggc cag gtg aca gga gac ctt ggc tgg cgg ctc agc ctg ttg ctg  48

Met Gly Gln Val Thr Gly Asp Leu Gly Trp Arg Leu Ser Leu Leu Leu

                5                   10                  15

cta ccc ttg ctt ctg gta caa gct ggt tcc tgg ggg ttc cca aca gac  96

Leu Pro Leu Leu Leu Val Gln Ala Gly Ser Trp Gly Phe Pro Thr Asp

            20                  25                  30

ccc ctg agc ctt caa gag ctg cgc agg gaa ttc aca gtc agc ctg tac  144

Pro Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Phe Thr Val Ser Leu Tyr

        35                  40                  45

ctt gcc agg aag ctg ctc tct gag gtt cag ggc tat gtc cac agc ttt  192

Leu Ala Arg Lys Leu Leu Ser Glu Val Gln Gly Tyr Val His Ser Phe

    50                  55                  60

gct gaa tct cga ttg cca gga gtg aac ctg gac ctc ctg ccc ctg gga  240

Ala Glu Ser Arg Leu Pro Gly Val Asn Leu Asp Leu Leu Pro Leu Gly

65                  70                  75                  80

tac cat ctt ccc aat gtt tcc ctg act ttc cag gca tgg cat cac ctc  288

Tyr His Leu Pro Asn Val Ser Leu Thr Phe Gln Ala Trp His His Leu

                85                  90                  95

tct gac tct gag aga ctc tgc ttc ctc gct acc aca ctt cgg ccc ttc  336

Ser Asp Ser Glu Arg Leu Cys Phe Leu Ala Thr Thr Leu Arg Pro Phe

            100                 105                 110

cct gcc atg ctg gga ggg ctg ggg acc cag ggg acc tgg acc agc tca  384

Pro Ala Met Leu Gly Gly Leu Gly Thr Gln Gly Thr Trp Thr Ser Ser

        115                 120                 125

gag agg gag cag ctg tgg gcc atg agg ctg gat ctc cgg gac ctg cac  432

Glu Arg Glu Gln Leu Trp Ala Met Arg Leu Asp Leu Arg Asp Leu His

    130                 135                 140

agg cac ctc cgc ttt cag gtg ctg gct gca gga ttc aaa tgt tca aag  480

Arg His Leu Arg Phe Gln Val Leu Ala Ala Gly Phe Lys Cys Ser Lys

145                 150                 155                 160

gag gag gag gac aag gag gaa gag gaa gag gag gaa gaa gaa gaa aag  528

Glu Glu Glu Asp Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys

                165                 170                 175

aag ctg ccc cta ggg gct ctg ggt ggc ccc aat cag gtg tca tcc caa  570

Lys Leu Pro Leu Gly Ala Leu Gly Gly Pro Asn Gln Val Ser Ser Gln

            180                 185                 190

gtg tcc tgg ccc cag ctg ctc tat acc tac cag ctc ctt cac tcc ctg  624

Val Ser Trp Pro Gln Leu Leu Tyr Thr Tyr Gln Leu Leu His Ser Leu

        195                 200                 205

gag ctt gtc ctg tct cgg gct gtt cgg gac ctg ctg ctg ctg tcc ctg  672

Glu Leu Val Leu Ser Arg Ala Val Arg Asp Leu Leu Leu Leu Ser Leu

    210                 215                 220

ccc agg cgc cca ggc tca gcc tgg gat tcc taa                      705

Pro Arg Arg Pro Gly Ser Ala Trp Asp Ser^***

225                 230

<210>3

<211>687

<212>DNA

<213>Mouse

atg tcc aag ctg ctc ttc ctg tca ctt gcc ctc tgg gcc agc cgc tcc  48

Met Ser Lys Leu Leu Phe Leu Ser Leu Ala Leu Trp Ala Ser Arg Ser

                5                10                   15

cct ggt tac act gaa aca gct ctc gtg gct cta agc cag ccc aga gtg  96

Pro Gly Tyr Thr Glu Thr Ala Leu Val Ala Leu Ser Gln Pro Arg Val

