CN1276797A - 低毒性的人干扰素－α类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种通过在多肽序列的N末端部分进行特定的氨基酸取代从而降低干扰素－α的细胞毒性的方法。本发明还描述了具有低细胞毒性的人干扰素－α类似物,以及这些低毒性人干扰素－α类似物在治疗上的应用。

Description

低毒性的人干扰素-α类似物
本发明的领域
本发明涉及一种降低人干扰素-α毒性的方法、低毒性的人干扰素-α类似物以及这些类似物在治疗上的应用。参考文献
Ausubel，F.M.，等，现代分子生物学手册，John Wiley&Sons公司，Media，PA(1988)。
Benoit，P.等，免疫学杂志150(3)：707(1993)。
Bonnem，E.M.等，生物应答调节子杂志3：580(1984)。
Davis，G.L.等，新英格兰医学杂志321：1501(1989)
DeMaeyer，E.，等，干扰素和其它的调控细胞分裂素，John Wileyand Sons，New York(1988)
Dianzani，F.，干扰素研究专题，5/92：109(1992)
Dusheiko，G.M.，等，血液学期刊3(Supl.2)：S199(1986)
Eaton，M.A.W.等，美国专利第4,719,180号，1988年1月12日注册
Finter，N.B.，等，药物42(5)：749(1991)
Francis，M.L.，等，爱滋病研究和人反转录病毒，8(2)：199(1992)
Kashima，H.，等，喉镜98：334(1988)
Maniatis，T.，等，分子克隆实验指南，冷泉港实验室(1982)
Martin，E.W.，药物分配：药剂产品分配和阐述的实用指南(Hoover，J.E.，Ed.)第八版，Mack出版公司，Easton，PA.，(1976)
Oldlam，R.K.，医院实践20：71(1985)
Pearson，W.R.and Lipman，D.J.，美国科学院院报85：2444-2448(1988)
Pearson，W.R..，酶学方法183：63-98(1990)
Pontzer，C.H.，等，癌症研究51：5304(1991)
Quesada，J.R.，等，新英格兰医学杂志310：15(1984)
Yoshio，T.，等，美国专利4,849,350，1989年6月18日注册。本发明的背景
干扰素(IFNs)被分为两大类：I型干扰素，包括IFNα、IFNβ、IFNω(即众所周知的IFNαII)；II型干扰素，现在称为IFNγ(DeMaeyer等的综述，1988)。椐估计，在人中至少有17对IFNα非等位基因，2对IFNβ非等位基因和一个IFNγ基因。
已表明IFNα抑制多种细胞的增殖，尤其对血液恶性肿瘤譬如毛细胞性白血病十分有效(Quesada，等，1984)。而且，这些蛋白对多种恶性肿瘤的抑制活性，如：多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、轻度淋巴瘤、卡波氏肉瘤、慢性髓性白血病、肾细胞癌、泌尿膀胱癌以及卵巢癌(Bonnem，等，1984；Oldham，1985)。对于在某些自身免疫病和感染性疾病的发生中干扰素和干扰素受体所起的作用，也已有研究(Bonnem，等，1993)。
在治疗各种病毒性感染中，IFNα也发挥着重要作用(Finter，等，1991)。IFNα在针对人乳头瘤病毒感染、乙肝病毒和丙肝病毒感染(Finter，等1991；Kashima，等1988；Dushiko，等1986；Davis，等1989)的疾病中表现出生物活性。
但是显然，IFNα的毒性限制了其使用：在治疗癌症和病毒性疾病中产生了一系列副作用，如发热、打寒颤、厌食、消瘦以及乏力(Pontzer，等，1991；Oldham，1985)这些副作用常需要(I)降低干扰素的使用剂量，从而限制了干扰素的疗效，或(II)使病人无法使用干扰素。这些毒性大大降低了此类抗病毒和抗肿瘤蛋白在用于虚弱患者的疾病治疗作用。本发明概述
一方面，本发明包括了降低人IFNα(HuIFNα)毒性的方法。此方法包括在成熟的人IFNα的第19，20，22，24，和27位上取代一个或多个的氨基酸，将取代过的IFNα加入人单核细胞培养物中，从而明显降低对此细胞的特异毒性。在人成熟的IFNα的第1-27位的大多数氨基酸残基保持不变。
在一个实施方案中，此方法包括以非保守性的氨基酸取代第19，20，22，24和27位中一个或多个氨基酸。在不同的实施方案中，此取代还可包括，但不局限于：用III类氨基酸，尤其是Asp来取代第19位氨基酸；用IV类氨基酸，尤其是Arg来取代第20位氨基酸；用III类氨基酸，尤其是Asn来取代第22位氨基酸；用IV类氨基酸，尤其是His来取代第27位氨基酸；在另一个实施方案中，此取代还可包括用V类氨基酸，尤其是Leu来取代第24位氨基酸。
在另一个实施方案中，本方法包括用SEQ ID NO：2所定义的9-mer序列取代成熟的人IFNα第19-27位残基序列，尤其是，成熟的人IFNα第9-27位的残基序列为SEQ ID NO：1。9-mer的SEQ ID NO：2相应于成熟的绵羊IFNτ中第19-27位残基序列，并包括成熟的人IFNα中所不同的第19，20，22，24，27位的残基。在另一个实施方案中，本方法包括用SEQ ID NO：4所述的17-mer序列取代成熟的人IFNα的第11-27位残基序列，尤其是，成熟的人IFNα第11-27位残基序列为SEQ ID NO：3。17-mer SEQ ID NO：4相应于成熟的绵羊τ干扰素的第11-27位的残基序列并包括成熟的人IFNα中所不同的第11，13，14，16，19，20，22，24，27位的残基。在另一个实施方案中，本方法包括用SEQ ID NO：6所述的22-mer序列取代成熟的人IFNα6-27位残基序列，尤其是，成熟的人IFNα的第6-27位残基序列为SEQ IDNO：5。22-mer SEQ ID NO：6相应于成熟的绵羊IFNτ中第6-27位残基序列并包括成熟的人IFNα中所不同的第6，7，8，11，13，14，16，19，20，22，24，27位的残基。
在相关的方面，本发明包括一种降低人IFNα毒性的方法。此方法包括用氨基酸来取代一个或多个成熟的人IFNα19，20，22，24，和27位上的氨基酸，将经取代的IFNα加入人单核细胞培养物中后，可以明显降低对此细胞的特异毒性，而其中成熟的人IFNα的第28-166位氨基酸序列基本不变。在一个实施方案中，所说的取代是指用SEQID NO：8定义的27-mer序列取代人IFNα1-27位残基序列，尤其是指成熟的人IFNα1-27位残基序列为SEQ ID NO：7，27-merSEQ ID NO：8相应于成熟的绵羊IFNτ中1-27位残基序列并包括成熟的人IFNα中所不同的第2，4，5，6，7，8，11，13，14，16，19，20，22，24，27位的残基。
在另一个方面，本发明包括应用于治疗人疾病中的低毒性的人IFNα类似物。这种类似物含有成熟的人IFNα，其中的第19，20，22，24，27位上一个或多个位点的氨基酸被取代，而大多数1-27位上的氨基酸还是天然的IFNα的氨基酸残基。相对于天然的人IFNα，这种类似物具有能显著地降低其毒性的特性，这一点可通过它能提高单核细胞培养物的成活率的实验来证明。
在一个实施方案中，此类似物包括在第9，20，22，27位的一个或多个位点上非保守型氨基酸的取代。在不同的实施方案中，这些被取代的氨基酸可以包括，但不局限于：用III类氨基酸，尤其是Asp来取代第19位氨基酸；用IV类氨基酸，尤其是Arg来取代第20位氨基酸；用III类氨基酸，尤其是Asn来取代第22位氨基酸；用IV类氨基酸，尤其是His来取代第27位氨基酸；在另一个实施方案中，此取代还可包括用V类氨基酸，尤其是Leu来取代第24位氨基酸。
在一个实施方案中，此类似物包括用9-mer序列SEQ ID NO：2来取代成熟的人IFNα的第19-27位残基片段。在另一个实施方案中，此类似物包括用17-mer序列SEQ ID NO：4来取代成熟的人IFNα的第11-27位残基片段。在又一个实施方案中，此类似物包括用22-mer序列SEQ ID NO：6来取代成熟的人IFNα的第6-27位残基片段。
在相关的方面，本发明包括用于人疾病治疗中的低毒性人IFNα类似物，这种类似物含有成熟的人IFNα，其中的第19，20，22，24，27位上一个或多个位点的氨基酸被取代，而大多数的第28-166位上的氨基酸并没有改变。相对于天然的人IFNα，这种类似物具有能显著地降低其毒性的特性，这一点可通过它能提高单核细胞培养物的成活率的实验来证明。在一个实施方案中，此类似物包括用27-mer序列SEQ ID NO：8来取代成熟的人IFNα的第1-27位残基片段。
本发明进一步还包括一种抑制肿瘤细胞生长的方法。在此方法中，以能够有效地抑制病毒在肿瘤细胞内复制的浓度，将上述类型的低毒性人IFN类似物与肿瘤细胞作用。这种低毒性的IFNα类似物质可以作为任何可接受的药学配方中的一部分。被低毒性人IFN类似物所抑制的肿瘤细胞可包括，但不局限于以下细胞：癌细胞，造血干细胞瘤细胞，白血病细胞，淋巴瘤细胞，黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，这些肿瘤细胞是类固醇敏感肿瘤细胞，例如，乳腺肿瘤细胞。
在本发明的另一个方面，低毒性的上述类型IFN类似物，被用于抑制病毒复制的方法中。在本方法中，以能够有效地抑制病毒复制的浓度，将被病毒感染的细胞用上述类型的低毒性IFN类似物处理。这种低毒性的IFNα类似物质可以作为任何可接受的药学配方中的一部分。RNA和DNA病毒均可被该低毒性人IFNα所抑制。范例性的RNA病毒包括：猫白血病病毒，绵羊进行性肺炎病毒，绵羊慢病毒，马传染性贫血病毒，牛免疫缺陷病毒visna-maedi病毒，山羊关节炎脑炎病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)或丙肝病毒(HCV)。范例性的DNA病毒包括，乙肝病毒(HBV)。
