CN101096384A - 一种抗肿瘤融合蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种抗肿瘤融合蛋白的制备方法及其应用，涉及一种融合蛋白。根据ProTα的基因序列，设计上下游引物P1和P2，P1引入BamHI酶切位点，P2引入EcoRI酶切位点。用RT-PCR方法得前胸腺素α原全长基因cDNA，PCR产物纯化后与pMD18-T Vector连接，转化DH5α感受态细胞，对7个单克隆基因序列和参考的proTα的基因序列比对。用EcoRI和BamHI双酶切ProTα PCR产物，将ProTα基因片断插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX 6P-1中，转化大肠杆菌BL21，加入IPTG，诱导表达，菌液离心后的沉淀用上样缓冲液溶解，离心取上清电泳，得GST-Proα融合蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白，尤其是涉及一种抗肿瘤及瘤苗免疫佐剂功能融合蛋白的制备方法及应用。
背景技术
1984年，Haritos等从大鼠胸腺分离出一种含有111个氨基酸残基的多肽，其N端含已发现的所有胸腺素α原家族成员的序列，因此命名为胸腺素α原，人ProTα由109个氨基酸残基组成，与大鼠ProTα的序列相比，有6个位点的差异，包括4个位点的替代和2个位点的缺失(1、Haritos AA，Goodall GJ，Horecker BL，Prothymosin alpha：isolation and propertiesof the major immunoreactive form of thymosin alphal in rat thymus.Proc Natl Acad Sci USA，1984，81：1008；2、Haritos AA.Alpha-thymosins：relationships in structure，distribution，andfunction.Isozymes Curr Top Biol Med Res 1987；14：123-152；3、Goodall GJ，Dominguez F，Horecker BL.Molecular cloning of cDNA for human prothymosin alpha.Proc Natl Acad Sci USA 1986；83(23)：8926-8928；4、Pan LX，Haritos AA，Wideman J，Komiyama T，Chang M，Stein S eta1.Human prothymosin alpha：amino acid sequence and immunologic properties.Arch BiochemBiophys 1986；250(1)：197-201。)。
1985年，Haritos等(Komiyama T，Pan LX，Haritos AA，et al.The primary structure of ratparathymosin.ProcNatl Acad Sci USA 1986；83(5)：1242-1245。)发现大鼠ProTA能增强小鼠抗白色念珠菌(Candida albicans)感染的能力，1986年Pan又发现ProTα能刺激转移抑制因子(MIF)的释放，其作用比Tα1强10～20倍(1、Haritos AA，r.Blacher，S.Stein，J..Horecker.Parathymosin alpha：a peptide from rat tissues with structural homology to prothymosinalpha.Proc Natl Acad Sci USA，82：1050-1053；2、Pan LX，Haritos AA，Wideman J，et al.Humanprothymosin alpha：amino acid sequence and immunologic properties.Arch Biochem Biophys1986；250(1)：197-201)，1987年，Sαlvin等发现腹腔注射ProTα能增强RF/J小鼠产生抗体的能力，锌能加强这种作用，能使青年大鼠和老年大鼠的细胞免疫和体液免疫都增强(1、Salvin SB，Horecker BL，Pan LX，Rabin BS.The effect of dietary zinc and prothymosin alpha oncellular immune responses of RF/J mice.Clin Immunol Immunopathol 1987；43(3)：281-288。)。