TW593336B - Low-toxicity human interferon-alpha analog - Google Patents

Description

03886pif3.doc/012 玖、發明說明： 本發明爲1996年4月12日提出申請之美國專利申請案 第08/631,328之部份連續案，該案於此處倂入參考。本發明 係於國家衛生院CA69959計劃支持下進行。依此，美國政府 享有本發明之特有權利。 發明範疇 本發明有關減少人類干擾素-ex毒性之方法，低毒性之人 類干擾素-α類，及該些低毒性干擾素-α類在治療上的應用。 參考文獻

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Zoon，K.C·，et AL·，Μ以ΛοΑ 五119:312-315(1986) 〇 發明背景 干擾素(INFs)已分類爲二不同族群:干擾素I型，包括 IFNoc、IFNp、IFNy、及 IFNco(亦稱之爲 IFNocII);及干擾素 II 型，以IFNy表示（由DeMaeyer等人於1988回顧）。在人體中， 估計至少有17 IFNa非對偶基因，至少2 IFNP非對偶基因及 單一 IFNy基因。 IFNa類已顯示可限制多種型式細胞增生。IFNa類特別 可用於抗血液增生性，如毛狀細胞白血病（Quesada, et.al·， 1984)。再者，此些蛋白質亦顯示抗多骨髓病、慢性淋巴白血 病、低級淋巴瘤、卡波西瘤、慢性骨髓性白血病、腎細胞癌、 膀胱癌及卵巢癌（Bonnem，et. al.，1984 ; Oldham，1985)之活 性。在特定自體免疫及炎症疾病的致病原理中干擾素及干擾 03886piB.doc/012 素受體之角色已被硏究（Benoit，et· al· 1993)。 IFNa類亦可用於抗多種病毒感染(Finter，et al·，1991)。α-干擾素亦顯示抗人類乳頭狀瘤病毒感染、Β型肝炎及C型肝 炎感染（Finter，et al·，1991;Kashima，et al·，1988; Dusheiko, et al·，1986; Davis，et al·，1989)。 然而，IFNa類的使用已明顯受限於其毒性：在治療癌症 及病毒疾病中用IFNa類造成多種副作用，如發燒、發冷、 缺乏食慾、體重減輕、及疲勞(Pontzer，et al·，1991; Oldham， 1998)。此些副作用通常需要⑴干擾素的量降低至限制其治療 功效；或（ii)病患除去治療。此毒性已降低此些潛在抗病毒及 抗增生之蛋白質在衰弱人類及動物疾病之治療中使用。 發明槪述 本發明在一方面爲包括減少人類IFNa (HuIFNoc)之毒性 的方法。此方法包含以一有效之胺基酸取代在成熟的HuIFNa 上19、20、22、24及27位置上的一或至少一胺基酸，當其 曝於人類單核細胞之培養基中時，可實質降低多胜肽之特定 毒性。在成熟HuIFNa中之主要胺基酸殘基1-27保留不變。 在一實施例中，本發明方法包含以非保留胺基酸取代在 19、20、22、24及27位置上的至少一胺基酸。在不同實施 例中，但未限制爲:以第ΠΙ類胺基酸取代位置19之胺基酸， 特別是以天冬胺酸(Asp);以第IV類胺基酸取代位置20之胺 基酸，特別是以精胺酸(Arg);以第ΙΠ類胺基酸取代位置· 22 之胺基酸，特別是以天冬醯胺(Asn);以第iv類胺基酸取代 位置27之胺基酸，特別是以組胺酸(His)。在另一實施例中， 03886pif3. doc/012 可以第V類胺基酸取代位置24之胺基酸，特別是以亮胺酸 (Leu) 〇 在另一實施例中，本發明方法包含在成熟HuIFNa序列 中於殘基19-27間以序列編號第2號（SEQ ID No. 2)之九聚物 取代。特別是在成熟HuIFNa序列中於殘基19-27間以序列 編號第1號（SEQ ID No· 1)之九聚物取代。序列編號第2號（SEQ ID No. 2)之九聚物相當於成熟羊之r干擾素(〇vIFN r )之殘基 19-27且含有不同於成熟HuIFNa之位置19、20、22、24及 27之殘基。在另一實施例中，本發明方法包含在HuIFNa序 列中於殘基11-27間以序列編號第4號（SEQ ID No. 4)之17 聚物取代。特別是在成熟HuIFNa序列中於殘基11-27間爲 序列編號第3號(SEQ ID Ν〇·3)取代。序列編號第4號（SEQ ID Ν〇· 4)之17聚物相當於成熟ovIFNr之殘基11-27且含有不 同於成熟 HuIFNa之位置 11、13、14、16、19、20、22、24 及27之殘基。在另一實施例中，本發明方法包含在HuIFNa 序列中於殘基6-27間以序列編號第6號（SEQ ID No. 6)之22 聚物取代。特別是在成熟HuIFNa序列中於殘基6-27間爲序 列編號第5號（SEQ ID Νο·5)。序列編號第6號（SEQ ID No. 4) 之22聚物相當於成熟ovIFN r之殘基6-27且含有不同於成 熟 HuIFNa之位置 6、7、8、U、13、14、16、19、20、22、 24及27之殘基。 本發明在一相關方面爲包括減少人類IFNa (HuIFNa)之 毒性的方法。此方法包含在成熟的HuIFNa上以一可有效實 質降低多胜肽在單核細胞培養基中特定毒性之胺基酸取代在 03886pif3.doc/012 19、20、22、24及27位置上的一或至少一胺基酸，其中在 成熟HuIFNoc序列中胺基酸殘基28_166實質不變。在一實施 例中，該取代作用之完成係經由以序列編號第8號（SEQ ID N0:8)之27聚物取代在HuIFNoc序列上之殘基1-27。特別是 在成熟HuIFNoc序列中於殘基1-27間爲序列編號第7號（SEQ 10 1^〇.7)。序列編號第7號（8£()10>1〇.7)之27聚物相當於成 熟ovIFN τ之殘基1-27且含有不同於成熟HuIFNoc之位置2、 4 、 5 、 6 、 7 、 8 、 11 、 13 、 14 、 16 、 19 、 20 、 22 、 24 及 27 之 殘基。 本發明在另一方面爲包括低毒性之人類IFNa (HuIFNoc) 以用人類治療。此類似物包含一成熟的HuIFNoc蛋白質，其 在19、20、22、24及27位置的具有一取代胺基酸，且胺基 酸殘基1-27爲天然HuIFNa殘基。此類似物之特徵在於相對 天然人類HuIFNa，其具有一實質減少特定毒性，其在培養 基中增加單核細胞之存活性而證實。 在一實施例中，此類似物含有在19、20、22及27至少 一位置上以非保留胺基酸取代。在不同實施例中，取代胺基 酸包括但未限制爲:第ΠΙ類胺基酸，特別是天冬胺酸，取代 位置19之胺基酸；第IV類胺基酸，特別是精胺酸，取代位 置20之胺基酸；第III類胺基酸取代位置22之胺基酸，特 別是以天冬醯胺；第IV類胺基酸，特別是組胺酸，取代位 置.27之胺基酸。在另一實施例中，取代胺基酸可包括第V 類胺基酸，特別是亮胺酸，取代位置24之胺基酸。 在另一實施例中，此類似物包含在成熟HuIFNa序列中 593336 03886piD.doc/012 於殘基19-27間以序列編號第2號（SEQ ID No. 2)之九聚物取 代。在另一實施例中，此類似物包含在HuIFNa序列中於殘 ^ 基11-27間以序列編號第4號（SEQ ID No. 4)之17聚物取代。 在另一實施例中，此類似物包含在HuIFNa序列中於殘基6-27 間以序列編號第6號（SEQ ID No. 6)之22聚物取代。 本發明在一相關方面爲包括減少人類IFNa (HuIFNa)毒 性之類似物以用於人類治療中，其包含成熟的HuIFNa蛋白 質在19、20、22、24及27胺基酸位置上具有至少一取代胺 基酸，且在成熟HuIFNa序列中胺基酸殘基28-166實質不變。 · 此類似物之特徵在於相對天然人類HuIFNa，其具有一實質 減少特定毒性，其在培養基中增加單核細胞之存活性而證 實。在一實施例中，此類似物包含在1-27殘基間以序列編號 ’ 第8號（SEQ ID No.8)之27聚物取代的成熟人類HuIFNa。 〜 本發明進一步包括抑制瘤細胞生長之方法。在此方法中， · 瘤細胞與前述低毒性HuIFNa類似物在一可有效抑制瘤細胞 生長之濃度下接觸。此低毒性HuIFNa類似物可爲可接受藥 學製劑中之部份。可由低毒性HuIFNa類似物抑制之瘤細胞 φ 包括但未限制爲癌細胞、造血癌細胞、白血病細胞、淋巴瘤 細胞、及骨髓瘤細胞。在一實施例中，腫瘤細爲類脂醇敏性 之腫瘤細胞，例如乳房瘤細胞。 本發明之另一方面爲前述低毒性HuIFNa類似物用於抗 病毒複製之方法。在此方法中，受病毒感染之細胞與前述低.