在另一个方面，本发明包括一种在患者需要此方法治疗时所采取的治疗自身免疫疾病的方法。在一个实施方案中，此自身免疫疾病是指多样硬化。本方法包括，给患者施用药物学药效计量的上述类型低毒性人IFNα类似物。
在另一个方面，本发明包括一种在患者需要此方法治疗时所采取的治疗慢性炎症的方法。在一个实施方案中，此慢性炎症是指溃疡性结肠炎。本方法包括，给患者施用药物学药效计量的上述类型低毒性人IFNα类似物。
在另一个方面，本发明还包括，在对静脉注射IFNα敏感的任何病情下，通过口服上述的低毒性人IFNα类似物来治疗的方法。患者优选地摄入口服吸收的该类似物。
阅读下列关于本发明的详细描述和附加的图表，将会对本发明的各个方面及其特征有更为全面的理解。附图的简要描述
图1显示了成熟的HuIFNα、成熟的OvIFNτ，和记作IFNα-N0至IFNα-N7的8个成熟的HuIFNα类似物的N端27个氨基酸的排列顺序之间的对比。序列的简要描述
SEQ ID NO：1为mHuIFNα第19-27位残基之间的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2为mOvIFNτ第19-27位残基之间的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3为mHuIFNα第11-27位残基之间的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4为mOvIFNτ第11-27位残基之间的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5为mHuIFNα第6-27位残基之间的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6为mOvIFNτ第6-27位残基之间的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7为mHuIFNα第1-27位残基之间的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8为mOvIFNτ第1-27位残基之间的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9为成熟的HuIFNα的氨基酸序列(IFNα-d；Genbank收录号NO.J00210，PID g386796)
SEQ ID NO：10为成熟的IFNα类似物IFNα-N0的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11为成熟的IFNα类似物IFNα-N1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12为成熟的IFNα类似物IFNα-N2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13为成熟的IFNα类似物IFNα-N5的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16为成熟的IFNα类似物IFNα-N6的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17为成熟的IFNα类似物IFNα-N7的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18为成熟的OvIFNτ的氨基酸序列(oTP-1；Genbank收录号NO.Y00287；PID g1358)
SEQ ID NO：19为合成的编码IFNα-N0的核苷酸序列。
SEQ IDNO：20为接头1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：21为接头2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：22为片段N1的核苷酸序列，正向链
SEQ ID NO：23为片段N1的核苷酸序列，反向链
SEQ ID NO：24为片段N2的核苷酸序列，正向链
SEQ ID NO：25为片段N2的核苷酸序列，反向链
SEQ ID NO：26为片段N3的核苷酸序列，正向链
SEQ ID NO：27为片段N3的核苷酸序列，反向链
SEQ ID NO：28为片段N4的核苷酸序列，正向链
SEQ ID NO：29为片段N4的核苷酸序列，反向链
SEQ IDNO：30为片段N5的核苷酸序列，正向链
SEQ ID NO：31为片段N5的核苷酸序列，反向链
SEQ ID NO：32为片段N6的核苷酸序列，正向链
SEQ ID NO：33为片段N6的核苷酸序列，反向链
SEQ ID NO：34为片段N7的核苷酸序列，正向链
SEQ ID NO：35为片段N7的核苷酸序列，反向链。本发明的详细描述I.定义
α干扰素(IFNα)是指，干扰素蛋白家族中任何一个与SEQ IDNO9所述的成熟IFNα具有大于70％，或优选的大于80％，或更加优选的大于90％的氨基酸相同性的成员。氨基酸向同性可以运用例如LALIGN程序并使用其缺省参数来确定。该程序可以在FASTA 1.7版本的序列比照程序中找到(Pearson and Lipman 1988；Pearson，1990；本程序可以从William R.Pearson处获得，生物化学系，440信箱，约旦会堂，Charlottesville，VA)。作为代表性的，IFNα至少具有如下这些特性中的一项：(a)抗病毒特性；(b)抗细胞增殖特性；以及(3)可被核酸或病毒的诱导的特性。优选的IFNα来自人。
干扰素τ(IFNτ)是指，干扰素蛋白家族中任何一个与SEQ IDNO：18所述的成熟IFNτ具有大于70％，或优选的大于80％，或更加优选的大于90％的氨基酸相同性的成员。作为代表的，IFNτ具有如下一组特性中的至少一项：(a)在胚胎/胎儿时期由滋养外胚层细胞/胎盘表达，(b)抗黄体解体特性，(c)抗病毒特性，以及(d)抗细胞增殖特性。优选的IFNτ为羊和牛IFNτ。
“成熟蛋白”是指，去除前导序列的IFN蛋白。成熟的IFN蛋白序列从完整IFN氨基酸序列的Cys24残基开始，其相应于成熟蛋白序列的Cys 1。
一个多核苷酸序列或片段“衍生自”另一个多核苷酸序列或片段是指，一个多核苷酸序列或片段含有与作为其来源的另一个多核苷酸序列相同的序列。
例如，一个细菌质粒含有一个“衍生自”所需的人基因的插入片段，这是指，该插入的多核苷酸序列与该所需的人基因的多核苷酸序列相同。
类似的，一个多肽序列或片段“衍生自”另一个多肽序列或片段是指，一个多肽序列或片段含有与作为其来源的另一个多肽序列或片段相同的氨基酸序列。
对于两个氨基酸序列来说，百分比相同性是指在两个序列进行最佳对比且“缺空”不作补偿时，两个序列之间相同残基的百分数。换句话说，如果必须将一个“缺空”插入到第一个序列中以使其与第二个序列达到最佳对比，那么百分比同一性仅仅计入那些存在可以与其相对齐的氨基酸残基(即，计算方法不计入一个序列中与另一个序列中“缺空”对齐的氨基酸)。最佳对比是指可以给出最大百分比相同性数值的对比方式。这种对比操作可以使用“GENEWORKS”程序来完成。另外，对比操作可以使用局部对比程序LALIGN并使用1作为ktup数值，使用缺省参数及缺省PAM而完成。
“保守性取代”是指一类中的一个氨基酸被同一类中的另一个氨基酸取代，这里的“类”是由普通生理化学氨基酸侧链特性以及自然界里存在的同源蛋白高取代频率(使用标准Dayhoff频率交换矩阵确定)而定义的。如上文所述中划分的氨基酸侧链的六大类包括：第I类(Cys)；第II类(Ser，Thr，Pro，Ala，Gly)；第III类(Asn，Asp，Gln，Glu)；第IV类(His，Arg，Lys)；第V类(Ile，Leu，Val，Met)以及第VI类(Phe，Tyr，Trp)。例如，一个Asp被另一个第III类残基中的诸如Asn，Gln，或Glu取代，是一个保守取代。
“非保守性取代”是指一类中的氨基酸被另一类中的某个氨基酸所取代；例如，第II类残基的Ala被一个第III类中的残基，诸如Asp，Asn，Glu或Gln所取代。
“治疗”一种疾病是指施用有治疗作用的物质以减轻疾病的症状和/或减轻疾病的严重程度。II.低毒性的人IFNα类似物
本发明是基于HuIFNα的毒性可以在成熟HuIFNα的第19，20，22，24及27位氨基酸引入氨基酸取代后显著的降低这个发现基础上的。
图1显示了成熟HuIFNα(SEQ ID NO：9)N端前27个氨基酸残基及成熟的OvIFNτ(SEQ ID NO：18)，其中不相同的残基以黑体字标出。HuIFNα类似物含有按照实施例1中所述制备出的OvIFNτ的各种取代。每个HuIFNα类似物的第1-27位在图1中以黑体字表示出来。每一个类似物的第28-166位氨基酸保留了原来的HuIFNα残基(例如，SEQ ID NO：9中的28-166位残基)。
HuIFNα类似物，记作IFNα-N0至IFNα-N7(SEQ ID NO：10至SEQID NO：17)，其毒性在实施例2和3中测定。与HuIFNα温育的肝细胞表现出显著的活力降低(表1，实施例2)。相对之下，如本专利申请所述，细胞和IFNα类似物IFNα-N0温育后未表现出活力的实质性降低。