Papanastasiou(Papanastasiou M，Baxevanis CN，Papamichail M.Promotion of murineantitumor activity by prothymosin alpha treatment：I.Induction of tumoricidal peritoneal cellsproducing high levels of tumour necrosis factor alpha.Cancer Immunol Immunother 1992；35(2)：145-150。)发现，CBA/2小鼠如果腹腔接种肿瘤细胞，一般8-12d之内产生腹水，10-14d后死亡，20％的经过ProTα处理的小鼠不产生腹水，并能够使不产生腹水中的40％-60％的小鼠寿命可以延长到70d。当腹腔注射ProTα时，能够增强巨噬细胞、提高NK，LAK细胞的活性(1、Lopez-Rodriguez JL，Cordero OJ，Sarandeses C，.Interleukin-2 killer cells：invitro evaluation of combination with prothymosin alpha.Lymphokine Cytokine Res 1994；13(3)：175-182；2、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Dedoussis GV，.Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha.Cancer Immunol Immunother 1994；38(4)：281-286)；增强MHC限制的细胞免疫(1、Baxevanis CN，Thanos D，Reclos GJ，J et al.Prothymosin alpha enhances human and murine MHC class II surface antigen expression andmessenger RNA accumulation.J Immunol 1992；148(7)：1979-1984；2、Baxevanis CN，Thanos D，Reclos GJ，et al.Prothymosin alpha enhances human and murine MHC class II surface antigenexpression and messenger RNA accumulation.J Immunol 1992；148(7)：1979-1984。)，抑制系统性红斑狼疮(Baxevanis CN，Reclos CJ，Papamichail M et al.Prothymosin alpha restores thedepressed autologous and allogenic mixed lymphocyte responses in patient with systemic lupuserythematosus.Immuopharmaco immunotoxico，1987，9：429。)，促进IL-2，MIF的分泌和TN F-α，IFN-γ的合成；促进IL-2受体的表达(1、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Spanakos G，.Induction of tumor-specific T lymphocyte responses in vivo by prothymosin alpha.CancerImmunol Immunother 1995；40(6)：410-418；2、Lopez-Rodriguez JL，Cordero OJ，Sarandeses C，.Interleukin-2 killer cells：in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha.LymphokineCytokine Res 1994；13(3)：175-182；3、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Dedoussis GV，.Induction oflymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha.Cancer Immunol Immunother1994；38(4)：281-286；4、Voutsas IF，Baxevanis CN，Gritzapis AD，et al.Synergy betweeninterleukin-2 and prothymosin alpha for the increased generation of cytotoxic T lymphocytesagainst autologous human carcinomas.Cancer Immunol Immunother 2000；49(8)：449-458；5、Cordero OJ，Sarandeses CS，Lopez JL，et al.Prothymosin alpha enhances IL-2 receptor expressionin norma human T-lymphoctyes.Int J Immunpharmacol，1991，13：1059。)