毒性HuIFNa化合物在一可有效抑制病毒複製之濃度下接 觸。此低毒性HuIFNa可爲可接受藥學製劑中之部份。RNA 11 593336 03886piB.doc/012 及DAN病毒之複製可由低毒性人類HuIFNa抑制。RNA病 毒之例示包括貓白血病毒、羊進行性肺炎、羊豆病毒、馬感 染性貧血病毒、牛免疫不全病毒、Visna-maedi病毒、正白胺 基酸風濕性腦炎病毒、人類免疫不全病毒(HIV)或C型肝炎 病毒(HCV)。DNA病毒之例示爲B型肝炎病毒(HBV)。 本發明之另一方面包括一需要治療自體免疫疾病之病患 中進行此一疾病之治療的方法。在一實施例中，此自體免疫 疾病爲多發性硬化症。此方法包括對此一病患給予藥學有效 量之如前述低毒性HiiIFNa類似物的投藥。 本發明之另一方面包括一需要治療慢性炎症之病患中進 行此一疾病之治療的方法。在一實施例中，此慢性炎症源自 潰瘍性結腸炎。此方法包括對此一病患給予藥學有效量之如 前述低毒性HuIFNa類似物的投藥。 本發明之再一方面包括治療任何對HuIFNa靜脈投藥有 反應的疾病，其係經由口服投藥如前述低毒性HuIFNa類似 物。口服投藥類似物較佳爲病患口服用。 本發明之此些及其他優點與特徵將由下列本發明之詳細 描述參考附圖而瞭解。 圖式之簡要說明 第1圖顯示本發明成熟HuIFNa、OvIFN r、及八個 HuIFNa-NO至HuIFNa-N7標號之HuIFNa類似物之前27個 N-端胺基酸的排列。 序11L之詳細說明 序列編號第1號（SEQ ID NO· 1)爲人類IFNa (HuIFNa)在 12 593336 03886pif3.doc/012 19-27殘基間之胺基酸序列。 序列編號第2序列編號第2號（SEQ ID NO. 2)爲羊IFNt (OvIFNt)在19-27殘基間之胺基酸序列。 序列編號第3號（SEQ ID NO. 3)爲HuIFNa在11-27殘基 間之胺基酸序列。 序列編號第4號（SEQ ID NO· 4)爲OvIFNt在11-27殘基 間之胺基酸序列。 序列編號第5號（SEQ ID NO. 5)爲HuIFNa在6-27殘基 間之胺基酸序列。 序列編號第6號（SEQ ID NO. 6)爲OvIFNt在6-27殘基間 之胺基酸序列。 序列編號第7號（SEQ ID NO. 7)爲HuIFNoc在1-27殘基 間之胺基酸序列。 序列編號第8號（SEQ ID NO. 8)爲OvIFNt在1-27殘基間 之胺基酸序列。 序列編號第9號（SEQ ID NO. 9)爲成熟HuIFNa之胺基酸 序列（IFNa-d; GenBank Accession No. J00210, PID g386796)。 序列編號第10號（SEQ ID NO. 10)爲IFNa-NO之胺基酸 序列。 序列編號第11號（SEQ ID NO. 11)爲IFNa-Nl之胺基酸 序列。 序列編號第12號（SEQ ID NO. 12)爲IFNoc-N2之胺基酸 序列。 序列編號第13號（SEQ ID NO. 13)爲IFNoc-N3之胺基酸 13 593336 03886piO.doc/012 序列。 序列編號第14號（SEQ ID NO. 14)爲IFNa-N4之胺基酸 序列。 序列編號第15號（SEQ ID NO. 15)爲IFNa-N5之胺基酸 序列。 序列編號第16號（SEQ ID NO. 16)爲IFNa-N6之胺基酸 序列。 序列編號第17號(SEQ ID NO. 17)爲IFNa-N7之胺基酸 序列。

序列編號第18號(SEQ ID NO. 18)爲成熟OvIFNt之胺基 酸序列（〇Τρ-1; GenBank Accession No· Y00287, PID gl358) 〇 序列編號第19號(SEQ ID NO. 19)爲編碼類似物IFNa-NO 之合成基因的核苷酸序列。 序列編號第20號(SEQ ID NO. 20)爲接合子1之核苷酸 序列。 序列編號第21號（SEQ ID NO. 21)爲接合子2之核苷酸 序列。 序列編號第22號（SEQ ID NO. 22)爲片段N1之正向股之 核苷酸序列。 序列編號第23號（SEQ ID NO. 23)爲片段N1之反向股之 核苷酸序列。 序列編號第24號（SEQ ID NO· 24)爲片段N2之正向股之 核苷酸序列。 序列編號第25號（SEQ ID NO· 25)爲片段N2之反向股之 14 593336 03886pif3.doc/012 核苷酸序列。 序列編號第26號（SEQ ID NO· 26)爲片段N3之正向股之 核苷酸序列。 序列編號第27號（SEQ ID NO. 27)爲片段N3之反向股之 核苷酸序列。 序列編號第28號（SEQ ID NO. 28)爲片段N4之正向股之 核苷酸序列。 序列編號第29號（SEQ ID NO. 29)爲片段N4之反向股之 核苷酸序列。 序列編號第30號（SEQ ID NO. 30)爲片段N5之正向股之 核苷酸序列。 序列編號第31號（SEQ ID NO. 31)爲片段N5之反向股之 核苷酸序列。 序列編號第32號（SEQ ID NO. 32)爲片段N6之正向股之 核苷酸序列。 序列編號第33號（SEQ ID NO. 33)爲片段N6之反向股之 核苷酸序列。 序列編號第34號（SEQ ID NO· 34)爲片段N7之正向股之 核苷酸序列。 序列編號第35號（SEQ ID NO. 35)爲片段N7之反向股之 核苷酸序列。 發明之詳細描述 I·定義 α干擾素（INFa)係指具有大於7〇%之成熟]^1?〇6蛋白質序 593336 03886pif3.doc/012 ^列，如序列編號第9號表示的胺基酸同源物，較佳爲大於 80%，尤以大於90%之干擾素蛋白質屬者。胺基酸同源物爲 序列可使用例如LALIGN程式以異常參數而決定。此程式可 在FASTA 1.7版組中取得比較程式（Pearson And Lipman; Pearson，1990;可由 William R. Pearson，Department of Biological Chemistry，Box 440，Jordan Hall, Charlottesville， VA取得）。基本上，INFa具有至少一由下列特徵組群中選出 之特徵：（a)抗病毒性；（b)抗細胞增生性質；（c)可由核苷酸 或病毒誘發。較佳之INFa爲得自人類。 干擾素τ(ΙΝΡτ)係指具有大於70%之成熟INFt蛋白質序 列，如序列編號第18號表示的胺基酸同源物，較佳爲大於 80%，尤以大於90%之干擾素蛋白質屬者。基本上，INFx具 有至少一由下列特徵組群中選出之特徵：（a)在胚胎/胎兒階 段由滋胚外層/胎盤表現；（b)抗白血球崩解性質；（c)抗病毒 性；及(d)抗細胞增生性質。較佳之INFt爲得自羊及牛之 INFt。 「成熟蛋白質」爲指在除去引導序列後之IFN蛋白質。 成熟IFN蛋白質由完全之IFN胺基酸多列之殘基Cys24開 始，其相當於成熟蛋白質序列之Cys 1。 當多核苷酸序列或片段包含相同於在其衍生之序列或片 段中，爲指由另一多核苷酸序列或片段“衍生”。例如，一 細菌質體含有一“衍生”自選擇之人類基因的插入體，係若 在該插入體中含有相同於選擇之人類基因的多核苷酸列。 相似的，當多胜肽序列或片段包含相同於在其衍生之序 16 593336 03886piB.doc/012 列或片段中，爲指由另一多胜肽序列或片段“衍生”。 相同性百分比(％)爲有關二胺基酸序列，係指在當序列 爲最佳排列且無補償部份指定爲”間隙”處時，在二序列中之 相同殘基之百分比(％)。換言之，若一間隙需要插入一第一 序列以一第二多列最佳化排列，相同性％爲僅使用以一相當 胺基酸殘基成對之胺基酸計算（亦即，此計算並不考慮在第一 序列之間隙中之第二序列之的殘基）。最佳化排列定義爲在給 多最高之相同性％分數。此一排列可使用”GENEWORKS”程 式進行。另，排列可使用具有ktup 1，缺少參數及缺少PAM 之局部排程式LALIGN進行。 “保留性取代作用”爲指在一類之胺基酸以相同類之胺基 酸取代人，此類之定義爲以一般胺基酸側鏈之物化性質及在 天然發現之同源性蛋白質的高取代作用頻率(如以標準 DAYHOFF頻率交換基質決定）。胺基酸側鏈之槪要分類爲， 如前述類別，包括：第I類(Cys);第II類（Ser、Thr、Pro、 Ala、Gly);第 III 類（Asn、Asp、Gin、Glu);第 IV 類（His、 Arg、Lys);第 V 類(lie、Leu、Va卜 Met);及第 VI 類（Phe、 Tyr、Trp)。例如，Asp爲另一第III類殘基如Asn、Gin或Glu 之取代作用爲一保留性取代作用。 “非保留性取代作用”爲指在一類中之胺基酸以另一類之 胺基酸取代，例如第II類殘基Ala以第III類之Asp、Asn、 Gin或Glii之取代作用。 治療一疾病爲指投以治療物質以有效減低疾病之症狀及/ 或鬆緩疾病之嚴重性。 17 593336 03886pifi.doc/012 II.低毒性人類IFNa類似物 本發明爲基於HiiIFNa之細胞毒性可經由在成熟HuIFNa 之胺基酸位置19、20、22、24及27的至少之一引入胺基酸 取代作用的發現。 第1圖顯示成熟HuIFNa(序列編號第9號）及成熟Ον IFNa(多列編號第18號）之前27 Ν-端胺基酸殘基，其中非相 同之殘基以加黑顯示。含有OvIFNt取代基之次組的HuIFNa 類似物依實施例1所述製備。每一 HuIFNa類似物之位置1-27 顯示於第1圖，取代基以加黑顯示。每一類似物之胺基酸 28-166保留HuIFNa(即序列編號第9號之殘基28-166)。