类似物IFNα-N1至IFNα-N7按照实施例3中所述测定毒性。外周血单核细胞(PBMCs)和不同量的OvIFNτ或其类似物IFNα-N0在七天的温育中未表现出活力的实际降低。PBMCs和类似物-N1或-N3以与HuIFNα类似的剂量温育表现出显著的活力的降低。从而类似物-N1及-N3在2，4，5，6，7，8，11，13及14位的取代在降低HuIFNα毒性方面是相对无效的。细胞IFNα-N4温育所获得的活力水平在与HuIFNα及OvIFNτ温育的结果之间。因此在第16，19及20位上增加的取代在降低HuIFNα毒性方面具有部分效力。
PBMCs和IFNα类似物IFNα-N5及IFNα-N6及IFNα-N7在七天的温育过程中未表现出实质上活力的降低(表2)。这三个类似物保持了OvIFNτ的低毒性并且进而确定出了与降低HuIFNα毒性相关的位点。更加引人注目的是，类似物IFNα-N7仅包含在第19，20，22，24和27位的五个取代。其他表现出低毒性的类似物，-N0，-N5以及-N6，包含有这些及其它位点的取代(图1)。类似物IFNα-N4，在这个实验中表现出中等水平的毒性，缺乏位置22，24及27的取代。根据本发明，所得数据阐明了第19，20。22，24及27位残基在决定这些蛋白毒性上有着显著的作用。
更特别的是，本发明计划构建在第19，20，22，24及27位包含了一个或几个取代的HuIFNα类似物，而余下的氨基酸主要为HuIFNα原来的残基。该类似物经过所述的毒性测定具有降低了的毒性，同时具有天然人IFNα的相关的治疗特性。
优选的取代包扩如下的一个或几个：成熟HuIFNα第19位氨基酸可以被取代为成熟OvIFNτ上的Asn22或同类残基中的Asp，Gln或Glu；成熟HuIFNα第19位氨基酸可以被取代为成熟OvIFNτ上的Arg20或同类残基中的Val或Met；成熟HuIFNα第27位氨基酸可以被取代为成熟OvIFNτ上的His27或同类残基中的Arg，或Lys。这些取代在不显著降低HuIFNα治疗特性的同时有效地降低了HuIFNα的毒性。
其它实例性的含有位点取代而具有低毒性HuIFNα类似物的序列包括，如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，以及SEQ ID NO：6所给出的序列。最为优选的实施方案是在第19-27位区域中不同于OvIFNτ的取代的HuIFNα类似物。例如，成熟人IFNα(SEQ ID NO：1)的第19-27位氨基酸取代为成熟OvIFNτ(SEQ ID NO：2)的第19-27为氨基酸，形成一个成熟人IFNα剩余序列不变，而第19，20，22，24及27位上发生改变的构建。该实例相应于类似物IFNα-N7(SEQ IDNO：17)。
应当理解的是，虽然上述的低毒性人IFNα类似物是“成熟”蛋白，即，它们是从完整干扰素序列的残基Cys24开始(相应于成熟蛋白Cys1)的，但是，本发明也包含带有前导序列的IFNα类似物，即，开始于起始的甲硫氨酸。在这些人IFNα类似物中，前导序列可以来源于人IFNα，绵羊IFNτ或其它I型干扰素。
如上文中所指出的，本发明的HuIFNα类似物的最重要的优点是，相对于天然人IFNα，它具有低毒性。该HuIFNα类似物可以具有与天然人IFNα相同的生物学活性。III.重组及合成技术
人工合成编码HuIFNα类似物IFNα-N0基因的构建方法如实施例1A所述。简要的说，成熟的HuIFNα氨基酸序列在N端的前27个氨基端中包含所有15个OvIFNτ取代(SEQ ID NO：10)，将其逆向翻译成Pichia pastoris密码子偏爱性的核酸。核酸序列的不同位置被加入五个限制性内切酶位点。此合成基因序列被分割为四个核苷酸片段。各个独立的片段分别有150个碱基对大小，通过寡核苷酸相继连接构建在一起。这些片段被序次克隆入一个细菌载体并产生编码IFNα-N0(SEQ ID NO：19)的基因。将此合成基因克隆入pPICZ-α载体中并在Pichia pastoris中表达。编码类似物IFNα-N1至IFNα-N7的合成的基因也如实施例1A所述利用寡核苷酸序次连接而构建。
合成基因在Pichia中的表达(实施例1B)获得重组HuIFNα类似物的大量生产。重组HuIFNα类似物表现出与同一Pichia pastoris系统表达的重组OvIFNτ类似的抗病毒活性(实施例1C)。IV.实用性
A.抗病毒特性
I型干扰素表现出有效的抗病毒特性。相对于IFNα降低的IFNτ
毒性似可以归结于在成熟蛋白N端前27个氨基酸残基中的非保守氨基酸。这些氨基酸残基被IFNα相应位置上的氨基端氨基酸取代似乎表现出在HuIFNα类似物I型干扰素抗病毒活性保留的同时降低了的细胞毒性。因而，含有本发明的低毒性HuIFNα类似物的配方可用于抗病毒复制。
本发明中低毒性HuIFNα类似物可以用于影响母体及胎儿的免疫关系，例如，防止母体内病毒(如HIV)传染到发育中的胎儿。人干扰素类似物由于其本质上相对于异体蛋白的低抗原反应对于人疾病治疗中尤其有效。
B.抗细胞增殖特性
I型干扰素展现出有效的抗细胞增殖活性。如上所述低毒性的人IFNα类似物可以用于抑制细胞生长，同时又不具有其它现在已知的干扰素相关的副作用。含有本发明的低毒性HuIFNα类似物的配方可用于抑制，预防或减慢肿瘤生长。
C.免疫系统紊乱
利用本发明的方法可以治疗的疾病包括自身免疫病、炎症、增殖性及高增殖性疾病，以及免疫介导的皮肤表现。特别的，本发明所述的方法对于治疗免疫系统的高敏感性有优势。I型、或速发/过敏高敏感性，是由于肥大细胞对于变应原(如花粉)发生脱颗粒，包括哮喘，过敏性鼻炎(枯草热)，荨麻疹，过敏性休克以及其它基于过敏基础的疾病。II型、或自身免疫性高敏感性，是由于针对人体自身细胞上假想“抗原”的抗体造成。III型高敏感性是由于抗原抗体免疫复合物滞留在多种组织中并且引发进一步的免疫反应，且可以造成血清病，过敏性肺泡炎，以及有些时候在疫苗加强接种后发生的大肿胀。IV型高敏感性是由于致敏T细胞释放淋巴因子，可以造成炎症反应，接触性皮炎，麻疹的红疹以及对某些药物的“过敏”反应。
这些造成某些个体高敏感性的机制迄今为止还没有很好的解释，但是可能包括基因及体外双方面的因素。例如，细菌、病毒或药物对于那些已经具有自身免疫紊乱遗传易感性的个体触发其自身免疫反应可能起着重要作用。有证据表明某些类型的高敏感性可能与其它类型相关。例如，那些患有某些特定过敏疾病的个体也对自身免疫紊乱更为敏感。
自身免疫紊乱可以被大体分为主要局限在特定器官或可以影响到全身的两种类型。器官特异性紊乱(以及被影响器官)包括多发性硬化(髓磷脂包裹在神经突触上)，I型糖尿病(胰腺)，乔本氏甲状腺炎(甲状腺)，恶性贫血(胃)，艾迪生氏病(肾上腺)，重症肌无力(神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体)，类风湿性关节炎(关节)，葡萄膜炎(眼)，银屑病(皮肤)，格林-巴利综合征(神经细胞)以及Grave’s病(甲状腺)。系统性自身免疫病包含系统性红斑狼疮及皮肌炎。
其它高反应性紊乱的实施例包括哮喘，湿疹，遗传性过敏性皮炎，接触性皮炎，其它湿疹性皮炎，脂溢性皮炎，鼻炎，扁平苔癣，天疱疮，大疱性天疱疮，大疱性表皮松解症，血管神经性水肿，血管炎，红皮病，皮肤嗜酸细胞增多症，斑秃，动脉粥样硬化，原发性硬化性胆管炎以及肾病综合症。相关疾病包括肠道炎症，诸如Coeliac病，直肠炎，嗜酸细胞增多性胃肠炎，肥大细胞增生，炎性肠病，克隆氏病及溃疡性结肠炎以及食物相关性过敏症。
自身免疫性疾病最适于使用本发明所述的方法治疗，包括多发性硬化，I型(胰岛素依赖型)糖尿病，红斑狼疮，肌萎缩性侧索硬化，克隆氏病，类风湿性关节炎，口腔炎，哮喘，葡萄膜炎，过敏症以及银屑病。
含有本发明中所述低毒性HuIFNα类似物的药剂可以被用于治疗并且如上所述减轻自身免疫紊乱的症状。
D.药学组合物
本发明中所述低毒性人IFNα类似物可以按照周知的制备药学应用组合物的方法来配制。含有干扰素或干扰素类复合物的配方以前已有描述(例如，Martin，1976)。总体来说，为了利于有效地给药，应将本发明的物质配制成组合物，从而将有效量的干扰素类似物联合与适当的载体。
用于这些治疗的组合物可有多种形式，有固态，半固态，及液态制剂，例如片剂，丸剂，粉剂，溶液或悬浮液，脂质体，栓剂，可注射的溶液。优选的形式取决于所需的给药和治疗应用方式。这些组合物优选地包括本领域技术人员所熟知的并为传统药剂学所接受的载体和佐剂。本发明优选以单位剂量为组合物的形式，通常每天一次或多次给病人服用。
低毒性的人IFNα类似物或相关多肽也可以任何药剂学认可的剂型给病人服用，包括口服，吸入，鼻腔喷入，腹腔、静脉、肌肉、病损内、或皮下注射。特别是用于其它干扰素化合物的组合物和方法可用于运送这些类似物。
本发明中IFNα类似物的一个基本优点是极低的细胞毒性。正因为这种低毒性，才可能给予比普通使用的其它干扰素(例如天然人IFNα)化合物浓度更高的干扰素类似物。这样本发明的低毒性HuIFNα类似物，预期以5×104至20×106单位/每天到500×106单位/每天的剂量给予病人。在一个优选的实施方案中，剂量是约20×106单位每天。高剂量在全身给药的治疗中是优选的。本发明的组合物和方法当然也可与其他方法联合使用。
一旦一个病人的状况得到改善维持给药剂量是必须的。其后根据药效，给药的剂量或次数或者两者都可被降低至维持病人状况的水平。当病况减轻至预期水平，治疗应当终止。然而为防治病症复发，病人需要长时期给于间歇治疗。
本发明的IFNα类似物依照标准程序可治疗多种癌症和病毒疾病，其中包括以前其他干扰素显示有效的疾病。例如，Finter等，1991；Dianzani，1992；Francis，等，1992，和美国专利4,885,166和4,975,276。然而正如上文所述，本发明的IFNα类似物具有独一的特性和优点，包括其无毒治疗这些病症的特点。