，从而产生非特异性肿瘤杀伤作用，同时，诱导肿瘤特异性细胞毒T细胞(CD8+)和辅助性T细胞(CD4+)的特异性抗肿瘤作用。ProTα在疾病早期可以刺激淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokien activatedkiller cells，LAK)活性，它是通过增加淋巴细胞与靶细胞的结合进而增加IFN-γ和IL-2的分泌来实现的(1、Lopez-Rodriguez JL，Cordero OJ，Sarandeses C，.Interleukin-2 killer cells：invitro evaluation of combination with prothymosin alpha.Lymphokine Cytokine Res 1994；13(3)：175-182；2、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Dedoussis GV，.Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha.Cancer Immunol Immunother 1994；38(4)：281-286)。单独使用ProTα时可以刺激TNF-α和IL-2的分泌，如果与IL-2联合使用时，可增加NK细胞CD56，CD16/56和CD25及CD18/11黏附分子的表达。在IFN-γ存在的条件下，ProTα主要通过增加CD54(细胞黏附分子配体)的表达，刺激单核细胞与集结的肿瘤细胞的结合，达到清除肿瘤细胞的目的(1、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Spanakos G，.Induction of tumor-specific T lymphocyte responses in vivo by prothymosin alpha.CancerImmunol Immunother 1995；40(6)：410-418；2、Lopez-Rodriguez JL，Cordero OJ，Sarandeses C，.Interleukin-2 killer cells：in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha.LymphokineCytokine Res 1994；13(3)：175-182；3、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Dedoussis GV，.Induction oflymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha.Cancer Immunol Immunother1994；38(4)：281-286；4、Voutsas IF，Baxevanis CN，Gritzapis AD，et al.Synergy betweeninterleukin-2 and prothymosin alpha for the increased generation of cytotoxic T lymphocytesagainst autologous human carcinomas.Cancer Immunol Immunother 2000，49(8)：449-458。)。近来研究表明，ProTα在DNA疫苗中还可以起到疫苗佐剂的效果(1、Jin Y，Cao C，Li P，Liu X，Huang W，Li C et al.Boosting immune response to hepatitis B DNA vaccine by coadministrationof Prothymosin alpha-expressing plasmid.Clin Diagn Lab Immunol 2005；12(12)：1364-1369；2、Shiau AL，Chen CC，Yo YT，Chu CY，Wang SY，Wu CL.Enhancement of humoral and cellularimmune responses by an oral Salmonella choleraesuis vaccine expressing porcine prothymosinalpha.Vaccine 2005；23(48-49)：5563-5571)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗肿瘤及瘤苗免疫佐剂功能融合蛋白的制备方法及其应用。本发明从中国人外周血中所克隆到的胸腺素原α基因及其蛋白原核表达，为今后研制和开发新的基因工程抗肿瘤药物及应用于肿瘤疫苗佐剂奠定基础。
本发明所述的一种抗肿瘤融合蛋白的制备方法包括以下步骤：