HuIFNa類似物，編號爲IFNa-NO至IFNa-N7(序列編號 第10號至第17號），以述於實施例2及3生物檢測細胞毒性。 以HuIFNa培養之肝細胞顯示明顯在活動力上的降低(表1， 實施例2)。相反的，以IFNa類似物IFNa N0培養的細胞顯 示基本上無活動力的損失，如在母案中述及者。 類似物IFNa N1至IFNa N7以如實施例3所述檢測生物 細胞毒性。以不同類之OvIFNt或類似物IFNa-ΝΟ培養周邊 血液單核細胞(PBMCs)即使在7天培養之後，顯示基本上無 活動力的損失。以類似物N1或N3培養PBMCs顯示在活動 力上的明顯降低，其量相同於在HuIFNa觀察得到的。在類 似物N1或N3中於2、4、6、7、8、11、13及14的取代作 用因此在降低HuIFNa的細胞毒性上相對無效。在位置16、19 及2〇的加成取代作用因此在減少HuIFNa之細胞毒性上部份 有效。 18 593336 03886pif3.doc/012 以 IFNoc類似物 IFNa-N5、IFNoc-N6 及 IFNoc-N7 培養 PBMCs即使在7天培養之後，顯示基本上無活動力的損失。 此3種類似物保留OvIFNt之低細胞毒性且進一步限定負有 減少HuIFNa之細胞毒性作用之位置。最顯著的，類似物 IFNaN7僅含有五個取代基，爲位置19、20、22、24及27 〇 其他顯示低毒性之類似物，NO、N5及N6在此些位置含有取 代基且在附加的位置上(第1圖）。此在此測試中顯示中間量 細胞毒性之類似物IFNa-4在位置22、24及27缺少取代作 用。依本發明，此數據說明殘基位置19、20、22’24及27在 細胞毒性上扮演重要角色。 更詳言之，本發明意欲一在位置19、20、22、24及27 含有至少一胺基酸取代基之HuIFNa類似物。此同類具有以 此處所述之細胞毒性生物檢測法測定之降低毒性，及具有天 然人類IFNa附隨之治療性質。 較佳之取代作用爲包括至少下列之一者：成熟HuIFNa 之胺基酸19可以成熟之〇νΐρΝτ之Aspl9取代，或以同類之 殘基Asn、Gin或Glu取代；成熟HuIFNa之胺基酸20可以 成熟之OvIFNt之Arg20取代，或以同類之殘基ms或Lys取 代；成熟HuIFNa之胺基酸22可以成熟之OvIFNt之AsN22 取代，或以同類之殘基Asp、Gin或Glu取代；成熟HuIFNa 之胺基酸24可以成熟之〇vIFNt2 Leu24取代，或以同類之 殘基Val或Met取代；及成熟HuiFNoc之胺基酸27可以成熟 之OvIFNt之His27取代，或以同類之殘基Arg或Lys取代。 此一取代作用可有效的降低HuIFNa之細胞毒性，但未明顯 19 03886piB .doc/012 改變所欲之HuIFNoc之治療性質。 其他包含低毒性HuIFNa同類之改變位置之例示序列包 括在此處出之序列，如序列編號第2號、序列編號第4號、 及序列編號第6號。最佳之實施例爲在19-27區域位置中被 取代之HuIFNoc，其不同於OvIFNt。例如，成熟人類IFNa(序 列編號第1號）之胺基酸19-27以成熟OvIFNt之胺基酸19-27 取代之結構導致成熟人類IFNa在位置19、20、22、24及27 的改變，同時殘留成熟人類保留未改變。此實施例相當於同 類IFNa-N7(序列編號第17號）。 可瞭解雖然所述之低毒性人類IFNa類似物爲”成熟”蛋白 質，亦即其以完整干擾素序列之殘基Cys24開始（其相當於成 熟蛋白質之Cysl)，本發明亦包括含有引導序列，亦即其以 起始甲硫胺酸開始。在此人類IFNa之引導序列類似物可由 人類IFNa、OvIFNt或另一 I型干擾素。 如前述指出，本發明之HuIFNa類似物所欲之顯著優點 爲降低由有關於天然人類IFNa之類似物的毒性。此HuIFNa 類似物可具有如天然人類IFNa相同之生物活性。 III.重組體及合成之操作 編碼HuIFNa類似物IFNa-NO之合成基因的結構述於實 施例1A。簡言之，在前27 N-端位置(序列編號第1〇號）中含 有全部15 OvIFNt取代之成熟HuIFNa的胺基酸序列以可用於 Pic/ni p㈣aA之密碼子回譯。編組此核苷酸序列以在結構 之全部長度內間隔包含五個限制區域。此合成基因序列分割 爲四核苷酸片段。此各自片段，每一之長度約爲150鹼基對， 593336 03886pif3.doc/012 經由寡核苷酸之後序連接作用而構成。此片段接著複製入一 細菌載體以產生基因碼編IFNa-NO(編號序列第19號）。此合 成基因然後複製入pPICZ_a載體以在中表現。此合 成基因碼編類似物IFNa-Nl至IFNa-NO亦經由如實施例1A中 所述寡核苷酸建構。 在尸伽r化中表現之合成基因(實施例1B)可使重組體 HuIFNa類似物之超產。重組體HuIFNa類似物顯示之抗病毒 活性（實施例1C)相似於在相同尸伽治中系統表現ΟvIFNt 之抗病毒活性。 IV.利用性 A. 抗病毒性 I型干擾素顯示抗病毒性質。IFNt相對於IFNa所降低之 毒性明顯爲在成熟蛋白質存在之前27 N-端的非保留性胺基 酸的作用。IFNa之N-端部份的相對應殘基之胺基酸殘基的 取代作用顯示可給予結果HuIFNa類似物之降低的毒性，同 時保留I型干擾素的抗病毒性。因此，含有本發明低毒性之 HuIFNa同類之製劑可用以抑制病毒的複製。 本發明之低毒性HuIFNa類似物可用於影響胎兒與母親 間之免疫系統的方法，例如預防母體效應之傳遞至發育中之 胎兒(例，HIV)。人類干擾素類似物特別適用於人體之治療， 因爲潛在投基因反應少於如使用同源蛋白質。 B. 抗細胞增生性質 I型干擾素顯示有效抗細胞增生活性。低毒性人類IFNa 21 593336 03886pifi.doc/012 類似物，如此處所述，亦可在未有其他目前已知的干擾素附 隨之負面副作用下用於抑制細胞生長。含有本發明之低毒性 IFNcc類似物之製劑可用於抑制、預防或減緩腫瘤的生長。 C.免疫系統失調 可使用本發明方法治療之疾病包括自體免疫、發炎、增 生及過度增生疾病，以及免疫介體疾病。詳言之，本發明之 方法利於治療有關免疫系統之過敏狀況。免疫系統之過敏狀 況有四種。I型或直接/過敏性過敏症，此歸因於母細胞在回 應過敏原（例如花粉)之去顆粒作用，包括氣喘、過敏性鼻炎(花 粉熱）、風疹(蓴麻疹）、過敏性休克、及其他過敏性性質之疾 病。Π型或自體免疫過敏症，係歸因於抗體對抗意識到”抗 原”或自體細胞。III型過敏症係歸因於抗原/抗體免疫複合物 之形成，其在不同組織中聚集且活化進一步免疫反應，且對 如免疫自淸疾病、過敏齒槽炎及有時在強化疫苗後形成之大 腫脹。IV型過敏症係歸因於由誘發T細胞所釋出之淋巴液， 其造成發炎反應。實施例括接觸性皮膚炎、麻疹及’對特定藥 物之”過敏”反應。 在某些個體中由特定狀況導致之過敏症的機制通常並不 瞭解，但可能涉及遺傳及外在因素。例如，細菌、病毒或藥 物在個體中發動自體免疫反應扮演重要角色，該個體已具有 對自體免疫失調之遺傳素因。已建議某些型式之過敏症的發 生與其他有關。例如，已推測具有特定一般過敏性之個體較 易對自體免疫失調。 自體免疫失調可能不受限於對最初限制之特定器官或組 22 593336 03886piB.doc/012 統且其影響整個身體。特定器官失調(與受影響之器官）之例 不包括多重硬化症(髓脂質塗覆在神經的過程）、第I型糖尿 病（胰臟）、慢性甲狀腺炎（甲狀腺）、致命性貧血（胃）、艾迪生 氏病（腎上腺）、重症肌無力（在神經與肌細胞交接處之乙醯膽 鹼受體）、風濕性關節炎（關節內襯）、葡萄膜炎（眼）、乾癬(皮 膚）、朱利安-巴瑞症（Guillain-Barre Syndrome)(神經細胞）、 及格雷武式病(Grave’s disease)突眼甲狀腺腫（甲狀腺）。系統 自體免疫疾病包括系統圓盤狀紅斑性狼瘡及皮肌炎。 其他過敏性失調之例示包括氣喘、濕疹、異位性皮炎、 接觸性皮炎、其他濕疹性皮炎、皮脂漏性皮炎、鼻炎、扁平 苔蘚、天庖瘡、大水泡天庖瘡、大泡性表皮鬆弛、皮炎 (uritcaris)、血管水腫、血管疾病(vasculitides)、紅斑、皮膚 性嗜伊紅血球增多症、簇狀禿髮、動脈粥狀硬化、原發性膽 汁硬化症及腎病。相關疾病包括腸炎，如腹腔疾病、直腸炎、 嗜伊紅血球增多胃炎（eosinophilia gastroenteritis)、著色性蓴 麻疹、發炎性下消化道疾病、克薩氏疾病及潰瘍性結腸炎、 及食物過敏症。 特別適用於本發明方法治療之自體免疫疾病包括多數性 硬化症、I型糖尿病(胰島素依賴型）、紅斑性狼瘡、肌萎性側 索硬化、克薩氏疾病、風濕性關節炎、口腔炎、氣喘、葡萄 膜炎、過敏症、及牛皮癖。 含有本發明低毒性之HuIFNa類似物可甩於醫療，因而 可避免自體免疫失調之症狀，如則述討論者。 D.醫藥組成物 23 593336 03886pif3.doc/012 本發明之低毒性人類IFNa可依已知之方法調配以製備 藥理有效之組成物。含有干擾素或似干擾素化合物之製劑已 在習知描述(例如，1976年，Martin)。通常，本發明組成物 的調配爲可使干擾素類似物的量與合宜之載劑組合以利於組 成物之有效投藥。 可用於此些治療之組成物亦可爲多種形式。例如包括， 固體、半固體、及液態劑量形式，如藥片、藥九、粉末、液 態溶液或懸浮液、脂溶液、栓劑、可注射及注入溶液。較佳 形式爲依投藥及治療應用所欲之模式而定。此組成物且較佳 包括傳統藥用可接受載劑及佐劑，其爲熟於此技人士已知 者。較佳地，本發明之組合爲在單一劑量形式，且通常可給 予病患每天至少一次投藥。 低毒性人類IFNa類似物或相關多胜肽可在任何藥學可 接受劑量形式給藥，包括口服、收入劑、鼻內噴霧劑、腹膜 內、靜脈內、肌內、病灶內或皮下皮射。特定言之，可用於 其他干擾素之組成物及方法可用於傳遞此些藥物。 然而本發明之IFNa的主要優點爲其特別低的毒性。因 爲其低毒性，其可在大於一般用於其他干擾素（如天然人類 IFNa)化合物之濃度下投藥。因此，預期本發明之低毒性 HuIFNa類似物投藥的量可在約5 X 104至20 X 106單位/每 天至約500 X 106單位/每天或更高。在一較佳實施例中，劑 量爲約20 X 106單位/天。高劑量對於系統投藥較佳。當然， 亦應瞭解本發明之組成物及方法可與其他治療組合。 一旦病患狀況已產生改進，則若需要可給予維持劑量。 24 593336 03886pif3.doc/012 接著，依症狀的作用，劑量或投藥頻率或二者可降低至一量 以維持改進之狀況。當症狀已排除至所欲狀態，可停止治療。 然而病患可要求依任何病症再發生以長時間之間斷治療。 本發明之IFNa類似物可經由標準程序給藥以治療多種 癌症及病毒性疾病，包括其他干擾素在習知已顯示活性者。 例如參考 Finter，et al·，1991; Dianzani，1992 ; Francis，et al·， 1992 ;及美國專利第4,885，166及4,975,276號。然而，如前 已討論，本發明之IFNa類似物具有獨特特徵及優點，包括 其在無毒性下治療此些病症之能力。 E. 皮膚失調之治療 皮膚失調可使用本發明之低毒性干擾素類似物病症內治 療，其中製劑及劑量可依投藥方法及被治療的病害大小及嚴 重性而定。可多次注射至大病害區，且在單一病患之皮膚的 數個病害區可一次治療。 F. 系統治療 系統治療實質上對所有的應用爲相當的。多重血管內、 皮下及/或肌內劑量爲可能的’且在治療用之移植方法狀況 下，用以緩釋之製劑上特別有用。患者亦可使用可植入皮下 門脈、貯器或泵。 G. 局部治療 本發明之類似物進行局部治療可用於特定器官之癌症治 療。治療可經由動脈注入而達成。導管可經由外科或血管掃 描的植入以直接治療受感染器官。連接至導管之皮下門脈可 用以慢性治療，或可使用植入、塡充栗。 25 593336 03886pifi.doc/012 下列實施例爲用以說明，但非用以限制本發明。 材料及方法 限制核酸內切酶、T4 DNA連接酶、T4多聚核苷酸激酶、 Taq DNA聚合酶及牛腸磷酸酶由新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs (Bevedy，ΜΑ))或普羅美加生物實驗室 (Promega Biotech (Madison，WI))購得；此些試劑依製造者之 指示使用。對於序列反應，使用”SEQUENASE DNA II，，序列 組件（United States Biochemical Co. Cleveland 0H) 〇 免疫印 跡及其他試劑可得自西格馬化學公司（Sigma Chemical Co. (St. Louis，MO))或費雪科技公司（Fisher Scientific Co. (Needham， MA))。硝基纖維素濾網可得自Schleicher & Schuell公司 (Keene，NH) 〇 合成寡核苷酸接合子及引子可使用商業可取得寡核苷酸 自動合成器(例如ABI 380B-02型DNA合成器(Applied Biosystems，Foster City，CA))製備。另，亦可由例如合成基 因公司（Synthetic Genetics(San Diego, CA))購買客戶指定合成 寡核苷酸。CDAN合成組件及隨機起動標示組件可由 Boehringer-Mannheim Biochemical (BMB，Indianapolis，IN)獲 得。 寡核苷酸序列碼編多胜肽可直接由寡核苷酸合成之標準 方法合成，或在大量碼編序列狀況時以系列植株步驟串接陣 列之多個相當編碼序列之寡核苷酸片段(Yoshio, et al.，1989 ; Eaton, et al·，1988)。寡核苷酸編碼序列可以標準重組體製程 表現（Maniatis，et al·，1982 ; Ausubel，et al·，1988)。另，可直 26 593336 03886pif3.doc/012 接由在標準試管內之技術合成胜肽(Applied Biosystems， Foster City，CA) 〇 可由生物源國際公司（Biosource International，Camarillo， CA)獲得重組體人類IFNaA。除非特別指明，蛋白質濃度可 由雙金雞鈉酸生物檢測組(Pierce，Rockford IL)依製造者之指 示測定。 用於此硏究之所有培養基、血漿及INF類皆對內毒素爲 陰性反應，如以 Limulus Amebocyte Lysate(Associates of Cape Cod，Woods Hole，MA)在 0.07 ng/ml 之感測量測定。 實施例1