E.治疗皮肤病
皮肤病可使用本发明的干扰素类似物进行病损内治疗。给药的方法及待治病损的大小和严重程度决定配方和剂量。优选的方法包括真皮内和皮下注射。向大病损内多点注射是可行的，一个病人皮肤上的几个病损可以同时治疗。给药的方法可由本领域的熟练技术人员决定。为维持已减轻的病症而设计的配方可以减少给药次数。
F.全身治疗
全身治疗和其他治疗方法是等效的。多点静脉注射、皮下和/或肌肉注射是可行的，用移植的方法治疗的病例中，为维持已减轻的病症而设计的配方特别有用。病人可以通过可植入的皮下门(portals)，库(reservoirs)或泵(pumps)得到治疗。
G.局域治疗
用本发明的低毒性IFNα类似物局域治疗特定器官的癌症是有效的。治疗通过动脉输入完成。可以使用外科或血管造影技术植入导液管直接治疗感染器官。一个与导液管相连的的皮下门可以用于慢性病的治疗，或者也可以使用可填充的移植泵。
下列的实施例旨在进一步解释本发明，而非限制本发明。材料与方法
限制性内切酶，T4DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶，TaqDNA聚合酶，和购自New England Biolabs(Beverly，MA)或PromegaBiotech(Madison，WI)：的小牛肠磷酸酶：这些试剂的使用是根据厂商的说明进行的。如测序反应，使用“SIQUENASE DNA II”测序试剂盒(美国生物化学公司，Cleveland OH)。免疫印记和其他试剂购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)或Fisher Scientific (Needham，MA)。硝酸纤维素滤器购自Schleicher和Schuell(Keene，NH)。
人工合成的寡聚核苷酸接头和引物由可购买的自动寡聚核苷酸合成仪合成(例如ABI模式380B-02 DNA合成仪(Applied Biosystems，Foster City，CA))。另外可定购设计好的寡聚核苷酸，例如从SyntheticGenetics(San Diego，CA)购买。CDNA合成试剂盒和随机引物标记试剂盒购自Bochringer-Mannheim Biochemical(BMB，Indianapolis，IN)。
编码多肽的寡聚核苷酸序列既可通过标准的寡聚核苷酸合成方法直接合成，也可在大编码序列的实施例中，通过克隆包括相应编码序列的多个首尾相接的寡聚核苷酸片段的系列步骤合成(Yoshio，等，1989；Eaton，等，1988)。寡聚核苷酸编码序列可以通过标准的重组程序得到表达(Maniatis，等，1982；Ausubel等1988)。也可通过标准的体外技术直接合成肽段(Applied Biosystems，Foster City CA)。
重组人IFNα从Biosource International(Camarillo，CA)。除非另有说明，蛋白浓度根据厂家说明由bicinchoninic acid assay试剂盒(Pierce，Rockford IL)测定。
用于本研究的所有组织培养基质，丝氨酸重复抗原和IFNs经秧鹤变形细胞裂解物分析确定是内毒素阴性的(Associates of CapeCod，Woods Hole，MA)，敏感水平为0.07ng/ml。实施例1HuIFNα类似物的克隆和表达
A.合成的编码HuIFNα类似物基因的构建
N端前27个氨基酸位置(SEQ ID NO：10)由15OvIFNτ取代的HuIFNα的氨基酸序列是由Pichia pastori最适密码子反译得到。在核苷酸序列的全长结构中，编辑加入五个限制酶切位点。合成的基因序列分为四个核苷酸片段。每个片段约长150个碱基对，是通过寡核苷酸的序列连接构建的。将这些片段依次克隆到细菌G2载体以合成编码IFNα-N0(SEQ ID NO：19)的基因。然后从细菌载体上切下此合成基因连入pPICZ-α载体的XhoI/NotI位点，在Pichia pastoris中表达。
编码类似物IFNαN1-IFNαN7的合成基因也可通过寡核苷酸的有序连接构建而成。上文描述的pPICZ-α/IFNα-N0结构用XbaI和BstEII消化，然后将复性的寡核苷酸接头1(SEQ ID NO：20)和接头2(SEQ IDNO：21)连入这些位点形成中间过渡载体结构。此步骤去除相应于IFNα-N0N端的核苷酸序列，代之以下文的核苷酸片段。中间过渡载体用XhoI和EcoRI消化。将由寡核苷酸有序连接而成的下述核苷酸片段连入中间载体的XhoI/EcoRI位点，在pPICZ-α载体上形成IFNα-N1-IFNα-N7类似物。
IFNα-N1    正向N1片段  SEQ ID NO：22
            反向N1片段  SEQ ID NO：23
IFNα-N2    正向N2片段  SEQ ID NO：24
            反向N2片段  SEQ ID NO：25
IFNα-N3    正向N3片段  SEQ ID NO：26
            反向N3片段  SEQ ID NO：27
IFNα-N4    正向N4片段  SEQ ID NO：28
            反向N4片段  SEQ ID NO：29
IFNα-N5    正向N5片段  SEQ ID NO：30
            反向N5片段  SEQ ID NO：31
IFNα-N6    正向N6片段  SEQ ID NO：32
            反向N6片段  SEQ ID NO：33
IFNα-N7    正向N7片段  SEQ ID NO：34
            反向N7片段  SEQ ID NO：35
B.在Pichia中表达HuIFNα类似物
为了表达重组干扰素类似物，利用载体上的XhoI和NotI限制性内切酶位点将基因的编码序列插入pPICZ-α表达载体(Initrogen，SanDiego，CA)中。pPICZ-α表达载体提供多种元件以实现表达和重组干扰素的纯化。例如该载体有一个包含甲醇诱导的醇氧化酶(AOX)启动子的表达盒。甲醇生长酵母细胞中，约5％的polyA+RNA来于AOXI基因。此外该载体上还有来源于酿酒酵母α因子前期肽的分泌信号序列，它可介导蛋白分泌到培养介质中。该载体还可用Sh ble基因(Streptoalloteichus hindustanus ble基因)编码的Zeocin抗生素筛选重组细菌和酵母。
编码HuIFNα类似物的重组质粒电转入X-33野生型Pichiapastoris株大量培养。按照Invitrogen的程序培养并诱导重组酵母菌落。收集上清，用0.8/0.2mm孔径大小的acrodisc滤器(Gelman Science，Ann Arbor，MI)过滤除菌，并利用Centriplus-10浓缩器(Amicon，Inc.，Beverly，MA)以磷酸缓冲盐(PBS)交换缓冲液。此法获得的重组HuIFNα类似物显示了与在Pichia pastoris体系中表达的重组OvIFNτ相似的抗病毒活力。
C.抗病毒定量分析
利用比色分析定量干扰素蛋白的抗病毒活力。用补充有10％胎牛血清(FBS)和抗生素的Eagle’sMEM在96孔平板上培养MadinDarby牛肾(MDBK)细胞，使生长至汇合的程度。弃去培养基，并用灭菌的PBS洗细胞一次。用补充有2％FBS和抗生素的Eagle’sMEM作为稀释液，样品分为三份加入孔中，分行向每孔加入100ul 10倍稀释液和2倍稀释液。加入干扰素样品，于37℃培养细胞18小时。重组HuIFNαA(Biosource Intl.)作为标准干扰素对照。向测试细胞中加入100ul囊状口腔病毒(VSV)，再于37℃培养48小时。从每孔中除去100ul培养基，换以100ul 0.2％中性红溶液(Gibco-BRL)，于37℃保温1小时。弃去所有培养基，用PBS轻柔的洗细胞两次，再加入100ul酸性乙醇(50％乙醇，1％乙酸)。用Bio-KineticsReader(Bio-Tek Instrument，Winooski VT)读得已溶解的染料的A550。用下述公式算出保护百分数：
Figure A9881036800231
一个抗病毒单位(U)定义为50％保护。实施例2干扰素在肝细胞中的体外毒性
HuIFNc和IFNα类似物IFNα-N0(SEQ ID NO：10；图1)的体外毒性用普通人肝细胞比较。在购自Clonetics Corporation(San Diego，CA)并铺有基质胶的96孔板上铺一层汇合的肝细胞。第二天，用100ul补充有0.1uM生理盐水，0.1uM地塞米松，50ug/ml庆大霉素，50ng/ml两性霉素B的改良Williams E培养基(Clonetics Corp.)取代孔中的培养基。然后用2000U/ml至128,000U/ml的HuIFNα或IFNα-N0处理细胞。经过4，6，或7天的培养后，向每个孔中加入10ul的四唑盐WST-1(4-3-(4-吲哚苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑并-1-3-苯二磺酸盐)(Boehringer Mannheim，Indianapolis IN)。存在于线粒体呼吸链中仅在活细胞中有活力的四唑鎓琥珀酸盐还原酶系统将WST-l裂解成甲月簪。活细胞的百分数由450nm的光吸收值确定，表示成无干扰素处理的细胞的百分数。
结果示于表1。表中的值表示活细胞的代谢活力百分数，仅用培养基处理的活细胞的存活力是100％。
                          表1用IFN样品培养4，6或7天的初级正常人肝细胞的代谢活力百分数
IFN处理的天数   样品                                     (单位/毫升)