1)根据ProTα的基因序列，设计上游引物P1和下游引物P2，上游引物P1和下游引物P2分别为：
上游引物P1：5’GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’，
下游引物P2：5’-GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’，
将上游引物P1引入BamHI酶切位点，将下游引物P2引入EcoR I酶切位点。
2)采用RT-PCR方法获得前胸腺素α原全长基因cDNA，将PCR产物纯化后与pMD18-TVector连接，重组载体命名为TP，转化DH5α感受态细胞，将鉴定的阳性菌液测序。
3)采用生物学软件DNAman对7个单克隆基因序列和参考的proTα的基因序列进行比对。
4)用EcoRI和BamHI双酶切ProTαPCR产物，将ProTα基因片断插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX 6P-1中，命名为PP，转化大肠杆菌BL21，LB培养基，37℃培养，加入IPTG，37℃诱导表达，菌液离心后的沉淀用上样缓冲液溶解，沸水浴后离心取上清，进行SDS-PAGE电泳，获得GST-Proα融合蛋白。
5)将4经过转化的转基因BL21菌株超声破碎后，离心所获得的上清中含有可溶性的融合蛋白GST-Proα。
6)将上清经过GST亲和层析柱分离纯化获得高纯度的GST-Proα融合蛋白。
上游引物P1和下游引物P2由上海生工公司合成。将鉴定的阳性菌液可送至上海博亚生物公司测序。
在步骤4)中，37℃培养至OD500nm为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达5h，菌液离心后的沉淀用等体积的上样缓冲液溶解，沸水浴中10min后离心取上清，进行SDS-PAGE电泳。
本发明所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物及其瘤苗免疫佐剂中的应用。
体内实验证明具有增加胸腺指数能力。但在增加胸腺指数方面对于老龄老鼠效果更明显。对于脾脏指数没有发现有统计学上的差异。
在体内抗肿瘤活性检测中，选择6～8周龄，体重在18～22g的昆明小鼠进行实验，通过腹腔注射重组融合蛋白，可显著提高小鼠生存时间和存活率，同时在10μg/只可以达到所有实验小鼠完全存活的效果。在皮下注射S180肿瘤细胞观察重组蛋白对抑瘤率的效果中发现，单独使用重组蛋白，10μg/只的剂量可以达到50％以上的抑瘤率，如果在期间注射重组蛋白的同时注射S180细胞抗原，则抑瘤率可以达到80％以上。说明该蛋白具有良好的佐剂功能。
胸腺是人体免疫中枢，青年时最发达，但随着年龄的增加，胸腺逐渐萎缩，因而人的免疫功能逐渐减弱，临床上有采用注射胸腺因子来提高病人的免疫功能，其中目前常用的是从动物胸腺中提取的胸腺肽，胸腺肽成分复杂，质量不稳定，因此寻找作用稳定，成分单一的有效胸腺因子作为临床应用是目前的重要热点，目前临床上已经应用的单一组份是合成的胸腺素α1(商品名日达仙，1.6mg 800人民币，意大利进口)，价格昂贵，本发明采用基因工程手段表达前胸腺素原蛋白，纯度高，成分一致，并且经过实验效果显著，同时适合于大规模产业化生产。由此可见，本发明所述的融合蛋白可以单独使用，也可以与其他抗原，尤其是瘤细胞抗原一起使用，达到有效控制肿瘤细胞增长，延长机体寿命的功效。
附图说明
图1为中国人外周血淋巴总RNA电泳图。在图1中，5S，18S，28S代表不同沉降系数的RNA。
图2为本发明实施例检测RT-PCR获得的产物。在图2中，2000bp，1000bp，750bp，500bp，300bp，250bp，100bp分别代表DNA大小，M代表标准DNA。
图3为ProTα的PCR扩增结果。在图3中，1为PCR产物，M代表标准DNA。
图4为质粒PUCT-α限制性酶切分析。在图4中，1：PUCT-α/BamHI+EcoRI双酶切结果(2.6Kb，300bp)；M：标准DNA DL2000(bp)；2：pMD18-T-Vector质粒。
图5为质粒pGEX-ProTα的PCR鉴定结果。在图5中，1、2：PCR产物(300bp)，3：阴性对照，M：M代表标准DNA，DL2000(bp)。
图6为质粒pGEX-α限制性酶切分析。在图6中，1、2：pGEX-α/BamHI+EcoRI(4.9kb，300bp)，M代表标准DNA，DL2000(bp)。
图7为表达载体pGEX-α构建流程图。在图7中，将proT基因克隆到质粒pUCT载体中，并用EcoRI和BamHI双酶切，同时用与之相同的两种酶双酶切载体pEGX6p-1，在T4连接酶作用下连接构建成表达载体，连接产物在Amp+抗性板筛选阳性克隆子。EcoRI，BamHI，XhoI，NotI，SmaI，SalI等代表多克隆酶切位点。