HuIFNcx類似物之複製及表現 A·編碼HuIFNa類似物合成基因之建構 在前27 N端位置含有全部15 OvIFNt取代基之HuIFNa 類似物胺基酸序列(序列編號第10號)以適用於 之碼回轉譯。編譯此核苷酸序列以在建構物之全長中包括五 個相間隔之限制位置。此合成基因可分割爲四個核苷酸片 段。此獨立片段經由系列寡核苷酸之接合作用一建構，每一 在長度上相當於150鹼基對。此片段接著複製入G2細菌載 體以產生基因編碼IFNa-NO(序列編號第19號）。此合成基因 然後由細菌載體中切出並接合至pPICZ-a載體之Χ/ζ〇Ι/Λ^ίΐ 位置（Invitrogen，San Diego CA)以在 pasorzV中表現。 編碼類似物IFNa-Nl至IFNa-N7之合成基因亦由寡核苷 酸之系列接合作用而建構。前述之pPICZ-a/ IFNa-NO結構 27 593336 03886piO.doc/012 以Xbal及BstEII浸漬，且重整之寡核苷酸接合子1(序列編 號第20號）及接合子2(序列編號第21號)在此些位置接合以 產生一中間產物載體結構。此步驟移除相當於IFNa-NO之N 端部份的核苷酸序列，以由下列列示之核苷酸片段取代。中 間介質載體結構以ΧΑοΙ及EaRI浸漬。下列由寡核苷酸之 序列接合作用而製備的核苷酸片段然後接合入中間介質結丰尊 之⑶RI位置以在pPICZ-a載體中製造IFNa_N0至 IFNa-N7類似物。 IFNa-Nl片段N1正向序列編號第22號 片段N1逆向序列編號第23號 IFNa_N2片段N2正向序列編號第24號 片段N2逆向序列編號第25號 IFNa-N3片段N3正向序列編號第26號 片段N3逆向序列編號第27號 IFNa_N4片段N4正向序列編號第28號 片段N4逆向序列編號第29號 IFNa_N5片段N5正向序列編號第30號 片段N5逆向序列編號第31號 IFNa-N6片段N6正向序列編號第32號 片段N6逆向序列編號第33號 IFNa_N7片段N7正向序列編號第34號 片段N7逆向序列編號第35號 B. HuIFNa在P/c/n’a中之表現 爲重組體干擾素類似物之表現，每一基因之編碼序列使 28 593336 03886piO.doc/012 用在載體體上之义及限制核酸酸內切酶位置內插入 pPICZ-α表現載體（Invitrogen，San Diego, CA)。pPICZ-α表現 載體提供多種元素以促進重組干擾素之表現及純化。例如， 載體包括含有甲醇-調節醇氧化酶(AOX)促進子之表現套組。 在甲醇生長酵母細胞中，約5%之多A+RNA爲來自A0X1基 因。此外，載體亦含由釀酒酵母a因子早前胜肽的分泌訊號 序列，其有關蛋白質分泌至培養基中。載體亦提供重組細菌 及酵母細胞之選擇性，其係使用Zeocin抗生素經由Shble 基因（Streptoalloteichus hindustanus ble 基因）所碼編。 編碼HuIFNoc類似物之重組質體電穿孔入X-3 3原型Pic/ui 户似⑺…菌株以大量生長。重組酵母植株依由Invitrogen提供 之記錄生長及誘發。收集上淸液並使用0.8/0.2 mm孔洞大小 之頂盤狀瀘器(Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)過濾並以磷酸鹽緩衝之 生理食鹽水使用Centriplus· 10濃度計(Amicon，Inc·，Beverly，MA)交換緩 衝。經由此方法獲得之重組HuIFNa類似物顯示的抗病毒活性相 似於使用相同外以系統表現之重組OvIFNt之抗病 毒活性。 C.定量抗病毒活性生物檢測 使用色彩計生物檢測以定量干擾素蛋白質之抗病毒性。 在96井平底板使用以10%胎牛血淸(FBS)及抗生素補充之 Eagle MEM培養Madin darby牛腎(MDBK)細胞至群聚。移出 培養基並以無菌PBS沖洗細胞一次。試樣以三份加入，其在 100 μΐ/井使用以2% FBS及抗生素補充之Eagle MEM爲稀釋 培養基中使用系列10倍及2倍稀釋液。加入干擾素試樣並 29 593336 03886piB.doc/012 在 37°C 培養細胞 18 小時。以重組 HuIFN-ocA(Biosource Inti·) 爲標準干擾素對照組。loo μΐ泡狀口腔炎病毒(vsv)加至測 試井中並再於37t再培養48小時。由每一井中移出100 μΐ 培養基並以100 μΐ 0.2%中性紅溶液(Gibco-BRL)取代，再於 37°C培養1小時。移出所有培養基並在加入1〇〇 μΐ酸性醇(50% 乙醇，1%醋酸)前以PBS緩慢沖洗二次。可溶性染料之Α550 以生物動能讀取計程 Bi〇-Kinetic Reader(Bio_Tek Instruments， Winooski VT))讀取。使用下列方程式計算保護百分比。

