JPH083058A

JPH083058A - 新規な骨代謝疾患治療剤

Info

Publication number: JPH083058A
Application number: JP6135275A
Authority: JP
Inventors: Masakazu Kato; 雅一加藤; Kazuyuki Kitamura; 和之北村
Original assignee: Hoechst Japan Ltd
Current assignee: Sanofi Aventis KK
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 1996-01-09
Also published as: AU2171695A; US5726148A; TW496740B; NO952411L; HUT72054A; EP0687470A2; AU697136B2; EP0687470A3; CA2152023A1; HU9501779D0; HU218947B; NO952411D0; FI952953A0; FI952953A; KR960000248A

Abstract

(57)【要約】【構成】哺乳動物のIL-1受容体、その細胞外部分から
なる可溶性断片またはその断片を有効成分とする骨代謝
性疾患治療剤。【効果】骨吸収抑制作用があり、骨代謝性疾患の治
療、予防に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、骨からカルシウムおよ
び骨基質が異常に減少することにより生ずる疾病を予防
および治療する薬剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】異常な骨吸収は、骨粗鬆症をはじめ、関
節リュウマチ炎、ページェト病、悪性腫瘍の骨転移、甲
状腺機能後進症、卵巣切除施行後、さらに四肢の神経切
断あるいは長時間の不使用又は固定によりおこり、その
結果として骨強度の減少及び骨折の危険性を増加させ
る。さらに、人の平均寿命の急速な延びにより６５才以
上の人口が増加し、上記疾患特に骨粗鬆症患者が増加す
ると推測されている。従来は、ビタミンＤ３、カルシト
ニン、エストロジェン、ビスフォスフォネート誘導体な
どの薬剤が臨床応用されている。しかし、これらによる
治療も決して充分とはいえず、さらに優れた治療薬が求
められている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は骨代謝疾患治療に対して優れた効果のある新たな
治療薬として用いることのできる蛋白質を提供すること
である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】骨吸収は、破骨細胞が活
性化されることにより起こることが知られている。ま
た、インターロイキン１（以下、IL-1と略記）が、破骨
細胞の活性化、及び骨吸収を強く誘導することが知られ
ている（Gowenら, Nature, vol.306, p378-380,(1983);
Pfeilschifterら, J. Bone Miner. Res., vol.4, p113
-118, (1989); Thomsonら, J. Exp. Med., vol.164, p1
04-112, (1989)）。本発明者は、IL-1活性阻害剤が、骨
吸収を抑制すると考え、鋭意研究した結果、IL-1受容体
（以下、IL-1Rと略記）、その細胞外部分からなる蛋白
質である可溶性IL-1Rおよびその断片が、骨吸収を抑制
することを発見し、本発明を完成した。なお、これまで
に、IL-1活性阻害剤による骨吸収抑制としては、Seckin
gerら（J. Immunology, vol.145, p4181-4184, (199
0)）により、IL-1レセプターアンタゴニスト（以下、I
L-1raと略記）が、Taniharaら（Biochem. Biophys. Re
s. Commun., vol.188, p912-920, (1992)；特開平５−
９１９９）により、Ｉ型IL-1Rの８６から９３までのア
ミノ酸からなる合成ペプチドが、報告されている。しか
し、IL-1raは生体内で産生されていることが知られてお
り、IL-1ra製剤の効果は、局所でのIL-1raの産生状態に
依存すると考えられ、また、IL-1Rの合成ペプチドは、I
L-1に対する親和性が低い。本発明は、上記の問題を解
決しており、骨吸収抑制剤として優れた効果が期待でき
る。本発明のIL-1Rは、ヒト、サル、マウス等の哺乳動
物の体内に存在するものである。特に好ましいヒトIL-1
Rは、配列表配列番号１に示される５６９個のアミノ酸
より成る。好ましくは、その生理活性を保っている可溶
性の断片である。好ましい可溶性断片の例は、配列表配
列番号１において１番目から３１９番目のアミノ酸より
なる蛋白質である。更に好ましくは、１番目から３１２
番目のアミノ酸よりなる可溶性の蛋白質である（以下、
shuIL-1Rという）。このshuIL-1Rは、公知の蛋白質であ
り、特開平５−３３２９９４に記載されている。Ｉ型IL
-1Rおよびその可溶性断片は、哺乳動物の白血球から精
製することもできるが、遺伝子工学的に生産することが
適当である。遺伝子工学的製造法は前記の特許公報に記
載されている。