图8为融合蛋白表达SDS-PAGE。在图8中，1.沉淀；2.上清；3.全蛋白；4诱导前对照；5.空载体诱导后；6.空载体诱导前；M蛋白标准；116KDa，66.2KDa，45.0KDa，37KDa，35.0KDa，26KDa，25.0KDa，18.8KDa，14.4KDa分别代表不同分子量大小标准蛋白。
图9为融合蛋白表达纯化的SDS-PAGE分析。在图9中，1和3为纯化的蛋白；2为空载体诱导前；4为重组载体诱导后上清；97.2，66.4，44.3，35，25代表不同分子量大小标准蛋白。
图10为Western blot分析(一抗采用兔抗ProTα)。在图10中，M：小分子量蛋白Maker，1：转化菌株诱导后蛋白；2：纯化后蛋白；3，4分别为阳性和阴性血清杂交结果；97.2，66.4，44.3，35，25代表不同分子量大小标准蛋白。
图11为纯化蛋白Western-blot分析(一抗采用兔抗Tα1)。在图11中，M.分子量标准；1.纯化蛋白；2纯化蛋白杂交(一抗为兔抗thymosinα1)，175kDa，83kDa，62kDa，47.5kDa，32.5kDa，25.0kDa，16.5kDa，6.5kDa代表不同分子量大小标准蛋白。
图12为ProTα单独使用抗肿瘤活性照片。在图12中，(a)：500μg/kg；(b)50μg/kg；(c)5μg/kg；(d)0.5μg/kg；(e)对照组；(f)对照组；(g)S180再次攻击(用药组)。
图13为ProTα联合S180抗原一起使用时抗肿瘤活性照片。在图13中，(a)用药组接种S180(第15d)；(b)对照组接种S180(第15d)；(c)用药组接种S180(第30d)；(d)对照组接种S180(第25d)；(e)用药组接种S180(第30d)；(f)对照组接种S180(第25d)。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。实施例采用的材料与方法说明如下。
1.实验取材和主要分子生物试剂
试验动物：昆明种小鼠，(20±2)g，6-7周龄，雌性，厦门大学医学院实验动物中心提供，合格证号0501452；S180肿瘤种鼠由厦门大学医学院实验动物中心提供。
正常成人外周血：来自厦门大学医院体检健康成年人，由厦门大学医院提供。淋巴细胞分离液购自厦门泰京技术有限公司，TRIZOL Reagent试剂盒为Invitrogen公司产品，MMLV第一链cDNA合成试剂盒购自上海生工公司，pMD18-T Vector试剂盒、T4 DNA连接酶、DNA标准分子量和Taq DNA聚合酶为TakaRa公司产品，pGEX 6P-1表达载体，大肠杆菌DH5α及BL21均为本实验室保存。
本发明实施例的健康中国人cDNA序列如下。
ATG TCA GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC GAG GAC TTA AAG GAG AAGAAG GGA GTT GTG GAA GAG GCG GAA AAT GGA AGA GAC GCC CCT GCT CAC GGG AAT GCT AAT GAGGAA AAT GGG GAG CCG GAG GCT GAC AAC GAG GTA GAT GAA GAA GAG GAA GAA GGT GGG GAG GAAGAA GGT GAT GGT GAG GAA GAG GAT GGA GAT GAA GAT GAG GGA GCT GAG TCA GCT ACG GGC AAGCGG GCA GCT GAA GAT GAT GAG GAT AAC GAT GTC GAT ACC CAG AAG CAG AAG ACC GAC GAG GATGAC TAG
2.引物的设计与合成
根据ProTα的基因序列，设计上游引物P1：5’-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’引入BamHI酶切位点，下游引物P2：5′GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’引入EcoR I酶切位点。引物由上海生工公司合成。
3.中国人外周血中ProTα基因的RT-PCR扩增
按照参考文献的方法(郭葆玉，余建国，张淑英，等.克隆人胸腺素原αcDNA及RNA二级结构分析和带Xa因子的融合表达[J].第二军医大学学报，2000，21(1)：34-37.)及TRIZOL Reagent试剂盒上的说明，常规分离中国人正常成人外周血PBMC，提取总RNA，紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测。以总RNA为模板按照MMLV第一链cDNA合成试剂盒上的说明进行逆转录反应。PCR反应体系100μl∶10μl逆转录产物，引物P1、P2各50pmol，4种dN TP各0.4mmol/L、Taq DNA酶5U。扩增条件：94℃变性5min，94℃45s、60℃45s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸8min(见图1和2)。
4.PCR产物克隆鉴定与测序