            20                  25                  30

caa tgc cat gct tct cgg tat ccc gtg gcc gtg gac tgc tcc tgg act  144

Gln Cys His Ala Ser Arg Tyr Pro Val Ala Val Asp Cys Ser Trp Thr

        35                  40                  45

cct ctc cag gct ccc aac tcc acc aga tcc acg tcc ttc att gcc act  192

Pro Leu Gln Ala Pro Asn Ser Thr Arg Ser Thr Ser Phe Ile Ala Thr

    50                  55                  60

tac agg ctc ggt gtg gcc acc cag cag cag agc cag ccc tgc cta caa  240

Tyr Arg Leu Gly Val Ala Thr Gln Gln Gln Ser Gln Pro Cys Leu Gln

65                  70                  75                  80

cgg agc ccc cag gcc tcc cga tgc acc atc ccc gac gtg cac ctg ttc  288

Arg Ser Pro Gln Ala Ser Arg Cys Thr Ile Pro Asp Val His Leu Phe

                85                  90                  95

tcc acg gtg ccc tac atg cta aat gtc act gca gtg cac cca ggc ggc  336

Ser Thr Val Pro Tyr Met Leu Asn Val Thr Ala Val His Pro Gly Gly

            100                 105                 110

gcc agc agc agc ctc cta gcc ttt gtg gct gag cga atc atc aag ccg  384

Ala Ser Ser Ser Leu Leu Ala Phe Val Ala Glu Arg Ile Ile Lys Pro

        115                 120                 125

gac cct ccg gaa ggc gtg cgc ctg cgc aca gcg gga cag cgc ctg cag  432

Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu Arg Thr Ala Gly Gln Arg Leu Gln

    130                 135                 140

gtg ctc tgg cat ccc cct gct tcc tgg ccc ttc ccg gac atc ttc tct  480

Val Leu Trp His Pro Pro Ala Ser Trp Pro Phe Pro Asp Ile Phe Ser

145                 150                 155                 160

ctc aag tac cga ctc cgc tac cgg cgc cga gga gcc tct cac ttc cgc  528

Leu Lys Tyr Arg Leu Arg Tyr Arg Arg Arg Gly Ala Ser His Phe Arg

                165                 170                 175

cag gtg gga ccc att gaa gcc acg act ttc acc ctc agg aac tcg aaa  570

Gln Val Gly Pro Ile Glu Ala Thr Thr Phe Thr Leu Arg Asn Ser Lys

            180                 185                 190

ccc cat gcc aag tat tgc atc cag gtg tca gct cag gac ctc aca gat  624

Pro His Ala Lys Tyr Cys Ile Gln Val Ser Ala Gln Asp Leu Thr Asp

        195                 200                 205

tat ggg aaa cca agt gac tgg agc ctc cct ggg caa gta gaa agt gca  672

Tyr Gly Lys Pro Ser Asp Trp Ser Leu Pro Gly Gln Val Glu Ser Ala

    210                 215                 220

ccc cat aag ccc tga                                              687

Pro His Lys Pro^***

225

Claims (7)

1.一种含p28分子或其基因的医药制剂，其特征是以p28分子或基因为有效成分。

2.根据权利要求1所述的医药制剂，其特征为所述p28分子是由序列表1所示的第29至243氨基酸序列构成的p28分子、或者是在序列表1所列氨基酸序列的第29至243氨基酸序列基础上，缺失、置换和/或添加数个氨基酸残基而产生的、具有与p28分子相同功能的蛋白质。

3.根据权利要求1所述的医药制剂，其特征为所述的p28分子的编码基因是：编码含有序列表1所示的第29至243氨基酸序列的蛋白质的基因，或者是编码具有与p28分子相同功能的、在序列表1第29至243氨基酸基础上缺失、置换和/或添加数个氨基酸残基而产生的蛋白质的基因。

4.根据权利要求1所述的医药制剂，其特征为所述的编码p28分子的编码基因是：具有序列表1所示的第85至732的碱基序列的基因，或者在严格杂交条件下，与序列表1所述第85至732的碱基序列互补的基因进行分子杂交而获得的、所编码分子与p40分子具有同样功能的编码基因。

5.根据权利要求1至4中任一项权利要求所述的医药制剂，其特征是编码p28分子的基因是以可表达和可分泌的形式构建到病毒或者非病毒载体中的。

6.根据权利要求5所述的医药制剂，其特征是所述病毒或者非病毒载体是导入到细胞中的。

7.根据权利要求1到6所述的任一医药制剂，在制备预防或者治疗由IL-27引起的免疫应答异常所致的免疫性疾病、抑制对移植器官的排异反应、或对抗IL-27引起的对免疫应答的抑制作用的药物中的用途。

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