保護百分比=1〇〇 X AVG(A^測試井）-AVG(A_病毒對照組井） AVG(A55Q未處理細胞照組井） 1抗病毒單位(U)定義爲以50%保護。 實施例2 IFNoc類似物在肝細胞中之活體外毒性 HuIFNa及IFNa類似物IFNa-NO(序列編號第10號；第1 圖）的活體外毒性使用正常人類肝細胞比較。肝細胞由 Clonetics Corporation(San Diego，CA)以母膠塗覆之 96-井平 板的細胞群聚層收集。在第二天，在井中之培養基以wo μ1 經補充(Μ μΜ 胰島素、0_ 1 μΜ 類脂醇(dexamethasone)、50 pg/ml Gentamicin、及 50 ng/ml Amphotericin B 之改質 Williams E 培 養基（clonetics Corp.)。細胞接著以 2000 U/ml 至 128,000 U/ml 之HuIFNa或IFNa-NO處理。在培養4、6或7天後，在每一 井中加入四唑鹽WST-l(4-3-(4-碘苯）-2-(4-硝基苯）-2Η-5·四唑 醇-1-3-苯二擴酸鹽）(Boehringer Mannheim，Indianapolis IN)。 30 593336 03886piB.doc/012 WST-1經由丁二酸-四唑鹽還原酶系統切斷至甲腊 (fonnazan) ’該系統存在於腺粒體呼吸鏈中且僅存在於活細 胞中。存活細胞之百分比係在450 nm吸收度測定，並以非 干擾素處理細胞的百分比表示。 結果顯示於表1中。値爲存活細胞之新陳代謝活性的百 分比値’其中100%係相等於僅以培養基處理之細胞的存活 〇 表1

在以IFN試樣培養4、6及7天後最初正常 人類肝細胞的新陳代謝活件百分比

IFN處 理之 天數 試樣 (單位/ML) 1.28x ΙΟ5 6.4 x 104 3.2 x 104 1.6 x 104 8xl03 4xl03 2xl03 4 RHuIF N-a 70.9 74.4 92.1 72.0 71.3 77.5 91.4 4 IFNa- NO 114.6 130.9 142.4 122.3 112.0 93.5 111.3 6 RHuIF N-a 58.1 68.2 96.3 112.4 76.5 73.6 ND 6 IFNa- NO 118.3 96.2 114.6 129.9 138.6 110.7 ND 7 RHuIF N-a 35.0 47.1 71.4 66.0 82.0 83.0 ND 7 IFNa- NO 94.4 132.0 139.0 97.4 111.7 155.4 ND