按常规方法将PCR产物纯化后与pMD18-T Vector连接，重组载体命名为TP，转化DH5α感受态细胞，挑取7个单克隆37℃，LB培养基分别培养，用设计的引物进行PCR扩增鉴定重组菌。将鉴定的阳性菌液送至上海博亚生物公司测序。
5.表达载体的构建及原核表达
用EcoRI和BamHI双酶切ProTαPCR产物，将该基因片断插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX 6P-1中，命名为PP，转化大肠杆菌BL21，LB培养基，37℃培养至OD500nm为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达5h，菌液离心后沉淀用等体积的上样缓冲液溶解，沸水浴中10min，离心取上清，进行SDS-PAGE电泳(参见图3和4)。
6.表达产物纯化
超声破碎菌体，15000g，10min离心取上清，ProTα-GST融合蛋白的纯化：Glutathione Sepharose 4B预处理：根据谷胱甘肽-琼脂糖4B(Glutathione SepharoseTM4B)操作说明书，按下列程序纯化GST融合蛋白：因每升细菌培养物约需谷胱甘肽-琼脂糖4B 0.5ml，故按0.5ml柱床体积进行(参见图5)。
1)将谷胱甘肽-琼脂糖4B基质转移至一次性的小柱子；
2)轻扣小柱以去除气泡，然后让谷胱甘肽-琼脂糖4B基质着床；
3)移取底盖，让柱子滴干；
4)加入10倍床体积的1×PBS洗涤，让柱子滴干，重复2次；
5)在基质中每次加入100μl GSTreduction elution buffer洗脱GST融合蛋白，共洗脱4次；
6)收集洗脱液，每次各取5μl用于SDS-PAGE分析，SDS-PAGE参照《分子克隆手册》进行，分离胶和浓缩胶浓度分别为12％和5％；
7)将蛋白置于-20℃保存。
7.重组人前胸腺素α原对肿瘤细胞S180的抑制活性实验
肿瘤抑制率实验按如下方法进行：
重组人前胸腺素α原融合蛋白抗小鼠肉瘤S180及免疫功能实验，选择腹腔接种S180后15d，生长状况良好的荷瘤鼠，从腹腔用一次性注射器无菌吸取腹水，以生理盐水稀释细胞，洗涤2次，再用生理盐水稀释细胞数为8×106个/ml，活细胞计数大于95％，取0.2ml瘤细胞悬液接种于小鼠右腋皮下。于接种次日随机分成5组，每组10只，称重开始给样。设计6组试验，其中一组为对照组，每组为10只小鼠，首先皮下注射S180细胞1*105个/只老鼠，7d后肿瘤长出，对照组注射PBS缓冲液，其余5组分别开始注射胸腺素原(按此剂量0.05，0.5，5，50，500μg/kg)连续注射7d，之后解剖小鼠测肿瘤重，胸腺重，脾脏重。
另设两个对照组，一组为肿瘤模型对照组(Tumour control)；另一组为药物对照组(Medicament control)。该两组每天分别腹腔注射生理盐水和环磷酰胺(CPA，剂量为15mg/kg·d)0.5ml。连续腹腔注射20d后，称取体重断颈处死小鼠，称取瘤结以及荷瘤小鼠胸腺、脾脏重量，进行影响效果分析。
以下给出融合蛋白生物活性的评价指标，评价指标为抑瘤率，可按下列公式计算：
抑瘤率＝(C-T)/C×100％
式中：C为对照组平均瘤重(mg)，T为实验组平均瘤重(mg)。
脏器指数按下列公式计算：
脏器指数＝内脏各器官重量(mg)/终体重(g)。
8.重组蛋白ProTα与肿瘤细胞抗原一起联合使用观察抑制S180效果
实验步骤如前，但在皮下注射重组蛋白ProTα时同时注射S180细胞经过蛋白提取试剂盒提取的抗原，抗原总共注射3次，每次间隔7d。抑瘤率和体重变化与前步骤相同。
9.延长荷瘤小鼠寿命实验
选择腹腔接种S180后15d，生长状况良好的荷瘤鼠，从腹腔用一次性注射器无菌吸取腹水，以生理盐水稀释细胞，洗涤2次，再用生理盐水稀释细胞数为8×106个/ml，活细胞计数大于95％，取0.2ml瘤细胞悬液接种于小鼠腹腔。于接种第6日随机分成6组，每组10只，称重开始给样。用药剂量组分别为0.05，0.5，5，50，500μg/kg。，此四组每天每鼠腹腔注射重组人前胸腺素α原融合蛋白0.5ml/次。
另设两个对照组，一组为肿瘤模型对照组(Tumour control)；另一组为药物对照组(Medicament control)。该两组每天分别腹腔注射生理盐水和环磷酰胺(CPA，剂量为15mg/kgd)0.5ml。连续腹腔注射30d，每天观察小鼠生活状态，取食情况，每隔5d称重，连续观察60d，计算死亡率，用药组延长小鼠寿命程度，存活时间超过60d作为完全存活标准，计算完全存活率。用药组对再次接种S180的抵抗力实验：将生存下来的用药(注射重组ProTα)小鼠每组取5只，选择相同年龄和体重的雄性健康小鼠做对照，腹腔接种与前述相同数量的S180细胞，观察用药组和对照组小鼠生存情况。
本实验所有数据通过SPSS(version11.0，SPSS)软件进行分析处理。