 1.28×105  6.4×104  3.2×104  1.6×104  8×103  4×103  2×103
 4  rHuIFN-α  70.9  74.4  92.1  72.0  71.3  77.5  91.4
 4  IFNα-N0  114.6  130.9  142.4  122.3  112.0  93.5  111.3
 6  rHuIFN-α  58.1  68.2  96.3  112.4  76.5  73.6  ND
 6  IFNα-N0  118.3  96.2  114.6  129.9  138.6  110.7  ND
 7  rHuIFN-α  35.0  47.1  71.4  66.0  82.0  83.0  ND
 7  IFNα-N0  94.4  132.0  139.0  97.4  111.7  155.4  ND
ND＝未做
用HuIFNα培养的肝细胞有显著的活力降低。相反地，用IFNα类似物IFNα-N0培养的细胞与未处理的细胞对照没有本质的活力损失。实施例3IFNα类似物在单核细胞中的体外毒性
用外周血单核细胞(PBMC)对照HuIFNα，OvIFNτ和IFNα类似物IFNα-N0至IFNα-N7(SEQ ID NO：17；图1)的体外毒性。整个血液的棕黄层部分用PBS 1∶4稀释，涂盖于Nycoprep 1.077(NycomedPharma，Oslo，Norway)。20℃600xg离心20分钟，用移液枪吸取界面处的PBMC。用PBS洗细胞一次，以每孔2×105个细胞的浓度将细胞铺于96孔板中。第二天用2000U/ml至128,000U/ml的IFNα，IFNτ或IFNα类似物处理细胞。培养七天后，每孔中加入四唑鎓盐wST-1(Boehringer Mannheim)。用450nm的光吸收测活细胞的百分数，表示为无干扰素处理的细胞的百分数。
结果示于表2。表中的值表示活细胞的代谢活力百分数，仅用培养基处理的活细胞的存活力是100％。
                          表2用IFNα样品培养七天的人外周血单核细胞(PBMC)代谢活力百分数
样品                                         单位/毫升
  1.28×105   6.4×103   3.2×104   1.6×104   8×103   4×103   2×103
  rHuIFN-α   64.4   65.0   63.8   74.1   71.6   73.6   92.5
  rOvIFN-τ   97.4   105.7   122.5   117.5   90.2   100.9   89.7
  IFNα-N0   ND   124.6   138.9   101.7   103.5   103.0   105.7
  IFNα-N1   60.0   56.1   60.4   69.3   65.6   ND   ND
  IFNα-N3   53.8   64.1   59.0   73.5   63.7   66.6   71.7
  IFNα-N4   82.5   80.9   80.5   76.1   89.8   71.1   73.4
  IFNα-N5   139.1   118.0   99.2   110.2   82.2   96.8   120.0
  IFNα-N6   ND   103.4   116.5   91.4   106.9   96.0   125.3
  IFNα-N7   97.5   15.6   96.8   121.5   159.4   111.5   140.3
ND＝未做
用HuIFNα培养的PBMCs活力有显著降低，相反地，用rOvIFN-τ或人IFNα类似物IFNα-N0，IFNα-N5，IFNα-N6和IFNα-N7培养的细胞七天后活力无本质降低。用IFNα类似物IFNα-N1，IFNα-N3培养的细胞有相似与HuIFNα培养细胞的活力下降。用IFNα类似物IFNα-N4培养的细胞相对HuIFNα培养细胞活力有小的下降。
本发明已参照特殊的方法和实施例说明，但应理解的是可不脱离本发明进行各种修改和变化。序列表<110>派普根公司，佛罗里达大学<120>低毒性的人干扰素-α类似物<130>5600-0301.41<140>待定<141>1998-10-20<150>US 08/954,95<151>1997-10-20<150>US 08/631,328<151>1996-04-12<160>35<170>FastSEQ for Windows，3.0版<210>1<211>9<212>蛋白质<213>人<400>1Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser1               5<210>2<211>9<212>蛋白质<213>绵羊<400>2Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His1               5<210>3<211>17<212>蛋白质<213>人<400>3Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro1               5                  10                   15Ser<210>4<211>17<212>蛋白质<213>绵羊<400>4Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro1               5                  10                   15His<210>5<211>22<212>蛋白质<213>人<400>5Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met1               5                  10                  15Ser Arg Ile Ser Pro Ser20<210>6<211>22<212>蛋白质<213>绵羊<400>6Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Arg Met1               5                  10                  15Asn Arg Leu Ser Pro His
         20<210>7<211>27<212>蛋白质<213>人<400>7Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser
        20                  25<210>8<211>27<212>蛋白质<213>绵羊<400>8Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1               5                  10                  15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His
        20                  25<210>9<211>166<212>蛋白质<213>人<400>9Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp
         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
     35                  40                  45Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
         100                 105                 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
     115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
 130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
             165<210>10<211>166<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>链<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的类似物IFN-N0<400>10Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1               5                  10                  15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Met Asp
        20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
    35                  40                  45Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