ND =未撿測 以HuIFNa培養之肝細胞顯示在存活力之明顯降低。相 反的，以IFNa類似物IFNa-NO顯示相對於未處理細胞無存 31 593336 03886pif3.doc/012 活率損失。 實施例3 在單核細胞中IFNa類似物之體外毒性 HuIFNa、OvIFNt、及人類 IFNa類似物 IFNa-ΝΟ 至 IFNa-N7(編號序列第10號至編號序列第Π號；第1圖）使 用周邊血管單核細胞(PBMC)比較。全血之淡黃表層分量以1:4 PBS 稀釋，並覆蓋在 Nycoprep 1.077 (Nycomed Pharma，Oslo， Norway)。在20°C以600 xg離心20分鐘後，在介面形成帶 狀的PBMC以滴管移除。以PBS沖洗細胞一次並以2 X 105 濃度置於96井平板中。第二天細胞以2000 U/ml至128,000 U/ml之IFN-α、IFN-τ或IFN-α類似物處理。在7天後，四唑 鹽WST-l(Boehringer Mannheim)君至每一細胞中。存活細胞 ‘ 之百分比係在450 nm吸收度測定，並以非干擾素處理細胞 - 的百分比表示。 結果顯示於2中。値爲存活細胞之新陳代謝活性的百分 比値，其中100%係相等於僅以培養基處理之細胞的存活率。φ 32 593336 03886pif3.doc/012 疋llgN試樣營蠢7天後最初正常 人麗肝.細胞的耗」遠代謝活性百分比 試樣 (單位/ML) l.zisx 0.4 x i.zx 1.6 x 105 104 104 104 8x l〇3 4xl03 2x 103 rHuIF N-a 64.4 65.0 63.8 74.1 71.6 73.6 92.5 rOvIF Ν-τ 97.4 105.7 122.5 117.5 90.2 100.9 89.7 IFNa- ΝΟ ND 124.6 138.9 101.7 103.5 103.0 105.7 IFNa- N1 60.0 56.1 60.4 69.3 65.6 ND ND IFNoc- N3 53.8 64.1 59.0 73.5 63.7 66.6 71.7 IFNa- N4 82.5 80.9 80.5 76.1 89.8 71.1 73.4 IFNa- N5 139.1 118.0 99.2 110.2 82.2 96.8 120.0 IFNa- N6 ND 103.4 116.5 91.4 106.9 96.0 125.3 IFNa- N7 97.5 150.6 96.8 121.5 159.4 111.5 140.3 ND =未檢測 以HiiIFNa培養之PBMC顯示在存活力之明顯降低。相 反的，以OvIFNt或以人類類似物IFNa-NO、IFN.a_N5、 IFNa-N6、及IFNa-N7顯示在培養7天後無存活率損失。相 似於以HuIFNa觀察到的在存活率的降低係在以IFNa類似物 IFNa-Nl至IFNa-N3培養的細胞中觀察至[J的。以IFNa類似 33 593336 03886pif3.doc/012 物IFNa-N4培養的細胞顯示比以HuIFNa培養的細胞有一些 增加。 雖然本發明以參考特定方法及實施例描述，但可瞭解在 未偏離本發明下可進行多種修飾及變化。 序列表 序列編號第1號之資料： (i) 序列特性： (A) 長度:9胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學··線性 (ii) 分子型式:胜肽 (v)片段型式：內部 (vii)直接來源： (B)植株:成熟HuIFNa 19-27殘基 (xi)序列描述:序列編號第1號

Ala Gin Met Ser Arg lie Ser Pro Ser 1 5 序列編號第2號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度:9胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (C) 股··單股 (D) 拓樸學:線性 34 593336 03886piB.doc/012 (ii)分子型式:胜肽 (v)片段型式：內部 (vii)直接來源： (B)植株··成熟OvIFNt 19-27殘基 〇d)序列描述:序列編號第2號

Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His 1 5 序列編號第3號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：17胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (C) 股··單股 (D) 拓樸學:線性 (ii)分子型式:胜肽 (v)片段型式：內部 (vii)直接來源： (B)植株··成熟HuIFNa 11-27殘基 (xi)序列描述:序列編號第3號

Asn Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gin Met Ser Arg lie Ser Pro 15 10 15

Ser 序列編號第4號之資料： ⑴序列特性： 35 593336 03886pif3.doc/012 (A) 長度：17胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學:線性 (ii)分子型式:胜肽 (v)片段型式：內部 (vii)直接來源： (B)植株:成熟OvIFNt 11-27殘基 (xi)序列描述:序列編號第4號

Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro 1 5 10 15

His 序列編號第5號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度:22胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (C) 股··單股 (D) 拓樸學:線性 (Π)分子型式:胜肽 (v)片段型式：內部 (vii)直接來源： (B)植株:成熟HuIFNa 6-27殘基 (xi)序列描述:序列編號第5號

Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gin Met 15 10 15 36 593336 03 886piB. doc/012

Ser Arg lie Ser Pro Ser 20 序列編號第6號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度:22胺基酸 (B) 型式··胺基酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學··線性 (ii)分子型式:胜肽 (v)片段型式：內部 (vii)直接來源： (B)植株:成熟OvIFNt 6-27殘基 (xi)序列描述:序列編號第6號

Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Arg Met 15 10 15

Asn Arg Leu Ser Pro His 20 序列編號第7號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度:27胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (C) 股··單股 (D) 拓樸學:線性 (ii)分子型式:胜肽 (v)片段型式:N-端 37 593336 03886piD.doc/012 (Vii)直接來源： (B)植株:成熟HuIFNoc 1-27殘基 (xi)序列描述:序列編號第7號

Gys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met 15 10 15

Leu Leu Ala Gin Met Ser Arg lie Ser Pro Ser 20 序列編號第8號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度:27胺基酸 (B) 型式··胺基酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學:線性 (ii)分子型式:胜肽 (v)片段型式:N-端 (vii)直接來源： (B)植株··成熟OvIFNt 1-27殘基 (xi)序列描述:序列編號第8號

Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 15 10 15

Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His 20 25 序列編號第9號之資料： ⑴序列特性： (A)長度：166胺基酸 38 593336 03886pif3.doc/012 (B) 型式:胺基酸 (C) 股澤股 (D) 拓樸學:線性 (ii)分子型式:蛋白質 (vii)直接來源： (A) 庫：Genbank Accessn· J00210, PID g386796 (B) 植株:HuIFNa-d，成熟蛋白質 (xi)序列描述:序列編號第9號

Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met 15 10 15

Leu Leu Ala Gin Met Ser Arg lie Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45

Gin Lys Ala Pro Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu lie Gin Gin He 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gin Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110

Asn Ala Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140

Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu !45 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 序列編號第10號之資料： ⑴序列特性： (A)長度：166胺基酸 39 593336 03886pif3.doc/012 (B) 型式:胺基酸 (C) 股澤股 (D) 拓樸學:線性 (ii)分子型式:蛋白質 (vii)直接來源： (B)植株:HuIFNa類似物 IFNoc-NO (xi)序列描述:序列編號第10號

Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 15 10 15

Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45

Gin Lys Ala Pro Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu lie Gin Gin lie 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gin Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110

Asn Ala Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu 丁hr Glu Lys Lys 丁yr Ser Pro Gys Ala TVp Glu 130 135 140

Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 序列編號第11號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：166胺基酸 (B) 型式:胺基酸 40 593336 03886piO.doc/012 (c)股:單股 (D)拓樸學:線性 (ii)分子型式:蛋白質 (vii)直接來源： (B)植株:HuIFNoc類似物 IFNa-Nl (xi)序列描述:序列編號第11號

Cys Tyr Leu Ser Arg Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met 15 10 15

Leu Leu Ala Gin Met Ser Arg lie Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45

Gin Lys Ala Pro Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu lie Gin Gin lie 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gin Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110

Asn Ala Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140

Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 序列編號第12號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：166胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (C) 股:單股 41 593336 03886pif3.doc/012 (D)拓樸學:線性 (ii)分子型式:蛋白質 (vii)直接來源： (B)植株:HuIFNa類似物 IFNoc-N2 (xi)序列描述:序列編號第12號

Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15

Leu Leu Ala Gin Met Ser Arg lie Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45

Gin Lys Ala Pro Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu lie Gin Gin lie 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gin Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110