本发明成功地采用基因工程的方法从经过体检健康的成年人外周血淋巴细胞中获得前胸腺素原cDNA，并经过重组技术在原核细胞中以可溶性形式得到高效表达，表达量占细菌总蛋白的28％。采用生物学软件DNAman对7个单克隆基因序列和参考的proTα的基因序列进行比对，该cDNA序列与已报道的AF257099 ProTα序列存在3个碱基的差异，但是与1984年首次从胸腺中克隆到的基因序列只有84％的同源性。
重组胸腺素α原融合蛋白抑制S180生长效果见表1。
表1
| 组 | n | 初始体重 | 结束体重 | 肿瘤重(g) | 胸腺指数 | 抑瘤率(％) |
| 对照组 | 10 | 19.28±0.82 | 28.50±3.52 | 3.69±2.17 | 2.56±0.53 | |
| CPA(15mg/kg) | 10 | 19.12±0.76 | 28.30±4.44 | 1.74±0.75 | 1.85±0.62 | 45.4 |
| 500μg/kg | 10 | 19.39±1.00 | 31.55±3.64 | 1.57±1.14 | 3.58±0.60ab | 57.45 |
| 50μg/kg | 10 | 20.16±1.25 | 32.19±2.53 | 1.83±0.65 | 3.14±0.86ab | 50.41 |
| 5μg/kg | 10 | 19.64±0.97 | 28.44±4.66 | 2.44±1.88 | 2.89±0.65b | 33.88 |
| 0.5μg/kg | 10 | 19.93±1.29 | 27.39±3.60 | 2.55±1.70 | 2.70±0.91b | 30.89 |
| 0.05μg/kg | 10 | 19.39±1.00 | 31.55±3.64 | 2.65±1.57 | 2.57±0.47b | 28.18 |
3次实验结果，x±s，n＝10。
重组胸腺素α原融合蛋白联合瘤细胞抗原一起抑制S180生长见表2，抑瘤率明显比单独用重组胸腺素α原融合蛋白效果好，说明重组胸腺素α原融合蛋白具有免疫佐剂的效果。
表2
| 组 | n | 初始体重 | 结束体重 | 肿瘤重(g) | 抑瘤率(％) |
| 对照组 | 10 | 21.18±0.92 | 39.50±3.52 | 4.69±2.17 | |
| CPA(15mg/kg) | 10 | 20.22±0.86 | 28.30±4.44 | 2.62±0.80 | 44.2 |
| 500μg/kg | 10 | 21.26±1.20 | 30.55±3.64 | 1.02±0.75 | 79.36 |
| 50μg/kg | 10 | 20.15±1.35 | 31.20±2.67 | 1.99±0.78 | 58.57 |
| 5μg/kg | 10 | 22.54±1.67 | 29.54±3.67 | 2.38±1.96 | 49.26 |
| 0.5μg/kg | 10 | 21.53±1.39 | 28.38±2.65 | 2.87±1.90 | 38.81 |
| 0.05μg/kg | 10 | 20.39±1.30 | 32.64±3.52 | 3.55±1.87 | 24.31 |
x±s，n＝10
重组胸腺素α原融合蛋白对荷瘤小鼠生存时间的影响见表3。
表3
| 组别 | n | 初始体重 | 结束体重 | 死亡老鼠数量 | 死亡老鼠寿命(d) | 超过60d存活期老鼠数量(只) |
| 对照组 | 30 | 19.56±0.75 | 55.20±6.23 | 29 | 23.66 | 1 |
| CPA(15mg/kg) | 30 | 20.11±1.05 | 48.50±5.20 | 28 | 29.5 | 2 |
| 500μg/kg | 30 | 19.69±0.98 | 31.20±3.12 | 1 | 28 | 29 |
| 50μg/kg | 30 | 19.98±1.12 | 34.10±2.50 | 4 | 28 | 26 |
| 5μg/kg | 30 | 19.65±1.20 | 36.25±3.05 | 4 | 27 | 26 |
| 0.5μg/kg | 30 | 20.12±1.30 | 37.65±2.55 | 6 | 25 | 24 |
3次实验结果，x±s，n＝10。
用药组小鼠对再次接种S180的抵抗效果见表4。
表4
| 组别 | n | 死亡老鼠数量 | 超过60d存活期老鼠数量(只) |
| 对照组 | 5 | 5 | 0 |
| 500μg/kg | 5 | 0 | 5 |
| 50μg/kg | 5 | 0 | 5 |
| 5μg/kg | 5 | 0 | 5 |
| 0.5μg/kg | 5 | 1 | 4 |
健康中国人cDNA序列