             85                 90                  95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>11<211>166<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>链<222>(1)…(166)<223>成熟的Hu1FNα的类似物IFN-N1<400>10Cys Tyr Leu Ser Arg Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp
        20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
    35                  40                  45Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
            85                  90                  95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>12<211>166<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>链<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的类似物IFN-N2<4O0>10Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp
        20                  25                  50Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
    35                  40                  45Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
            85                  90                  95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>13<211>166<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>链<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的类似物IFN-N3<400>13Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp
        20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
    35                  40                  45Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
            85                  90                  95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>14<211>166<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>链<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的类似物IFN-N4<400>14Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1               5                  10                  15Leu Leu Asp Arg Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp
        20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
    35                  40                  45Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
            85                  90                  95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>15<211>166<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>链<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的类似物IFN-N5<400>15Cys Asp Leu Pro Glu Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1               5                  10                  15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Met Asp
        20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
    35                  40                  45Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp65                  70                  75                              80Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
            85                  90                  95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>16<211>166<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>链<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的类似物IFN-N6<400>16Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1               5                  10                  15Leu Leu Asp Arg Met AsnArg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Met Asp
        20                 25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
    35                  40                  45Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
            85                  90                  95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>17<211>166<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>链<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的类似物IFN-N7<400>17Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Met Asp
        20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
    35                  40                  45Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
            85                  90                  95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>18<211>172<212>蛋白质<213>绵羊<400>18Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1               5                  10                  15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp
        20                  25                  30Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu
    35                  40                  45Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser
50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu
            85                  90                  95Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly
        100                 105                 110Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr
    115                 120                 125Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val
130                 135                 140Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro
            165                 170<210>19<211>527<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(18)…(518)<223>IFN-N0的合成基因<400>19ctaggctcga gaagaga tgt tac ttg tct aga aag ttg atg ttg gac gcc          50
               Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala
                1               5                   10aga gag aac ttg aag ttg ttg gat aga atg aac aga ctt tct cct cac         98Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His
         15                  20                  25tct tgt ctt atg gac aga cac gac ttc ggt ttc cca caa gaa gaa ttt         146Ser Cys Leu Met Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe
     30                  35                  40gac ggt aac caa ttc caa aag gct cca gct atc tct gtc ttg cac gag         194Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu
 45                  50                  55ttg atc caa caa att ttc aac ctt ttc act acc aag gac tcc tcc gct        242Leu Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala60                  65                  70                  75gct tgg gac gaa gat ttg ctt gac aag ttc tgt act gag ctt tac caa         290Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln
             80                  85                  90caa ttg aac gac ttg gaa gcc tgt gtc atg caa gaa gag aga gtt gga         338Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly
         95                 100                 105gag acc cct ttg atg aac gct gat tcc att ttg gct gtc aag aag tac         386Glu Thr Pro Leu Met Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr
    110                 115                 120ttc aga aga att acc ttg tac ctt act gag aag aag tac tct cca tgt         434Phe Arg Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys
125                 130                 135gct tgg gag gtt gtt aga gct gaa att atg aga tcc ttg tct thg tct         482Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser140                 145                 150                 155act aac ctt caa gaa aga ttg aga aga aag gag taa gcggccgcg               527Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu  *
            160                 165<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>接头1  <400>20ctagaaagtt gatggaattc gacg             24<210>21<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>接头2<400>21gttaccgtcg aattccatca acttt            25<210>22<211>135<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N1，正向链<400>22tcgagaagag atgttacctt tctagaaccc actccttgga caacagaaga accttgatgt        60tgctagccca aatgtccaga atctcccctt cctcttgtct tatggacaga cacgacttcg        120gtttcccaca agaag                                                         135<210>23<211>135<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N1，反向链<400>23aattcttctt gtgggaaacc gaagtcgtgt ctgtccataa gacaagagga aggggagatt        60ctggacattt gggctagcaa catcaaggtt cttctgttgt ccaaggagtg ggttctagaa        120aggtaacatc tcttc                                                         135<210>24<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N2，正向链<400>24tcgagaagag atgttacttg tctagaaagt tgatgttgga caacagaaga acccttatgc        60tgctagctca aatgtccaga atctctccat cctcttgtct                              100<210>25<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N2，反向链<400>25cgaagtcgtg tctgtccata agacaagagg atggagagat tctggacatt tgagctagca        60gcataagggt tcttctgttg tccaacatca actttctaga caagtaacat ctcttc            116<210>26<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N3，正向链<400>26tcgagaagag atgttacttg tctagaaagt tgatgttgga cgctagagag