【０００５】本発明の蛋白質は、骨吸収抑制剤として有
用であり、その投与方法としては静脈内および筋肉内投
与が可能であり、静脈内投与の場合は通常の静脈内注射
の他点滴静注が可能である。注射用製剤としては、例え
ば注射用粉末製剤とすることができる。その場合は適当
な水溶性賦形剤例えばマンニトール、ショ糖、乳糖、マ
ルトース、ブトウ糖、フルクトース等の１種または２種
以上を加えて水で溶解し、バイアルまたはアンプルに分
注した後凍結乾燥し密封して製剤とすることができる。
臨床における成人１日当りの投与量は、投与法、患者の
年令、体重、症状等によって異なるが、通常はshuIL-1R
として１〜５００μgの範囲である。

【０００６】本蛋白質の骨吸収抑制作用は、破骨細胞活
性に対する直接作用を調べることにより立証される。破
骨細胞活性に対する効果は、例えばピットフォーメーシ
ョンアッセイで調べることができる。ピットフォーメー
ションアッセイでは、破骨細胞を含むマウス副甲状腺ホ
ルモン（以下、ＰＴＨと略記）刺激長管骨細胞懸濁液を
象牙片上で培養すると破骨細胞は象牙片上の骨組織を溶
かし吸収窩（ピット）を形成する。この被験液中にIL-1
を加えると破骨細胞がさらに活性化され吸収窩数が増加
する。そこに、本蛋白質を加え、破骨細胞による象牙片
上の吸収窩数を計測して、本蛋白質の効果の程度を調べ
ることができる。骨吸収抑制効果が高ければ、計測され
る吸収窩の数はより少なくなる。以下に、本発明の効果
を、実施例を示して具体的に説明する。

【０００７】

【実施例】

実施例１マウスＰＴＨ刺激長管骨細胞の調製１０日齢ＩＣＲマウスの大腿骨および経骨を無菌的に摘
出し、５％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含むα−ＭＥＭ（α
−Modified Eagle's Medium）培養液中に懸濁させる。
約３分間静置し、骨切片等を沈殿させた後、上清の細胞
浮遊液を回収し、1,200rpm、５分間遠心後、細胞の沈査
に新しい培養液を加え、約５×１０⁶個／mlの細胞濃度
に調整し、ＰＴＨを１０^-8Ｍになるように加え、この細
胞調整液１５mlを培養用フラスコ（７５cm²底面積）へ
入れ、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で７日間
培養する。培養の途中３日目にＰＴＨ１０^-8Ｍを含む
新しい培養液と交換する。７日間培養後、セルスクレイ
パーを用いて付着性の細胞を回収し、５％ＦＣＳを含む
α−ＭＥＭに再懸濁し、マウスＰＴＨ刺激長管骨細胞を
得た。

【０００８】実施例２可溶性Ｉ型IL-1受容体のインビトロ（in vitro）におけ
る骨吸収抑制作用実施例１で得られたマウスＰＴＨ刺激長管骨細胞を、１
×１０⁶個／mlの細胞濃度に調整し、直径６mmの象牙片
を置いた９６穴プレート上に１００μl加える。被験薬
は、細胞懸濁液中に０.０１〜１０μg／mlとなるように
加え、プレートは１ng／mlのヒトIL-1α、またはヒトIL
-1β存在下、あるいは非存在下で３７℃、５％ＣＯ₂イ
ンキュベーター内で２日間培養した後、象牙片を取り出
しクマシーブリリアントブルー染色を行ない顕微鏡下で
吸収窩数を測定する。被験薬未添加群と被験薬群の吸収
窩数をstudent-t検定を行ない評価する。ただし、shuIL
-1Rは、特開平５−３３２９９４実施例４に示される方
法に従い、図１に示される配列番号１〜３１２からなる
蛋白質をコードするＤＮＡ配列をマウス骨髄腫細胞NS-1
において発現させることにより調製した。また、ヒトIL
-1α、ヒトIL-1βは、ゼンザイム社（米国、Genzyme C
o.）より購入した。結果を表１に示した。

【０００９】

【表１】縦の列は象牙片上の吸収窩数を、各カラム比較群の平均
と標準偏差を示す。横の列は処置方法を記載し、対照
は、被験薬であるshuIL-1Rを加えない場合を示す。