ATG TCA GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC GAG GAC TTA AAG GAG AAGAAG GGA GTT GTG GAA GAG GCG GAA AAT GGA AGA GAC GCC CCT GCT CAC GGG AAT GCT AAT GAGGAA AAT GGG GAG CCG GAG GCT GAC AAC GAG GTA GAT GAA GAA GAG GAA GAA GGT GGG GAG GAAGAA GGT GAT GGT GAG GAA GAG GAT GGA GAT GAA GAT GAG GGA GCT GAG TCA GCT ACG GGC AAGCGG GCA GCT GAA GAT GAT GAG GAT AAC GAT GTC GAT ACC CAG AAG CAG AAG ACC GAC GAG GATGAC TAG
上游引物P1：5’-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’，
下游引物P2：5’-GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’。
Claims (5)
1.一种抗肿瘤融合蛋白的制备方法，其特征在于其包括以下步骤：
1)根据ProTα的基因序列，设计上游引物P1和下游引物P2，上游引物P1和下游引物P2分别为：
上游引物P1：5’-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’，
下游引物P2：5’-GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’，
将上游引物P1引入BamHI酶切位点，将下游引物P2引入EcoRI酶切位点；
2)采用RT-PCR方法获得前胸腺素α原全长基因cDNA，将PCR产物纯化后与pMD18-TVector连接，重组载体命名为TP，转化DH5α感受态细胞，将鉴定的阳性菌液测序；
3)采用生物学软件DNAman对7个单克隆基因序列和参考的proTα的基因序列进行比对；
4)用EcoRI和BamHI双酶切ProTαPCR产物，将ProTα基因片断插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX 6P-1中，命名为PP，转化大肠杆菌BL21，LB培养基，37℃培养，加入IPTG，37℃诱导表达，菌液离心后的沉淀用上样缓冲液溶解，沸水浴后离心取上清，进行SDS-PAGE电泳，获得GST-Proα融合蛋白；
5)将4经过转化的转基因BL21菌株超声破碎后，离心所获得的上清中含有可溶性的融合蛋白GST-Proα；
6)将上清经过GST亲和层析柱分离纯化获得高纯度的GST-Proα融合蛋白。
2.如权利要求1所述的一种抗肿瘤融合蛋白的制备方法，其特征在于在步骤4)中，37℃培养至OD500nm为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达5h。
3.如权利要求1所述的一种抗肿瘤融合蛋白的制备方法，其特征在于在步骤4)中，菌液离心后的沉淀用等体积的上样缓冲液溶解，沸水浴中10min后离心取上清，进行SDS-PAGE电泳。
4.如权利要求1所述的一种融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求1所述的一种融合蛋白在制备瘤苗免疫佐剂中的应用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007100090830A CN101096384A (zh) | 2007-06-08 | 2007-06-08 | 一种抗肿瘤融合蛋白的制备方法及其应用 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101096384A true CN101096384A (zh) | 2008-01-02 |
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|---|---|
| CN (1) | CN101096384A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101428136B (zh) * | 2008-11-07 | 2011-03-23 | 厦门大学 | 一种重组蛋白在制备预防糖尿病口服药物中的应用 |
| CN101736008B (zh) * | 2008-11-13 | 2012-02-08 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种制备基因工程N-乙酰化胸腺素α1的方法 |
| CN102757503A (zh) * | 2011-04-28 | 2012-10-31 | 中国人民解放军第二军医大学 | 人前列腺凋亡反应蛋白4与凋亡素2配体融合蛋白的制法和用途 |
-
2007
- 2007-06-08 CN CNA2007100090830A patent/CN101096384A/zh active Pending
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