aacttgatgc            60tgctagctca aatgtccaga atttcccctt cttcttgtct                                  100<210>27<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N3，反向链<400>27cgaagtcgtg tctgtccata agacaagaag aaggggaaat tctggacatt tgagctagca            60gcatcaagtt ctctctagcg tccaacatca actttctaga caagtaacat ctcttc                116<210>28<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N4，正向链<400>28tcgagaagag atgttacttg tctagaaagt tgagtcttga cgctagagaa aacttgaagc            60ttttggacag aatgtccaga atttccccat cctcttgtct                                  100<210>29<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N4，反向链<400>29cgaagtcgtg tctgtccata agacaagagg atggggaaat tctggacatt ctgtccaaaa            60gcttcaagtt ttctctagcg tcaagcatca actttctaga caagtaacat ctcttc                116<210>30<211>135<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N5，正向链<400>30tcgagaagag atgtgacttg ccagaaaagc ttatgttgga cgccagagaa aacttgaaac              60ttctagacag aatgaacaga ttgtctccac actcttgtct tatggacaga cacgacttcg              120gtttcccaca agaag                                                               135<210>31<211>135<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N5，反向链<400>31aattcttctt gtgggaaacc gaagtcgtgt ctgtccataa gacaagagtg tggagacaat              60ctgttcattc tgtctagaag tttcaagttt tctctggcgt ccaacataag cttttctggc              120aagtcacatc tcttc                                                               135<210>32<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N6，正向链<400>32tcgagaagag atgtgacttg cctgaaactc acagtctaga cgccagagag aacttgaagc              60ttttggacag aatgaacaga ttgtctccac actcttgtct                                    100<210>33<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N6，反向链<400>33cgaagtcgtg tctgtccata agacaagagt gtggagacaa tctgttcatt ctgtccaaaa              60gcttcaagtt ctctctggcg tctagactgt gagtttcagg caagtcacat ctcttc                  116<210>34<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N7，正向链<400>34tcgagaagag atgtgacttg ccagagaccc actcccttga caacagaaga actttgatgc              60ttctagacag aatgaacaga ttgtccccac actcttgtct                                    100<210>35<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N7，反向链<400>35cgaagtcgtg tctgtccata agacaagagt gtggggacaa tctgttcatt ctgtctagaa              60gcatcaaagt tcttctgttg tcaagggagt gggtctctgg caagtcacat ctcttc                  116

Claims (17)

1.一种降低人IFNα的毒性的方法，所说的方法包括
用能有效地降低培养的单核细胞中的人IFNα的特异毒性的氨基酸取代成熟的人IFNα序列的第19，20，22，24和27位的一个或多个氨基酸，而第1-27位的大多数氨基酸仍保持为天然的人IFNα的氨基酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中所说的取代包括以非保守型氨基酸取代所说的成熟的人IFNα序列上的第19，20，22，24和27位的一个或多个氨基酸。
3.如权利要求1所述的方法，其中所说的取代包括下列的一种或多种：
(a)以III类氨基酸取代第19位的氨基酸，
(b)以IV类氨基酸取代第20位的氨基酸，
(c)以III类氨基酸取代第22位的氨基酸，
(d)以V类氨基酸取代第24位的氨基酸，和
(e)以IV类氨基酸取代第27位的氨基酸。
4.如权利要求1所述的方法，其中所说的取代包括下列的一种或多种：
(a)以Asp取代第19位的氨基酸，
(b)以Arg取代第20位的氨基酸，
(c)以Asn取代第22位的氨基酸，
(d)以Leu取代第24位的氨基酸，和
(e)以His取代第27位的氨基酸。
5.如权利要求1所述的方法，其中所说的取代通过选自下列一组中的一种取代而完成：
(a)以SEQ ID NO：2所定义的9-mer序列取代成熟的人IFNα序列上第19-27位的氨基酸，
(b)以SEQ ID NO：4所定义的17-mer序列取代成熟的人IFNα序列上第11-27位的氨基酸，和
(c)以SEQ ID NO：6所定义的22-mer序列取代成熟的人IFNα序列上第6-27位的氨基酸。
6.如权利要求1所述的方法，其中成熟的人IFNα序列第28-166位基本不变。
7.一种用于人类治疗的低毒性的IFNα类似物，包括
具有一个或多个取代的氨基酸的成熟的人IFNα，其是按照权利要求1所述的方法取代所述氨基酸而制备的。
8.如权利要求7所述的类似物，其中取代的氨基酸是在第19，20，22，和27位上的一个或多个非保守型氨基酸。
9.如权利要求7所述的类似物，其中所说的取代包括下列的一种或多种：
(a)以III类氨基酸取代第19位的氨基酸，
(b)以IV类氨基酸取代第20位的氨基酸，
(c)以III类氨基酸取代第22位的氨基酸，
(d)以V类氨基酸取代第24位的氨基酸，和
(e)以IV类氨基酸取代第27位的氨基酸。
10.如权利要求7所述的类似物，其中所说的取代包括下列的一种或多种：
(a)以Asp取代第19位的氨基酸，
(b)以Arg取代第20位的氨基酸，
(c)以Asn取代第22位的氨基酸，
(d)以Leu取代第24位的氨基酸，和
(e)以His取代第27位的氨基酸。
11.如权利要求7所述的类似物，其中所说的取代通过选自下列一组中的一种取代而完成：
(a)以SEQ ID NO：2所定义的9-mer序列取代成熟的人IFNα序列上第19-27位的氨基酸
(b)以SEQ ID NO：4所定义的17-mer序列取代成熟的人IFNα序列上第11-27位的氨基酸，和
(c)以SEQ ID NO：6所定义的22-mer序列取代成熟的人IFNα序列上第6-27位的氨基酸。
12.如权利要求7所述的类似物，其中成熟的人IFNα序列上第28-166位基本不变。
13.一种抑制病毒复制的方法，包括
将感染病毒的细胞与权利要求7所述的低毒性的人IFNα类似物在能够有效地抑制病毒在所说的细胞内复制的浓度下相接触。
14.一种抑制肿瘤细胞生长的方法，其中包括将肿瘤细胞与如权利要求7所述的低毒性的人IFNα类似物在能够有效地抑制所说的肿瘤细胞生长的浓度下相接触。
15.一种治疗需要治疗的患者的自身免疫疾病的方法，包括对所说的患者施用有效量的如权利要求7所述的低毒性的人IFNα类似物。
16.一种治疗需要治疗的患者的慢性炎症的方法，包括对所说的患者施用有效量的如权利要求7所述的低毒性的人IFNα类似物。
17.一种治疗对静脉注射IFNα产生敏感性的病情的方法，包括口服给予有效量的如权利要求7所述的低毒性的人IFNα类似物。
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