Asn Ala Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140

Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 序列編號第13號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：166胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學:線性 42 593336 03886piB.doc/012 (ii)分子型式:蛋白質 (vii)直接來源： (B)植株:HuIFNoc類似物 IFNoc-N3 (xi)序列描述:序列編號第13號

Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Met 15 10 15

Leu Leu Ala Gin Met Ser Arg lie Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45

Gin Lys Ala Pro Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu lie Gin Gin lie 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gin Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110

Asn Ala Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140

Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 序列編號第14號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：166胺基酸 (B) 型式··胺基酸 (C) 股··單股 (D) 拓樸學:線性 (ii)分子型式:蛋白質 43 593336 03886piB.doc/012 (Vii)直接來源： (B)植株:HuIFNoc類似物 IFNa-N4 (xi)序列描述:序列編號第14號

Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 15 10 15

Leu Leu Asp Arg Met Ser Arg lie Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45

Gin Lys Ala Pro Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu lie Gin Gin lie 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gin Glu Glu Arg Val Gly Giu Thr Pro Leu Met 100 105 110

Asn Ala Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala 丁rp Glu 130 135 140

Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 序列編號第15號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：166胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (C) 股:單股 ，-. * (D) 拓樸學:線性 (ii)分子型式:蛋白質 (vii)直接來源： 44 593336 03886pif3.doc/012 (B)植株:HuIFNa類似物 IFNa-N5 (xi)序列描述:序列編號第15號

Cys Asp Leu Pro Glu Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 15 10 15

Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45

Gin Lys Ala Pro Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu lie Gin Gin lie 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gin Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110

Asn Ala Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140

Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 序列編號第16號之資料z ⑴序列特性： (A) 長度：166胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學:線性 (ii)分子型式:蛋白質 (vii)直接來源： (B)植株:HuIFNoc類似物 IFNa_N16 45 593336 03886pifi.doc/012 (xi)序列描述:序列編號第16號

Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 15 10 15

Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45

Gin Lys Ala Pro Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu lie Gin Gin lie 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gin Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110

Asn Ala Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140

Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 序列編號第17號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：166胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (C) 股:單股 (D) 拓撲學:線性 (ii)分子型式:蛋白質 (vii)直接來源： (B)植株:HuIFNa類似物 IFNoc-N17 (xi)序列描述:序列編號第17號 46 593336 03886pif3.doc/012

Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met 15 10 15

Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45

Gin Lys Ala Pro Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu lie Gin Gin lie 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys Val Met Gin Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110

Asn Ala Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Gys Ala Τϊρ Glu Vial Val 130 135 140

Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 序列編號弟18號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：172胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學:線性 (ii)分子型式:蛋白質 (vii)直接來源： (A) 庫：GenBank Accessn. Y00287，PID gl358 (B) 植株:〇vIFNt，成熟蛋白質 (xi)序列描述:序列編號第18號 47 593336 03886pif3.doc/012

Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 15 10 15

Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gin Asp 20 25 30

Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gin Glu Met Val Glu Gly Asp Gin Leu 35 40 45

Gin Lys Asp Gin Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gin Gin Ser 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr 65 70 75 80

Leu Leu Glu Gin Leu Cys Thr Gly Leu Gin Gin Gin Leu Asp His Leu 85 90 95

Asp Thr Cys Arg Gly Gin Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly 100 105 110

Asn Met Asp Pro lie Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gin Gly lie Tyr 115 120 125

Asp Tyr Leu Gin Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala TYp Glu lie Val 130 135 140

Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gin Lys 145 150 155 160

Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro 165 170 序列編號第19號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度:527鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股澤股 (D) 拓樸學··線性 (vii)直接來源： (B)植株:IFNa-N0合成基因 (xi)序列描述:序列編號第19號 48 593336 03886piB.doc/012 CTAGGCTCGA GAAGAGATGT TACTTGTCTA GAAAGTTGAT GTTGGACGCC AGAGAGAACT 60 TGAAGTTGTT GGATAGAATG AACAGACTTT CTCCTCACTC TTGTCTTATG GACAGACACG 120 ACTTCGGTTT CCCACAAGAA GAATTTGACG GTAACCAATT CCAAAAGGCT CCAGCTATCT 180 CTGTCTTGCA CGAGTTGATC CAACAAATTT TCAACCTTTT CACTACCAAG GACTCCTCCG 240 CTGCTTGGGA CGAAGATTTG CTTGACAAGT TCTGTACTGA GCTTTACCAA CAATTGAACG 300 ACTTGGAAGC CTGTGTCATG CAAGAAGAGA GAGTTGGAGA GACCCCTTTG ATGAACGCTG 360 ATTCCATTTT GGCTGTCAAG AAGTACTTCA GAAGAATTAC CTTGTACCTT ACTGAGAAGA 420 AGTACTCTCC ATGTGCTTGG GAGGTTGTTA GAGCTGAAAT TATGAGATCC TTGTCTTTGT 480 CTACTAACCT TCAAGAAAGA TTGAGAAGAA AGGAGTAAGC GGCCGCG 527 序列編號第20號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度:24鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股澤股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株:接合子1 (xi)序列描述:序列編號第20號 CTAGAAAGTT GATGGAATTC GACG 24 序列編號第21號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度:25鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： 49 25 25593336 03886pif3.doc/012 (B)植株:接合子2 (xi)序列描述:序列編號第21號

GTTACCGTCG AATTCCATCA ACTTT 序列編號第22號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：135鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學··線性 (vii)直接來源： (B)植株:片段N1，正向股 (xi)序列描述:序列編號第22號 TCGAGAAGAG ATGTTACCTT TCTAGAACCC ACTCCTTGGA CAACAGAAGA ACCTTGATGT 60 TGCTAGCCCA AATGTCCAGA ATCTCCCCTT CCTCTTGTCT TATGGACAGA CACGACTTCG 120 GTTTCCCACA AGAAG 135 序列編號第23號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：135鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股··單股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株··片段N1，逆向股 (xi)序列描述:序列編號第23號 50 03886piD.doc/012 AATTCTTCTT GTGGGAAACC GAAGTCGTGT CTGTCCATAA GACAAGAGGA AGGGGAGATT 60 CTGGACATTT GGGCTAGCAA CATCAAGGTT CTTCTGTTGT CCAAGGAGTG GGTTCTAGAA 120 AGGTAACATC TCTTC 135 593336 序列編號第24號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：100鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股··單股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株:片段N2，正向股 (xi)序列描述:序列編號第24號 TCGAGAAGAG ATGTTACTTG TCTAGAAAGT TGATGTTGGA CAACAGAAGA ACCCTTATGC 60 TGCTAGCTCA AATGTCCAGA ATCTCTCCAT CCTCTTGTCT 100 序列編號第25號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：116驗基對 (B) 型式:核酸 · (C) 股··單股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株··片段N2，逆向股 (xi)序列描述:序列編號第25號 CGAAGTCGTG TCTGTCCATA AGACAAGAGG ATGGAGAGAT TCTGGACATT TGAGCTAGCA 60 GCATAAGGGT TCTTCTGTTG TCCAACATCA ACTTTCTAGA CAAGTAACAT CTCTTC 116 51 593336 03886pif3.doc/012 序列編號弟2 6號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：116鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股澤股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株:片段N3，正向股 (xi)序列描述:序列編號第26號 TCGAGAAGAG ATGTTACTTG TCTAGAAAGT TGATGTTGGA CGCTAGAGAG AACTTGATGC 60 TGCTAGCTCA AATGTCCAGA ATTTCCCCTT CTTCTTGTCT 100 序列編號弟2 7號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：116鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株:片段N3，逆向股 (XI)序列描述:序列編號第27號 CGAAGTCGTG TCTGTCCATA AGACAAGAAG AAGGGGAAAT TCTGGACATT TGAGCTAGCA 60 GCATCAAGTT CTCTCTAGCG TCCAACATCA ACTTTCTAGA CAAGTAACAT CTCTTC 116 序列編號第28號之資料： ⑴序列特性： 52 593336 03886pif3.doc/012 (A) 長度：100鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股澤股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株:片段N4，正向股 (xi)序列描述:序列編號第28號 60 100

TCGAGAAGAG ATGTTACTTG TCTAGAAAGT TGATGCTTGA CGCTAGAGAA AACTTGAAGC

TTTTGGACAG AATGTCCAGA ATTTCCCCAT CCTCTTGTCT 序列編號第29號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：116驗基對 (B) 型式:核酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株:片段N4，逆向股 (xi)序列描述:序列編號第29號 60 116