【００１０】ヒトIL-1α、またはヒトIL-1βで促進され
た吸収窩数の増加を、shuIL-1Rは、１ng／mlの濃度で有
意に抑制した。さらに、１０ng／mlの濃度のshuIL-1R
は、１ng／mlのヒトIL-1α、またはヒトIL-1βの促進効
果をほぼ完全に阻害した。また、IL-1非存在下では、１
０ng／mlの濃度のshuIL-1Rでも抑制効果は認められず、
非特異的な抑制効果（細胞毒性を含む）のないことを示
した。

【００１１】

【発明の効果】本発明によるshuIL-1Rは、インビトロに
おいて極めて優れた骨吸収抑制作用を示す。これは、骨
粗鬆症、高カルシウム血症などの骨吸収亢進を起因とす
る骨代謝性疾患に対する改善効果がある。

【００１２】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：５６９配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：ヒト（Homo sapiense）細胞の種類：白血球配列の特徴：他の情報：ヒトＩ型IL-1R 配列 Met Lys Val Leu Leu Arg Leu Ile Cys Phe Ile Ala Leu Leu Ile Ser -20 -15 -10 -5 Ser Leu Glu Ala Asp Lys Cys Lys Glu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Leu 1 5 10 Val Ser Ser Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro 15 20 25 Asn Glu His Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asp Asp Ser Lys Thr 30 35 40 Pro Val Ser Thr Glu Gln Ala Ser Arg Ile His Gln His Lys Glu Lys 45 50 55 Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys 60 65 70 75 Val Val Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Ser Ala Lys 80 85 90 Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Gln Ala Ile Phe 95 100 105 Lys Gln Lys Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr 110 115 120 Met Glu Phe Phe Lys Asn Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Gln Trp 125 130 135 Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly 140 145 150 155 Val Lys Asp Arg Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly 160 165 170 Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln Tyr Pro 175 180 185 Ile Thr Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr 190 195 200 Arg Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu 205 210 215 Gly Ser Gln Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp 220 225 230 235 Ile Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp Asp Pro 240 245 250 Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg 255 260 265 Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg 270 275 280 Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile 285 290 295 Asp Ala Ala Tyr Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Asn Phe Gln Lys 300 305 310 315 His Met Ile Gly Ile Cys Val Thr Leu Thr Val Ile Ile Val Cys Ser 320 325 330 Val Phe Ile Tyr Lys Ile Phe Lys Ile Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg 335 340 345 Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu Pro Ile Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr 350 355 360 Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Val Gly Glu Gly Ser Thr 365 370 375 Ser Asp Cys Asp Ile Phe Val Phe Lys Val Leu Pro Glu Val Leu Glu 380 385 390 395 Lys Gln Cys Gly Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val 400 405 410 Gly Glu Asp Ile Val Glu Val Ile Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser Arg 415 420 425 Arg Leu Ile Ile Ile Leu Val Arg Glu Thr Ser Gly Phe Ser Trp Leu 430 435 440 Gly Gly Ser Ser Glu Glu Gln Ile Ala Met Tyr Asn Ala Leu Val Gln 445 450 455 Asp Gly Ile Lys Val Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile Gln Asp Tyr 460 465 470 475 Glu Lys Met Pro Glu Ser Ile Lys Phe Ile Lys Gln Lys His Gly Ala 480 485 490 Ile Arg Trp Ser Gly Asp Phe Thr Gln Gly Pro Gln Ser Ala Lys Thr 495 500 505 Arg Phe Trp Lys Asn Val Arg Tyr His Met Pro Val Gln Arg Arg Ser 510 515 520 Pro Ser Ser Lys His Gln Leu Leu Ser Pro Ala Thr Lys Glu Lys Leu 525 530 535 Gln Arg Glu Ala His Val Pro Leu Gly 540 545

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物のIL-1受容体を有効成分とする
骨代謝疾患治療剤。
【請求項２】 IL-1受容体が可溶性断片である請求項１
の骨代謝疾患治療剤。
【請求項３】 IL-1受容体の可溶性断片がヒトのIL-1受
容体の可溶性断片である請求項２の骨代謝疾患治療剤。
【請求項４】ヒトのIL-1受容体の可溶性断片がヒトの
Ｉ型IL-1受容体の可溶性断片である請求項３の骨代謝疾
患治療剤。
【請求項５】ヒトのＩ型IL-1受容体の可溶性断片が配
列表配列番号１の１番目から３１２番目のアミノ酸より
なる蛋白質である請求項４の骨代謝疾患治療剤。
【請求項６】骨代謝疾患が骨吸収に起因する疾患であ
る請求項１〜５のいずれかの項の骨代謝疾患治療剤。