CGAAGTCGTG TCTGTCCATA AGACAAGAGG ATGGGGAAAT TCTGGACATT CTGTCCAAAA

GCTTCAAGTT TTCTCTAGCG TCAAGCATCA ACTTTCTAGA CAAGTAACAT CTCTTC 序列編號第30號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：135鹼基對 (B) 型式:核酸 53 593336 03886piO.doc/012 (c)股:單股 (D)拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株:片段N5，正向股 (xi)序列描述:序列編號第30號 TCGAGAAGAG ATGTGACTTG CCAGAAAAGC TTATGTTGGA CGCCAGAGAA AACTTGAAAC 60 TTCTAGACAG AATGAACAGA TTGTCTCCAC ACTCTTGTCT TATGGACAGA CACGACTTCG 120 GTTTCCCACA AGAAG 135 序列編號弟31號之資料· ⑴序列特性： (A) 長度：135鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股澤股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株··片段N5 ’逆向股 (xi)序列描述:序列編號第31號 AATTCTTCTT GTGGGAAACC GAAGTCGTGT CTGTCCATAA GACAAGAGTG TGGAGACAAT 60 CTGTTCATTC TGTCTAGAAG TTTCAAGTTT TCTCTGGCGT CCAACATAAG CTTTTCTGGC 120 AAGTCACATC TCTTC 135 序列編號第32號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：100鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股:單股 54 593336 03886pif3.doc/012 (D)拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株:片段N6，正向股 (xi)序列描述:序列編號第32號 60 100

TCGAGAAGAG ATGTGACTTG CCTGAAACTC ACAGTCTAGA CGCCAGAGAG AACTTGAAGC TTTTGGACAG AATGAACAGA TTGTCTCCAC ACTCTTGTCT 序列編號第33號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：116鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株:片段N6，逆向股 (xi)序列描述:序列編號第33號 60 116

CGAAGTCGTG TCTGTCCATA AGACAAGAGT GTGGAGACAA TCTGTTCATT CTGTCCAAAA GCTTCAAGTT CTCTCTGGCG TCTAGACTGT GAGTTTCAGG CAAGTCACAT CTCTTC 序列編號第34號之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：1〇〇鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： 55 593336 03886pifi.doc/012 (B)植株:片段N7，正向股 (xi)序列描述:序列編號第34號 TCGAGAAGAG ATGTGACTTG CCAGAGACCC ACTCCCTTGA CAACAGAAGA ACTTTGATGC 60 TTCTAGACAG AATGAACAGA TTGTCCCCAC ACTCTTGTCT 100 序列編號弟3 5 5虎之資料· ⑴序列特性： (A) 長度：116驗基對 (B) 型式:核酸 (C) 股:單股 (D) 拓樸學:線性 (vii)直接來源： (B)植株:片段N7，逆向股 (xi)序列描述:序列編號第35號 CGAAGTCGTG TCTGTCCATA AGACAAGAGT GTGGGGACAA TCTGTTCATT CTGTCTAGAA 60 GCATCAAAGT TCTTCTGTTG TCAAGGGAGT GGGTCTCTGG CAAGTCACAT CTCTTC 116

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Claims (1)

1. 〇.doc/012

   拾、申請專利範圍： 1·—種天然人類干擾素-α蛋白質的多胜肽類似物， 其中類似物之胺基酸序列與天然干擾素蛋白質相對應 之1-27殘基序列係在於位置19、20、22、24、27之中一個 位置或多個位置不同，而該類似物的胺基酸序列與該天然干 擾素-α相對應之序列之差異不得只爲Ser、Thr、Asn、Gin 或Gly出現在相對應之胺基酸殘基位置22 ; 以及其中該類似物可以顯示出較天然干擾素-α有較低毒 性，其係由下列之分析方法而測得： (a) 以一包含至少每毫升2000抗病毒單位之類似物培養基 來培養一第一試樣之周邊血管單核細胞經過七天； (b) 以一具有如上每毫升抗病毒單位相同濃度之天然干擾 素-α培養基來培養一第二試樣之周邊血管單核細胞經過七 天；以及 (c) 比較第一試樣中之存活細胞與第二試樣中之存活細胞 之百分比，具有較高百分比之存活細胞顯示出該類似物在培 養基中具有相對較低之毒性。 2. 根據申請專利範圍第1項之多胜肽類似物，其中與天然 千擾素-α位置19、2〇、22、24及27相對應之該些胺基酸殘 基係與相對應之原有胺基酸殘基不同，而該些胺基酸殘基係 有關於非保留性胺基酸之取代。 3. 根據申請專利範圍第2項之多胜肽類似物，其中相對應 於位置19之該胺基酸殘基爲Asn、Asp、Gin及Glu其中選 57 593336 03 886ρίβ .doc/012 4. 根據申請專利範圍第2項之多胜肽類似物，其中相對應 於位置19之該胺基酸殘基爲Asp。 5. 根據申請專利範圍第2項之多胜肽類似物，其中相對應 於位置20之該胺基酸殘基爲His、Arg及Lys其中選一。 6. 根據申請專利範圍第2項之多胜肽類似物，其中相對應 於位置20之該胺基酸殘基爲Arg。 7. 根據申請專利範圍第2項之多胜肽類似物，其中相對應 於位置22之該胺基酸殘基爲Asn、Asp、Gin及Glu其中選 -- ο 8. 根據申請專利範圍第2項之多胜肽類似物，其中相對應 於位置22之該胺基酸殘基爲Asn。 9. 根據申請專利範圍第2項之多胜肽類似物，其中相對應 於位置27之該胺基酸殘基爲His、Arg及Lys其中選一。 10. 根據申請專利範圍第2項之多胜肽類似物，其中相對 應於位置27之該胺基酸殘基爲His。 11. 根據申請專利範圍第1項之多胜肽類似物，其中相對 應於位置24之該胺基酸殘基爲lie、Leu、Val及Met其中選 --- ο 12. 根據申請專利範圍第1項之多胜肽類似物，其中相對 應於位置24之該胺基酸殘基爲Leu。 13. 根據申請專利範圍第1項之多胜肽類似物，其中與天 然干擾素-α蛋白質之殘基序列28-166相對應之類似物之胺 基酸序列與天然干擾素-α蛋白質之殘基序列28-166大致上 是相同的。 58 593336 03886piB.doc/012 14·根據申請專利範圍第13項之多胜肽類似物，其中與天 然干擾素-α蛋白質之殘基序列28-166相對應之類似物之胺 基酸序列與天然干擾素-α蛋白質之殘基序列28-166是相同 的。 15·—種核酸分子，其編碼一種根據申請專利範圍第1-14 項中任何一項之多胜肽類似物。 16·—種製造人類干擾素蛋白質之多胜肽類似物的方 法，包括： 將一種根據申請專利範圍第15項之核酸分子放入重組體 表現系統中； 使該核酸加以表現以生產出該類似物；以及 回收該類似物。 17· —種製造編碼人類干擾素蛋白質之多胜肽類似物 之核酸分子的方法，包括： ‘ 對於編碼天然人類干擾素-α蛋白質之核酸分子進行一個 或多個密碼子的修改，以提供一種根據申請專利範圍第1-14 項中任何一項之核酸分子。 18· —種醫藥組成物，包括根據申請專利範圍第1-14項中 任何一項之一種干擾素-α類似物及一種醫藥上可接受之載 劑，以針對具有對人類干擾素-α有反應之一疾病症狀之一主 體治療。 19·一種根據申請專利範圍第18項之醫藥組成物，係以口 服方式而以具有干擾素-α反應性疾病者爲對象。 20·—種可以於被病毒感染的細胞中抑制病毒複製之組成 59 593336 03886pi£3.doc/012 物，包括根據申請專利範圍第1-14項中任何一項之一種干擾 素-α類似物，該干擾素-α類似物被施用於細胞中，以有效 抑制細胞中病毒的複製。 21·—種抑制腫瘤細胞生長之組成物，包括根據申請專利 範圍第1-14項中任何一項之一種干擾素-α類似物，該干擾 素-α類似物被施用於細胞中，以有效抑制腫瘤細胞生長。 22·根據申請專利範圍第1 -14項中任何一項之一種干擾素 -α類似物，以製備用來治療干擾素-α反應性疾病症狀之一 種醫藥組成物。 23. 根據申請專利範圍第1-14項中任何一項之一種干擾素 -α類似物，以製備用來治療干擾素-α反應性疾病症狀之一 種可以口服之醫藥組成物。 24. 根據申請專利範圍第1-14項中任何一項之一種干擾素 -α類似物，以製備用來治療自體免疫疾病、慢性炎症或是干 擾素-α反應性疾病症狀之一種醫藥組成物。 60